專利名稱：固相多肽合成胸腺五肽的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種胸腺五肽的制備方法，具體涉及胸腺五肽的固相多肽合成制備方法。
背景技術：
胸腺五肽，英文名為Thymopoietin pentapeptide；TP-5；Thymopentin，結構式為Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH，分子式及分子量C30H49N9O9，679.77。
胸腺五肽臨床用于免疫增強劑，用于艾滋病早期治療，慢性肝炎，惡性腫瘤，手術及嚴重感染，還可用于糖尿病、類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病，還具有抗衰老作用等。
胸腺五肽最早由Johnson & Johnson公司開發(fā)，于1985年在意大利、德國作為免疫增強劑及免疫調節(jié)劑上市，商品名為Timunox。
目前，常規(guī)的胸腺五肽的制備方法是以氯甲基樹脂為起始原料，如《化工進展》2003年第2期153-156，“固相合成胸腺五肽的研究進展”，公開的技術。接肽收率低，生產成本高，工藝復雜，使用劇毒的氟化氫和三氟乙酸，三廢污染嚴重，難以進行工業(yè)化生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的技術問題是公開一種固相多肽合成胸腺五肽的制備方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)以CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Arg-OH；(2)將切肽試劑加入步驟(1)的產物進行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)將步驟(2)的粗品采用C18或C8柱進行分離純化，獲得目標產物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，以CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Arg-OH的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂將CTC樹脂(1.0mmol/g)用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，吹干，獲得(A)；將溶解于DMF中的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW403.4)和DIPEA加入(A)中，10～40℃反應0.5～1.5小時，加甲醇，20～30℃反應0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF、乙醇DMF分別洗滌，吹干，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂；DMF中，CTC樹脂的重量濃度為5～15％，CTC樹脂與甲醇的重量比例為CTC樹脂∶甲醇＝1∶5～15；CTC樹脂與脫帽試劑的重量比例為CTC樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；所說的CTC樹脂為一種2-氯-三苯基氯樹脂，可采用天津和成科技有限公司生產的產品；所說的脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶2～6，體積比；(2)制備Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述Fmoc-Tyr(tBu)樹脂中，加入脫帽試劑，20～35℃反應15～45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。加入Fmoc-Val-OH(FW339.4)、TBTU(FW321)和HOBT(FW135.1)溶解于接肽試劑，20～30℃反應1.0～2小時，吹干，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽試劑中，樹脂的重量濃度為5～15％，Fmoc-Val-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍，TBTU和HOBT的摩爾比為樹脂的2～5倍。
樹脂與脫帽試劑的重量比例為樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；(3)制備Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述的Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，20～35℃反應15～45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(FW411.5)、TBTU和HOBT溶解于接肽試劑，20～35℃反應1.0～2小時，其余操作同(2)，獲得Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽試劑中，Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍，TBTU和HOBT的摩爾比為CTC樹脂的2～5倍。
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂與脫帽試劑的重量比例為Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；(4)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，20～35℃反應15～45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(FW468.5)、TBTU和HOBT溶解于接肽試劑，20～30℃反應1.0～2小時，DMF、乙醇、DMF分別洗滌三次，獲得Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽試劑中，Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍，TBTU和HOBT的摩爾比為樹脂的2～5倍。
Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂與脫帽試劑的重量比例為Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；(5)制備Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，20～35℃反應15～45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。加入Boc-Arg-OH(FW310.81)、TBTU和HOBT，溶解于接肽試劑，20～35℃反應1.0～2小時，其余操作同(2)，獲得Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽試劑中，Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，Boc-Arg-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍，TBTU和HOBT的摩爾比為樹脂的2～5倍。
Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂與脫帽試劑的重量比例為Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；上述步驟中，所說的脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶2～5，體積比；所說的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶5～15，接肽試劑中，TBTU的摩爾為原料樹脂的2～5倍，HOBT的摩爾為原料樹脂的2～5倍。
所說的原料樹脂指的是CTC樹脂或每一步反應的起始樹脂，如步驟(3)中的Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂。
按照本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，切肽包括如下步驟將切肽試劑加入Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂，15～35℃反應1.5～3小時，加入乙醚沉淀，過濾，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，得粗品；所說的切肽試劑為(TFA/H2O/TIS＝760ml/20ml/20ml)；
按照本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，分離純化包括如下步驟將粗品溶于醋酸銨的水溶液中，過濾，濾液經C18柱純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(95∶5)；流速為100-650ml/min；檢測波長為275nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后，采用常規(guī)的方法脫鹽，凍干，獲得成品(MW680)，總收率44％(以CTC樹脂的50mmol計)。
醋酸銨的水溶液的濃度為0.05～0.15M。
由上述公開的技術方案可見，本發(fā)明采用CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個接上氨基酸，每步接肽收率≥98％，最后一個肽鏈采用Boc-Arg-OH的方法，降低了生產成本，簡化工藝，切肽后乙醚沉淀粗品，避免使用劇毒的氟化氫，三廢污染少。采用C18柱進行分離純化，避免使用三氟乙酸，減小三廢，純化收率≥50％，每步接肽收率均在98％以上；切肽后收率為88％，分離純化收率為52％，總收率約為44％。本發(fā)明的方法便于工業(yè)化實施。
具體實施例方式
實施例1實施例中采用的原料和物質列表如下


下述步驟中脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶4，體積比；所說的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶10；接肽試劑中，TBTU的摩爾為原料樹脂的3.5倍，HOBT的摩爾為原料樹脂的3.5倍。
制備Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂取50g CTC樹脂(1.0mmol/g樹脂，50mmol)，用800mlDMF浸泡，使樹脂充分溶脹，吹干。
1)取20g(FW403.4，50mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、55mlDIPEA，，用500mlDMF溶解，入反應容器，室溫反應60分鐘。加甲醇50ml，室溫反應60分鐘2)吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
制備Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂1)加1000ml脫帽試劑，室溫反應30分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
2)加入50.9g(FW339.4，150mmol)Fmoc-Val-OH、48.2g(FW321，150mmol)TBTU、23.3g(FW135.1，150mmol)HOBT，用500ml接肽試劑溶解，加入反應容器，室溫反應90分鐘。
3)吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
制備Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂加1000ml脫帽試劑，室溫反應30分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
加61.7g(FW411.5，150mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、48.2g(FW321，240mmol)TBTU、23.3g(FW135.1，150mmol)HOBT，用500ml接肽試劑溶解，加入反應容器，室溫反應90分鐘。其余操作同上。
制備Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂加1000ml脫帽試劑，室溫反應30分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
加70.3(FW468.5，150mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、48.2g(FW321，240mmol)TBTU、23.3g(FW153，240mmol)HOBT，用500ml接肽試劑溶解，加入反應容器，室溫反應90分鐘。其余操作同上。
制備Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂加1000ml脫帽試劑，室溫反應30分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
加49.3g(FW310.8 150mmol)Boc-Arg-OH 48.2g(FW321，150mmol)TBTU、23.3g(FW135.1，150mmol)HOBT，用500ml接肽試劑溶解，加入反應容器，室溫反應90分鐘。分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
將保護5肽樹脂轉移至1000ml反應器中，加入切肽試劑(TFA/H2O/TIS＝760ml/20ml/20ml)，25℃～30℃攪拌2小時。減壓除去溶劑后，加入1000ml冷乙醚沉淀，過濾收集，用無水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得粗品35g(FW680 51.5mmol)。
將35g粗品溶于100ml 0.1M醋酸銨中，過濾，濾液經C18柱純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(95∶5)；流速為300ml/min；檢測波長為275nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后脫鹽，凍干，約得15g白色塊狀物成品(MW680，22mmol)，總收率44％(以CTC樹脂的50mmol計)。
權利要求
1.一種固相多肽合成胸腺五肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)以CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Arg-OH；(2)將切肽試劑加入步驟(1)的產物進行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)將步驟(2)的粗品采用C18或C8柱進行分離純化，獲得目標產物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，以CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Arg-OH的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Try(tBu)-樹脂在反應容器中，加入CTC樹脂，用DMF溶脹后，吹干，加入Fmoc-Tyr(tBu)OH(FW403.4)、DIPEA及DMF，接肽反應，加甲醇，反應，吹干，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂；加入脫帽試劑，反應，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。接肽反應中，樹脂的重量濃度為5～15％，Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩爾比為樹脂的1～3倍；(2)制備Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂在上述Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂中，加脫帽試劑，反應，DMF洗滌。再加入Fmoc-Val-OH(FW339.4)、TBTU、HOBT及接肽試劑，反應，DMF洗滌，獲得Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽反應中，Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，Fmoc-Val-OH的摩爾比為CTC樹脂的2～5倍；(3)制備Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；在上述Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加脫帽試劑，反應，DMF洗滌，再加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(FW411.5)、TBTU、HOBT及接肽試劑，反應，DMF洗滌，獲得Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽反應中，Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍；(4)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂在上述Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加脫帽試劑，反應，DMF洗滌，再加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(FW468.5)、TBTU、HOBT及接肽試劑，反應，DMF洗滌，獲得Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽反應中，Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍；(5)制備Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加脫帽試劑，反應，DMF洗滌，再加入Boc-Arg-OH(FW310.81)、TBTU、HOBT及接肽試劑，反應，DMF洗滌，獲得Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-CTC樹脂；接肽反應中，Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-CTC樹脂的重量濃度為5～15％，Boc-Arg-OH的摩爾比為CTC樹脂的2～5倍。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所說的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶5～15；接肽試劑中，TBTU的摩爾為原料樹脂的2～5倍，HOBT的摩爾為原料樹脂的2～5倍。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，加入接肽試劑后，15～35℃反應1.0～2小時。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所說的脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶3～5，體積比，加入脫帽試劑后15～35℃反應15～45分鐘。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，切肽包括如下步驟將切肽試劑加入步驟(1)的產物中，15℃～35℃反應1～3小時，加入乙醚沉淀，過濾，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，得粗品；所說的切肽試劑為TFA/H2O/TIS＝760ml/20ml/20ml。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，分離純化包括如下步驟將粗品溶于醋酸銨的水溶液中，過濾，濾液經反相C18或C8柱純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(95∶5)；流速為100ml～650ml/min；檢測波長為275nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后，采用常規(guī)的方法脫鹽，凍干，獲得成品(MW680)，總收率44％(以CTC樹脂的50mmol計)。
8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中CTC樹脂與甲醇的重量比例為CTC樹脂∶甲醇＝1∶5～15；CTC樹脂與脫帽試劑的重量比例為CTC樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；所說的脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶3～5，體積比。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固相多肽合成胸腺五肽的制備方法，包括如下步驟(1)以CTC樹脂(或Wang樹脂)為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt(或HBTU/HOBt)為縮合劑，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc－Arg－OH；將切肽試劑加入步驟(1)的產物進行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)將步驟(2)的粗品采用C18或C8柱進行分離純化，獲得目標產物。本發(fā)明的方法，簡化了工藝，三廢污染少，總收率約為44％，便于工業(yè)化實施。
文檔編號C07K1/04GK1865279SQ20051002592
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月18日 優(yōu)先權日2005年5月18日
發(fā)明者周達明 申請人:周達明