專利名稱：核因子－kB p50亞基結(jié)合肽及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種治療用核因子-κB(NF-κB)p50亞基拮抗肽，更具體而言，涉及一種能夠與核因子-κB p50亞基特異結(jié)合并抑制其活性的小分子肽。本發(fā)明還涉及這種核因子-κB p50亞基拮抗肽的制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
NF-κB是普遍存在于幾乎所有細(xì)胞胞漿中的一種轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，具有調(diào)控多種參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡和增殖以及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的功能。NF-κB系由兩種Rel家族蛋白構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)。根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和合成方式等方面的差異，可將Rel蛋白家族分成兩類一類是前體蛋白p105和p100，其C術(shù)端含錨蛋白重復(fù)序列(ankin repeat motif)，可通過ATP依賴的蛋白水解過程裂解，變?yōu)槌墒斓膒50和p52。該類蛋白缺乏反式激活結(jié)構(gòu)域，無獨(dú)立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能；另一類是RelA(p65)、Rel(c-Rel)、v-Rel和RelB，其C末端含有1個(gè)或多個(gè)反式激活域(transactivationdomain)，具有獨(dú)立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能[1]。
當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB主要與κB抑制蛋白(IκBs)結(jié)合形成三聚體，以無活性方式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到前炎癥細(xì)胞因子、病毒、內(nèi)毒素、紫外線、氧化劑和放射線等多種外界信號(hào)刺激而啟動(dòng)細(xì)胞第二信使系統(tǒng)時(shí)，IκBs在IκB激酶(IKK)的作用下發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB失去IκBs的嚴(yán)格控制而被激活，并移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，其亞基形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)與靶基因啟動(dòng)子內(nèi)的特定部位結(jié)合，高效誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(如TNF、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-11、IL-17等)、趨化因子(如IL-8、RANTES、MIP-1α、MCP-2等)、粘附分子(如ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1等)、免疫受體(如IL-2R)以及參與炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大的多種酶(如NO合成酶、環(huán)氧化酶等)的表達(dá)[2]。NF-κB所誘導(dǎo)的一些蛋白可進(jìn)一步反轉(zhuǎn)活化NF-κB，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大和延續(xù)。基于上述認(rèn)識(shí)，許多學(xué)者認(rèn)為抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性將為炎性相關(guān)疾病的治療開辟新的途徑。另外，NF-κB在細(xì)胞凋亡和增殖中也發(fā)揮重要作用，其可通過直接上調(diào)凋亡抑制因子(c-IAP1、c-IAP2、和IXAP)、TNF受體相關(guān)因子(TRAF1和TRAF2)、鋅指蛋白A20、超氧化錳歧化酶、Bcl-2同系物A1/Bfl-1和IEX-IL等抗凋亡基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡[3]。在腫瘤治療中，化療和放療可使NF-κB活化，致使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療耐藥和對(duì)放射線不敏感。因此，抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，降低腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力不失為提高抗癌藥物治療功效的良策[4]。
由于NF-κB強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，NF-κB的過渡活化在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的作用如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、慢性腎小球性腎炎、幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎、炎癥性腸道疾病等慢性炎性疾病[5，6，7，8]，膿毒癥、膿毒性休克、急性腎小球性腎炎等急性炎性疾病[9]，Alzheimer′s病[10]，動(dòng)脈粥樣硬化[11]，系統(tǒng)性紅斑自狼瘡等身免疫性疾病[12]和癌癥的發(fā)生和發(fā)展均于NF-κB過度或持續(xù)活化密切相關(guān)。另外，NF-κB也參與了鼻病毒、流感病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒、HTL病毒和HIV病毒等在感染細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，在這些病毒的感染和致病過程中起著重要的作用[13]。
鑒于NF-κB在上述疾病的發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用，以NF-κB及其信號(hào)傳導(dǎo)通路中的相關(guān)蛋白為靶點(diǎn)，研發(fā)NF-κB相關(guān)疾病的治療藥物已成為本領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。目前國外有關(guān)以NF-κB為靶點(diǎn)的拮抗治療策略主要包括以下幾個(gè)方面[14，15，16，17](1)應(yīng)用傳統(tǒng)抗炎藥物——糖皮質(zhì)激素等激素藥物直接地或間接地部分拮抗NF-κB的活性；(2)抗氧化治療如抗氧化劑——乙酰半胱氨酸、阿司匹林水楊酸鈉和吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)等作為NF-κB的抑制劑，其中PDTC作為NF-κB的抑制劑已受到眾多研究者的青睞；(3)抑制IκK的形成及活性如靶向IκKα的反義核酸，可阻止IκKα的形成，從而緩解或減輕IκB的磷酸化及降解過程，最終達(dá)到抑制NF-κB活性的目的；NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB essential modifier，NEMO)是IκK蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)維持Iκ的功能有重要作用。May等設(shè)計(jì)了針對(duì)NEMO的抗炎多肽，該多肽包含NEMO結(jié)合域(NEMO binding domain，NBD)，它可以與NEMO結(jié)合，阻止NEMO與IκKβ的連接，從而抑制IκK的活性及其后續(xù)效應(yīng)；(4)減少IκB的降解某些蛋白酶小體抑制劑如MG101、MG115、MG132、PS-341、lactacystin以及近來發(fā)現(xiàn)的epoxomicin均可通過抑制IκB的降解從而拮抗NF-κB的活性，某些絲氨酸蛋白酶抑制劑如TLCK(N alpha-p-tosyll-L-lysinechloromethyl ketone)、TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)以及分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑也具有類似的功能；(5)促進(jìn)IκB的生成應(yīng)用IκBα的腺病毒表達(dá)載體，使IκBα顯性失活突變體過量表達(dá)，可明顯抑制NF-κB的核移位及其后續(xù)效應(yīng)。(6)抑制NF-κB的合成如針對(duì)p50和p65的反義寡脫氧核苷酸可與編碼NF-κB的基因及mRNA結(jié)合，進(jìn)而阻斷基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，最終抑制NF-κB的形成。設(shè)計(jì)針對(duì)NF-κB家族高保守區(qū)的核酶，可對(duì)編碼NF-κB的mRNA進(jìn)行切割破壞，在mRNA水平阻斷NF-κB的形成。
上述以NF-κB為靶點(diǎn)的治療策略在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中已表現(xiàn)出不同程度的療效。但上述措施均存在特異性欠佳的問題。事實(shí)上，要獲得最佳的治療效果并盡可能地減少系統(tǒng)毒性，則應(yīng)注意NF-κB靶性治療的特異性。如糖皮質(zhì)激素是NF-κB的強(qiáng)效抑制劑，但全身應(yīng)用時(shí)具有擾亂內(nèi)分泌和物質(zhì)代謝的副作用[18]。而抗氧化劑對(duì)NF-κB活性的抑制效應(yīng)更無特異性可言[19]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，PDTC具有很強(qiáng)的毒副作用。蛋白酶小體，它除了可降解IκB外，還具有其他許多重要的功能，因此抑制蛋白酶小體活性將導(dǎo)致潛在的嚴(yán)重副作用[5]。盡管有學(xué)者認(rèn)為IκK、IκB對(duì)NF-κB的調(diào)節(jié)是特異性的，但迄今的研究尚無足夠的證據(jù)表明IκK、IκB對(duì)其他的蛋白分子不具備調(diào)節(jié)作用，因此就不能確切的肯定靶向IκK、IκB的措施對(duì)NF-κB活性的干預(yù)就是特異性的。抑制NF-κB的合成策略對(duì)于NF-κB是特異性的，但在一些急性炎癥反應(yīng)性疾病中，NF-κB的活化(而不是合成)過程(細(xì)胞質(zhì)中無活性的NF-κB→活化入核→與DNA結(jié)合→啟動(dòng)基因表達(dá))更為重要，因此抑制NF-κB的合成策略并非最優(yōu)選擇。從NF-κB的整個(gè)活化途徑不難看出，NF-κB與DNA順式元件的結(jié)合是特異性的，也是NF-κB啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄的必經(jīng)之路。只有對(duì)NF-κB與DNA順式元件的結(jié)合實(shí)施直接的干預(yù)措施，才能達(dá)到真正意義上的特異性。而對(duì)NF-κB活化的上游途徑進(jìn)行干預(yù)則難以達(dá)到這一目的。
由p50和p65兩亞基形成的異二聚體是NF-κB的典型代表，是NF-κB所有形式中最重要的一種，幾乎存在于體內(nèi)所有細(xì)胞，其含量遠(yuǎn)高于其它二聚體。此異二聚體的氨基末端可構(gòu)成1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，由其介導(dǎo)與DNA堿基特異性結(jié)合。晶體衍射分析顯示，p50/p65異源二聚體與免疫球蛋白κ鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異性結(jié)合的方式為p50亞單位的Arg-54、Arg-56、Tyr-57、Glu-60、His-64和Lys-241氨基酸殘基與κB序列5′端的5′-G-5G-4G-3A-2C-1-3′堿基系列特異結(jié)合；p65亞單位的Arg-33、Arg-35、Arg-36、Glu-39、和Arg-187，與κB序列3′端的5′-T+1T+2C+3C+4-3′4個(gè)堿基對(duì)特異結(jié)合。另外，由NF-kB p50/p65異源二聚體的氨基端和二聚化結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，還可非特異地識(shí)別DNA核糖磷酸骨架[20]。即由p50和p65 N末端共同構(gòu)成的這一環(huán)狀結(jié)構(gòu)域形成了NF-κB的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)其與順式作用元件的結(jié)合，值得注意的是，這種結(jié)合為特異性結(jié)合。NF-κB激活靶基因首先需要DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別靶基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的順式作用元件，并與之結(jié)合，后在p65反式激活域的輔助下，激活靶基因的表達(dá)。在NF-κB(p50/p65異源二聚體)與其順式作用元件κB基序的結(jié)合過程中，p50亞基在其中起主要作用。因此，若我們獲得能夠拮抗p50亞基與其順式作用元件結(jié)合的多肽，則勢(shì)必能夠達(dá)到拮抗NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的效果，最終達(dá)到抑制NF-κB調(diào)控靶基因表達(dá)及治療急慢性炎癥相關(guān)疾病的目的[20]。
隨著20世紀(jì)80年代后期崛起的一種研究蛋白質(zhì)相互作用的有力工具——酵母雙雜交技術(shù)的建立、成熟和發(fā)展，對(duì)NF-κB拮抗多肽的篩選工作最終成為可能。酵母雙雜交系統(tǒng)具有很高的靈敏度，能檢測(cè)微弱而短暫的蛋白質(zhì)間相互作用，且該系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)生于酵母細(xì)胞胞內(nèi)和/或核內(nèi)。與原核細(xì)胞相比，真核酵母細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯和加工更加接近哺乳細(xì)胞，以其為工程菌研究蛋白質(zhì)的相互作用將更佳接近哺乳細(xì)胞的生理狀態(tài)，即保持蛋白質(zhì)天然的折疊狀態(tài)，使蛋白質(zhì)間相互作用更接近哺乳細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)水平。因此，應(yīng)用該系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)間的相互作用已得到愈來愈廣泛的應(yīng)用，特別對(duì)胞內(nèi)靶蛋白相互作用蛋白或多肽的篩選，此系統(tǒng)更為首選[21]。NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子，存在于細(xì)胞漿中，但于細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。因此，我們選用酵母雙雜交系統(tǒng)，以NF-κB p50保守結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌蛋白，從一個(gè)16肽的隨機(jī)肽庫中篩選NF-κB相互作用多肽，并鑒定這些多肽的功能。目前我們已篩選獲得9種NF-κB p50亞基結(jié)合肽，這里所列的是其中一種具有拮抗NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的p50結(jié)合肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能夠與核因子-κB p50亞基專一結(jié)合，并能夠抑制核因子-κB活性及其所調(diào)控基因表達(dá)的核因子-κB拮抗肽。
本發(fā)明的另一目的是提供此核因子-κB拮抗肽的醫(yī)療用途。
本發(fā)明的核因子-κB p50亞基拮抗肽，其氨基酸序列如下Asn Thr Trp Gly Met Leu Ser Leu Arg Ile Ile Val Arg Leu Val Arg Arg Asn Ser Tyr Tyr Gly ThrGln Asp Asn Ser His Leu Ala Arg Val His Phe Leu Leu本發(fā)明還包括，本發(fā)明的核因子-κB p50亞基拮抗肽在制備抗核因子-κB的藥物中的應(yīng)用。所述抗核因子-κB的藥物是治療免疫相關(guān)疾病的藥物或抗腫瘤的藥物。其中所述炎性相關(guān)疾病是膿毒癥、膿毒性休克、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、急慢性腎小球性腎炎、系統(tǒng)性紅斑自狼瘡等，其中所述腫瘤是肝癌、胃癌、食道癌、乳腺腫瘤、膀胱癌、前列腺腫瘤等。
本發(fā)明還包括，含有本發(fā)明的核因子-κB p50亞基拮抗肽的藥物組合物。組合物中可以含有藥物可接受的載體。組合物可以以任何形式的藥物制劑形式存在，優(yōu)選的是注射劑，最優(yōu)選的是冷凍干燥注射劑，該藥物制劑形式藥物組合物，可以按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備，包括將藥物活性成分，本發(fā)明的多肽與藥物載體混合，按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制成所需要的劑型。
具有上述氨基酸序列結(jié)構(gòu)的多肽可與核因子-κB p50亞基專一結(jié)合，并阻斷核因子-κB與其順式作用元件的結(jié)合，從而抑制核因子-κB的生物學(xué)活性，即核因子-κB調(diào)控各種靶基因表達(dá)的活性。此種結(jié)構(gòu)多肽既可以以多肽形式單獨(dú)存在，也可與其它蛋白和多肽融和，或被甲基化、乙酰化和氨基化等修飾，或進(jìn)行個(gè)別氨基酸的突變或替代，或插入蛋白質(zhì)表面的特定部位，如凸環(huán)區(qū)，或與其它物質(zhì)連接。無論以什么形式存在，含此結(jié)構(gòu)多肽的物質(zhì)可能表現(xiàn)出與核因子-κB p50亞基結(jié)合，并抑制核因子-κB活性的作用。
本發(fā)明通過酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得與核因子-κB p50亞基新型結(jié)合多肽，并證實(shí)了此條多肽具有抑制核因子-κB生物活性的功能，這對(duì)于設(shè)計(jì)和研制新型抗核因子-κB的藥物具有重要意義。
研究結(jié)果表明，本發(fā)明篩選到的多肽不僅能夠競(jìng)爭(zhēng)性阻斷核因子-κB與其順式作用元件的結(jié)合，也能夠抑制核因子-κB所調(diào)控的靶基因的表達(dá)，因而可以成為新的抗核因子-κB藥物或藥物前體，本發(fā)明的核因子-κB拮抗肽在制造抗核因子-κB的藥物中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值及廣闊的市場(chǎng)前景。
另外，本發(fā)明的核因子-κB p50亞基結(jié)合肽作為生物制劑也有著潛在的應(yīng)用價(jià)值，如作為配體用于核因子-κB的親和純化、作為探針用于核因子-κB的檢測(cè)等等。
根據(jù)核因子-κB p50亞基結(jié)合肽氨基酸序列，可以有多種獲取本發(fā)明氨基酸序列的物質(zhì)的方法，如固相合成方法，溶液中合成方法，基因重組方法，以及其它化學(xué)方法合成。以上制備方法可以采用多肽合成和制備的常規(guī)方法，如教科書中的方法，優(yōu)選的制備方法列在本發(fā)明的具體實(shí)施例中。
含此氨基酸序列的物質(zhì)可有各種應(yīng)用方式，主要包括在體外和體內(nèi)抑制核因子-κB的活性，以各種給藥方式實(shí)現(xiàn)以抑制核因子-κB活性為目的的疾病治療，以及核因子-κB的檢測(cè)或純化等。
含本發(fā)明氨基酸序列的物質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用還包括1、通過合成或基因重組的方式，將含此序列的肽段與其它蛋白或肽融合或進(jìn)行化學(xué)修飾，用于以抑制核因子-κB活性為目的的各種炎性相關(guān)疾病、自身免疫疾病、腫瘤以及其它相關(guān)疾病的治療。
2、將其與瓊脂糖偶聯(lián)后，用于核因子-κB的親和分離。
3、將其與指示標(biāo)簽偶聯(lián)后，用于核因子-κB的鑒定。


圖1A為GST融合肽大腸桿菌表達(dá)結(jié)果。M為蛋白Marker；GST為pET-42a(+)空載體表達(dá)產(chǎn)物；1為GST-結(jié)合肽融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物。
圖1B為GST融合肽GST親和層析純化的結(jié)果。M為蛋白Marker；1、2、3、4、5、6分別為GST(pET-42a(+)表達(dá)產(chǎn)物)純化前、GST過柱后產(chǎn)物、GST純化產(chǎn)物、GST-結(jié)合肽純化前、GST-結(jié)合肽過柱后產(chǎn)物、GST-結(jié)合肽純化產(chǎn)物。
圖2為GST-結(jié)合肽融合蛋白與核因子-κB p50亞基結(jié)合的生物傳感器的檢測(cè)結(jié)果圖3為ELISA檢測(cè)GST-結(jié)合肽融合蛋白與核因子-κB p50亞基的特異性結(jié)合的結(jié)果。GST為pET-42a(+)空載體表達(dá)產(chǎn)物；GST-結(jié)合肽為GST-結(jié)合肽融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物。
圖4為ELISA方法檢測(cè)GST-結(jié)合肽融合蛋白對(duì)核因子-κB p50亞基與核因子-κB順式作用元件結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果曲線圖5為Pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GST-結(jié)合肽融合蛋白與核因子-κB p50亞基相互作用結(jié)果圖。M、1、2、3、4、5、6分別為低分子量蛋白Marker、GST(pET-42a(+)空載體)表達(dá)產(chǎn)物、GST表達(dá)產(chǎn)物過柱液、GST與p50結(jié)合后的洗脫液、GST-結(jié)合肽表達(dá)產(chǎn)物、GST-結(jié)合肽表達(dá)產(chǎn)物過柱液、GST-結(jié)合肽與p50結(jié)合后的洗脫液。
圖6為熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)GST-結(jié)合肽融合蛋白對(duì)核因子-κB反應(yīng)性熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的抑制效應(yīng)。A、B、C、D、E、F、G、H分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+0.5μg/mLGST-結(jié)合肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+1μg/mL GST-結(jié)合肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+2μg/mL GST-結(jié)合肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+4μg/mL GST-結(jié)合肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+8μg/mL GST-結(jié)合肽。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、核因子-κB p50亞基結(jié)合肽與GST的融合表達(dá)與純化根據(jù)結(jié)合多肽的基因序列，在保持多肽蛋白基因編碼序列不變的情況下，按照大腸桿菌偏愛密碼子，分別設(shè)計(jì)并合成上游基因序列含BamH I，下游基因序列含Sal I粘性末端的互補(bǔ)DNA片段，DNA序列如下，DNA序列的合成由上海生物有限工程公司合成。
FP5’-GATCAACACTTGGGGTATGCTGAGCCTGCGTATCATCGTTCGCCTGGTTCGTCGTAACTCCTACTACCGTCGTAACTCCTACTACGGCACCCAGGACAACAGCCACCTGGCACGCGTTCACTTCCTGCTG-3’RP5’-TCGACAGCAGGAAGTGAACGCGTGCCAGGTGGCTGTTGTCCTGGGTGCCGTAGTAGGAGTTACGACGGTAGTAGGAGTTACGACGAACCAGGCGAACGATGATACGCAGGCTCAGCATACCCCAAGTGTT-3’用無菌雙蒸水將上述DNA序列溶解，終濃度為20μM，后取20μl FP和20μl RP于一無菌EP管中，充分混合，后將混合物放入94℃水浴變性，室溫放置讓水浴自然冷卻，使多肽基因序列能夠緩慢退火形成雙鏈。再用T4連接酶將多肽基因序列插入經(jīng)BamH I/Sal I雙酶切的pET 42a載體內(nèi)，并轉(zhuǎn)化CaCl2法制備的E.coli DH-5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取數(shù)個(gè)單菌落進(jìn)行酶切鑒定，并測(cè)序。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET42a/結(jié)合肽轉(zhuǎn)化CaCl2法制備的E.col.BL-21感受態(tài)細(xì)胞，挑取新鮮轉(zhuǎn)化的單菌落，接種于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶100比例將過夜菌菌液轉(zhuǎn)接于200ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.5～0.6，加IPTG至終濃度為0.1-0.5mmol/L，移至30℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心收集菌體，菌體可進(jìn)行純化或凍存于-70℃。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體按原菌液1/10的體積重懸于PBS中，后加入50mmol/L PMSF 15μl后超聲破碎細(xì)胞(6×10sec×40hz)，再加入終濃度為1％的Triton X-100，輕輕振蕩20min，于4℃，12000r/m離心15min取上清，加DTT至終濃度為1mmol/L。同時(shí)用10倍柱體積的PBS液平衡谷胱甘肽瓊脂糖4B親和樹脂，后取適量的上述上清液上柱，使GST-結(jié)合肽融合蛋白與樹脂結(jié)合，再用10倍柱體積的PBS液洗去非特異結(jié)合的雜蛋白。最后用10mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫目的蛋白，并通SDS-PAGE鑒定其純度，純化蛋白經(jīng)蒸餾水充分透析去除還原型谷胱甘肽后凍干于-20℃保存。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，GST-結(jié)合肽融和蛋白為可溶性表達(dá)，表達(dá)量約為總蛋白量的24％(圖1A)。經(jīng)GST親和純化后融和蛋白純度達(dá)到82％以上(圖1B)實(shí)施例2、生物傳感器(Biosensor)檢測(cè)GST-結(jié)合肽融合蛋白與核因子-κB p50亞基的結(jié)合將羧甲基葡聚糖生物傳感片裝入Iasys Plus系統(tǒng)微射流卡盤，用60μl PBS/T(pH7.4PBS，0.05％吐溫20)沖洗3次，平衡10min，待基線走平后采集基線數(shù)據(jù)5min；將EDC和NHS按1∶1比例混合，取40μl混合液沖洗樣品池2次，后再在樣品池中加入40μl混合液，保留7min以激活傳感片表面；用50μl PBS/T沖洗樣品池3次采集基線值1min；用40μl 10mM pH5.5的乙酸緩沖液沖洗樣品池3次，后再加入40μl乙酸緩沖液，采集基線值1min；然后在樣品池中加入40μl用乙酸緩沖液稀釋的總量約為0.5μg的p50標(biāo)準(zhǔn)蛋白；反應(yīng)20min后用PBS/T沖洗3次，并采集基線值1min；用40μl 1M pH8.0的Tris-Hcl緩沖液沖洗樣品池3次，并保留3min以封閉未反應(yīng)的NHS；用40μl 10mM HCl沖洗3次，除去傳感片上殘留的沒用發(fā)生共價(jià)結(jié)合的p50標(biāo)準(zhǔn)蛋白；用50μl PBS/T沖洗3次，采集基線值1min，4℃放置待后進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。
用蛋白結(jié)合緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.2，100mM NaCl，10mM MgCl2，10uM ZncL2，1mM DTT，0.1％(v/v)NP40)將GST-結(jié)合肽融合蛋白稀釋成1μg/mL，取50μl融合蛋白稀釋液加入樣品池，溫度25℃，結(jié)合反應(yīng)5～10min；待反應(yīng)完全，用50μl蛋白結(jié)合緩沖液沖洗樣品池3次，以洗脫非特異性結(jié)合，待反應(yīng)曲線走平后采集反應(yīng)曲線值1min；用40μL10mM HCl沖洗樣品池3次，再生傳感片；再用50μl蛋白結(jié)合緩沖液沖洗樣品池3次，采集基線數(shù)據(jù)1min，開始新一輪的結(jié)合反應(yīng)。
Biosensor結(jié)果表明，本發(fā)明的p50拮抗肽能高親和與p50結(jié)合，見圖2。
實(shí)施例3、ELISA方法檢測(cè)GST-結(jié)合肽融合蛋白與核因子-κB p50亞基的特異性結(jié)合用去離子水洗ELISA平板包被孔數(shù)次，倒置平版，并在一清潔濾紙上拍打平板，去除剩余的水份；用PBS緩沖液稀釋p50蛋白，濃度為10μg/ml；加100μl稀釋的p50蛋白至96孔酶聯(lián)板的包被孔中，室溫孵育3～4h或4℃過夜孵育，注意水份蒸發(fā)；用300μl PBS洗孔3次，去除未結(jié)合的p50蛋白；制備5％的脫脂奶粉水溶液，每孔加入200μl，室溫孵育1h或4℃過夜孵育封閉包被孔；用蛋白結(jié)合緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.2，100mM NaCl，10mM MgCl2，10uM ZncL2，1mM DTT，0.1％(v/v)NP40)洗板5次；樣品檢測(cè)孔加入0.5μmol/L的GST-結(jié)合肽(蛋白結(jié)合緩沖液稀釋)100μl/孔，共20孔。陰性對(duì)照孔加入0.5μmol/L的GST純化蛋白(蛋白結(jié)合緩沖液稀釋)100μl/孔，共20孔。于樣品檢測(cè)孔和陰性對(duì)照孔中分別加入終濃度分別為0μg/ml、20μg/ml、100μg/ml、400μg/ml的p50蛋白，各濃度行5個(gè)復(fù)孔，以此通過未包被的p50蛋白與包被的p50蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地p50結(jié)合肽結(jié)合來驗(yàn)證GST-結(jié)合肽與p50蛋白的特異性結(jié)合，室溫結(jié)合1h；PBST(PBS+0.1％TWEEN-20)洗板3次后加入抗GST的單克隆抗體(1∶1000稀釋于PBS中)100μl/孔，室溫孵育1h；PBST洗板3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(按產(chǎn)品說明要求稀釋于PBS中)100μl/孔，室溫孵育1h；PBST洗板3次后加入顯色液100μl/孔避光保存顯色5～10min，加入1mol/LH2SO4O50μl/孔終止反應(yīng)，立即測(cè)定OD450。
結(jié)果表明，本發(fā)明的GST-結(jié)合肽融合蛋白可特異性地與p50結(jié)合，隨著p50加入量的增加，多肽與包被蛋白的結(jié)合減少，見圖3。
實(shí)施例4、ELISA方法檢測(cè)GST-結(jié)合肽融合蛋白對(duì)核因子-κB p50亞基與核因子-κB順式作用元件結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)于包被了核因子-κB順式作用元件的96孔酶聯(lián)板(購自美國Clontech公司的MercuryTMTransfactor p50 kits)中加入150μl/孔轉(zhuǎn)錄因子封閉液，室溫孵育15min；棄轉(zhuǎn)錄因子封閉液后加入50μl/孔用轉(zhuǎn)錄因子封閉液稀釋的檢測(cè)樣品，樣品分別為含10ng/μl的p50標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為陽性對(duì)照、含10ng/μl的p50標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)加入系列濃度GST融合肽以及含10ng/μl的p50標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)加入相同系列濃度GST純化蛋白的樣品，室溫孵育1h，空白對(duì)照為加入50μl轉(zhuǎn)錄因子封閉液；加入轉(zhuǎn)錄因子封閉液150μl/孔洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉(zhuǎn)錄因子封閉液以1∶500稀釋的p50抗體100μl/孔，室溫孵育1h；加入轉(zhuǎn)錄因子封閉液150μl/孔洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉(zhuǎn)錄因子封閉液以1∶1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP二抗100μl/孔，室溫孵育30min；加入轉(zhuǎn)錄因子緩沖液250μl/孔洗滌4次，每次4min，去除洗滌液；加入TMB底物，室溫孵育10min，待液體變藍(lán)后，用100μl/孔的終止液終止反應(yīng)；于450nm和630nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。p50結(jié)合肽對(duì)p50與其順式作用元件結(jié)合的抑制百分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為(同一濃度GST純化蛋白OD-同一濃度GST融合肽OD)/p50標(biāo)準(zhǔn)蛋白陽性對(duì)照OD。
結(jié)果表明，本發(fā)明的GST-結(jié)合肽融合蛋白可特異性抑制p50與其順式作用元件的結(jié)合，而這種抑制效應(yīng)具有量效關(guān)系，既抑制作用隨著肽濃度的升高而增加，而GST則不影響p50與其順式作用元件的結(jié)合，如圖4所示。
實(shí)施例5、Pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GST-結(jié)合肽融合蛋白與核因子-κB p50亞基相互作用按PIERCE公司的GST pull-down assay試劑盒操作說明書進(jìn)行。先將1ml谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析樹脂裝柱在一次性注射器的針管中，用預(yù)冷的PBS自然過濾洗滌4～6次(5mL/次)并平衡樹脂；然后加入經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-結(jié)合肽融合蛋白的大腸桿菌超聲破碎的上清液5ml，將GST-結(jié)合肽融合蛋白固化在谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析樹脂上，用預(yù)冷的PBS自然過濾洗滌10次(5mL/次)。洗去未結(jié)合的雜蛋白；加入2mL蛋白結(jié)合緩沖液(142.5mmol/LKCl，5mmol/L MgCl2，0.2％(v/v)諾乃洗滌劑-40，10mmol/L N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸，pH7.2，1mmol/L EDTA)冰上預(yù)孵30min后，最后加入經(jīng)原核重組表達(dá)獲得的粗制p50蛋白5ml，自然過濾并捕獲目的蛋白，再用預(yù)冷的PBS過濾洗滌10次，洗去未結(jié)合的蛋白，最后加入1mL洗脫液(10mmol/L還原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，室溫孵育30min后，過濾。收集最后的過濾產(chǎn)物行SDS-PAGE分析。同時(shí)用pET-42a(+)空載體表達(dá)獲得的GST蛋白做陰性對(duì)照。
實(shí)施例6、核因子-κB p50亞基拮抗肽對(duì)核因子-κB反應(yīng)性報(bào)告基因表達(dá)的抑制實(shí)驗(yàn)。
1640培養(yǎng)基培養(yǎng)U937細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞密度調(diào)整為0.5～2.5×105個(gè)/mL，過夜培養(yǎng)；取1mL過夜培養(yǎng)細(xì)胞或以0.5×105個(gè)細(xì)胞/孔細(xì)胞量加入24孔培養(yǎng)板；取3μL GeneJuice轉(zhuǎn)染試劑加入100μL無血清1640培養(yǎng)基中，旋渦混勻，室溫放置5min；取1μg p4kB-Luc質(zhì)粒加入GeneJuice/1640培養(yǎng)基混合物中，輕輕吹打混勻，室溫放置5-15min；將上述混合物逐滴加入完全培養(yǎng)基中，輕輕震蕩，使混合物和細(xì)胞充分混勻；37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染5h后，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液培養(yǎng)1h后用PBS洗細(xì)胞3次，最后將細(xì)胞重懸于100μL的無血清1640培養(yǎng)基中；用PBS將GST-結(jié)合肽稀釋成6個(gè)不同濃度(加入培養(yǎng)基后的終濃度分別為0、0.5、1、2、4、8μg/mL)，體積為50μL的融合蛋白液，同時(shí)用PBS將2μLChariot轉(zhuǎn)染試劑稀釋成50μL，將不同濃度的GST-結(jié)合肽與Chariot轉(zhuǎn)染試劑混合，輕輕吹打混勻，室溫放置30min。將100μL GST-結(jié)合肽/Chariot轉(zhuǎn)染試劑混合液逐滴加入上述100μL無血清1640培養(yǎng)基重懸的U937細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕震蕩，使混合物和細(xì)胞充分混勻；37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h；除去轉(zhuǎn)染液，將培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為1μg/mL的LPS進(jìn)行刺激，培養(yǎng)2h后吸取細(xì)胞500g離心5min，PBS洗滌細(xì)胞一次，除盡PBS上清；以100μl/孔加入1×CCLR細(xì)胞裂解緩沖液；渦旋EP管10-15s，4℃，12000rpm離心2min，取上清，-70℃保存或直接檢測(cè)熒光素酶的活性；于96孔檢測(cè)板中加入100μL/孔熒光素酶檢測(cè)試劑后，再加入100μL/孔細(xì)胞裂解液后立刻讀數(shù)，并打印或記錄數(shù)據(jù)。
結(jié)果表明，本發(fā)明的GST-結(jié)合肽融合蛋白對(duì)核因子-κB反應(yīng)性熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)具有抑制作用，且這種抑制作用具有量效關(guān)系，既抑制作用隨著蛋白濃度的升高而增加，而對(duì)照GST蛋白則不具有這種抑制作用，如圖5所示。由此說明，我們篩選獲得的p50結(jié)合肽具有抑制核因子-κB轉(zhuǎn)錄活性的功能，既具有抑制核因子-κB調(diào)控炎癥介質(zhì)等基因表達(dá)的功能。
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<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院<120>核因子-kB p50亞基結(jié)合肽及其制備與應(yīng)用<160>1<210>1<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>1Asn Thr Trp Gly Met Leu Ser Leu Arg Ile Ile Val Arg Leu Val1 5 10 15Arg Arg Asn Ser Tyr Tyr Gly Thr Gln Asp Asn Ser His Leu Ala20 25 30Arg Val His Phe Leu Leu3權(quán)利要求
1.一種特異性地與核因子-κB p50亞基結(jié)合，并特異性地拮抗核因子-κB活性的多肽，其氨基酸序列如下Asn Thr Trp Gly Met Leu Ser Leu Arg Ile Ile Val Arg Leu Val Arg Arg Asn Ser TyrTyr Gly Thr Gln Asp Asn Ser His Leu Ala Arg Val His Phe Leu Leu
2.權(quán)利要求1的多肽在制備抗核因子-κB的藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，所述抗核因子-κB的藥物是治療炎性免疫相關(guān)疾病的藥物或抗腫瘤的藥物。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述炎性相關(guān)疾病是膿毒癥、膿毒性休克、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、急慢性腎小球性腎炎、系統(tǒng)性紅斑自狼瘡，其中所述腫瘤是肝癌、胃癌、食道癌、乳腺腫瘤、膀胱癌、前列腺腫瘤。
5.含有權(quán)利要求1的多肽的藥物組合物。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中含有藥物可接受的載體。
7.權(quán)利要求5的藥物組合物，以任何形式的藥物制劑形式存在。
8.權(quán)利要求5的藥物組合物，是注射劑。
9.權(quán)利要求5的藥物組合物，是冷凍干燥注射劑。
10.權(quán)利要求1的多肽的制備方法，其特征在于，所述方法選自常規(guī)的固相合成方法、溶液中合成方法，基因重組方法或化學(xué)合成方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及核因子－ κBp50亞基結(jié)合肽及其制備與應(yīng)用，更具體而言，涉及一種能夠與核因子－κBp50亞基特異結(jié)合并抑制其活性的小分子肽，其氨基酸序列見序列表。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1687128SQ200510069428
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日
發(fā)明者梁華平, 徐祥, 王正國 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院