專利名稱：一種從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鵝去氧膽酸的提取方法，特別涉及一種從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，屬于精細(xì)化工和醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鵝去氧膽酸(簡(jiǎn)稱CDCA)是動(dòng)物膽汁的主要有效成分之一，被廣泛的應(yīng)用在醫(yī)藥行業(yè)。鵝去氧膽酸在臨床上藥理作用有以下幾個(gè)方面1、治療膽固醇型結(jié)石。CDCA能夠抑制HMG-COA還原酶的活性；刺激膽酸合成限速酶的活性，從而擴(kuò)大膽汁酸池以利于膽固醇以微膠粒狀態(tài)溶解。CDCA的最佳療效見于治療后2年，40％的結(jié)石可溶解。
2、抗菌作用。CDCA的體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CDCA對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、金黃色葡萄球菌卻有顯著的抗菌作用。
3、抗炎作用。CDCA能極顯著地抑制二甲苯所致的小鼠耳殼炎癥并增強(qiáng)小鼠皮膚毛細(xì)血管的通透性，對(duì)小鼠棉球肉芽腫、大鼠角叉菜膠性足跖腫脹和甲醛性足腫脹均有明顯的抑制作用，且作用與其劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。
4、解熱作用。CDCA分別按0.15g/Kg和0.225g/Kg的劑量給大鼠灌胃，連續(xù)給藥3天；然后測(cè)定其對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素和蛋自胨所致大鼠發(fā)墊體溫的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高劑量的CDCA對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素致熱后15h內(nèi)大鼠的發(fā)熱體溫有顯著抑制作用，低劑量的CDCA則作用不明顯。
盡管鵝去氧膽酸具有上述突出療效，但對(duì)其生產(chǎn)工藝的研究卻很少。專利CN02128138.6公開了一種鵝去氧膽酸粗品的精制方法。該方法主要對(duì)鵝去氧膽酸粗品進(jìn)行進(jìn)一步精制，采用將鵝去氧膽酸粗品用乙酸乙酯完全溶解，按鵝去氧膽酸粗品重量的0.1-2％用量加入稀氨水，萃取鵝去氧膽酸乙酸乙酯溶液中的膽酸及其它親水性雜質(zhì)，對(duì)溶液中的鵝去氧膽酸進(jìn)行回收，得成品。該工藝主要用于對(duì)鵝去氧膽酸粗品進(jìn)行精加工。專利CN03151475.8公開了一種鵝去氧膽酸的制備方法。其過程包括通過堿液皂化膽汁、制備總膽汁酸的鈣鹽沉淀、雙氧水及活性碳脫色、碳酸鈉及鹽酸轉(zhuǎn)化鵝去氧膽酸鈣鹽沉淀及大孔吸附樹脂純化步驟。整個(gè)工藝較復(fù)雜，需要氯化鈣成鹽、脫鈣、脫色等步驟，工業(yè)生產(chǎn)中收率低，純度為95％。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種能提高提取鵝去氧膽酸產(chǎn)率、純度同時(shí)簡(jiǎn)化提取工藝的從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，其特殊之處在于包括如下步驟a、皂化反應(yīng)將禽畜膽汁與氫氧化鈉溶液按一定比例及溫度下進(jìn)行皂化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為20-30小時(shí)；b、中和反應(yīng)皂化反應(yīng)結(jié)束后加入稀鹽酸調(diào)節(jié)至酸性，然后過濾得到粗膽酸；c、柱層析將粗膽酸用稀氫氧化鈉溶液調(diào)至堿性，打入層析柱中，用堿性溶液洗脫，合并經(jīng)薄層層析檢測(cè)為單純的鵝去氧膽酸斑點(diǎn)的洗脫液；d、超濾用截留分子量為3K-100K的超濾膜超濾；e、超濾液用稀酸調(diào)至酸性，過濾，烘干，得純度為96％以上的鵝去氧膽酸。
其中在步驟a皂化反應(yīng)中所述氫氧化鈉溶液濃度為1-5M，反應(yīng)溫度為80-110℃。
其中在步驟b中和反應(yīng)中所述稀鹽酸的濃度為0.5-2M。
其中在步驟c柱層析中所述稀氫氧化鈉溶液濃度為1-5M，層析柱中填料為離子交換樹脂或氧化鋁，洗脫液選自氫氧化鈉、氨水、乙酸鈉或磷酸鈉中的一種，或乙醇和它們的復(fù)合溶液，或其他堿性無機(jī)鹽水溶液和乙醇的復(fù)合溶液。
其中在步驟d超濾中所述超濾膜為中空纖維、陶瓷或聚砜膜。
本發(fā)明的從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，所述層析柱中填料選自強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂、強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂、弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂、堿性氧化鋁或酸性氧化鋁中的一種。
其中中間控制采用薄層層析(TLC)方法。通過TLC，可以對(duì)提取液和柱層析洗脫液中主要活性成分進(jìn)行控制。TLC條件展開劑為環(huán)己烷∶乙醚∶丁酸∶水＝12∶5∶4∶1，用50％硫酸乙醇顯色。
產(chǎn)品純度測(cè)定采用高效液相色譜(HPLC)法。
HPLC條件設(shè)備Waters 600，Waters 996泵，Photodiode ArrayDetector檢測(cè)器；色譜柱Dikma，Diamonsil C18，4.6mm*25cm；流動(dòng)相甲醇∶0.3％醋酸水溶液＝74∶26(V∶V)；檢測(cè)溫度室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)205nm；流速0.8ml/min。
在傳統(tǒng)制備工藝中，都忽視了鵝去氧膽酸呈酸性并可以用離子交換進(jìn)行純化的特點(diǎn)，使的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，收率低。本發(fā)明創(chuàng)新性的找到了一種提高提取鵝去氧膽酸產(chǎn)率、純度同時(shí)簡(jiǎn)化提取工藝的方法，從而用于大規(guī)模提取純度鵝去氧膽酸。本發(fā)明采用超濾技術(shù)取代了氯化鈣和氯化鋇等傳統(tǒng)沉淀法，用水代替了大量的有機(jī)溶劑乙酸乙酯，利用CDCA與雜膽酸、脂肪酸的酸堿性不同，采用離子交換柱層析技術(shù)，直接用緩沖液洗滌，分離純化得到含量大于96％CDCA產(chǎn)品，產(chǎn)品收率達(dá)到96％以上。
本發(fā)明采用的技術(shù)原理主要是1、鵝去氧膽酸的分子量為329.56，是小分子物質(zhì)。根據(jù)分子量大小選擇3K以上的超濾柱進(jìn)行超濾，分子量大于3K的大分子蛋白等物質(zhì)經(jīng)過超濾可以除去，達(dá)到較好的除雜效果。
2、由于膽汁中除鵝去氧膽酸外，還含有膽酸、去氧膽酸、膽紅素、石膽酸等物質(zhì)，但它們的結(jié)構(gòu)不同，物化性質(zhì)不同，主要是酸性強(qiáng)度不同，這樣它們和離子交換樹脂的結(jié)合能力就不同，也就是通過柱層析技術(shù)將其完全分開，而離子交換樹脂又可以重復(fù)利用。
綜上所述，本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高、成本低，不使用有機(jī)溶劑，是一種綠色環(huán)保型生產(chǎn)工藝。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。但它們不是對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1取雞膽汁，粉碎，過濾，加入等重量的1M氫氧化鈉溶液，在80℃溫度下進(jìn)行皂化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為30小時(shí)；加入0.5M鹽酸調(diào)至PH＝3，攪拌2小時(shí)，靜置，離心，收集濾餅，得粗膽酸。將粗膽酸用稀5M氫氧化鈉溶液調(diào)至PH＝10，打入強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂層析柱中，用濃度5％氫氧化鈉溶液洗脫，合并經(jīng)薄層層析(TLC)檢測(cè)為單純的鵝去氧膽酸斑點(diǎn)的洗脫液。然后用截留分子量為3K的超濾膜超濾，超濾液用0.5M稀酸調(diào)至PH＝2，靜置，離心過濾，烘干，得純度為99.5％(HPLC測(cè)定)的鵝去氧膽酸。
實(shí)施例2取豬膽汁，粉碎，過濾，加入等重量的5M氫氧化鈉溶液，在110℃溫度下進(jìn)行皂化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為20小時(shí)；加入2M鹽酸調(diào)至PH＝2，攪拌5小時(shí)，靜置，離心，收集濾餅，得粗膽酸。將粗膽酸用稀1M氫氧化鈉溶液調(diào)至PH＝11，打入弱堿性陰離子交換樹脂層析柱中，用濃度10％的乙酸鈉和5％乙醇混合溶液洗脫，合并經(jīng)薄層層析(TLC)檢測(cè)為單純的鵝去氧膽酸斑點(diǎn)的洗脫液。然后用截留分子量為100K的超濾膜超濾，超濾液用2M稀酸調(diào)至PH＝3，靜置，離心過濾，烘干，得純度為98％(HPLC測(cè)定)的鵝去氧膽酸。
實(shí)施例3取雞膽汁，粉碎，過濾，加入等重量的2M氫氧化鈉溶液，在90℃溫度下進(jìn)行皂化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為30小時(shí)；加入1M鹽酸調(diào)至PH＝2.5，攪拌1小時(shí)，靜置，離心，收集濾餅，得粗膽酸。將粗膽酸用稀4M氫氧化鈉溶液調(diào)至PH＝11，打入弱堿性陰離子交換樹脂層析柱中，用濃度12％氨水溶液洗脫，合并經(jīng)薄層層析(TLC)檢測(cè)為單純的鵝去氧膽酸斑點(diǎn)的洗脫液。然后用截留分子量為10K的超濾膜超濾，超濾液用0.5M稀酸調(diào)至PH＝3，靜置，離心過濾，烘干，得純度為99％(HPLC測(cè)定)的鵝去氧膽酸。
實(shí)施例4取雞膽汁，粉碎，過濾，加入等重量的3M氫氧化鈉溶液，在100℃溫度下進(jìn)行皂化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為22小時(shí)；加入1M鹽酸調(diào)至PH＝2，攪拌3小時(shí)，靜置，離心，收集濾餅，得粗膽酸。將粗膽酸用稀2M氫氧化鈉溶液調(diào)至PH＝11，打入弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂層析柱中，用濃度10％乙醇溶液洗脫，合并經(jīng)薄層層析(TLC)檢測(cè)為單純的鵝去氧膽酸斑點(diǎn)的洗脫液。然后用截留分子量為30K的超濾膜超濾，超濾液用1M稀酸調(diào)至PH＝3，靜置，離心過濾，烘干，得純度為98.9％(HPLC測(cè)定)的鵝去氧膽酸。
實(shí)施例5取牛膽汁，粉碎，過濾，加入等重量的4M氫氧化鈉溶液，在80℃溫度下進(jìn)行皂化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為28小時(shí)；加入0.5M鹽酸調(diào)至PH＝2，攪拌3小時(shí)，靜置，離心，收集濾餅，得粗膽酸。將粗膽酸用稀2M氫氧化鈉溶液調(diào)至PH＝11，打入酸性氧化鋁層析柱中，用濃度25％乙醇溶液洗脫，合并經(jīng)薄層層析(TLC)檢測(cè)為單純的鵝去氧膽酸斑點(diǎn)的洗脫液。然后用截留分子量為70K的超濾膜超濾，超濾液用1M稀酸調(diào)至PH＝2.5，靜置，離心過濾，烘干，得純度為98.6％(HPLC測(cè)定)的鵝去氧膽酸。
權(quán)利要求
1.一種從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，其特征在于包括如下步驟a、皂化反應(yīng)將禽畜膽汁與氫氧化鈉溶液按一定比例及溫度下進(jìn)行皂化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為20-30小時(shí)；b、中和反應(yīng)皂化反應(yīng)結(jié)束后加入稀鹽酸調(diào)節(jié)至酸性，然后過濾得到粗膽酸；c、柱層析將粗膽酸用稀氫氧化鈉溶液調(diào)至堿性，打入層析柱中，用堿性溶液洗脫，合并經(jīng)薄層層析檢測(cè)為單純的鵝去氧膽酸斑點(diǎn)的洗脫液；d、超濾用截留分子量為3K-100K的超濾膜超濾；e、超濾液用稀酸調(diào)至酸性，過濾，烘干，得純度為96％以上的鵝去氧膽酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，其中在步驟a皂化反應(yīng)中所述氫氧化鈉溶液濃度為1-5M，反應(yīng)溫度為80-110℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，其中在步驟b中和反應(yīng)中所述稀鹽酸的濃度為0.5-2M。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，其中在步驟c柱層析中所述稀氫氧化鈉溶液濃度為1-5M，層析柱中填料為離子交換樹脂或氧化鋁，洗脫液選自氫氧化鈉、氨水、乙酸鈉或磷酸鈉中的一種，或乙醇和它們的復(fù)合溶液，或其他堿性無機(jī)鹽水溶液和乙醇的復(fù)合溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，其中在步驟d超濾中所述超濾膜為中空纖維、陶瓷或聚砜膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，所述層析柱中填料選自強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂、強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂、弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂、堿性氧化鋁或酸性氧化鋁中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從禽畜膽汁中生產(chǎn)高純度鵝去氧膽酸的方法，屬于精細(xì)化工和醫(yī)藥領(lǐng)域。該方法包括如下步驟a.皂化反應(yīng)將禽畜膽汁與氫氧化鈉溶液按一定比例及溫度下進(jìn)行皂化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為20－30小時(shí)；b.中和反應(yīng)皂化反應(yīng)結(jié)束后加入稀鹽酸調(diào)節(jié)至酸性，然后過濾得到粗膽酸；c.柱層析將粗膽酸用稀氫氧化鈉溶液調(diào)至堿性，打入層析柱中，用堿性溶液洗脫，合并經(jīng)薄層層析檢測(cè)為單純的鵝去氧膽酸斑點(diǎn)的洗脫液；d.超濾用截留分子量為3K－100K的超濾膜超濾；e.超濾液用稀酸調(diào)至酸性，過濾，烘干，得純度為96％以上的鵝去氧膽酸。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高、成本低、綠色環(huán)保。
文檔編號(hào)C07J75/00GK1775798SQ20051004534
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2005年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日
發(fā)明者王洪鐘, 田林煥, 王洪果, 丁建平, 崔世軍 申請(qǐng)人:山東博爾德生物科技有限公司