專利名稱：木鱉子含三萜皂甙成分提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥有效成分提取技術(shù)，涉及一種中藥木鱉子含三萜皂甙成分提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
木鱉子(Semen momordicae)為葫蘆科植物木鱉Momordica Cochinchinesis(Lour.)Spreng.的干燥成熟種子。木鱉為多年生藤本，主要分布在東南亞國家、蒙古、以及我國南方的大部分地區(qū)，如廣西、四川、湖北、湖南、貴州、云南、廣東、安徽等省。一般冬季采收成熟果實，剖開，曬至半干，除去果肉，取出種子，曬干備用。木鱉子為常用中藥，味苦、微甘，性涼，具有散結(jié)消腫，攻毒療瘡的功能。北宋《開寶本草》(公元973年)記載木鱉子治“婦人乳癰，肛門腫痛”?，F(xiàn)在該藥已收載于《中國藥典》和《中國獸藥典》。人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上常用于治療乳癰、腹瀉、腫毒、瘰疬等感染性疾病。
木鱉子作為一個抗感染中藥已經(jīng)在臨床上應(yīng)用了1000多年。木鱉子可以單味應(yīng)用，也可以和其他藥物配伍組成方劑使用。
化學(xué)分析表明木鱉子含脂肪酸、皂甙、蛋白質(zhì)以及α-菠菜甾醇、齊墩果酸、木鱉子酸等成分。最近的研究發(fā)現(xiàn)木鱉子的一種水提取物具有抗腫瘤(Tien et al.，2005；Tsoi et al.，2004；Wonget al.，2004)以及抗氧化活性(Tsoi et al.，2005)。Iwamnoto等(1985)從木鱉子中分離出兩種皂甙，momordica saponin I和II，并確認(rèn)I為絲石竹皂甙，II為一種含皂皮酸的皂甙。絲石竹皂甙為含雙糖鏈的三萜皂甙。一些具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的皂甙已被證明具有免疫佐劑作用，和疫苗同時應(yīng)用可以提高疫苗的免疫效果。
然而，木鱉子在許多醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中被認(rèn)為是一個有毒的中藥。張景岳在《本草正》中記載“木鱉子，有大毒，本草言其甘溫?zé)o毒，繆也。今見毒狗者，能斃于傾刻。”木鱉子水浸液，乙醇水浸液和乙醇浸出液靜脈或肌肉注射狗貓兔等動物，被注射動物血壓降低，于數(shù)日之內(nèi)死亡；木鱉子皂甙的小鼠LD50研究表明，靜脈注射為32.35mg/kg，腹腔注射為37.34mg/kg。
為了開拓我國傳統(tǒng)中藥的應(yīng)用價值，目前有將木鱉子含三萜皂甙提取物在免疫佐劑方面的應(yīng)用研究，然而，佐劑使用的途徑為包含在與疫苗中口服或注射，這使得傳統(tǒng)以外用為主的有毒的木鱉子不能直接應(yīng)用于佐劑，本發(fā)明的目的在于制備木鱉子中含三萜皂甙有效成分的提取物，去除其毒性成分，使木鱉子的應(yīng)用安全、可靠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種中藥木鱉子含三萜皂甙成分提取物的制備方法。所得到的木鱉子提取物為一種去除毒性的含三萜皂甙成分的黃色粉來。
本發(fā)明木鱉子含三萜皂甙成分提取物的制備方法包括以下步驟(1)將原料木鱉子粉碎后在40～50％乙醇中浸泡，回流提取2～5次，提取液過濾后減壓濃縮；(2)在濃縮液中加入澄清劑去除雜質(zhì)，靜置后取上清液，用乙醚萃取去除脂溶性成分，保留水層的水溶液；(3)水溶液用水飽和正丁醇萃取，減壓濃縮正丁醇萃取液至干，得黃色粉末狀木鱉子粗提物；(4)用50～80℃熱水溶解粗提物，調(diào)節(jié)pH至6～7，充分溶解后，將水溶解的木鱉子粗提物加入吸附性大孔樹脂柱，靜置15～30小時后，水洗去除非有效成分的雜質(zhì)；(5)用40～50％乙醇洗脫，減壓濃縮洗脫液，將濃縮的洗脫液真空干燥，得黃色粉末狀木鱉子精提物。
按以上方法獲得的木鱉子粗提物或木鱉子精提物產(chǎn)品均為本發(fā)明的產(chǎn)品，該產(chǎn)品中含三萜皂甙類化學(xué)成分。
具體實施例方式
實施例一木鱉子30公斤(購自安徽省亳州中藥材市場)，分3次提取，每次10公斤。首先將木鱉子粉碎，在40～50％乙醇中浸泡24小時；然后，乙醇回流提取3次，每次2小時；提取液過濾，減壓濃縮濾液(R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購自上海申生科技有限公司)；濃縮液加入101澄清劑(上海沃遜生物工程有限公司)，使最終濃度為5‰(101澄清劑與濃縮液重量體積比)，充分混勻，水浴加熱至60℃后，靜置24小時；取上清液，用乙醚萃取3次，以除去脂溶性成分；水層加入水飽和正丁醇萃取4次，以除去不溶于正丁醇的成分，減壓濃縮正丁醇萃液至干，得黃色殘留物；熱水洗出殘留物，用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6～7，使殘留物充分溶解；將溶液加至吸附性大孔樹脂(D101A，天津市海光化工有限公司產(chǎn)品)柱，靜置24小時，吸附有效成分；用蒸餾水洗柱除去雜質(zhì)，再用40～50％酒精洗脫；減壓濃縮洗脫液；濃縮液真空干燥，得淡黃色木鱉子提取物粉末，略帶清香味，對鼻粘膜有刺激性。三次提取分別獲得木鱉子20.58g、22.10g和19.63g，從30kg木鱉子中共獲提取物62.31g，平均得率為2.077g/kg。
實施例二將木鱉子的種仁和硬質(zhì)種皮分離，得種仁0.597kg和硬質(zhì)種皮0.401kg。按上述方法分別提取種仁和硬質(zhì)種皮。從0.401kg硬質(zhì)外種皮中獲得0.45g，得率為1.12g/kg；從0.597kg種仁中獲得2.02g，得率為3.38g/kg。
木鱉子提取物性質(zhì)的分析為證實本發(fā)明方法所得木鱉子提取物的性質(zhì)，以及是否含有三萜皂甙，特進(jìn)行以下試驗。
1.醋酐-濃硫酸反應(yīng)(Liebermann-Burchard reaction)取5mg木鱉子提取物溶于1ml醋酐中，加濃硫酸-醋酐(1∶20)5ml，開始出現(xiàn)為黃褐色，然后變?yōu)樯詈稚?br> 2.氯仿-濃硫酸反應(yīng)(Salkowski reaction)取5mg木鱉子提取物溶于1ml氯仿，后加入1ml濃硫酸，底部的濃硫酸層開始為黃褐色，然后變?yōu)樯詈稚?br> 3.表面活性取木鱉子提取物的水溶液2ml于具塞試管中，用力振搖，可產(chǎn)生持久性泡沫，且不因加熱而消失。
4.紫外光譜分析配制0.1mg/ml木鱉子提取物水溶液，用紫外分光光度計(Ultrospec3300pro，Biochrom Ltd公司)掃描，觀察木鱉子提取物水溶液的紫外吸收。在紫外分光光度計下從190nm-1100nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在200nm處有最大吸收峰。
以上結(jié)果提示木鱉子提取物含三萜皂甙。
5、木鱉子提取物的溶血作用取檸檬酸鈉抗凝的雞血，1500rpm10分鐘離心，棄去上清，用生理鹽水洗三次，配成2％的雞紅細(xì)胞懸液。配制5mg/ml的木鱉子提取物水溶液，在V型96孔血凝板的1～12孔中加入50ul生理鹽水，于第1孔加入50ul木鱉子提取物溶液，對倍稀釋，然后在各孔加入50ul雞紅細(xì)胞懸液，于37℃培養(yǎng)1小時，觀察溶血情況。根據(jù)公式V/PS計算溶血指數(shù)(hemolytic index，HI)，式中V每孔液體的總體積(ml)；P使紅細(xì)胞溶血的最低木鱉子提取物的百分比濃度；S加入孔中木鱉子提取物溶液的體積(ml)。96孔板上出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的最低濃度木鱉子提取物溶液位于第7孔，該孔木鱉子提取物濃度為0.0039％，根據(jù)溶血指數(shù)計算公式，HI＝V/PS＝100μl/(0.0039％×50μl)＝51200。
溶血作用提示木鱉子提取物含三萜皂甙成分。
6、木鱉子提取物的急性毒性試驗(1)木鱉子提取物靜脈注射LD50的測定取體重為19～21g的ICR小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組20只，雌雄各半。尾靜脈注射木鱉子提取物水溶液，各組注射劑量分別為115.50mg/kg、109.73mg/kg、104.24mg/kg和99.03mg/kg。注射前用75％酒精棉尾部消毒，緩慢注射，注射后，立即觀察小鼠的反應(yīng)，進(jìn)行記錄。靜脈注射木鱉子提取物的LD50為108.05mg/kg，95％可信限范圍為105.78～110.36mg/kg；(2)木鱉子提取物肌肉注射LD50的測定取體重為19～21g的ICR小鼠100只，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，每組20只，雌雄各半。腿部肌肉注射木鱉子提取物水溶液，各組注射劑量分別為240.00mg/kg、192.00mg/kg、153.60mg/kg、122.90mg/kg和98.30mg/kg，注射前用75％酒精棉腿部消毒，緩慢注射，注射后，立即觀察小鼠的反應(yīng)，進(jìn)行記錄。肌肉注射木鱉子提取物的LD50為178.09mg/kg，95％可信限范圍為160.10～198.09mg/kg。
靜脈注射木鱉子提取物的LD50為108.05mg/kg，肌肉注射木鱉子提取物為的LD50為178.09mg/kg，靜脈和腹腔注射均十分安全。
以上結(jié)果表明，按本發(fā)明的制備方法所得到的木鱉子提取物主要含三萜皂甙成分，已去除了毒性，靜脈注射和肌肉注射對小鼠均十分安全。肌肉注射小鼠、奶牛和豬未見局部刺激反應(yīng)。因此，本發(fā)明采用的制備方法去處了木鱉子中的毒性成分，使木鱉子含三萜皂甙成分提取物的應(yīng)用更加安全。
權(quán)利要求
1.木鱉子含三萜皂苷成分提取物的制備方法，其特征在于以下步驟(1)將原料木鱉子粉碎后在40～50％乙醇中浸泡，回流提取2～5次，提取液過濾后減壓濃縮；(2)在濃縮液中加入澄清劑去除雜質(zhì)，靜置后取上清液，用乙醚萃取去除脂溶性成分，保留水層的水溶液；(3)水溶液用水飽和正丁醇萃取，減壓濃縮正丁醇萃取液至干，得黃色粉末狀木鱉子粗提物；(4)用55～65℃熱水溶解粗提物，調(diào)節(jié)pH至6～7，充分溶解后，將水溶解的木鱉子粗提物加入吸附性大孔樹脂柱，靜置15～30小時后，水洗去除非有效成分的雜質(zhì)；(5)用40～50％乙醇洗脫，減壓濃縮洗脫液，將濃縮的洗脫液真空干燥，得黃色粉末狀木鱉子精提物。
2.按權(quán)利要求1所述木鱉子含三萜皂苷成分提取物的制備方法，其特征在于一種按以上方法獲得的木鱉子粗提物或木鱉子精提物產(chǎn)品，含三萜皂苷類化學(xué)成分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木鱉子含三萜皂甙成分提取物的制備方法。將中藥木鱉子粉碎后，用乙醇回流提取、乙醚萃取除去脂溶性成分、正丁醇萃取除去不溶于正丁醇的成分、吸附性大孔樹脂純化，獲得一種淡黃色具有清香味的木鱉子提取物粉末。理化分析和溶血試驗表明該提取物含三萜皂甙成分。本發(fā)明所得木鱉子含三萜皂甙提取物毒性低，肌肉注射小鼠、豬、牛后無局部刺激性，口服和注射應(yīng)用較為安全，在疫苗制造領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號C07J73/00GK1748725SQ20051006043
公開日2006年3月22日 申請日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日
發(fā)明者胡松華, 蕭琛聞 申請人:浙江大學(xué)