專利名稱：N(2)－l－丙氨酰－l－谷氨酰胺二肽合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含氨基酸的二肽合成方法，尤其是涉及一種N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺是人體中含量最多的氨基酸，谷氨酰胺在肌肉蛋白質(zhì)和血漿蛋白質(zhì)中含量約分別為75％和26％。
谷氨酰胺具有重要的生理作用。谷氨酰胺是生物合成核酸的必需前體物質(zhì)，是蛋白質(zhì)合成與分解的調(diào)節(jié)物，是氨基氮從外周組織轉(zhuǎn)動(dòng)至內(nèi)臟的攜帶者，是腎臟排泄氨的重要基質(zhì)。谷氨酰胺是腸粘膜上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的重要能量物質(zhì)，在維持腸道機(jī)能、促進(jìn)免疫功能、維持體內(nèi)堿平衡及提高機(jī)體對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)等方面都發(fā)揮著極其重要的作用。
已有的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法有如下7種1、首先將Gln(谷氨酰胺)的氨基進(jìn)行保護(hù)，形成Cbz-Gln；第二步，將Cbz-Gln的酰氨基保護(hù)形成Cbz-Gln(OC13H9)；第三步，將Cbz-Gln(OC13H9)的羧基保護(hù)形成Cbz-Gln(OC13H9)OMe；第四步，通氫氣形成Gln(OC13H9)OMe；第五步，加入CbZ-Ala；第六步，對(duì)CbZ-Ala活化；第七步，CbZ-Ala和Gln(OC13H9)OMe結(jié)合成肽；第八步，皂化脫甲酯；第九步，酸化脫去全部保護(hù)，形成N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文獻(xiàn)YasutsuguShimomishi.Studies on the Synthesis of Peptides Containing Glutamine as theC-Terminal.Y.Bull.Chem.Soc.Jpn.1962，35，1966)該方法反應(yīng)步驟太多，而且試劑昂貴，無實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
2、利用Z-Ala與HOSu在DCC作用下，于20～25℃反應(yīng)5h，過濾去二環(huán)己基脲，然后與未保護(hù)的Gln于碳酸氫鈉的水溶液中進(jìn)行合成。產(chǎn)物在甲醇中還原氫化，脫去保護(hù)基，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文獻(xiàn)Katoh，T.Kurauchi，M.US 5,032,675，Jul.16，1991)該方法的試劑昂貴，而且DCC反應(yīng)后的產(chǎn)物難以除去，生產(chǎn)過程復(fù)雜。
3、利用COCl2與Ala反應(yīng)生成混酐，然后與Gln在水中反應(yīng)，pH保持在10.2。最后在酸溶液中脫去保護(hù)，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文獻(xiàn)Frerst，P.Pfaendetr，P.Ger.Offen.DE3,206,784，01.Sep.1983)此方法的反應(yīng)步驟少，但該反應(yīng)難以反應(yīng)完全，副產(chǎn)物較多。
4、利用手性試劑氯代丙酸通過SOCl2活化，形成酰氯，然后與Gln在NaOH的水溶液中反應(yīng)，pH保持在10。產(chǎn)物為氯代丙酰谷氨酰胺，再與液氨在一定的壓力下反應(yīng)，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文獻(xiàn)Kunimi Inou，Yoshiyuki Yamada，US 5,380,934，Jan 10，1995)該反應(yīng)的原料為手性試劑，價(jià)格較高，在合成酰氯步驟中，溫度較高，副反應(yīng)較多。
5、通過Boc保護(hù)的丙氨酸，與HOSu在DCC作用下，形成活潑酯，該活潑酯滴加到谷氨酸r甲酯的飽和的碳酸氫鈉水溶液中，最后酸化，得到Boc保護(hù)的丙氨酰谷氨酸r甲酯二肽，產(chǎn)物通過三氟乙酸脫去Boc保護(hù)基，產(chǎn)物該甲酯產(chǎn)物與濃氨水室溫反應(yīng)24小時(shí)，即可得N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(潘和平，王良友，陳正英，徐琪壽，CN 1295079，2001.05.16)6、利用丙氨酸酯與谷氨酸或者谷氨酰胺在水和有機(jī)溶劑的混合溶劑中，在微生物的作用下，反應(yīng)溫度維持在20～60℃，pH保持在8～10，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(Behensky Peter Ing，Mirzajevova Marcela Ing，Netrval Jiri Rndr，SK70898，Oct.13，1999)7、通過氨基保護(hù)的丙氨酸，在三苯基氧磷和六氯乙烷的作用下，形成活潑酯，該活潑酯滴加到谷氨酰胺的飽和的堿水溶液中，得到氨基保護(hù)的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，然后脫去保護(hù)基，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文獻(xiàn)趙玉芬，唐果，周寧，ZL 02123369.1，2004.09.01)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種原料便宜、合成工藝簡單、設(shè)備簡單、成本低、產(chǎn)率高、有利于環(huán)保的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法。
N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法的步驟1)N端保護(hù)的氨基酸(I)10mmol，與三苯基氧磷(Ph3PO)10～20mmol，最佳15～20mmol，三光氣(C3O3Cl6)10～20mmol，最佳15～20mmol，在有機(jī)溶劑(II)中反應(yīng)1～5h，最佳2～3h，反應(yīng)溫度-5～30℃，最佳0～10℃，形成活潑酯；2)活潑酯與谷氨酰胺10～20mmol，最佳為15～20mmol，無機(jī)堿水溶液(III)的溶液中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為-5～10℃，最佳為0～5℃，pH控制在8.5～11，最佳為9.5～10.5；3)用無機(jī)酸(IV)酸化至pH≥3.0，最佳為2.0～3.0，然后脫去N端保護(hù)基團(tuán)(V)，可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，產(chǎn)率為30～65％。
其中(I)，N端保護(hù)的氨基酸主要選自芐氧羰基丙氨酸，叔丁氧羰基丙氨酸，N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸，N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸，N-(O，O-二異丙基)磷酰氨酸，N-(O，O-二正丁基)磷酰丙氨酸，等其中的一種；(II)有機(jī)溶劑主要選自二氯甲烷，甲苯，四氫呋喃，乙腈，1，2-二氯乙烷，二氧六環(huán)等其中的一種；(III)無機(jī)堿主要選自氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，碳酸氫鉀，碳酸鈉，碳酸鉀，等其中的一種；(IV)無機(jī)酸主要選自鹽酸，硫酸，硝酸，等其中的一種；(V)脫保護(hù)基所用試劑主要選自三氟乙酸，氯化氫/冰乙酸(含氯化氫的冰乙酸溶液)，溴化氫/冰乙酸(含溴化氫的冰乙酸溶液)，氯化氫/二氧六環(huán)(含氯化氫的二氧六環(huán)溶液)，溴化氫/二氧六環(huán)(含溴化氫的二氧六環(huán)溶液)，氫氣，等中的一種。
與已有的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法相比，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是1)原料極為便宜；2)合成工藝簡單，中間產(chǎn)物不需要分離，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物容易分離提純；3)活性酯在酸性介質(zhì)中形成，避免了有機(jī)堿引起的產(chǎn)物消旋化；4)在第二步反應(yīng)，采用了水相法，省去了谷氨酰胺氨基酸接保護(hù)基團(tuán)保護(hù)和脫除保護(hù)基團(tuán)，簡化了合成路線，縮短了時(shí)間；5)由于第二步采用了水相法，用無機(jī)堿代替了有機(jī)堿，降低了生產(chǎn)成本，有利于環(huán)保；6)反應(yīng)結(jié)束后，生成兩個(gè)產(chǎn)物，其一為所需的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，另一個(gè)為三苯基氧磷，三苯基氧磷為不揮發(fā)的固體，容易回收，還可為反應(yīng)原料重新投入反應(yīng)；7)整個(gè)合成過程中所采用的溶劑均易于回收再利用。
總之，本方法合成路線短，原料便宜易得，有利于環(huán)保，生產(chǎn)工藝合理，成本低，有著良好的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1三光氣20mmol用10mL二氯甲烷溶解，滴加到N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸10mmol，三苯基氧磷20mmol，和20mL二氯甲烷的混合體系內(nèi)，于-5℃反應(yīng)3h后，滴加到含有20mmol谷胺酰胺和20mL水中，反應(yīng)中用氫氧化鉀調(diào)pH為10，反應(yīng)溫度為0℃，滴加后反應(yīng)1.5h，然后用濃鹽酸酸化至pH為2.5，萃取得到含保護(hù)基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，該中間體用氯化氫/冰乙酸室溫反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用異丙醇-水重結(jié)晶得產(chǎn)物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。產(chǎn)率45％。
實(shí)施例2三苯基氧磷10mmol用30mL四氫呋喃溶解，滴加到N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸10mmol，三光氣15mmol，和10mL四氫呋喃的混合體系內(nèi)，于10℃反應(yīng)1h后，滴加到含有10mmol谷氨酰胺和20mL水中，反應(yīng)中用氫氧化鈉調(diào)pH為9，反應(yīng)溫度為10℃，滴加后反應(yīng)30min。然后用稀硝酸酸化至pH為1.5，萃取得到含保護(hù)基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，該中間體用溴化氫/冰乙酸室溫反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用甲醇-水重結(jié)晶得產(chǎn)物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。產(chǎn)率40％。
實(shí)施例3將三光氣15mmol溶于20mL甲苯中，5℃下滴加到N-(O，O-二異丙基)磷酰丙氨酸10mmol，三苯基氧磷15mmol的20mL甲苯中，然后5℃反應(yīng)2h后，滴加到含有20mmol谷氨酰胺和20mL水，5mL乙醇的混合液中，反應(yīng)中用碳酸鉀調(diào)pH為9.5，反應(yīng)溫度為5℃，滴加后反應(yīng)10min。然后用硫酸酸化至pH為1.0，萃取得到含保護(hù)基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，該中間體用三氟乙酸室溫反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出同體，將固體用乙醇-水重結(jié)晶得產(chǎn)物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。產(chǎn)率50％。
實(shí)施例4三苯基氧磷10mmol溶于1，2二氯乙烷10mL中，滴加到三光氣10mmol的1，2二氯乙烷10mL中，滴加溫度維持在0℃，滴加后，反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)液滴加到叔丁氧羰基丙氨酸10mmol的1，2二氯乙烷10mL中，反應(yīng)1小時(shí)后滴加到含有10mmol谷氨酰胺，水20mL中，反應(yīng)用氫氧化鉀調(diào)pH為11，反應(yīng)溫度為-5℃，滴加后反應(yīng)30min。然后用稀硝酸酸化至pH為1.5，萃取得到含保護(hù)基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，該中間體用三氟乙酸室溫反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用乙醇-水重結(jié)晶得產(chǎn)物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。產(chǎn)率35％。
實(shí)施例5三苯基氧磷10mmol用10mL二氧六環(huán)溶解，滴加到10mmol芐氧羰基丙氨酸，和三光氣10mmol，20mL二氧六環(huán)的混合體系內(nèi)，于15℃反應(yīng)5h后，滴加到含有15mmol谷氨酰胺，水20mL中，反應(yīng)中用碳酸氫鈉調(diào)pH為10.5，反應(yīng)溫度為0℃，滴加后反應(yīng)1.5h。然后用稀硫酸酸化至pH為1.5，萃取得到含保護(hù)基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，該中間體用氯化氫/二氧六環(huán)室溫反應(yīng)15h。反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用甲醇-水重結(jié)晶得產(chǎn)物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。產(chǎn)率30％。
實(shí)施例6三光氣20mmol用10mL二氧六環(huán)溶解，滴加到叔丁氧基丙氨酸10mmol，和三苯基氧磷20mmol，10mL二氧六環(huán)的混合體系內(nèi)，于30℃反應(yīng)1h后，滴加到含有20mmol谷氨酰胺，水20mL中，反應(yīng)中用碳酸鈉調(diào)pH為10，反應(yīng)溫度為8℃，滴加后反應(yīng)2h，然后用濃鹽酸酸化至pH為2.0，萃取得到含保護(hù)基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，該中間體溴化氫/冰乙酸室溫反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用甲醇-水重結(jié)晶得產(chǎn)物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。產(chǎn)率55％。
實(shí)施例7三苯基氧磷10mmol溶于甲苯10mL中，滴加到三光氣10mmol的甲苯10mL中，滴加溫度維持在20℃，滴加后，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)液滴加到芐氧羰基丙氨酸10mmol的甲苯10mL中，反應(yīng)1小時(shí)后滴加到含有15mmol谷氨酰胺，水20mL中反應(yīng)中用碳酸氫鈉調(diào)pH為8.5，反應(yīng)溫度為5℃，滴加后反應(yīng)1.5h。然后用鹽酸酸化至pH為2.5，固體用氫氣在甲醇-水中室溫反應(yīng)15h，得產(chǎn)物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。產(chǎn)率48％。
實(shí)施例8三光氣15mmol用10mL乙腈溶解，滴加到芐氧羰基丙氨酸10mmol，和三苯基氧磷15mmol，10mL乙腈的混合體系內(nèi)，于0℃反應(yīng)3h后，滴加到含有10mmol谷氨酰胺，水20mL中，反應(yīng)中用碳酸氫鉀調(diào)pH為8.8，反應(yīng)溫度為5℃，滴加后反應(yīng)2h。然后用硫酸酸化至pH為3.0，固體用氫氣在甲醇-水中室溫反應(yīng)15h，得產(chǎn)物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。產(chǎn)率65％。
權(quán)利要求
1.N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于其步驟為1)N端保護(hù)的氨基酸10mmol，與三苯基氧磷10～20mmol，三光氣10～20mmol，在有機(jī)溶劑中反應(yīng)1h～5h，反應(yīng)溫度-5～30℃，形成活潑酯；2)活潑酯與谷氨酰胺10～20mmol，在無機(jī)堿水溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為-5～10℃，pH控制在8.5～11；3)用無機(jī)酸酸化至pH≤3.0，然后脫去N端保護(hù)基團(tuán)，得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。
2.如權(quán)利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于在步驟1)中，所說的三苯基氧磷15～20mmol，三光氣15～20mmol，在有機(jī)溶劑中反應(yīng)2～3h，反應(yīng)溫度0～10℃，形成活潑酯。
3.如權(quán)利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于在步驟2)中，所說的谷氨酰胺15～20mmol，在無機(jī)堿水溶液進(jìn)行，反應(yīng)溫度為0～5℃，pH控制在9.5～10.5。
4.如權(quán)利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于在步驟3)中，所說的pH為2.0～3.0。
5.如權(quán)利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于N端保護(hù)的氨基酸選自N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸，N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸，N-(0，0-二異丙基)磷酰氨酸，N-(O，O-二正丁基)磷酰丙氨酸，芐氧羰基丙氨酸，叔丁氧羰基內(nèi)氨酸(Boc-L-Ala)中的一種。
6.如權(quán)利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于有機(jī)溶劑選自二氯甲烷，甲苯，四氫呋喃，乙腈，1，2-二氯乙烷中的一種。
7.如權(quán)利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于無機(jī)堿選自氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，碳酸氫鉀，碳酸鈉，碳酸鉀中的一種。
8.如權(quán)利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于無機(jī)酸選自鹽酸，硫酸，硝酸中的一種。
9.如權(quán)利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于脫保護(hù)基所用試劑選自三氟乙酸，氯化氫/冰乙酸，溴化氫/冰乙酸，氫化還原，氯化氫/二氧六環(huán)，溴化氫/二氧六環(huán)中的一種。
全文摘要
N(2)－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺二肽合成方法，涉及一種含氨基酸的二肽合成方法。提供一種原料便宜、合成工藝簡單、設(shè)備簡單、成本低、產(chǎn)率高、中間產(chǎn)物不需要分離和提純處理，產(chǎn)物容易分離提純，有利于環(huán)保的N(2)－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺二肽合成方法。其步驟為N端保護(hù)的氨基酸10mmol，與三苯基氧磷、三光氣在有機(jī)溶劑中反應(yīng)形成活潑酯；活潑酯與谷氨酰胺在無機(jī)堿水溶液進(jìn)行反應(yīng)；用無機(jī)酸酸化，脫去N端保護(hù)基團(tuán)。
文檔編號(hào)C07K5/00GK1683391SQ20051005408
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月2日
發(fā)明者唐果, 趙玉芬, 許鵬翔 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)