專利名稱：禽霍亂凝集抗原的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物活性物質(zhì)的制備方法，具體地說，是一種禽霍亂凝集抗原的制備方法。用于生物工程領域。
背景技術：
目前，禽霍亂的預防均采用疫苗進行預防接種。對雞群免疫水平的檢測一般采用凝集試驗，包括試管凝聚、平板凝聚和微量板凝聚，采用的抗原均為巴氏桿菌滅活抗原，該抗原敏感性較差。多殺性巴氏桿菌CVCC458是《中國菌種目錄》在編菌種(英文版，1992年10月機械工業(yè)出版社出版，中國微生物菌種保藏管理委員會編著)，中國獸醫(yī)微生物保藏中心作為中國微生物菌種保藏管理委員會下設機構保證常年為國內(nèi)外教學、科研、生產(chǎn)單位提供《中國菌種目錄》中的微生物，列入《中國菌種目錄》的微生物將長期保存，一直對外供應，公眾能從中國獸醫(yī)微生物保藏中心買到的微生物菌種(CVCC中國獸醫(yī)微生物保藏中心，該中心20多年來為生產(chǎn)、科研、教學提供了6萬多株各類獸醫(yī)微生物菌種)。多殺性巴氏桿菌是禽霍亂的病源，能引起感染禽的急性死亡，死亡率可達100％。CVCC458是列入《中國菌種目錄》的微生物，1987年從發(fā)病雞中分離，血清型A組。
經(jīng)對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，在白文斌等人主編的中國農(nóng)業(yè)出版社2002年12月出版的《動物傳染病診斷學》的第六章、第三節(jié)(第305-307頁)中，有關凝集抗原制備方法中描述，菌種選用標準型，在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時，收集菌體用1％甲醛滅活，洗滌后按McFarland比濁法，將菌液用PBS稀釋至第一管的濁度，即可用作凝集試驗的抗原。其不足之處是巴氏桿菌免疫后抗體的檢測因用常規(guī)法制備的凝集抗原敏感性差，穩(wěn)定性不強，一般不被采用，常用沉淀試驗進行檢測，但該法敏感性也不強，檢測結果滯后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種禽霍亂凝集抗原的制備方法，使其制備出穩(wěn)定性好、特異性強、敏感性高的禽霍亂凝集抗原。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明具體步驟如下1)將禽多殺性巴氏桿菌CVCC458復蘇后連續(xù)3次傳代接種11日齡雞胚，分離鑒定細菌；2)將菌種接種于改良馬丁肉湯培養(yǎng)液中，懸浮振蕩培養(yǎng)無雜菌后，按菌液總量0.5％加入福爾馬林，37℃振蕩處理24小時進行滅活，無菌檢驗后，將菌液用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)洗菌體2次；3)將菌體進行酸處理用PBS(pH5.8)或鹽酸生理鹽水稀釋成300億菌/ml的懸液，37℃水浴30分鐘，中間輕搖數(shù)次，離心棄上清，用PBS(pH7.0)洗菌體2次，以生理鹽水(pH7.0)配成含120億菌/ml；4)將上述酸處理菌體進行乙二胺四乙酸鹽(EDTA)處理每100ml酸化菌體懸液中加入EDTA 1mg，37℃水浴15分鐘，離心洗菌體2次，用生理鹽水配成含60億菌/ml懸液，即為禽霍亂凝集抗原。
禽霍亂凝聚抗原經(jīng)酸處理后，其表面游離蛋白被洗滌，與抗體結合的位點充分暴露，易于特異性的抗體結合，使其敏感性提高。而EDTA是一種無機物的螯合物，酸化抗原經(jīng)其處理后則可將液體中雜離子經(jīng)過絡合形式予以去除，使抗原呈單個存在，穩(wěn)定性提高，防止了抗原發(fā)生自凝。
本發(fā)明采用多殺性巴氏桿菌菌株，經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后滅活處理，經(jīng)酸處理和乙二胺四乙酸鹽(EDTA)處理后，制備成禽霍亂凝集抗原。制備的禽霍亂凝集原具有高度的特異性、敏感性和穩(wěn)定性；適用于平板凝集、試管凝集與微量板凝集試驗，使測定雞群禽霍亂抗體水平結果準確可靠，為臨床合理制定禽霍亂的免疫程序提供依據(jù)。
具體實施例方式
實施例1將禽多殺性巴氏桿菌CVCC458復蘇后連續(xù)3次傳代接種11日齡雞胚，分離鑒定細菌作為菌種。將細菌接種于改良馬丁肉湯培養(yǎng)液中，懸浮振蕩培養(yǎng)24小時，鏡檢無雜菌后，按菌液總量0.5％加入福爾馬林，37℃振蕩處理24小時進行滅活，無菌檢驗后，將菌液以3000rpm離心10分鐘，棄上清用PBS(pH7.0)洗菌體2次?？乖乃崽幚碛肞BS(pH5.8)，將上述菌體抗原稀釋成300億菌/ml的懸液，37℃水浴30分鐘，中間輕搖數(shù)次，3000rpm離心10分鐘，棄上清，用PBS(pH7.0)洗菌體2次，以生理鹽水(pH7.0)配成含120億菌/ml備用。抗原的EDTA處理每100ml酸化抗原懸液中加入EDTA 1mg，37℃水浴15分鐘，3000rpm離心10分鐘，洗菌體2次，用生理鹽水配成含60億菌/ml懸液，即為禽霍亂凝集抗原。
制備的禽霍亂凝集原穩(wěn)定性好，敏感性高，用于平板凝集試驗或微量板凝集試驗檢測血清中的禽霍亂抗體，其檢測抗體滴度比常規(guī)制備的禽霍亂凝集抗原測定的結果要高2個以上(log2)。
實施例2將禽多殺性巴氏桿菌接種于改良馬丁肉湯培養(yǎng)液中，懸浮振蕩培養(yǎng)24小時，鏡檢無雜菌后，按菌液總量0.5％加入福爾馬林，37℃振蕩處理24小時進行滅活，無菌檢驗后，將菌液以3000rpm離心10分鐘，棄上清用PBS(pH7.0)洗菌體2次?？乖乃崽幚碛胮H5.8的鹽酸生理鹽水進行處理，將上述菌體抗原稀釋成300億菌/ml的懸液，37℃水浴30分鐘，中間輕搖數(shù)次，3000rpm離心10分鐘，棄上清，用PBS(pH7.0)洗菌體2次，以生理鹽水(pH7.0)配成含120億菌/ml備用。抗原的EDTA處理每100ml酸化抗原懸液中加入EDTA 1mg，37℃水浴15分鐘，3000rpm離心10分鐘，洗菌體2次，用生理鹽水配成含60億菌/ml懸液，即為禽霍亂凝集抗原。
制備的禽霍亂凝集原具有高度的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。制備方法簡便，適用于平板凝集、試管凝集與微量板凝集試驗。
權利要求
1.一種禽霍亂凝集抗原的制備方法，其特征在于，具體步驟如下1)將禽多殺性巴氏桿菌CVCC458復蘇后連續(xù)傳代接種雞胚，分離鑒定細菌；2)將菌種接種于改良馬丁肉湯培養(yǎng)液中，懸浮振蕩培養(yǎng)無雜菌后，加入福爾馬林，振蕩處理進行滅活，無菌檢驗后，將菌液用磷酸鹽緩沖液洗菌體；3)將菌體進行酸處理，用磷酸鹽緩沖液或鹽酸生理鹽水稀釋成懸液，水浴，水浴中間輕搖數(shù)次，離心棄上清，用磷酸鹽緩沖液洗菌體，以生理鹽水配成懸液；4)將上述酸處理菌體進行乙二胺四乙酸鹽處理，用生理鹽水配成懸液，即為禽霍亂凝集抗原。
2.根據(jù)權利要求1所述的禽霍亂凝集抗原的制備方法，其特征是，所述的步驟1)中，復蘇后3次連續(xù)傳代接種11日齡雞胚。
3.根據(jù)權利要求1所述的禽霍亂凝集抗原的制備方法，其特征是，所述的步驟2)中，按菌液總量0.5％加入福爾馬林，37℃振蕩處理24小時進行滅活，pH為7.0的磷酸鹽緩沖液洗菌體2次。
4.根據(jù)權利要求1所述的禽霍亂凝集抗原的制備方法，其特征是，所述的步驟3)中，用pH為5.8的磷酸鹽緩沖液或鹽酸生理鹽水稀釋成300億菌/ml的懸液，37℃水浴30分鐘，用pH為7.0的磷酸鹽緩沖液洗菌體2次，以pH為7.0的生理鹽水配成含120億菌/ml懸液。
5.根據(jù)權利要求1所述的禽霍亂凝集抗原的制備方法，其特征是，所述的步驟4)中，每100ml酸化菌體懸液中加入乙二胺四乙酸鹽1mg，37℃水浴15分鐘，離心洗菌體2次，用生理鹽水配成含60億菌/ml懸液，即為禽霍亂凝集抗原。
全文摘要
一種用于生物工程領域的禽霍亂凝集抗原的制備方法，本發(fā)明步驟如下1)將禽多殺性巴氏桿菌CVCC458復蘇后連續(xù)傳代接種雞胚，分離鑒定細菌作菌種；2)將菌種接種于改良馬丁肉湯培養(yǎng)液中，懸浮振蕩培養(yǎng)無雜菌后，加入福爾馬林，振蕩處理進行滅活，無菌檢驗后，將菌液用磷酸鹽緩沖液洗菌體；3)將菌體進行酸處理，用磷酸鹽緩沖液或鹽酸生理鹽水稀釋成懸液，水浴，水浴中間輕搖數(shù)次，離心棄上清，用磷酸鹽緩沖液洗菌體，以生理鹽水配成懸液；4)將上述酸處理菌體進行乙二胺四乙酸鹽處理，用生理鹽水配成懸液，即為禽霍亂凝集抗原。本發(fā)明制備的禽霍亂凝集原具有高度的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，方法簡便，適用于平板凝集、試管凝集與微量板凝集試驗。
文檔編號C07K14/285GK1724070SQ20051002733
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月30日 優(yōu)先權日2005年6月30日
發(fā)明者劉永德, 汪毅, 葉陳梁, 吳祖立 申請人:上海交通大學