專利名稱：抗人骨生成誘導(dǎo)因子單克隆抗體及其制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種單克隆抗體，更具體的，本發(fā)明涉及一種抗人骨生成誘導(dǎo)因子單克隆抗體及其制備方法和藥物組合物。
背景技術(shù)：
骨生成誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor OIF)，又稱Osteoglycin或Mimecan，是一種分泌蛋白，最早是從牛的骨基質(zhì)中分離出的一12kDa的蛋白質(zhì)(Bentz H等，J Biol Chem 1989；264(34)20805-10)，通過氨基酸測序，獲得了其氨基酸序列(Bentz H等，J Biol Chem 1990；265(9)5024-9)。隨后人們從成骨細(xì)胞的cDNA文庫中克隆到人的OIF基因(Madisen L等，DNA Cell Biol1990；9(5)303-9)，但未公開發(fā)表其cDNA序列。人的OIF基因編碼一298個氨基酸的分泌蛋白前肽，與牛的OIF同源性達(dá)86％，其第1-19位為信號肽結(jié)構(gòu)，20-193位為前肽，成熟區(qū)在194-298位，由105個氨基酸殘基組成；在124-260位有6個重復(fù)的亮氨酸富集區(qū)；在255和280位為二硫鍵位點，214和258位有兩個糖基化位點(Swissport號p20774)。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，在牛的角膜等結(jié)締組織中，OIF表達(dá)較高，其成熟蛋白由羧基端233個氨基酸組成，分子量為25kDa。該成熟蛋白與硫酸角質(zhì)素結(jié)合，是角膜基質(zhì)的組成成份；而在非結(jié)締組織內(nèi)該蛋白主要以非糖基化形式存在，以12kDa的成熟蛋白為主。Northern分析發(fā)現(xiàn)，OIF在小鼠的肺、骨骼肌、睪丸中表達(dá)，而腦、肝、平滑肌、胰腺中不表達(dá)(Ujita M等，Gene 1995；158(2)237-40)。除了翻譯后蛋白質(zhì)有不同的水解和加工過程外，最近人們在牛的組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)因不同的剪接或Poly A位點不同形成的多種OIF異形體，但在這些不同長度的OIF基因異形體中，其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)卻完全相同，而且該基因在不同物種之間，結(jié)構(gòu)也是高度保守的，這提示OIF蛋白在生物體內(nèi)具有重要的功能。以前的研究發(fā)現(xiàn)，將OIF和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)或TGFβ2一起注入小鼠的皮下，可在注射部位引起異位骨形成，體外研究發(fā)現(xiàn)，OIF可抑制破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的形成及破骨細(xì)胞的活性。但最近在OIF基因剔除的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，剔除后的小鼠能正常發(fā)育，不影響小鼠的生育。與野生型小鼠相比，其骨骼發(fā)育無明顯異常。提示OIF在骨代謝調(diào)節(jié)中可能不起重要的作用。在OIF基因剔除的小鼠，僅發(fā)現(xiàn)角膜和皮膚的膠原纖維的直徑增粗，皮膚的抗張力的能力下降。那么，作為重要的分泌蛋白，OIF在人體的生理過程中發(fā)揮什么樣的作用是值得深入研究的課題。與此同時，國際上一些研究組對OIF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行了深入的研究，2002年Tasheva對OIF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進行了研究，發(fā)現(xiàn)在OIF基因上游296bp，含有3個起始元件，一個E盒(E-box)和Oct-1、NF-nB、金屬反應(yīng)元件(MRE)結(jié)合位點，而在該基因的第一個內(nèi)含子中，含有該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的增強子和沉默子序列(Tasheva ES等，Biochim Biophys Acta 2001；1517(3)333-8)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在OIF基因第一個內(nèi)含子區(qū)含有P53基因的結(jié)合位點，而且P53可以增強OIF基因的轉(zhuǎn)錄活性(Ren-ming Hu等，Proc Natl Acad Sci USA.2000；979543-9548)。最近，人們發(fā)現(xiàn)OIF啟動子區(qū)域含有紫外線反應(yīng)元件，其表達(dá)受UV的調(diào)控(Tasheva ES等，Molecular Vision 2003；91-9)。
本發(fā)明人用大規(guī)模EST技術(shù)對垂體基因表達(dá)譜進行研究時，發(fā)現(xiàn)了一個與牛OIF基因有高度同源性的克隆，并通過生物信息學(xué)手段，結(jié)合RACE PCR技術(shù)，從垂體中克隆到人OIF的全長cDNA序列，并首次在GenBank中公布(GenBank登錄號為AF100758)(Ren-ming Hu，Ze-guang Han，Huai-dong Song等，Proc NatlAcad Sci USA.2000；979543-9548)。但是，目前現(xiàn)有技術(shù)中還沒有人獲得抗人OIF的特異性的單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種OIF抗原特異性的單克隆抗體。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種免疫球蛋白，它特異性地結(jié)合于人骨生成誘導(dǎo)因子蛋白。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的人骨生成誘導(dǎo)因子蛋白具有GenBank登錄號AF100758所示的序列。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的OIF抗原特異性的單克隆抗體是單克隆抗體，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409所產(chǎn)生。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物含有特異性地結(jié)合于骨生成誘導(dǎo)因子蛋白的免疫球蛋白和選自下組的偶聯(lián)部分藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、酶。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，它是小鼠雜交瘤細(xì)胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測腫瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血壓或高血脂的試劑盒，它含有所述的免疫球蛋白或所述的免疫偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的腫瘤選自垂體瘤、肺癌、腎上腺腫瘤、皮質(zhì)或髓質(zhì)腫瘤。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有所述的免疫球蛋白或所述的免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種抗人骨生成誘導(dǎo)因子蛋白的單克隆抗體在制備檢測腫瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血壓或高血脂的試劑中的應(yīng)用。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，所述的抗人骨生成誘導(dǎo)因子蛋白的單克隆抗體由小鼠雜交瘤細(xì)胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409所產(chǎn)生。


圖1顯示了OIF的Northern印跡分析結(jié)果，其中，1為腎上腺，2為下丘腦，3為腦，4為肝臟，5為心臟，6為腎臟，7為肺，8為垂體，9為脂肪的Northern印跡。結(jié)果顯示，在肺、脂肪、腎上腺表達(dá)較高，垂體和心臟有表達(dá)。
圖2通過原位雜交和免疫組化證實OIF在垂體組織的表達(dá)情況。其中，A和B表示垂體OIF基因原位雜交結(jié)果，A為用地高辛(DIG)標(biāo)記OIF mRNA反義鏈，OIF主要表達(dá)在垂體前葉(箭頭所示的為陽性細(xì)胞)；B為用DIG標(biāo)記OIF基因的正義鏈，作為陰性對照，在垂體前葉無陽性雜交信號；C為人垂體OIF免疫組化檢測結(jié)果，箭頭所指處為免疫組化陽性細(xì)胞；D為相鄰切面用HE染色結(jié)果。
圖3顯示了OIF的調(diào)控區(qū)序列，在其上游有兩個垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，加下劃線部位為Pit-1反應(yīng)元件。
圖4通過Gel shift分析顯示OIF上兩個Pit-1反應(yīng)元件可與體外翻譯的Pit-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。其中，泳道1、2、3和泳道4、5、6分別為OIF啟動子區(qū)域兩個不同的Pit-1反應(yīng)元件探針，1、4泳道為不加Pit-1體外翻譯蛋白，只加標(biāo)記探針；2、5泳道為即有標(biāo)記的特異探針，又有體外翻譯的Pit-1蛋白，箭頭所示為與Pit-1轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的條帶；3、6泳道用非標(biāo)記的特異探針競爭抑制標(biāo)記探針與Pit-1特異結(jié)合后的結(jié)果；泳道7是用標(biāo)記的非Pit-1反應(yīng)元件探針與Pit-1轉(zhuǎn)錄因子體外翻譯產(chǎn)物反應(yīng)，無特異性結(jié)合條帶。
圖5顯示了本發(fā)明中使用的人mimecan啟動子/熒光素酶受體構(gòu)造的示意圖，指示了用于啟動子/受體構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和引物的位置。Hm-1350表示轉(zhuǎn)錄起始位點上游1350個堿基，Hm-789表示轉(zhuǎn)錄起始位點上游789個堿基，Hm-468表示轉(zhuǎn)錄起始位點上游468個堿基，Hm1072表示轉(zhuǎn)錄起始位點下游1072個堿基。
圖6顯示了在SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)，垂體特異表達(dá)Pit-1轉(zhuǎn)錄因子增強OIF報告基因的轉(zhuǎn)錄活性。P-1350/1072表示構(gòu)建從轉(zhuǎn)錄起始位點上游1350個堿基到表示轉(zhuǎn)錄起始位點下游1072個堿基這段轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，含兩個Pit1。P-789/1072表示構(gòu)建從轉(zhuǎn)錄起始位點上游789個堿基到表示轉(zhuǎn)錄起始位點下游1072個堿基這段轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，含一個Pit1。P-468/1072表示構(gòu)建從轉(zhuǎn)錄起始位點上游468個堿基到表示轉(zhuǎn)錄起始位點下游1072個堿基這段轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，不含Pit1。
圖7通過原位雜交證實OIF僅表達(dá)在腎上腺髓質(zhì)，皮質(zhì)不表達(dá)。
圖8顯示了OIF在組織中表達(dá)的電泳圖，其中，泳道1、2為正常和應(yīng)激后的脂肪組織，泳道3、4為正常和應(yīng)激后的腎上腺組織。燙傷應(yīng)激后腎上腺OIF表達(dá)下降，而脂肪組織OIF表達(dá)不變。
圖9顯示了ACTH和地塞米松對OIF表達(dá)的影響。其中，a靜脈注射ACTH后，腎上腺OIF表達(dá)明顯下降，N為注射生理鹽水小鼠的腎上腺組織，A為注射ACTH小鼠的腎上腺組織。b注射地塞米松對小鼠腎上腺組織OIF表達(dá)無影響，N為注射生理鹽水小鼠的腎上腺組織，D40、D80、D160非別為注射40mg、80mg和160mg小鼠的腎上腺組織。c圖、d圖注射地塞米松和ACTH對小鼠脂肪和肺組織OIF的表達(dá)無影響；c圖為注射地塞米松和ACTH后對脂肪組織OIF表達(dá)影響的結(jié)果；d圖為注射地塞米松和ACTH后對小鼠肺組織OIF表達(dá)影響的結(jié)果。
圖10顯示了用ELSA法檢測單抗的特異性。
圖11顯示了本發(fā)明的抗體的親和純化。其中，M蛋白分子量Marker；1偶聯(lián)在Chitin beads上的OIF-CBD蛋白；2OIF單抗腹水；3洗脫過后Chitinbeads上的OIF-CBD蛋白；4純化的OIF單抗(箭頭由上至下分別為IgM重鏈約75kDa，IgM輕鏈約25kDa)。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從垂體中克隆到了人OIF的全長cDNA序列(已公布于GenBank，GenBank登錄號AF100758)。本發(fā)明人的進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，OIF基因在多種組織器官中有不同的表達(dá)，并且在不同的疾病中有也表達(dá)各異，可以作為鑒別疾病的良好標(biāo)志。尤其是OIF在垂體瘤中有特異性表達(dá)，因此OIF將可作為垂體瘤的病理分型和臨床診斷的新的標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明人采用Northern印跡研究發(fā)現(xiàn)，OIF基因在小鼠肺、脂肪、腎上腺等組織表達(dá)較高，垂體中也有表達(dá)(圖1)。原位雜交和免疫組化均證實其在垂體細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)(圖2)。
本發(fā)明人用PCR技術(shù)克隆了人OIF的啟動子區(qū)域3.5kb DNA序列，發(fā)現(xiàn)在其第二個轉(zhuǎn)錄起始位點上游700-1000bp的范圍內(nèi)有兩個Pit-1反應(yīng)元件，且兩個反應(yīng)元件之間相距僅250bp(圖3)。提示OIF基因的表達(dá)受垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子Pit-1的調(diào)控。同時，本發(fā)明人用Gel-Shift技術(shù)在體外證實OIF基因啟動子區(qū)域的兩個Pit-1反應(yīng)元件能夠與Pit-1轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合(表1，圖4)；表1

在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明人構(gòu)建了含有一個pit-1、兩個pit-1和不含pit-1結(jié)合位點的OIF轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的報告基因載體，將它們分別轉(zhuǎn)染到pit-1穩(wěn)定表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明中使用的人mimecan啟動子/熒光素酶受體構(gòu)造的示意圖見圖5，指示了用于啟動子/受體構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和引物的位置。結(jié)果顯示見圖6，分別轉(zhuǎn)染了包含兩個Pit-1 RE(Response Elements反應(yīng)元件)、一個Pit-1 RE和有Pit-1 RE的pGL3-mimecan(2.4-kb)、GL3-mimecan(1.8-kb)和GL3-mimecan(1.5-kb)的SMMC-7721細(xì)胞，各孔中，300ngpcDNA-Pit-1表達(dá)載體用各自的試驗質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。熒光素酶活性以pRL-SV40為內(nèi)參照，空載體(pGL3-basic)的熒光素酶活性設(shè)置為1.0，測各組相關(guān)的熒光素酶活性，以觀察表達(dá)差異。顯示的結(jié)果是重復(fù)進行的四個獨立實驗的平均，豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。結(jié)果表明，pit-1能增加OIF基因的轉(zhuǎn)錄活性。這首次證實OIF在垂體組織內(nèi)表達(dá)，且受垂體特異的轉(zhuǎn)錄因子Pit-1的調(diào)控。由于發(fā)現(xiàn)OIF在垂體組織內(nèi)表達(dá)，且受Pit-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，提示OIF為垂體分泌的一種新的受pit-1調(diào)控的細(xì)胞因子，由垂體特異的細(xì)胞分泌；若如此，垂體瘤中將存在新的分泌OIF的腫瘤。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明人用免疫兔子獲得的OIF多抗，對20例不同類型的垂體瘤組織進行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)20例垂體瘤組織中12例(60％)患者陽性，與ACTH、PRL、GH、TSH等經(jīng)典激素的免疫組化結(jié)果均不完全相同(表2)。有意義的是，在8例無功能腺瘤的病人瘤組織內(nèi)，4例OIF陽性，其中1例強陽性。這些初步結(jié)果提示在垂體組織內(nèi)，存在一種新的能夠分泌OIF蛋白的細(xì)胞類型，在垂體瘤患者中，存在一種新的分泌OIF蛋白的垂體瘤新類型(圖2)。這些結(jié)果提示OIF將可作為垂體瘤的病理分型和臨床診斷的新的標(biāo)記。
表2.免疫組化分析OIF在20例不同垂體瘤組織內(nèi)表達(dá)

本發(fā)明人的Northern分析發(fā)現(xiàn)OIF在肺、脂肪和腎上腺組織中表達(dá)很高，提示這些組織是OIF的分泌器官，本發(fā)明人針對OIF在這些組織中表達(dá)分泌的生理功能進行了研究。
腎上腺是重要的內(nèi)分泌器官，在應(yīng)激反應(yīng)中起重要的作用。腎上腺由皮質(zhì)和髓質(zhì)組成，皮質(zhì)分為束狀帶、球狀帶和網(wǎng)狀帶，可分泌合成糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素和性激素；腎上腺髓質(zhì)主要合成去甲腎上腺素和腎上腺素；人體內(nèi)只有腎上腺髓質(zhì)才能合成腎上腺素，這主要是因為從去甲腎上腺素合成腎上腺素過程中的一個甲基轉(zhuǎn)移酶(phenylethanolamine-N methyl transferase(PNMT))，只有在大劑量糖皮質(zhì)激素的作用下才能具有酶的活性；糖皮質(zhì)激素在腎上腺皮質(zhì)合成后進入髓質(zhì)，發(fā)揮旁分泌的作用，使去甲腎上腺素轉(zhuǎn)化為腎上腺素。由于其是通過旁分泌起作用，因此局部糖皮質(zhì)激素的濃度才足夠大，而在能合成兒茶酚胺類激素的交感神經(jīng)節(jié)等部位，糖皮質(zhì)激素的濃度較低，因而這些部位僅能合成去甲腎上腺素，而不能合成腎上腺素。腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞按其功能分為兩大類，一類是合成去甲腎上腺素的細(xì)胞，另一類能夠合成腎上腺素的細(xì)胞；這兩類細(xì)胞都有兒茶酚胺合成過程的關(guān)鍵酶如酪氨酸羥化酶(TH)、多巴胺羥化酶(DBH)的表達(dá)，但在釋放去甲腎上腺素的細(xì)胞內(nèi)，則不表達(dá)將去甲腎上腺素轉(zhuǎn)化為腎上腺素的甲基轉(zhuǎn)移酶(PNMT)。雖然用敏感的RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)腎上腺髓質(zhì)有一些細(xì)胞因子的表達(dá)，但表達(dá)量很低，一般不能分泌入血，僅在局部發(fā)揮旁分泌或鄰分泌的作用；1993年日本的一個研究組發(fā)現(xiàn)腎上腺髓質(zhì)分泌一種52個氨基酸組成的小肽，命名為腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，簡稱AM)。其主要的生理功能是擴張血管，降低血壓。但后來發(fā)現(xiàn)，該分泌蛋白在人體內(nèi)表達(dá)廣泛，其降血壓作用主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的AM發(fā)揮作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，一些炎癥介質(zhì)如TNFα、IL-1、脂多糖(LPS)，以及糖皮質(zhì)激素等均能促進血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞AM的分泌，而在高血壓、心功能衰竭、敗血癥等疾病狀態(tài)下，血中AM濃度增加；AM對ACTH分泌的作用尚有爭議，體外實驗發(fā)現(xiàn)，AM可抑制垂體細(xì)胞分泌ACTH，靜脈注射AM后，羊體內(nèi)ACTH和考的松濃度均明顯下降；但腦室注射AM后，血中ACTH和考的松濃度卻升高，但有些研究腦室注射AM后，對血中ACTH和考的松無影響。雖然如此，這是人們發(fā)現(xiàn)的第一個在腎上腺髓質(zhì)高表達(dá)并能分泌入血的激素。
令人興奮的是，本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)OIF基因在腎上腺表達(dá)較高(圖1)，并且僅表達(dá)在腎上腺髓質(zhì)(圖7)，更重要的是，在燙傷應(yīng)激狀態(tài)下腎上腺髓質(zhì)OIF表達(dá)水平明顯下降，但肺和脂肪組織不變(圖8)；注射ACTH可使腎上腺OIF表達(dá)減少，但地塞米松不影響其表達(dá)(圖9)。
肺組織是OIF表達(dá)的一個重要的器官，本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，OIF在肺鱗癌和腺癌中表達(dá)，而在小細(xì)胞肺癌(SCLC)的組織中不表達(dá)，提示OIF可以作為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)鑒別診斷的分子標(biāo)志。同時，測定外周血中OIF的濃度，將有利于小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的鑒別診斷。有意義的是，OIF在肺鱗癌組織的表達(dá)與其腫瘤的分化程度密切相關(guān)，鱗癌的分化程度越低，OIF的表達(dá)量越少，表明OIF將可以作為肺鱗癌預(yù)后的新的指標(biāo)。
脂肪組織是OIF分泌的另一個重要的器官。近年來，脂肪組織作為一個內(nèi)分泌器官引起了人們的廣泛注意。脂肪組織通過其內(nèi)分泌功能，參與食欲和能量平衡的調(diào)節(jié)，同時還與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)；在肥胖、高血壓、2型糖尿病、高血脂等的發(fā)生中起重要的作用。OIF在脂肪組織高表達(dá)，這是目前從脂肪組織發(fā)現(xiàn)的少數(shù)幾種激素的一種。本發(fā)明人在體外表達(dá)OIF蛋白，經(jīng)初步的動物試驗，發(fā)現(xiàn)OIF可以使動物的血糖下降30-40％。但不如胰島素(一種用于治療糖尿病的激素)強。同時，OIF在3T3-L1細(xì)胞的分化過程中有明顯的表達(dá)水平的變化，表明OIF在胰島素抵抗和脂肪細(xì)胞的分化過程中起重要的作用，提示OIF在肥胖、2型糖尿病、高血脂等的診斷治療中有潛在的應(yīng)用價值。
在上述研究基礎(chǔ)上，本發(fā)明人利用雜交瘤技術(shù)制備了抗人OIF的單克隆抗體OIF-KG4。生產(chǎn)抗人OIF的單克隆抗體，以此為基礎(chǔ)建立OIF外周血測定方法對這些腫瘤和及某些危重病人、肥胖等疾病的診斷具有重要的意義。OIF單克隆抗體還可以用于肺癌、腎上腺腫瘤(皮質(zhì)和髓質(zhì)腫瘤)的病理診斷的分子標(biāo)志及預(yù)后指標(biāo)。
本發(fā)明包括具有OIF-KG4單抗的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體、具有OIF-KG4單抗可變區(qū)鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括藥物、毒素、細(xì)胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與OIF-KG4單抗或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與OIF-KG4單抗或其片段結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物或抗原。
如本文所用，“免疫毒素”指對靶細(xì)胞有特異性親和力和殺傷力的物質(zhì)，例如免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素或其他治療分子與OIF-KG4單抗或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。具體的例子有例如131I-OIF-KG4，MTX-OIF-KG4偶聯(lián)物等。
對于本發(fā)明OIF-KG4單抗重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測定。OIF-KG4單抗V鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)(complementarity determining region，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與OIF-KG4單抗CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab′)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的OIF-KG4單抗的抗原的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)OIF的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備模板，通過擴增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以如上用常規(guī)技術(shù)，利用小鼠雜交瘤細(xì)胞系OIF-KG4(CCTCC No.C200409)獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS7、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
此外，本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段，所述的檢測試劑盒可用于檢測腫瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血壓或高血脂。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶聯(lián)物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的OIF-KG4免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1單克隆抗體的制備在本實施例中，本發(fā)明人應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)對OIF進行表達(dá)和純化，并進一步制備了OIF特異性的單克隆抗體OIF-KG4，為進一步建立血中OIF的檢測方法提供方便，為OIF抗體診斷特殊類型腫瘤提供可能，為進一步深入研究OIF的生理功能奠定了基礎(chǔ)。具體過程如下1.材料(1)質(zhì)粒、菌株及主要制劑大腸桿菌BL21、Top10購于Amersham biosciences公司。據(jù)AF100758設(shè)計引物Forward 5′-atcgga tcccct gtc aac gca act ctg g-3′(SEQ ID NO5)，Reverse5′-atgctc gagcat tgg ttg agt cct ggg ac-3′(SEQ ID NO6)，PCR擴增OIF編碼序列，用BamH I和Xho I進行酶切，克隆入由原核表達(dá)載體pGEX-5X-2(購于PharmaciaBiotech)，構(gòu)建得pGEX-5X-2-OIF質(zhì)粒，表達(dá)GST-OIF融合蛋白。Taq、Pfu DNA聚合酶購自Sangon公司。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均為PROMEGA公司產(chǎn)品。QIAquick Gel Extraction Kit、DNA純化試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品。GST融合蛋白純化樹脂Glutathione Sepharose 4B為Pharmacia公司產(chǎn)品。鎳螯和親和純化樹脂Probond為Invitrogen公司產(chǎn)品。CBD融合蛋白純化樹脂Chitin beads和MBP融合蛋白純化樹脂Amylose Resin為NEB公司產(chǎn)品。完全福氏佐劑、不完全福氏佐劑、PEG、HAT、HT、RPMI-1640培養(yǎng)液、DMEM、胎牛血清均為Gibco BRL公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的兔抗鼠Ig二抗購自DAKO公司。
(2)動物與細(xì)胞株動物8-12周齡雌性Balb/c小鼠10只，有孕產(chǎn)史的Balb/c小鼠10只(購自中科院上海動物實驗中心)細(xì)胞株小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0(上海市免疫研究所提供)，哺乳動物細(xì)胞系COS(中科院生化所S212組提供)2.方法(1)OIF融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計特異性引物(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶識別位點)，OIF NdeI/+5’-CACCATATGGCAAAATACAACAAAATCAAGAG-3’(SEQ ID NO1)；OIF XhoI/-5’-GTTCTCGAGAAAGTATGACCCTATCGGTAATC-3’(SEQ ID NO2)；以pGEX-5X-2-OIF質(zhì)粒為模板，PCR擴增OIF片段，用Nde I和Xho I進行酶切，接入pTXB1載體(購于New England BioLab)的Nde I和Xho I之間，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pTXB1-OIF，表達(dá)CBD-OIF融合蛋白。
根據(jù)pTXB1質(zhì)粒中intein編碼序列設(shè)計反向引物intein/Hind III5’-GCAAGCTTTGAGTTCAGACCGGTGAGGC-3’(SEQ ID NO3)；以T7啟動子通用序列5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’(SEQ ID NO4)為正向引物，以pGEX-5X-2-OIF質(zhì)粒為模板，擴增OIF-intein編碼序列，產(chǎn)物經(jīng)Xba I和HindIII酶切后與pET28a(+)質(zhì)粒(購于Pharmacia Biotech)連接，并轉(zhuǎn)化BL 21感受態(tài)菌株，構(gòu)建獲得OIF-intein-His融合表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)OIF-intein-His融合蛋白。
同樣由PCR特異性擴增OIF編碼序列并克隆至原核表達(dá)載體pMAL-c2x(購于New England BioLab)的BamH I和Pst I位點，構(gòu)建質(zhì)粒即pMAL-c2x-OIF，表達(dá)MBP-OIF融合蛋白。
(2)OIF融合蛋白的表達(dá)與純化BL21(DE3)菌株用于MBP-OIF、GST-OIF、OIF-CBD以及OIF-intein-His的表達(dá)。表達(dá)菌在含100μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基(0.5％NaCl，1.6％Tryptone，1％Yeast Extract)中培養(yǎng)，至OD值為0.5-0.8時，加入0.5mMIPTG室溫下誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)(4小時)。菌液離心收集沉淀重懸后，超聲破碎菌體離心分離表達(dá)產(chǎn)物的上清和沉淀。
GST-OIF融合表達(dá)產(chǎn)物的上清與Glutathione Sepharose 4B結(jié)合1-2小時，用1×PBS洗滌結(jié)合有蛋白的樹脂3次后，加入洗脫液(50mM Tris-Cl，10mM谷胱甘肽(Glutathione)，PH8.0)洗脫目的蛋白。OIF-intein-His融合表達(dá)產(chǎn)物的沉淀用Buffer B(100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8M尿素(Urea)，PH8.0)重懸后，室溫振蕩1-2小時至澄清，離心后上清與Probond(已用BufferB平衡)室溫結(jié)合1-2小時后裝入親和層析柱中，用Buffer C(100 mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8M尿素(Urea)，PH6.3)洗滌柱子3次后，加入Buffer E(100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8M Urea，PH4.5)洗脫蛋白3次。
應(yīng)用Chitin beads和Amylose Resin對OIF-CBD及MBP-OIF蛋白的表達(dá)產(chǎn)物分別進行親和純化，操作步驟參照NEB公司產(chǎn)品操作手冊。各步留樣作SDS-PAGE分析，純化蛋白用Bradford法定量。
OIF-INTEIN-HIS融合蛋白進行變性純化，GST-OIF、MBP-OIF融合蛋白、單純GST和MBP蛋白進行非變性純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳，分子量正確，后利用免疫小鼠血清對OIF融合蛋白進行Western印跡鑒定證實融合蛋白正確。
(3)動物免疫將純化的OIF-Intein-His融合蛋白與等體積完全福氏佐劑乳化后，以每只鼠50μg OIH的劑量于足墊、背部多點注射8-12周齡雌性Balb/c小鼠。間隔兩周后將OIH與等體積不完全福氏佐劑乳化后，同等劑量同法注射小鼠一次。十天后再同法免疫小鼠。融合前三天腹腔注射50μg OIH加強免疫一次。融合前1天取小鼠尾靜脈血行間接ELISA法檢測抗體呈陽性后，即處死小鼠取其脾細(xì)胞作融合。
(4)細(xì)胞融合、篩選及克隆化將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞懸液以10∶1混合，按《免疫學(xué)常用實驗方法》(朱立平，人民軍醫(yī)出版社，2000，3)中的過程進行細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后換用HT培養(yǎng)，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞生長良好，占孔底25-50％左右時，選擇純化的GST-OIF包被酶標(biāo)板(0.5μg/孔)，采用間接ELISA法篩選陽性克隆。采用有限稀釋法進行雜交瘤細(xì)胞的克隆化，同法亞克隆3次，陽性細(xì)胞株加入凍存液-80℃保存后移入液氮中。
雜交瘤細(xì)胞經(jīng)間接ELISA法檢測及亞克隆3次，最后篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗OIF McAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別為G4(OIF-KG4)和C6。檢測該2株陽性雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液Ig亞型均為IgMκ。選擇純化的GST-OIF、MBP-OIF、GST、MBP包被酶標(biāo)板(0.5μg/孔)，采用間接ELISA法檢測。KG4腹水與GST-OIF、MBP-OIF反應(yīng)，效價為105，但不與GST、MBP反應(yīng)，進一步證實單抗的特異性，結(jié)果見圖10，其中X軸從1∶50開始對比稀釋的抗OIF單抗腹水，Y軸495nm處的吸光值。
(5)腹水的制備和鑒定將雜交瘤細(xì)胞(2×106個/只)，腹腔注射經(jīng)降植烷預(yù)先致敏的有孕產(chǎn)史的Balb/c小鼠，10-14天后抽取腹水，離心后上清加入0.02％疊氮鈉4℃保存。利用羅氏公司Ig亞類測定試劑盒，檢測2株陽性雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，選擇純化的GST-OIF、MBP-OIF、GST、MBP蛋白包被酶標(biāo)板(0.5μg/孔)，采用間接ELISA法檢測腹水效價。
(6)抗OIF單抗的親和純化應(yīng)用E.coli表達(dá)融合蛋白OIF-CBD對腹水中mAb進行親和純化。過量的OIF-CBD表達(dá)產(chǎn)物裂解液與幾丁質(zhì)樹脂充分偶聯(lián)，以10倍柱床體積1×PBS洗滌3次。腹水1∶5稀釋于1×PBS中，與OIF-CBD蛋白偶聯(lián)的Chitin beads混勻結(jié)合1小時，并以1×PBS洗滌。結(jié)合抗體以2倍體積甘氨酸/鹽酸緩沖液(0.2M甘氨酸，以鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0)洗脫，迅速以2M Tris堿中和。純度用SDS-PAGE分析，濃度由Bradford法測定。
應(yīng)用抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特異性，利用偶聯(lián)在Chitin beads上但很難洗脫的過量的OIF-CBD蛋白對單抗進行親和純化，得到高純度的OIF單抗，純化抗體濃度為0.1mg/ml。
上述產(chǎn)生抗OIF單克隆抗體的抗OIF單抗細(xì)胞株OIF-KG4于2004年9月7日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國，武漢)，保藏號為CCTCC No.C200409。
實施例2OIF的檢測用免疫組化方法進行檢測。具體的，用GST-OIF蛋白免疫新西蘭大白兔，取其血清作為抗OIF的多抗血清，作為一抗。二抗envision試劑購自DAKO公司。用DAB顯色(DAKO公司)。
對178例肺癌組織中OIF的表達(dá)情況進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OIF的表達(dá)和分化程度相關(guān)分化高者，表達(dá)程度也高。在鱗癌組織中，OIF的表達(dá)幾乎達(dá)100％(表3)，分化程度低的SCLC陽性率最低(表4)?？梢奜IF作為肺癌的一個腫瘤標(biāo)記物，能有效的鑒別小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。有助于臨床病理分型。
表3 NSCLC組間OIF表達(dá)情況

表4SCL與NSCLC間OIF表達(dá)的比較

實施例3用單克隆抗體OIF-KG4檢測OIF的表達(dá)本發(fā)明人用制得的單克隆抗體OIF-KG4檢測OIF的表達(dá)，重復(fù)實施例2的方法，不同點在于用單克隆抗體OIF-KG4替換實施例2中的多抗作為一抗。
結(jié)果表明，單抗OIF-KG4同樣能夠有效的鑒別小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。并且，單抗OIF-KG4比實施例2的多抗特異性有大幅度提高，親和力也顯著加強。
實施例4檢測的試劑盒本發(fā)明人制備了一種檢測小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的試劑盒，它含有上述實施例2制備獲得的OIF-KG4、實施例2中已經(jīng)列出的免疫組化檢測試劑、以及使用方法說明書。
目前，使用該種試劑盒，已完成臨床實驗200多例。
菌株保藏本發(fā)明的產(chǎn)生抗OIF單克隆抗體的抗OIF單抗細(xì)胞株OIF-KG4于2004年9月7日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國，武漢)，保藏號為CCTCC No.C200409。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院<120>抗人骨生成誘導(dǎo)因子單克隆抗體及其制備和用途<130>054238<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>32<212>DNA<213>引物<400>1caccatatgg caaaatacaa caaaatcaag ag32<210>2<211>32<212>DNA<213>引物<400>2gttctcgaga aagtatgacc ctatcggtaa tc32<210>3<211>28<212>DNA<213>引物<400>3gcaagctttg agttcagacc ggtgaggc 28<210>4<211>23<212>DNA<213>引物<400>4taatacgact cactataggg aga 23<210>5<211>28<212>DNA<213>引物<400>5atcggatccc ctgtcaacgc aactctgg 28
<210>6<211>29<212>DNA<213>引物<400>6atgctcgagc attggttgag tcctgggac29
權(quán)利要求
1.一種免疫球蛋白，其特征在于，它特異性地結(jié)合于人骨生成誘導(dǎo)因子蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的人骨生成誘導(dǎo)因子蛋白具有GenBank登錄號AF100758所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409所產(chǎn)生。
4.一種免疫偶聯(lián)物，其特征在于，該免疫偶聯(lián)物含有特異性地結(jié)合于骨生成誘導(dǎo)因子蛋白的免疫球蛋白和選自下組的偶聯(lián)部分藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、酶。
5.一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，它是小鼠雜交瘤細(xì)胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409。
6.一種檢測腫瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血壓或高血脂的試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白或權(quán)利要求4所述的免疫偶聯(lián)物。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的腫瘤選自垂體瘤、肺癌、腎上腺腫瘤、皮質(zhì)或髓質(zhì)腫瘤。
8.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白或權(quán)利要求4所述的免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
9.抗人骨生成誘導(dǎo)因子蛋白的單克隆抗體在制備檢測腫瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血壓或高血脂的試劑中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗人骨生成誘導(dǎo)因子蛋白的單克隆抗體由小鼠雜交瘤細(xì)胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409所產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗人骨生成誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor OIF)蛋白的特異性單克隆抗體OIF－KG4。本發(fā)明還公開了OIF－KG4免疫球蛋白、其片段和免疫偶聯(lián)物以及含有上述免疫球蛋白、片段或免疫偶聯(lián)物的藥物組合物。本發(fā)明還提供了一種可用于檢測腫瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血壓或高血脂的試劑盒。
文檔編號C07K16/24GK1951967SQ20051003101
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者宋懷東, 孔令春, 於惠敏 申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院