專利名稱：一種核苷酸類抗病毒藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核苷酸類抗病毒藥物，具體涉及一種質(zhì)子化的修飾性核苷酸；本發(fā)明還涉及此類化合物的藥用組合物，以及所述核苷酸在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒性疾病是人類所面臨的最大威脅之一。該類疾病的主要特點(diǎn)是它的高度傳染性(如HIV、SARS等)、病毒本身的易變性、某些病毒的致癌性(如HPV、EBV、HBV等)。尤其是，盡管病毒本身是一種結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的生物體，但已被證實(shí)為是一種最難控制的致病原，這就給抗病毒藥物的研發(fā)提出了空前的挑戰(zhàn)。
到目前為止，僅有少數(shù)幾種抗病毒藥物在臨床得到較廣泛使用。如Amentadine用于治療感冒病毒感染，Acyclovir用于皰疹病毒有關(guān)的疾病，Ganciclvir用于與巨細(xì)胞病毒有關(guān)的疾病，AZT、ddI、d4T等用于艾滋病的治療等。但這些抗病毒藥物均出現(xiàn)了嚴(yán)重的副作用，如嚴(yán)重影響神經(jīng)系統(tǒng)\腎功能及免疫細(xì)胞。因此，尋找新類型的抗病毒藥物已成為此類藥物研發(fā)的重點(diǎn)。
核苷酸是人體內(nèi)代謝的正常產(chǎn)物和前體，對(duì)核苷酸進(jìn)行修飾性改造，得到的修飾性核苷酸對(duì)人體的潛在性毒性會(huì)很小，有可能開發(fā)為一類新型安全有效的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類新型的抗病毒化合物。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，以天然核苷酸為基本結(jié)構(gòu)，利用優(yōu)化的化學(xué)合成途徑用某些取代基對(duì)5’、3’末端的保護(hù)及對(duì)糖基的修飾，所得到的修飾性核苷酸具有高效抗病毒感染活性，還能增加核苷酸的穩(wěn)定性，而且毒性低。
所述修飾性核苷酸可用于抑制廣泛的人類致病病毒的復(fù)制，其抑制機(jī)制是1.通過參入病毒RNA或DNA合成過程，使核酸鏈延伸終止；2.結(jié)合復(fù)制酶類，從而達(dá)到對(duì)病毒的抑制；3.抑制病毒誘導(dǎo)的核苷酸還原酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核苷酸庫(kù)的失衡。
所述人類致病病毒包括，但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、人單純皰疹病毒(HSV)、人巨細(xì)胞病毒(CMV)、人乙肝病毒(HBV)、人病肝病毒(HCV)、感冒病毒(influenza)。
所述修飾的核苷酸的基本結(jié)構(gòu)為

其中，X和Y分別為5′和3′端保護(hù)基團(tuán)，可為相同或不同的化學(xué)基團(tuán)。這些基團(tuán)選自直鏈烷基(如乙基、丙基、丁基)、羥基烷基(如羥丙基、羥丁基)、烷氧基烷基等；優(yōu)選的X或Y是正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、4-羥基正丁基(HO-CH3CH2CH2CH2-)；Z選自H、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的嘌呤基；優(yōu)選的Z是胸腺嘧啶基和H；A選自H、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烯基、烷基醇、苯酚基、烯醇等。
以下三個(gè)化合物(其代號(hào)分別為NBC-2、NBC-3和NBC-4)是本發(fā)明的優(yōu)選化合物，

結(jié)構(gòu)為

本發(fā)明還可以利用質(zhì)子化過程對(duì)修飾性核苷酸進(jìn)行酸化處理。所述質(zhì)子化或酸化是指將質(zhì)子或氫離子加到修飾性核苷酸中的磷酸或保護(hù)基團(tuán)的質(zhì)子受體上的過程。隨著化合物溶液的PH降低，核苷酸被質(zhì)子化修飾的程度隨之增加。當(dāng)質(zhì)子化的核苷酸溶于中性水時(shí)(PH值約為7)，由于核苷酸被質(zhì)子化，產(chǎn)生的溶液的PH也會(huì)降低。
合成方法為用堿基與酰胺化物(amidite)反應(yīng)，然后對(duì)3′和5′用保護(hù)基進(jìn)行保護(hù)。該合成方法為一步法過程，無需層析分離中間產(chǎn)物。利用此合成途徑，產(chǎn)量可達(dá)數(shù)克至數(shù)公斤，純度通常大于99％。
上述修飾性核苷酸還可進(jìn)一步經(jīng)脂質(zhì)體包裝，使其增加通透性及具有體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，抗病毒作用更好；所述脂質(zhì)體顆粒大小范圍在60nm～110nm之間，優(yōu)選范圍在80nm～100nm之間；所述脂質(zhì)體內(nèi)修飾性核苷酸與脂質(zhì)的比例(藥脂比)為1∶9～1∶3，優(yōu)選的藥脂比為1∶5～1∶3。
所述脂質(zhì)體含有中性脂類、膽固醇類或聚乙二醇類等物質(zhì)。在制備脂質(zhì)體的優(yōu)選方案中，使用如部分氫化的大豆卵磷脂(Partially hydrogenated soy phosphatidylcholine，PHSPC)、膽固醇(cholesterol)、末端甲氧基的聚乙二醇(methoxy-terminated polyethyleneglycol，mPEG)、乙醇胺磷酸二硬脂酸酯(distearoyl phosphatidyl ethanolamine，DSPE)為原料。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，所述脂質(zhì)體中含有部分氫化的大豆卵磷脂(PHSPC)、膽固醇、末端甲氧基的聚乙二醇-乙醇胺磷酸二硬脂酸酯，含量比例為50～60∶30～40∶5～10。
可采用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行脂質(zhì)體的制備。優(yōu)選采用乙醇注射法對(duì)修飾性核苷酸進(jìn)行包裝，所制備的脂質(zhì)體具有在體內(nèi)穩(wěn)定和循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)。
本發(fā)明利用測(cè)定細(xì)胞病變抑制方法對(duì)修飾性核苷酸進(jìn)行了抑制病毒生長(zhǎng)的活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明所提供的修飾性核苷酸，均呈現(xiàn)較強(qiáng)的抗病毒效果，且這種效應(yīng)是廣譜的。
本發(fā)明人還利用熒光光度法對(duì)修飾性核苷酸進(jìn)行了細(xì)胞毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，本發(fā)明提供的修飾性核苷酸抗病毒制劑具有抗病毒的特異性，而對(duì)宿主細(xì)胞基本無毒性。
經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的修飾性核苷酸對(duì)唇皰疹、生殖器官皰疹等病毒感染的患者也有滿意的療效。
用本發(fā)明提供的修飾性核苷酸可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種藥物可接受的載體、輔劑配合，制備成各種劑型的抗病毒藥物制劑。這些藥物可通過常規(guī)給藥方式應(yīng)用于臨床。
所述抗病毒藥物制劑包括口服劑，如片劑、膠囊，針劑、外用藥，如溶液劑、外用凝膠，外用藥膏，還可制成氣霧劑等。其制備方法可參照常規(guī)藥物制劑制備的方法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 NBC-3的化學(xué)合成將胸腺嘧啶(5.6克)溶于無水丙腈中，共蒸發(fā)后，再溶于85毫升無水二氯甲烷中。再將12.67克正丁基氰基乙基-N，N-二異丙基磷酰胺(n-butylcyanoethyl-N，N-diisopropylphosphoramidite)加入胸腺嘧啶溶液中。經(jīng)劇烈混勻后，加入3.32克(Tetrazole)，過夜攪拌。反應(yīng)混合物在鹽冰浴中(-10℃)冷卻后，緩慢加入10ml t-butylhydroperoxide的癸烷溶液(5～6M)。待反應(yīng)完成后(約2～3小時(shí))，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入分液漏斗，并用50毫升含5％二硫化鈉的二氯甲烷洗兩次，再用50毫升飽和氯化鈉洗一次。待乳濁液分層后，分出有機(jī)相。
有機(jī)相經(jīng)過濾后，用旋轉(zhuǎn)真空干燥器揮發(fā)二氯甲烷。再用乙醚洗滌含油的癸烷(3×25毫升)，并小心倒掉上層乙醚。再將油相溶于二氯甲烷后(12.5毫升)，加入125毫升乙醚。經(jīng)過約15分鐘靜放后，倒掉溶劑，并在真空中干燥油相。
最后將經(jīng)干燥的油相溶于甲醇(每克油加入10毫升甲醇)，并加入2當(dāng)量的NaOH，在室溫下攪拌約1～2小時(shí)，反應(yīng)混合物經(jīng)真空濃縮后，用干甲醇共蒸發(fā)除去殘留水分，使產(chǎn)物成為膠質(zhì)狀。再用丙腈將此膠質(zhì)物固體化(100毫升，約1～2小時(shí))，然后用真空干燥固體。此固體即為胸嘧啶-3’-5’雙磷酸丁酯(Thyamidine-3’-5’-bis-butyl phosphate)。
此產(chǎn)物經(jīng)31P NMR和1H NMR分析，其純度大于99％。
實(shí)施例2 NBC-3的質(zhì)子化NBC-3的質(zhì)子化可通過使用酸溶液來完成。這些酸溶液包括磷酸、硝酸，鹽酸或乙酸。在本實(shí)施例中，0.1N的HCl加入到NBC-3溶液中(每毫升100～300A260單位)直到PH達(dá)到1～4.5。
酸化處理后的NBC-3溶液經(jīng)柱層析(抗酸型BioRad或P4柱)，除去過量的酸和鹽。再經(jīng)冷凍干燥，獲得質(zhì)子化的NBC-3。
當(dāng)該化合物溶解于水或生理鹽水時(shí)，溶液的PH應(yīng)當(dāng)在1～4范圍內(nèi)。
實(shí)施例3 NBC-3脂質(zhì)體的制備制備方法采用乙醇注射法。首先將PHSPC，膽固醇和mPEG-DSPE按56∶38∶6溶于乙醇中(脂類終濃度為150mM，乙醇含量約為30％)，攪拌至清亮溶液。
在旋渦震蕩器上，緩慢將脂溶液加入到NBC-3溶液中(50mg/ml)。脂溶液與NBC-3溶液的比例為1∶2(v/v)。混合物經(jīng)200mm的聚碳酸酯膜擠壓過濾，形成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體溶液再經(jīng)超聲處理20秒，凍融四次(冷凍5分鐘，融解5分鐘)，最后，經(jīng)透析過夜除去乙醇。再經(jīng)Sepharose柱將脂質(zhì)體與未包裝的游離NBC-3分開。
用此法制備的脂質(zhì)體顆粒大小在60～110nm范圍之間，NBC-3-5脂類的藥脂比為1∶4。
實(shí)施例4 修飾性核苷酸抗病毒效應(yīng)的測(cè)定修飾性核苷酸的活性利用測(cè)定細(xì)胞病變抑制方法進(jìn)行(Snoeck R，Sakuma T，Clercy ED，Rosenberg A.Holy，Antimicrob.Agents Chemother 1988，32，1839-1844)。在96孔板中，HEL細(xì)胞用2-4 CCID5O(細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量)進(jìn)行感染。經(jīng)兩小時(shí)在37℃下吸附后，吸出未吸附病毒，加入含修飾性核苷酸的MEM+2％牛血清的培養(yǎng)液(100微升)。實(shí)驗(yàn)對(duì)每種劑量設(shè)兩孔重復(fù)。經(jīng)37℃培養(yǎng)6天后，利用觀察細(xì)胞病變(CPE)的方法，記錄抗病毒效應(yīng)。細(xì)胞首先用70％乙醇固定，然后用2.5％Giemse染色2小時(shí)，最后用蒸餾水洗三次，并在室溫下干燥。至此，培養(yǎng)液在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變?？共《拘?yīng)用EC5O表示(抑制50％細(xì)胞病變所需的藥物濃度)。結(jié)果見下表

從上表結(jié)果可見，本發(fā)明所提供的修飾性核苷酸，均呈現(xiàn)較強(qiáng)的抗病毒效果，且這種效應(yīng)是廣譜的。
實(shí)施例5 修飾性核苷酸的細(xì)胞毒性試驗(yàn)為了測(cè)定修飾性核苷酸對(duì)宿主細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)利用熒光光度法，對(duì)HEL細(xì)胞吸入propidium iodide(PI)的量進(jìn)行測(cè)量。若細(xì)胞處于健康狀態(tài)，則無PI的吸入，若細(xì)胞趨于死亡，則出現(xiàn)大量PI進(jìn)入細(xì)胞。3000 HEL細(xì)胞接種于96孔板的孔中(100微升NEM+10％牛血清)。24小時(shí)后，在每孔中加入經(jīng)系列稀釋的藥物。繼續(xù)培養(yǎng)3天后，每孔加入100微升PI溶液(每毫升培養(yǎng)液40微克)。在閉光條件下，保溫60分鐘后，將游離PI洗去。最后用熒光光度計(jì)對(duì)PI的參入進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞毒性用CS5O來表示(抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)所需的藥物濃度)。結(jié)果見下表

以上結(jié)果表明，本發(fā)明提供的修飾性核苷酸抗病毒制劑具有抗病毒的特異性，而對(duì)宿主細(xì)胞基本無毒性。
實(shí)施例6 NBC-3抗病毒感染的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果病例選擇用NBC-3進(jìn)行了抗皰疹病毒感染的臨床實(shí)驗(yàn)，5例受試者均有不同程度的皰疹，其感染程度由專科醫(yī)生確定。
實(shí)驗(yàn)藥物脂質(zhì)體包裝的NBC-3噴霧制劑，規(guī)格為20 A260單位/ml實(shí)驗(yàn)方法每日于患處噴藥物3次，每次100微升；2周后由?？漆t(yī)生檢查并記錄治療效果；感染程度按輕重分為10個(gè)等級(jí)，其中1為最輕級(jí)，10為最重級(jí)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果受試者局部用藥后，均明顯減輕了感染程度，具體結(jié)果見下表

權(quán)利要求
1.一種抗病毒化合物，其結(jié)構(gòu)為 其中，X和Y選自直鏈烷基、羥基烷基、烷氧基烷基；Z選自H、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的嘌呤基；A選自H、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烯基、烷基醇、苯酚基、烯醇。
2.權(quán)利要求1所述的抗病毒化合物，是質(zhì)子化的化合物；其中X和/或Y選自正丁基或4-羥基正丁基；Z選自胸腺嘧啶基或H；A選自H或甲氧基。
3.權(quán)利要求1所述的抗病毒化合物，其中X和Y均為CH3CH2CH2CH2-，Z是胸腺嘧啶基，A是H。
4.權(quán)利要求1所述的抗病毒化合物，特征是以脂質(zhì)體形式存在。
5.權(quán)利要求4所述的抗病毒化合物，所述脂質(zhì)體中含有下述物質(zhì)的一種或幾種；中性脂類、膽固醇類、聚乙二醇；脂質(zhì)體中藥脂比為1∶9～1∶3；脂質(zhì)體顆粒大小為60～110nm。
6.權(quán)利要求5所述的抗病毒化合物，所述脂質(zhì)體顆粒大小為80nm～100nm；藥脂比為1∶5～1∶3。
7.權(quán)利要求5所述的抗病毒化合物，所述脂質(zhì)體中含有部分氫化的大豆卵磷脂(PHSPC)、膽固醇、末端甲氧基的聚乙二醇—乙醇胺磷酸二硬脂酸酯，含量比例為50～60∶30～40∶5～10。
8.權(quán)利要求7所述的抗病毒化合物，所述脂質(zhì)體中部分氫化的大豆卵磷脂(PHSPC)、膽固醇、末端甲氧基的聚乙二醇—乙醇胺磷酸二硬脂酸酯含量比例為56∶38∶6，顆粒大小為80nm～100nm，藥脂比為1∶4。
9.一種抗病毒藥物組合物，含有權(quán)利要求1～8所述的抗病毒化合物。
10.用權(quán)利要求1～8所述的化合物制備抗病毒藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核苷酸類抗病毒藥物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一類修飾性核苷酸具有抗病毒作用，可用于制備抗病毒感染的藥物。
文檔編號(hào)C07H19/10GK1687101SQ200510064329
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月14日
發(fā)明者羅德瑞克·M·K·戴爾 申請(qǐng)人:奧林格斯技術(shù)有限公司