專利名稱：蛋黃免疫球蛋白的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋黃免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，尤其是一種純度高的蛋黃免疫球蛋白的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
蛋黃免疫球蛋白(IgY)是存在于雞卵黃中的一種免疫球蛋白，雖然其結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物的IgG有所不同，但它與IgG一樣，具有較高的免疫活性，50ng/ml含量仍能被檢測(cè)出有特異性活性。經(jīng)證實(shí)，從卵黃中可獲得200種不同的抗體，在體內(nèi)的主要生理功能為凝集、吞噬及中和細(xì)菌及毒素等成份，增強(qiáng)機(jī)體防病抗病能力，因此蛋黃免疫球蛋白被廣泛的應(yīng)用于免疫治療、疾病診斷等許多方面。
目前，蛋黃免疫球蛋白的制備方法是用高免雞蛋卵黃經(jīng)稀釋后直接制備，即將收集好的高免蛋蛋殼消毒，無(wú)菌分離蛋黃和蛋清，將蛋黃液和滅菌生理鹽水按1∶3(V/V)混合，在組織搗碎機(jī)中高速攪拌制成勻漿，經(jīng)雙層滅菌紗布過(guò)濾，加青、鏈霉素2000ug/ml和0.01％疊氮鈉，然后分裝于瓶中，-20℃保存。雖然用雞蛋作為抗體生產(chǎn)的來(lái)源，比從免疫的動(dòng)物中直接生產(chǎn)多克隆抗體的傳統(tǒng)方法工藝簡(jiǎn)單、成本低廉，避免了大量人畜共患傳染病的垂直傳播，但是目前的制備方法存在著如下缺點(diǎn)1.性能不穩(wěn)定，需低溫冷凍保存，不能反復(fù)凍融，否則容易形成沉淀及凝塊等缺陷；2.蛋黃液純度不高，不易吸收，大劑量注射易造成注射部位的損傷，影響血液循環(huán)，并加速體況較差的患病動(dòng)物的死亡；3.由于產(chǎn)品中雜質(zhì)較多，必需添加青、鏈霉素和疊氮鈉作為防腐劑，對(duì)機(jī)體有一定的副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)所存在的性能不穩(wěn)定、純度不高、雜質(zhì)較多及易造成多種傳染病嚴(yán)重傳播等技術(shù)問(wèn)題，提供一種性能穩(wěn)定、純度高、雜質(zhì)少的蛋黃免疫球蛋白的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種蛋黃免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟a.將免疫卵黃、生理鹽水、氯仿按1∶2∶2混勻后室溫放置2小時(shí)，離心取上清液；b.在上清液中加入硫酸鈉攪拌溶解，使硫酸鈉濃度為20％W/V，4℃靜置1小時(shí)，離心棄去上清，取沉淀的蛋白質(zhì)；c.將沉淀物溶于生理鹽水中，再對(duì)生理鹽水透析，得粗制蛋黃免疫球蛋白；d.用DEAE-纖維素柱對(duì)粗制蛋黃免疫球蛋白純化；e.采用納米級(jí)孔徑膜對(duì)純化后的蛋黃免疫球蛋白過(guò)濾。
所述的用DEAE-纖維素柱對(duì)粗制蛋黃免疫球蛋白純化有以下步驟a.DEAE-纖維素預(yù)處理用蒸餾水將DEAE-纖維素?cái)噭?、浸?0～24小時(shí)，漂洗2-3次，傾去上層細(xì)粒，先用0.1N NaOH處理1小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)洗至中性，隨后用0.1N HCl處理30分鐘，反復(fù)洗至中性，最后用0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液平衡。
b.裝注、層析裝柱時(shí)將平衡好的DEAE-纖維素?cái)噭颍瑢⒉０舨迦胫驳撞?，再將DEAE-纖維素沿玻棒倒入，邊提取玻棒邊加，直至裝成柱床，放置8～24小時(shí)。
c.加樣、洗脫、收集保存打開(kāi)出水口，使柱床上部緩沖液下降或吸出多余液體，放入直徑與柱床內(nèi)徑相當(dāng)?shù)膱A濾紙片，使其和DEAE-纖維素頂端接觸，再加樣；待樣品完全進(jìn)入柱床，再迅速加少量緩沖液將管壁內(nèi)側(cè)洗一下，待洗液進(jìn)入柱床后用緩沖液開(kāi)始洗脫，用紫外光檢測(cè)儀自動(dòng)監(jiān)測(cè)蛋白峰，收集含蛋白質(zhì)的洗脫液，分裝保存。
可以用聚乙二醇濃縮蛋白。
本發(fā)明是以免疫雞蛋黃為原料，用氯仿去除類脂質(zhì)成分后以飽和硫酸鈉鹽析法沉淀蛋白，采用DEAE-纖維素柱層析獲得含有蛋黃免疫球蛋白的制劑，用帶有納米級(jí)孔徑的膜過(guò)濾裝置，將細(xì)菌和病毒100％去除。此方法所獲蛋黃免疫球蛋白制劑雜質(zhì)少、純度高(可達(dá)95％以上)、性能穩(wěn)定，克服了現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)蛋黃免疫球蛋白所存在的種種弊病，保證了產(chǎn)品的高效和安全。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1用現(xiàn)有技術(shù)獲得免疫蛋黃。即第一天用含0.1-0.5mg所選特定抗原的Fre-und完全佐劑(CFA)對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫。分別在首免后的第14和21天用相同的抗原將雞做兩次加強(qiáng)免疫，每次抗原注射量為1ml。首次免疫后28天開(kāi)始收集雞蛋，之后每月作一次注射免疫，此雞群可在6個(gè)月內(nèi)作為IgY生產(chǎn)用的雞蛋來(lái)源。
具體生產(chǎn)方法如下a.將免疫卵黃、生理鹽水、氯仿按1∶2∶2混勻后室溫放置2小時(shí)，離心取上清液，去除類脂質(zhì)成分；b.在上清液中加入硫酸鈉攪拌溶解，使硫酸鈉濃度為20％W/V(質(zhì)量/體積)，4℃靜置1小時(shí)，離心棄去上清，取沉淀的蛋白質(zhì)；c.將沉淀的蛋白質(zhì)溶于等體積的生理鹽水中，再對(duì)生理鹽水透析，去除殘余的硫酸鈉，得粗制蛋黃免疫球蛋白；d.用DEAE-纖維素柱對(duì)粗制蛋黃免疫球蛋白純化；e.采用納米級(jí)孔徑膜對(duì)純化后的蛋黃免疫球蛋白過(guò)濾。
實(shí)施例2其前三步驟同實(shí)施例1，而用DEAE-纖維素柱對(duì)粗制蛋黃免疫球蛋白純化有以下步驟a.DEAE-纖維素預(yù)處理用蒸餾水將DEAE-纖維素?cái)噭颉⒔?0～24小時(shí)，漂洗2-3次，傾去上層細(xì)粒，先用0.1N NaOH處理1小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)洗至中性，隨后用0.1N HCl處理30分鐘，反復(fù)洗至中性，最后用0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液平衡。
b.裝注、層析裝柱時(shí)將平衡好的DEAE-纖維素?cái)噭?，將玻棒插入柱床底部，再將DEAE-纖維素沿玻棒倒入，邊提取玻棒邊加，直至裝成柱床，放置8～24小時(shí)。
c.加樣、洗脫、收集保存打開(kāi)出水口，使柱床上部緩沖液下降或吸出多余液體，放入直徑與柱床內(nèi)徑相當(dāng)?shù)膱A濾紙片，使其和DEAE-纖維素頂端接觸，再加樣；待樣品完全進(jìn)入柱床，再迅速加少量緩沖液將管壁內(nèi)側(cè)洗一下，待洗液進(jìn)入柱床后用緩沖液開(kāi)始洗脫，用紫外光檢測(cè)儀自動(dòng)監(jiān)測(cè)蛋白峰，收集含蛋白質(zhì)的洗脫液，可按1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml分裝保存。
實(shí)施例3其它步驟同實(shí)施例1、2，當(dāng)所收集蛋白的濃度較低時(shí)，可以用聚乙二醇濃縮蛋白。
成品檢驗(yàn)抽樣每批成品分別做物理檢查、化學(xué)檢定、蛋白質(zhì)含量、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)、無(wú)菌試驗(yàn)、熱原質(zhì)試驗(yàn)和安全試驗(yàn)等全面的質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果符合要求。
半成品檢定液體制劑于除菌過(guò)濾和除病毒后應(yīng)做理化檢查及熱原質(zhì)試驗(yàn)，并抽樣做無(wú)菌試驗(yàn)，結(jié)果符合要求。
權(quán)利要求
1.一種蛋黃免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟a.將免疫雞卵黃、生理鹽水、氯仿按1∶2∶2混勻后室溫放置2小時(shí)，離心取上清液；b.在上清液中加入硫酸鈉攪拌溶解，使硫酸鈉終濃度為20％W/V，4℃靜置1小時(shí)，離心棄去上清，取沉淀的蛋白質(zhì)；c.將沉淀物溶于生理鹽水中，再對(duì)生理鹽水透析，得粗制蛋黃免疫球蛋白；d.用DEAE-纖維素柱對(duì)粗制蛋黃免疫球蛋白純化；e.采用納米級(jí)孔徑膜對(duì)純化后的蛋黃免疫球蛋白過(guò)濾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋黃免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的用DEAE-纖維素柱對(duì)粗制蛋黃免疫球蛋白純化有以下步驟a.DEAE-纖維素預(yù)處理用蒸餾水將DEAE-纖維素?cái)噭?、浸?0～24小時(shí)，漂洗2-3次，傾去上層細(xì)粒，先用0.1N NaOH處理1小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)洗至中性，隨后用0.1N HCl處理30分鐘，反復(fù)洗至中性，最后用0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液平衡。b.裝注、層析裝柱時(shí)將平衡好的DEAE-纖維素?cái)噭?，將玻棒插入柱床底部，再將DEAE-纖維素沿玻棒倒入，邊提取玻棒邊加，直至裝成柱床，放置8～24小時(shí)。c.加樣、洗脫、收集保存打開(kāi)出水口，使柱床上部緩沖液下降或吸出多余液體，放入直徑與柱床內(nèi)徑相當(dāng)?shù)膱A濾紙片，使其和DEAE-纖維素頂端接觸后加樣；待樣品完全進(jìn)入柱床，再迅速加少量緩沖液將管壁內(nèi)側(cè)洗一下，待洗液進(jìn)入柱床后用緩沖液開(kāi)始洗脫，用紫外光檢測(cè)儀自動(dòng)監(jiān)測(cè)蛋白峰，收集含蛋白質(zhì)的洗脫液，分裝保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋黃免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于用聚乙二醇濃縮蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種蛋黃免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，包括如下步驟將免疫卵黃、生理鹽水、氯仿按1∶2∶2混勻后室溫放置2小時(shí)，離心取上清液；在上清液中加入硫酸鈉攪拌溶解，使硫酸鈉濃度為20％W/V，4℃靜置1小時(shí)，離心棄去上清，取沉淀的蛋白質(zhì)；將沉淀物溶于生理鹽水中，再對(duì)生理鹽水透析，得粗制蛋黃免疫球蛋白；用DEAE－纖維素柱對(duì)粗制蛋黃免疫球蛋白純化；采用納米級(jí)孔徑膜對(duì)純化后的蛋黃免疫球蛋白過(guò)濾。此方法所獲蛋黃免疫球蛋白制劑雜質(zhì)少、純度高(可達(dá)95％以上)、性能穩(wěn)定，克服了現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)蛋黃免疫球蛋白所存在的種種弊病，保證了產(chǎn)品的高效和安全。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1763095SQ20051004720
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日
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