專(zhuān)利名稱(chēng)：人趨化因子的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞系，尤其是人趨化因子CKLF1的單克隆抗體以及生成該抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
人趨化因子CKLF1(Chemokine-like factor 1)是由北京大學(xué)人類(lèi)疾病基因研究中心在國(guó)際上首次克隆的一個(gè)細(xì)胞因子，它具有CC家族趨化因子的結(jié)構(gòu)特征和趨化功能(中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9107284.7)。體內(nèi)外的功能試驗(yàn)表明，CKLF1具有廣譜的趨化活性，不僅對(duì)造血干細(xì)胞有特殊的促增殖效應(yīng)，且對(duì)骨骼肌增殖也具有顯著的促進(jìn)作用。通過(guò)對(duì)CKLF1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠的肺組織病變明顯，表現(xiàn)為肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集，肺泡隔增厚、充血、水腫，與哮喘發(fā)病后期的病理改變相似，這提示CKLF1在呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)病過(guò)程中起重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供能與人趨化因子CKLF1特異性結(jié)合的單克隆抗體。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，它已于2005年3月24日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No 1335。
本發(fā)明還進(jìn)一步確認(rèn)了所述的單克隆抗體在體外用于檢測(cè)體液或病變組織中的CKLF1蛋白的表達(dá)。例如用于檢測(cè)各種體液如血液、血漿、血清、尿、淋巴液或腦脊液中的CKLF1的水平；還可以測(cè)定各種疾病如哮喘、系統(tǒng)性紅瘢狼蒼等自身免疫性疾病外周血淋巴細(xì)胞CKLF1的表達(dá)水平，作為臨床診斷或輔助診斷的一個(gè)標(biāo)志。
本發(fā)明制得的人CKLF1單克隆抗體，為CKLF1的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究提供了有利的工具。
本文利用趨化因子CKLF1的真核表達(dá)質(zhì)粒為免疫原，經(jīng)過(guò)肌肉免疫、常規(guī)細(xì)胞融合、篩選及克隆化，建立了穩(wěn)定分泌抗CKLF1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(M4克隆株)。經(jīng)ELISA、免疫印跡等方法的鑒定，雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體能夠特異地識(shí)別大腸桿菌表達(dá)的重組CKLF1和CKLF1的活性片斷C27和C19，且具有中和活性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CKLF1蛋白主要表達(dá)在活化的外周血單個(gè)核細(xì)胞上，且有分泌形式的存在。臨床研究資料表明，哮喘病人外周血的淋巴細(xì)胞表達(dá)高水平的CKLF1蛋白，本研究結(jié)果對(duì)于哮喘病人的診斷或輔助診斷、特異性治療以及發(fā)病機(jī)理的研究提供了新的思路。
抗人CKLF1單克隆抗體的成功制備，為深入研究CKLF1蛋白的生物學(xué)效應(yīng)、以及在人體內(nèi)各組織器官的分布、生理和病理情況下的變化、疾病的診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。
CKLF1單克隆抗體的應(yīng)用(1)FITC標(biāo)記的CKLF1單克隆抗體為探針，利用直接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)各種疾病如哮喘、系統(tǒng)性紅瘢狼蒼等自身免疫性疾病外周血淋巴細(xì)胞CKLF1的表達(dá)水平，作為臨床診斷或輔助診斷的一個(gè)標(biāo)志。
(2)利用該抗體和免疫組化檢測(cè)各種病變組織中的CKLF1蛋白的表達(dá)。
(3)該抗體作為試劑盒可以測(cè)定各種體液如血液、血漿、血清、尿、淋巴液或腦脊液中的CKLF1的水平。
(4)利用該抗體制備免疫親和層析柱，來(lái)分離純化CKLF1蛋白。
(5)利用該單抗進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)研究。
(6)該單抗作為CKLF1的拮抗劑，可以進(jìn)行藥理學(xué)研究，用于治療以CKLF1高表達(dá)而引起的各種疾病，如哮喘，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和SARS等。


圖1為圖1Western Blot檢測(cè)M4單克隆抗體與重組CKLF1的特異性反應(yīng)其中泳道1為大腸桿菌的裂解物+CKLF1多克隆抗體泳道2為重組CKLF1+CKLF1多克隆抗體泳道3為大腸桿菌的裂解物+CKLF1單克隆抗體(M4)
泳道4為重組CKLF1+CKLF1單克隆抗體(M4)圖2A趨化試驗(yàn)檢測(cè)M4單克隆抗體中和CKLF1-C19的趨化活性圖2B趨化試驗(yàn)檢測(cè)M4單克隆抗體中和CKLF1-C27的趨化活性圖3免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CKLF1蛋白在PHA刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)圖4流式細(xì)胞術(shù)分析哮喘病人和正常人外周血淋巴細(xì)胞表面CKLF1的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用PCR技術(shù)從PHA刺激的U937細(xì)胞cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增得到CKLF1基因的完整開(kāi)放讀碼框架序列，并將其克隆到pGEM-T easy(購(gòu)自Promega公司)載體中，經(jīng)序列測(cè)定獲得序列正確的克隆。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I酶切后，將插入片斷CKLF1釋放出來(lái)，克隆到真核表達(dá)載體pcDI的EcoR I位點(diǎn)中，篩選正向插入克隆，經(jīng)內(nèi)切酶鑒定正確，命名為pcDI-CKLF1質(zhì)粒(Biochem J.2001，357，127-135)。質(zhì)粒的大量提取、純化以及內(nèi)毒素的處理方法和步驟嚴(yán)格按照EndoFreeTMplasmid Giga Kits(Qiagen-tip 10000，Hilden，Germany)使用說(shuō)明書(shū)操作。
實(shí)施例2.雜交瘤細(xì)胞系的建立步驟1、動(dòng)物免疫將純化的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDI-CKLF1于BALB/C小鼠(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物研究中心提供)脛前肌沿肌纖維走向注射100ul/只(100ug)，注射后即行電針脈沖刺激(80mV，100mA)，3周后同劑量質(zhì)粒再次注射，10天后以間接ELISA(波長(zhǎng)為490nm)檢測(cè)小鼠血清中CKLF1蛋白多抗的效價(jià)，效價(jià)高者進(jìn)行下一步的細(xì)胞融合。
步驟2、細(xì)胞融合無(wú)菌制備pcDI-CKLF1免疫的小鼠脾細(xì)胞懸液，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0(來(lái)源于ATCC)以5∶1的比例在PEG1500(為Fluka產(chǎn)品)作用下融合，融合按常規(guī)法(Kohler G.and Milstein CContinuous culture of fused cellssecreting antibody of predefined specificity.Nature.1975；256495-497)，PEG用1ml，1分鐘內(nèi)緩慢加完，反應(yīng)時(shí)間為90秒，無(wú)血清的RPMI 1640(為GibcoBRL產(chǎn)品)培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000rpm離心10min，HAT(H次黃嘌呤、A氨基蝶呤、T胸腺嘧啶核苷，為Gibco BRL產(chǎn)品)完全1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至1×106/ml，加入已預(yù)先鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞(Balb/c小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞)的96孔平底板，100μl/孔，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天觀察并換液，10天后以HT1640(為Gibco BRL產(chǎn)品)培養(yǎng)基換液，1周后換完全1640培養(yǎng)基。
步驟3、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞(1)CKLF1多肽的合成與偶聯(lián)CKLF1的兩個(gè)活性片斷的合成由深圳翰宇(Hybio Engineering)中國(guó)有限公司按照標(biāo)準(zhǔn)方法化學(xué)合成。它們的序列分別是ALIYRKL LFNPSGPYQKKPVHEKKEVL(C27)和FNPSGPYQKKPVHEKKEVL(C19)。凍干的多肽，溶于磷酸鹽緩沖液中，濃度為1mg/ml于-80℃保存。用于多肽偶聯(lián)的載體蛋白Imject MaleimideActivated Bovine Serum Albumin(BSA)購(gòu)自PIERCE公司，C27和C19多肽與BSA的連接按照公司提供的說(shuō)明書(shū)操作，最后產(chǎn)生C27-BSA和C19-BSA的偶聯(lián)蛋白。
(2)ELISA試驗(yàn)以C27-BAS和C19-BSA的偶聯(lián)蛋白(1μg/ml)包被酶標(biāo)96孔板，37℃反應(yīng)2小時(shí)或4℃過(guò)夜；3％牛血清白蛋白(BSA)封閉，4℃過(guò)夜，加入待檢雜交瘤細(xì)胞(上述步驟2制得的細(xì)胞)培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時(shí)，SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(為Promega產(chǎn)品)37℃孵育1小時(shí)；鄰苯二胺(OPD)底物液顯色10-15min，2M H2SO4終止反應(yīng)。每步完成均用含0.05％Tween 20的PBS充分洗滌，ELISA Reader(Bio-Tek Instruments公司產(chǎn)品)測(cè)OD490值。所測(cè)的OD490值比陰性對(duì)照高10倍的克隆，進(jìn)行亞克隆化，并進(jìn)行擴(kuò)增凍存。
步驟4、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化—采用有限稀釋法將上述步驟3篩選得到的細(xì)胞以含白細(xì)胞介素6(IL-6)(300U/ml)的HT1640培養(yǎng)基稀釋至每孔1個(gè)細(xì)胞，鋪于U型96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，4小時(shí)內(nèi)鏡下觀察每孔實(shí)際細(xì)胞數(shù)，記錄單個(gè)細(xì)胞孔，待其長(zhǎng)成克隆且ELISA鑒定抗體分泌呈陽(yáng)性，即獲得單抗分泌株，大量擴(kuò)增并凍存，長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后，以相同的方法再次克隆化鑒定之，從而獲得了穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株M4。雜交瘤細(xì)胞株M4于2005年3月24日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.1335。
實(shí)施例3.體外培養(yǎng)法制備單抗將已經(jīng)建立的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞M4擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞濃度達(dá)105/ml時(shí)停止換液，持續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞全部死亡。收集培養(yǎng)上清，1500rpm，離心10分鐘，上清含有高水平的單克隆抗體，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例4.體內(nèi)誘生腹水法制備單抗挑選經(jīng)產(chǎn)Balb/c小鼠，腹腔內(nèi)注射0.5ml不完全弗氏佐劑(為Gibco BRL產(chǎn)品)，7天后每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml含2×106的M4雜交瘤細(xì)胞，7-10天后視小鼠腹部膨脹程度收集腹水，4℃離心，2500rpm離心20min，收集上清，分裝并放置-30℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例5單抗的特性鑒定步驟1、滴度測(cè)定取小鼠腹水做等比稀釋?zhuān)訡KLF多肽C27-BSA為檢測(cè)抗原，間接ELISA法(同實(shí)施例2步驟3)測(cè)定實(shí)施例4制備的抗體滴度，并以SP2/0誘生的小鼠腹水為陰性對(duì)照，ELISA檢測(cè)的結(jié)果是1∶105。
步驟2、單克隆抗體IgG亞類(lèi)鑒定取M4雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，用SIGMA公司提供的小鼠單克隆抗體同型試劑進(jìn)行。具體方法如下(1)在已包被C27-BSA蛋白的ELISA板中分別加入M4雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，室溫孵育2小時(shí)。
(2)用含0.05％Tween 20的PBS洗板三次。分別加入羊抗鼠的IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3(SIGMA公司產(chǎn)品)(用PBS11000稀釋)各100ul/孔，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。室溫孵育30分鐘。
(3)用含0.05％Tween 20的PBS洗板三次。加入HRP偶聯(lián)的兔抗羊IgG(SIGMA公司產(chǎn)品)(用PBST做1∶5000稀釋)，100ul/孔，室溫孵育15分鐘。
(4)用含0.05％Tween 20的PBS洗板三次，鄰苯二胺(OPD)底物液顯色10～15min。
(5)2M H2SO4終止反應(yīng)。
(6)ELISA Reader測(cè)OD490值，判斷單抗IgG亞類(lèi)。
結(jié)果表明，M4雜交瘤分泌的單抗為IgG1亞類(lèi)免疫球蛋白。
步驟3、單抗的純化將CKLF1單抗腹水用0.01mol/L，pH7.4的PBS對(duì)倍稀釋。在攪拌的條件下逐滴加入飽和硫酸銨至飽和度為50％，4℃靜置過(guò)夜。次日12000rpm，離心15分鐘，棄上清，沉淀溶于PBS中透析2天(期間換4次液)。利用HiTrapTMProtein G(為Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品)親和層析的方法(按說(shuō)明書(shū)操作)純化CKLF1蛋白的單克隆抗體。將純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，按常規(guī)方法進(jìn)行(分離膠為12.5％，濃縮膠為4.5％)。純化的抗體放-30℃保存?zhèn)溆貌襟E4、單抗穩(wěn)定性的測(cè)定復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，收集不同傳代次數(shù)的細(xì)胞上清，并用ELISA方法檢測(cè)其效價(jià)。結(jié)果表明M4細(xì)胞株能夠穩(wěn)定的產(chǎn)生單克隆抗體。
步驟5、單克隆抗體的反應(yīng)特異性(1)間接ELISA方法(同實(shí)施例2步驟3)檢測(cè)所得的單克隆抗體與CKLF1多肽反應(yīng)特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，M4單抗能與C27和C19發(fā)生特異性反應(yīng)，而與載體蛋白雞卵清蛋白(OVA)無(wú)交叉反應(yīng)。
表1ELISA檢測(cè)M4單抗與C27和C19的特異性反應(yīng)

上述CKLF1多克隆抗體的制備請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，200426(5)496-469。
(2)Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)M4單抗與CKLF1蛋白結(jié)合反應(yīng)將大腸桿菌體外翻譯系統(tǒng)合成重組CKLF1蛋白(Yanan Liu，DalongMa.Expression of Recombinant Chemokine-Like Factor 1 with a Cell-FreeProtein Biosynthesis system.Cell-Free Protein Expression.EditorDr.James R.Swartz，2nded，2003，ISBN 3-540-05041-8，Springer，Chapter 20，pp165-177)和大腸桿菌裂解物進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳，按常規(guī)方法在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Schleicher&Schuell公司產(chǎn)品)，用5％脫脂奶粉在4℃封閉過(guò)夜，加入由實(shí)施例4制備的CKLF1單抗，陽(yáng)性對(duì)照加入兔抗人CKLF1多克隆抗體(該多克隆抗體的制備請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2004 26(5)496-469)，室溫反應(yīng)1h，洗滌三次。隨后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，(為Promega產(chǎn)品)室溫反應(yīng)1h，洗滌三次。最后加NBT/BCIP(Promega產(chǎn)品)底物顯色。洗滌均用TBS-T(pH7.5，0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，0.05％Tween-20)，每次10min。結(jié)果如圖1所示，M4單抗與重組CKLF1蛋白有較強(qiáng)的特異性反應(yīng)；而與宿主菌裂解物無(wú)交叉反應(yīng)。
ELISA和Western Blot的結(jié)果都證明M4細(xì)胞株產(chǎn)生的單抗能與CKLF1分子發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合反應(yīng)，因此可以應(yīng)用到CKLF1的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究。
實(shí)施例6.異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記CKLF1單抗的制備將通過(guò)實(shí)施例5步驟3純化的CKLF1單克隆抗體(2mg/ml)在FITC標(biāo)記緩沖液(0.05Mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.5)中透析，然后與0.1mg FITC(SIGMA公司產(chǎn)品)混合，4℃反應(yīng)16小時(shí)，過(guò)Sephadex G-50柱(AmershamBiosciences公司產(chǎn)品)，收集標(biāo)記蛋白，標(biāo)記物加1％牛血清白蛋白和0.1％NaN3，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例7單克隆抗體對(duì)CKLF1活性片斷的中和活性作用表2.CKLF1單抗對(duì)C27和C19中和活件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將上述各組分混合，4℃孵育30分鐘后，放在37℃預(yù)溫，接著進(jìn)行趨化試驗(yàn)(Han wl，et al.Biochem J.2001，357，127-135)，該試驗(yàn)用的靶細(xì)胞是人T細(xì)胞白血病細(xì)胞Hut102細(xì)胞系(北京大學(xué)人類(lèi)疾病基因研究中心保存)。CKLF1的趨化活性用趨化指數(shù)(Chemotactic Index，CI)來(lái)表示，趨化指數(shù)高表明趨化活性強(qiáng)，反之則趨化活性弱。趨化試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)圖2A和2B，圖中顯示CKLF1的活性片斷C27和C19具有趨化人白血病細(xì)胞系Hut102的能力，而我們篩選的M4單克隆抗體分別與濃度為100ng/ml和1000ng/ml的C19多肽和C27多肽孵育一定的時(shí)間后，這兩個(gè)活性片斷的趨化指數(shù)明顯下降，說(shuō)明M4單抗具有明顯的中和活性。
實(shí)施例8單克隆抗體用于檢測(cè)外周血單核細(xì)胞的CKLF1表達(dá)免疫熒光實(shí)驗(yàn)(1)CKLF1在PHA刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞上的表達(dá)A外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和培養(yǎng)將肝素抗凝的20ml正常人外周血，用人淋巴細(xì)胞分層液(比重d＝1.077±0.001，購(gòu)自上海華精生物高科技有限公司)分離單個(gè)核細(xì)胞，然后加入終濃度為50ug/ml的植物血凝素(PHA，購(gòu)自Sigma公司產(chǎn)品)在37℃，5％的CO2孵箱中培養(yǎng)，取不同時(shí)間(0、8、24、48、72小時(shí))培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行下面的直接免疫熒光試驗(yàn)和免疫組化試驗(yàn)。
B直接免疫熒光試驗(yàn)將PHA刺激不同時(shí)間的單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗兩次，加入FITC標(biāo)記的CKLF1單抗(由實(shí)施例6制備)，4℃孵育30分鐘，用PBS(含0.1％的BSA和0.1％的疊氮鈉)洗2次，流式細(xì)胞儀(FACSCAlibur，美國(guó)BD公司生產(chǎn))分析CKLF1在細(xì)胞膜上的表達(dá)。為了檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的CKLF1的表達(dá)水平，我們將PHA刺激的細(xì)胞用3％的多聚甲醛冰浴10分鐘，然后用含0.1％TritonX-100和1％BSA的PBS室溫反應(yīng)30分鐘，1500rpm離心10分鐘，最后加入FITC標(biāo)記的CKLF1單抗，4℃孵育30分鐘，用PBS(含0.1％的BSA和0.1％的疊氮鈉)洗2次，流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BDBioscience公司產(chǎn)品)分析CKLF1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)密度。結(jié)果證明正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞的表面以及胞內(nèi)均能表達(dá)低水平的CKLF1分子，經(jīng)PHA活化后，細(xì)胞膜表面表達(dá)的CKLF1明顯上調(diào)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高；而細(xì)胞內(nèi)CKLF1的表達(dá)與膜表達(dá)則相反，胞內(nèi)CKLF1的表達(dá)在活化24小時(shí)最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸下降(見(jiàn)表3)。
表3.CKLF1在PHA刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞上的表達(dá)密度

C免疫組化試驗(yàn)將上述培養(yǎng)的細(xì)胞懸液滴在潔凈的載波片上，離心甩片，PBS洗2次，每次3分鐘，加3％過(guò)氧化氫室溫避光反應(yīng)8～10分鐘，以便去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS洗2次，加羊血清室溫孵育20分鐘；加入1∶100稀釋的M4單抗，室溫反應(yīng)40～60分鐘；PBS洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(為Promega產(chǎn)品)，室溫反應(yīng)40～45分鐘；PBS洗3次，加入DAB(SIGMA公司產(chǎn)品)顯色液，避光觀察。免疫組化的結(jié)果(見(jiàn)圖3)表明，PHA刺激0小時(shí)和8小時(shí)，基本上沒(méi)有檢測(cè)到CKLF1的表達(dá)，而在24小時(shí)和48小時(shí)，CKLF1的表達(dá)明顯上調(diào)，72小時(shí)表達(dá)下降，實(shí)驗(yàn)表明活化的人外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)高水平的CKLF1蛋白，且存在分泌形式。
直接免疫熒光和免疫組化的結(jié)果證明，制備的單克隆抗體能夠動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞中的CKLF1的表達(dá)，為深入研究CKLF1蛋白的生物學(xué)效應(yīng)、以及在人體內(nèi)各組織器官的分布、生理和病理情況下的變化、疾病的診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。
實(shí)施例9單克隆抗體用于檢測(cè)哮喘病人外周血淋巴細(xì)胞膜表面CKLF1的表達(dá)取哮喘病人的肝素抗凝血0.1ml，加入FITC標(biāo)記的抗人CKLF1單克隆抗體(由實(shí)施例6制備)，輕輕混勻，4℃避光反應(yīng)30分鐘。加入2ml冷的PBS(含0.1％BSA和0.1％NaN3)，2000rpm 4℃離心5分鐘，棄上清。加入溶人紅細(xì)胞溶解液1ml(用前37℃預(yù)熱)，充分混勻，37℃孵育5分鐘，立刻加入上述的PBS 2ml終止反應(yīng)。2000rpm 4℃離心5分鐘，棄上清，加入0.5ml冷的PBS懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD Bioscience公司產(chǎn)品)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果證明，急性發(fā)作期的哮喘病人外周血淋巴細(xì)胞中，CKLF1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和表達(dá)密度顯著高于正常人(表4，圖4)。因此可以將FITC標(biāo)記的CKLF1單克隆抗體為探針，利用直接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)諸如哮喘病人外周血淋巴細(xì)胞CKLF1的表達(dá)水平，作為臨床診斷或輔助診斷的一個(gè)標(biāo)志。
表4流式細(xì)胞計(jì)分析CKLF1在哮喘病人和正常人外周血淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)密度

N1-N3表示第1-第3個(gè)正常人P1-P4表示第1-第4個(gè)病人。
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞系，保藏號(hào)為CGMCC No.1335。
2.一種抗人CKLF1的單克隆抗體，由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在體外用于檢測(cè)體液或病變組織中的CKLF1蛋白的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗人CKLF1的單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞系，雜交瘤細(xì)胞系的保藏號(hào)為CGMCC No.1335。本發(fā)明的單克隆抗體可以用來(lái)檢測(cè)各種病變組織中的CKLF1蛋白的表達(dá)；該單克隆抗體還可作為探針，利用直接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)各種疾病如哮喘、系統(tǒng)性紅瘢狼蒼等自身免疫性疾病外周血淋巴細(xì)胞CKLF1的表達(dá)水平，作為臨床診斷或輔助診斷的一個(gè)標(biāo)志。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1840657SQ20051005971
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月31日
發(fā)明者陳英玉, 韓文玲, 馬大龍, 李婷, 張婷 申請(qǐng)人:北京大學(xué)