專利名稱：一種人腫瘤壞死因子TNF－α突變體的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種人腫瘤壞死因子TNF-α突變體序列，及其生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的表達載體與工程細胞的構(gòu)建、重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的表達和純化工藝。
背景技術(shù)：
人腫瘤壞死因子α(human tumornecrosis factor-α，hTNF-α)，又稱惡液質(zhì)素，主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，是殺傷腫瘤細胞活性最強的一種細胞因子。
人的TNF-α基因長約2.76kb，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，人TNF-α前體由233個氨基酸殘基組成，含76個氨基酸殘基的信號肽，切除信號肽后成熟型TNF-α為157氨基酸殘基，分子量為17kDa，非糖基化蛋白，第69位和101位兩個半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。TNE-α發(fā)揮生物學效應(yīng)的天然形式是同源的三聚體。
TNF-α在免疫和非免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，具有抗感染、抗腫瘤、調(diào)節(jié)睡眠和促進發(fā)育等作用，其中最引人注目的是，它能特異性的殺死腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞增殖，而不損傷正常細胞，可能是至今所知抗癌劑中作用最強的。尤其是在和干擾素等其它抗腫瘤細胞因子合用時，能發(fā)揮出更好的效果，因此，TNF-α是有希望的天然抗癌因子之一。而且它還可刺激其他細胞因子合成。
然而目前國內(nèi)外普遍使用的是用大腸桿菌生產(chǎn)的基因工程重組產(chǎn)品，由于大腸桿菌含有內(nèi)毒素，而且重組蛋白往往形成包涵體，下游工藝復雜，成本較高而其活性往往偏低。
本發(fā)明系統(tǒng)提供了一種高效生產(chǎn)重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的方法。通過優(yōu)化編碼重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的核苷酸序列，采用新型畢赤酵母表達體系胞內(nèi)表達人腫瘤壞死因子TNF-α突變體，通過優(yōu)化改進發(fā)酵工藝，提高重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的表達水平，同時簡便純化工藝，獲得高表達、高得率、高活性、極具產(chǎn)業(yè)化價值的重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效簡便的生產(chǎn)重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的方法。
本發(fā)明的另一目的就是提供重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的編碼序列以及用于該方法的表達載體及工程細胞。
在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種優(yōu)化的編碼重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ IDNO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達載體，含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體是pPIC9K/nhTNF-α。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細胞，其特征在于，整合有權(quán)利要求3所述的表達載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的工程細胞是畢赤酵母(Pichia Pastoris)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母宿主細胞的基因組中整合有2-30拷貝的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體基因編碼序列。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母工程細胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的方法，該方法包括步驟a)在適合的表達條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求3所述的宿主細胞，從而胞內(nèi)表達出人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白；較佳地，所述的宿主細胞是畢赤酵母。
b)分離純化出表達的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟(a)的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)分為培養(yǎng)階段和誘導階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達到OD600為40-200，誘導時間為12-100hr，發(fā)酵及誘導溫度保持在25-32℃，微量元素的量為0.1-2ml/L，誘導期的pH值為3-10，誘導期甲醇濃度控制在0.1-5％。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，誘導過程還可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白胨(peptone)、胰蛋白胨(Tryptone)、精氨酸等作為保護劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟(b)包括步驟(i)對發(fā)酵菌體超聲或高壓破碎后，離心獲得上清；(ii)通過鹽析和/或超濾進行初步純化后，或直接層析純化，所述的層析選自陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析、及其組合。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，菌體破碎后上清經(jīng)SP Sepharose陽離子交換柱以及Q Sepharose陰離子交換柱以后得到純度大于95％、得率在50％以上的純品。


圖1是pPIC9k/nhTNF-α表達質(zhì)粒的構(gòu)建路線圖。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，通過基因編碼序列的優(yōu)化設(shè)計，將優(yōu)化后的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體編碼序列(SEQ ID NO1)轉(zhuǎn)入甲醇利用型畢赤酵母(P.pastoris)，從而實現(xiàn)了人腫瘤壞死因子TNF-α突變體高效表達，并且優(yōu)化了發(fā)酵與純化工藝。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明根據(jù)人腫瘤壞死因子TNF-α天然成熟肽序列，對其進行改造，N端缺失7個氨基酸，將Pro8Ser9Asp10換成ArgLysArg，將C末端157位的Leu換成Phe，突變后氨基酸序列見SEQ ID NO2，然后按密碼子偏愛性，在不改變氨基酸序列的條件下，全基因合成重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的編碼序列，將該基因克隆到pUC19中測序驗證后，用分子克隆的常規(guī)方法，克隆入表達載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化、整合入P.pastoris宿主細胞染色體，通過施加抗生素篩選出多拷貝整合的轉(zhuǎn)化細胞，進而篩選出高表達工程細胞。搖瓶試驗表明，誘導24小時后，表達蛋白占總蛋白30％以上，表達水平1g/L以上。根據(jù)其消耗甲醇的速度，判斷此工程細胞株為Mut+。
在獲得工程細胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細胞。在本發(fā)明中，工程菌表達的重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體發(fā)酵條件沒有特別限制。可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件。例如，合適的培養(yǎng)基包括(但不限于)以下組成(1)氮源含有機氮源和無機氮源，其中有機氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無機氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(2)無機鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩沖體系濃度20-200mM，pH5-10；Mg2+鹽0-5mM。
(3)在培養(yǎng)基中添加維生素B1作為補充維生素，濃度1～1000PPM。
(4)根據(jù)M9培養(yǎng)基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(5)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等?？梢允菃我惶荚?，也可以是混合碳源。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-3％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-1.5％。
為大規(guī)模獲得重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體，需要在發(fā)酵罐中進行表達培養(yǎng)。本發(fā)明研究了中試發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的表達水平達到10g/L在發(fā)酵表達后，對表達的重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白進行分離。通常，發(fā)酵樣品先以離心方式獲得菌體。然后超聲破碎，離心獲得上清，然后進行初步純化和層析包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
經(jīng)不同層析過程比較，優(yōu)化的純化方法包括1.對發(fā)酵菌體通過超聲和/或高壓方式破菌后，離心獲得上清；2.通過超濾進行初步純化后，或直接通過陰陽離子交換層析方法，從而得到純度達到95％的純品。
純品純度95％以上，得率約4g/L發(fā)酵液。
用MTT法對純品的細胞毒活性進行了檢測，以50％細胞死亡為1IU，其比活性約6.8X107IU/mg。
純化后重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體可用常規(guī)技術(shù)制成各種劑型。
在本發(fā)明的一個實例中，構(gòu)建了生產(chǎn)重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的P.pastoris酵母表達工程細胞，甲醇誘導，胞內(nèi)高水平表達。
在本發(fā)明的另一個實例中，經(jīng)過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，進一步提高了重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的表達量。
在本發(fā)明的另一個實例中，通過優(yōu)化純化工藝，純化后可得到純品4g/L。
純化后原液加入適當輔料，制成重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的注射用粉針劑。初步穩(wěn)定性試驗表明，該粉針劑穩(wěn)定。
中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液可獲得重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體純品4g，比活約5×107IU/mg。適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)優(yōu)化后的重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白基因非常適合在畢赤酵母中表達，具有高表達、高穩(wěn)定的特點。
(2)通過控制關(guān)鍵的發(fā)酵工藝條件，使表達水平達到10g/L。
(3)優(yōu)化了純化工藝，回收率高。由于簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使得大規(guī)模生產(chǎn)重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體成為可能。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1表達質(zhì)粒的構(gòu)建和高表達工程菌株的獲得根據(jù)人腫瘤壞死因子TNF-α天然成熟肽氨基酸序列，對其進行改造，N端缺失7個氨基酸，將Pro8Ser9Asp10換成ArgLysArg，將C末端157位的Leu換成Phe，突變后氨基酸序列見SEQ ID NO2，按密碼子偏愛性，在不改變氨基酸序列的條件下，全基因合成編碼人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白的目的基因序列，將該基因序列克隆到pUC19中并測序驗證。
表達載體構(gòu)建方法見圖1。通過PCR擴增得到目的人腫瘤壞死因子TNF-α基因，用BamHI+EcoRI雙酶切(MBI，2*TangoTM，37℃)PCR產(chǎn)物及pPIC9k質(zhì)粒(購自Invitrogen公司)。將兩個片段用T4DNA連接酶進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌DH5α(購自Promega公司)，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選克隆，小量制備質(zhì)粒，通過雙酶切/PCR鑒定篩選出陽性克隆，再經(jīng)測序驗證。獲得含有人腫瘤壞死因子TNF-α的重組質(zhì)粒pPIC9K/hTNF-α(人腫瘤壞死因子α)。
表達質(zhì)粒pPIC9K/hTNF-α經(jīng)測序驗證后，用Sal I酶切線性化，電穿孔法轉(zhuǎn)化進入畢赤酵母GS115(購自Promega公司)，涂于MD平板上于30℃培養(yǎng)至有轉(zhuǎn)化子長出，再用點種法鑒定酵母轉(zhuǎn)化子的G418抗性。依次用含G418濃度為1、2、3、4mg/mL的平板篩選高G418抗性轉(zhuǎn)化子，并進行小搖表達篩選得到TNF-α高表達的工程酵母菌株。根據(jù)其消耗甲醇的速度，判斷此工程細胞株為Mut+。
實施例2不同誘導時間對表達水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶10的比例二級接種于50ml培養(yǎng)基的500ml三角燒瓶中(每個條件有副管)，培養(yǎng)24hr左右，1％甲醇誘導，每隔12小時取樣，同時測定OD。共誘導120hr。誘導前、誘導不同時間樣品檢測SDS-PAGE。
實驗結(jié)果表明在搖瓶水平表達TNF-α的最佳誘導時間在24-96hr之間，最佳誘導時間在36-72hr。
實施例3誘導階段添加不同蛋白保護劑對表達水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶10的比例二級接種于250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)4~8hr左右，上罐發(fā)酵，pH 5.0、溫度20℃、D0＞35％，待溶氧上升后以10~15轉(zhuǎn)度流加50％甘油。待甘油耗盡，溶氧再次上升后用100％甲醇以轉(zhuǎn)速1開始誘導，逐漸提速。誘導階段將濃度為10％的CA、Peptone和Tryptone各300ml流加入罐(5L發(fā)酵罐，發(fā)酵上清3L)，誘導48hr結(jié)束。樣品檢測SDS-PAGE和蛋白含量以確定誘導階段的最佳蛋白保護劑。
實施例4重組人腫瘤壞死因子TNF-α突變體純化將高表達菌株擴大體積進行培養(yǎng)并誘導48h，4℃下5000rpm離心10分鐘，獲得發(fā)酵菌體，對菌體超聲破碎，離心所得含有表達產(chǎn)物的上清液先經(jīng)過SPSepharose FF陽離子交換柱，然后再上Q Sepharose FF陰離子交換柱，以鹽濃度梯度的緩沖液洗脫，收集目的蛋白的洗脫峰。
經(jīng)過以上純化工藝，最后可得蛋白純品4g/L，純度95％以上。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>一種人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的生產(chǎn)方法<160>2<210>1<211>453<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)…(453)<223>優(yōu)化的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體基因<400>1atgagaaaaa gaaagcctgt agcccatgtt gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc 60cagtggctga accgccgggc caatgccctc ctggccaatg gcgtggagct gagagataac120cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc180caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc acccacacca tcagccgcat cgccgtctcc240taccagacca aggtcaacct cctctctgcc atcaagagcc cctgccagag ggagacccca300gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag cccatctatc tgggaggggt cttccagctg360gagaagggtg accgactcag cgctgagatc aatcggcccg actatctcga ctttgccgag420tctgggcagg tctactttgg tatcattgcc ttc 453<210>2<211>151<212>PRT<213>智人
<400>2Met Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro15 10Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn15 20 25Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu30 35 40Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val45 50 55Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu60 65 70Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys7 80Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu85 90 95Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile100 105 110Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu115 120 125Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu130 135 140Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Phe145 150 15權(quán)利要求
1.一種人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.一種表達載體，其特征在于，所述的表達載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
3.一種工程細胞，其特征在于，它整合有權(quán)利要求2所述的表達載體。
4.如權(quán)利要求3所述的工程細胞，其特征在于，它是畢赤酵母。
5.一種生產(chǎn)人腫瘤壞死因子TNF-α突變體的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)在適合的表達條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求3所述的工程細胞，從而表達出人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白；(b)分離純化出表達的人腫瘤壞死因子TNF-α突變體蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(a)所示的表達條件為誘導時間為12-120小時，較佳的為24-100小時；誘導pH為3-10，較佳的為5-7。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(b)所示的表達條件為(1).發(fā)酵菌體超聲破碎或壓榨后離心，獲得含有目的蛋白的上清液；(2).通過簡單的離子交換層析等簡單步驟，即可獲得純度在95％以上的純品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人腫瘤壞死因子TNF－α突變體的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的表達載體與工程細胞構(gòu)建、表達和純化的工藝。優(yōu)化后的人腫瘤壞死因子TNF－α突變體蛋白基因非常適合在畢赤酵母中表達，同時通過發(fā)酵與純化工藝優(yōu)化，提高了表達量和純化得率，具有表達高、穩(wěn)定性好，生產(chǎn)工藝簡便的優(yōu)點。本發(fā)明可高效、簡便、低成本的獲得人腫瘤壞死因子TNF－α突變體。
文檔編號C07K14/525GK1876817SQ20051002665
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月10日
發(fā)明者孫九如, 任軍, 黃陽濱, 豐濤, 蔣劍 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司