專利名稱：一種天然防腐劑的工業(yè)化純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然防腐劑純化工藝，具體的說涉及乳酸鏈球菌素工業(yè)化純化工藝。
背景技術(shù)：
乳酸鏈球菌素又稱乳球菌肽或乳鏈菌肽，英文名為Nisin，是N型血清的某些乳酸鏈球菌在代謝過程中合成和分泌的具有很強(qiáng)殺菌作用的小肽。Nisin能抑制大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長(zhǎng)和繁殖，如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬的細(xì)菌，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒桿菌作用明顯。另外，Nisin還可以和某些絡(luò)合劑(如EDTA或檸檬酸)等一起作用，可是只有部分革蘭氏陰性菌對(duì)之敏感。Nisin的在食品防腐和化妝品中都有應(yīng)用，但其純度較低。如果要進(jìn)一步藥用就必須解決其純度的問題。
J.Meghrous等研究了Nisin的純化工藝，文章發(fā)表于Journal of AppliedMicrobiology 1997，83，133-138，但是他的純化工藝步驟多，總共需要4步純化，而且純化得率太低，純化總得率僅為3-6％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種乳酸鏈球菌素純化工藝，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的純化得率低的缺陷，滿足有關(guān)下游產(chǎn)品開發(fā)的需要。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)上樣將用預(yù)冷的無菌水稀釋至電導(dǎo)為3～4ms/cm、pH為3.5～4.5的樣品以每小時(shí)200～400厘米的流速通過預(yù)先用緩沖液平衡好層析柱；所說的樣品為含乳酸鏈球菌素(nisin)的乳酸鏈球菌培養(yǎng)上清；所說的層析柱采用的介質(zhì)是顆粒大小為100～300μm的強(qiáng)陽離子瓊脂糖凝膠(由安瑪西亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，商品名為SP Sepharose BigBead)；
(2)清洗用10～50mmol/L pH為3.5～4.5的醋酸緩沖液，以每小時(shí)80～200厘米的流速清洗層析柱，通過紫外檢測(cè)保證層析柱已清洗至基線；(3)洗脫用含0.5～1mol/L氯化鈉的10～15mmol/L pH為3.5～4.5的醋酸緩沖液，以每小時(shí)8～20厘米的流速將多肽從層析柱上洗脫并收集洗脫峰。
上述步驟亦稱為離子交換層析，其中緩沖液平衡層析柱包括如下步驟用15mmol/L pH為4.5的醋酸緩沖液平衡裝有適量體積的SP Sepharose BigBead介質(zhì)的層析柱，以每小時(shí)80～200厘米的流速平衡5～10個(gè)柱體積，通過紫外檢測(cè)保證層析柱已平衡至基線。
上述步驟的活性多肽回收率為75％～85％；純化后樣品的純度可以達(dá)到68.83％，多肽純化倍數(shù)為14以上，此方法的優(yōu)點(diǎn)是處理速度快、處理量大、凝膠載樣量大、濃縮效果好、回收率高及重復(fù)性好等，含一定量的色素。因此按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，還包括如下的反向高效液相色譜的純化步驟(1)樣品預(yù)處理在上述的層析洗脫液中加入等體積的15mmol/L pH為4.5的醋酸緩沖液，使得稀釋后的樣品可以直接上樣；所說的層析洗脫液為離子交換層析過程中洗脫并收集到的洗脫峰所得到的液體。
(2)上樣以每小時(shí)20～60厘米的流速將預(yù)處理后的洗脫液通過預(yù)先用0.1％TFA平衡好的高效液相色譜柱；所說的高效液相色譜柱采用的介質(zhì)是顆粒大小為10μm，孔徑為100A的C18硅膠填料(富士公司提供)；(3)清洗用含有濃度為0.1％TFA的水溶液，以每小時(shí)20～60厘米的流速清洗層析柱，通過紫外檢測(cè)保證層析柱已清洗至基線；(4)洗脫用含有濃度為50％乙腈的0.1％TFA的水溶液，以每小時(shí)20～60厘米的流速將多肽從層析柱上洗脫下來，并收集洗脫峰。
離子交換層析洗脫液通過反向高效液相色譜層析，可以很好的去除色素和其他多肽，產(chǎn)品純度達(dá)到98％以上。
反向高效液相色譜層析的多肽回收率為65％～75％，多肽純化倍數(shù)為3以上；本發(fā)明建立了簡(jiǎn)單快速的方法從含nisin的乳酸鏈球菌培養(yǎng)上清中純化nisin。該方法包括離子交換和反向高效液相色譜層析，處理45升樣品只需2個(gè)工作日，總回收率為50％以上，HPLC結(jié)果顯示純度在98％以上。比所公開的現(xiàn)有技術(shù)得率提高了10倍以上。


圖1為10毫升陽離子交換柱SP Sepharose BigBead層析圖譜。
圖2為SP Sepharose BigBead陽離子交換層析后產(chǎn)品的純度分析結(jié)果。
圖3為C18，100A，10um填料的HPLC層析圖譜。
圖4HPLC純化后產(chǎn)品的純度分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1離子交換層析裝有10ml顆粒大小為100～300μm的強(qiáng)陽離子瓊脂糖凝膠(由安瑪西亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，商品名為SP Sepharose BigBead介質(zhì)的層析柱，層析柱直徑為2.5厘米。
樣品含nisin的乳酸桿菌培養(yǎng)上清100毫升；含85300單位nisin。
層析設(shè)備安瑪西亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的AKTA explorer 100；平衡、清洗緩沖液15mmol/L pH 4.5的醋酸緩沖液；洗脫緩沖液含1mol/L NaCl的15mmol/L pH 4.5的醋酸緩沖液。
平衡用15mmol/L pH為4.5的醋酸緩沖液平衡裝有10毫升體積的SPSepharose BigBead介質(zhì)的層析柱，以每小時(shí)120厘米的流速平衡8個(gè)柱體積，通過紫外檢測(cè)保證層析柱已平衡至基線；樣品預(yù)處理將100毫升樣品(含nisin的乳酸鏈球菌培養(yǎng)上清)用預(yù)冷的無菌水稀釋至電導(dǎo)為3.5ms/cm，并用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.5。
上樣以每小時(shí)300厘米的流速使樣品通過預(yù)先用緩沖液平衡好層析柱。
清洗上樣完，用15mmol/L pH為4.5的醋酸緩沖液，以每小時(shí)150厘米的流速清洗層析柱，通過紫外檢測(cè)保證層析柱已清洗至基線。
洗脫清洗至基線后，用含1mol/L氯化鈉的15mmol/L pH為4.5的醋酸緩沖液，以每小時(shí)15厘米的流速將多肽從層析柱上洗脫下來，并收集洗脫峰10毫升。試驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1 SP Sepharose BigBead純化nisin結(jié)果。圖1中1為280nm波長(zhǎng)下的吸收曲線，2為254nm波長(zhǎng)下的吸收曲線，3為215nm波長(zhǎng)下的吸收曲線，4為洗脫梯度曲線。1，2，3都反映了洗脫液中不同吸收波長(zhǎng)的產(chǎn)品的含量的高低。4反映了不同時(shí)間內(nèi)流過層析柱的洗脫液和平衡緩沖液的比例。
表1SP Sepharose BigBead純化nisin結(jié)果

離子交換層析處理速度快、濃縮效果好，層析規(guī)模很容易放大，多肽活性回收率好；多肽純化倍數(shù)為14以上；多肽純度達(dá)到68.83％；但含一定量的色素。
經(jīng)過SP Sepharose BigBead離子交換純化后樣品的純度可以達(dá)到68.83％，結(jié)果如圖2(經(jīng)過SP Sepharose BigBead陽離子交換層析后產(chǎn)品的純度結(jié)果)及表2(對(duì)圖2的分析結(jié)果)。
表2對(duì)圖2的分析結(jié)果的說明

分析結(jié)果表明，含有nisin的乳酸鏈球菌發(fā)酵液經(jīng)過SP SepharoseBigBead陽離子交換層析后，純度可以達(dá)到68.83％(峰面積的百分比)。
實(shí)施例2
反向HPLC純化所說的高效液相色譜柱采用的介質(zhì)是顆粒大小為10μm，孔徑為100A的C18硅膠填料(富士公司提供)，層析柱直徑為2.5厘米。
樣品在上述的層析洗脫液中加入等體積的15mmol/L pH為4.5的醋酸緩沖液，含nisin 70372.5U；層析設(shè)備Varian公司生產(chǎn)的SD-1；平衡、清洗緩沖液0.1％TFA水溶液；洗脫緩沖液含50％乙腈的0.1％TFA水溶液。
洗脫清洗至基線后，用含50％乙腈的0.1％TFA水溶液，以每小時(shí)250厘米的流速將多肽從層析柱上洗脫下來，并收集洗脫峰。離子交換層析洗脫液通過反向高效液相色譜層析，可以很好的去除色素和其他多肽，產(chǎn)品純度達(dá)到98％以上，多肽回收率為65％～75％，多肽純化倍數(shù)為3以上。試驗(yàn)結(jié)果如表2和圖3經(jīng)過陽離子交換層析后的樣品經(jīng)過反向HPLC純化結(jié)果。
表3經(jīng)過陽離子交換層析后的樣品經(jīng)過反向HPLC純化結(jié)果

離子交換層析洗脫液通過反向高效液相色譜層析，可以很好的去除色素和其他多肽，產(chǎn)品純度達(dá)到98％(峰面積的百分比)以上，如圖4(nisin經(jīng)過反向HPLC層析后純度結(jié)果)及表4(對(duì)圖4的分析結(jié)果)。
表4對(duì)圖4的分析結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種乳酸鏈球菌素工業(yè)化純化工藝，其特征在于，包括如下離子交換層析步驟(1)上樣將電導(dǎo)為3～4ms/cm、pH為3.5～4.5的樣品通過預(yù)先用緩沖液平衡好層析柱；所說的樣品為含乳酸鏈球菌素的乳酸鏈球菌培養(yǎng)上清；所說的層析柱采用的介質(zhì)是顆粒大小為100～300μm的強(qiáng)陽離子瓊脂糖凝膠；(2).清洗用10-50mmol/L pH為3.5～4.5的醋酸緩沖液清洗層析柱；(3)洗脫用含0.5～1mol/L氯化鈉的10～15mmol/L pH為3.5～4.5的醋酸緩沖液，以每小時(shí)8～20厘米的流速將多肽從層析柱上洗脫并收集洗脫峰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化工藝，其特征在于，緩沖液平衡層析柱包括如下步驟用15mmol/L pH為4.5的醋酸緩沖液平衡裝有適量體積的SP SepharoseBigBead介質(zhì)的層析柱，以每小時(shí)80～200厘米的流速平衡5～10個(gè)柱體積，通過紫外檢測(cè)保證層析柱已平衡至基線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化工藝，其特征在于，將電導(dǎo)為3～4ms/cm、pH為3.5～4.5的樣品以每小時(shí)200～400厘米的流速通過預(yù)先用緩沖液平衡好層析柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化工藝，其特征在于，步驟(2)中，用醋酸緩沖液，以每小時(shí)80～200厘米的流速清洗層析柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化工藝，其特征在于，步驟(3)中，用醋酸緩沖液，以每小時(shí)8～20厘米的流速將多肽從層析柱上洗脫并收集洗脫峰。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一所述的純化工藝，其特征在于，還包括如下的反向高效液相色譜的純化步驟(1)樣品預(yù)處理在層析洗脫液中加入等體積的15mmol/L pH為4.5的醋酸緩沖液，使得稀釋后的樣品可以直接上樣；所說的層析洗脫液為離子交換層析過程中洗脫并收集到的洗脫峰所得到的液體；(2)上樣將預(yù)處理后的洗脫液通過預(yù)先用0.1％TFA平衡好的高效液相色譜柱；所說的高效液相色譜柱采用的介質(zhì)是顆粒大小為10μm，孔徑為100A的C18硅膠填料；(3)清洗用含有濃度為0.1％TFA的水溶液，以每小時(shí)20～60厘米的流速清洗層析柱；(4)洗脫用含有濃度為50％乙腈的0.1％TFA的水溶液，以每小時(shí)20～60厘米的流速將多肽從層析柱上洗脫下來，并收集洗脫峰。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化工藝，其特征在于，步驟(2)中洗脫液通過的流速為每小時(shí)20～60厘米。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳酸鏈球菌素工業(yè)化純化工藝，建立了簡(jiǎn)單快速的方法從含乳酸鏈球菌素的乳酸鏈球菌培養(yǎng)上清中純化乳酸鏈球菌素。該方法包括離子交換和反向高效液相色譜層析，處理45升樣品只需2個(gè)工作日，總回收率為50％以上，HPLC結(jié)果顯示純度在98％以上。得率提高了10倍以上。
文檔編號(hào)C07K2/00GK1876674SQ20051002651
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2005年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月7日
發(fā)明者黃青山, 李國棟 申請(qǐng)人:上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司