專利名稱：一種新的重組人干擾素α2b的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物蛋白的分裂純化方法，更具體地說，涉及一種新的重組人干擾素α2b的分離純化方法。
背景技術(shù)：
重組人干擾素α2b具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖以及提高免疫功能等作用。干擾素與細(xì)胞表面受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)繁殖，提高免疫功能，包括增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性和天然殺傷性細(xì)胞的功能。
文獻(xiàn)報(bào)道的重組人干擾素α2b的純化方法主要有兩大類，親和層析法和非親和層析法。親和層析法得到的重組人干擾素α2b的純度一般達(dá)96％以上，回收率也一般達(dá)60％(閻玉清，王曉沁，巫愛珍等.人干擾素α2b生產(chǎn)工藝的研究.生物工程學(xué)報(bào)，1996，12(1)232271)，但其缺點(diǎn)是親和層析柱價(jià)格昂貴，使用次數(shù)有限，清洗、再生和保存煩瑣，載量也不適合大規(guī)模生產(chǎn)，所以難以應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模；另一方面，在純化過程中鼠IgG易從親和層析上脫落，導(dǎo)致異源蛋白的污染，而非親和層析方法則可避免上述缺點(diǎn)，從而大大降低成本。
目前工業(yè)化生產(chǎn)的重組人干擾素α2b多以不溶性包涵體形式表達(dá)。不溶性包涵體的形成有兩個(gè)主要原因(1)重組人干擾素α2b在大腸桿菌中的高效表達(dá)，產(chǎn)量很高，容易相互聚集形成包涵體，(2)含二硫鍵的重組人干擾素α2b在大腸桿菌胞漿中表達(dá)，因處在還原狀態(tài)的細(xì)胞環(huán)境中，重組人干擾素α2b會(huì)形成錯(cuò)誤的二硫鍵，導(dǎo)致形成沉淀。
所以，在工業(yè)化生產(chǎn)重組人干擾素α2b的過程中，需要在裂解、溶解后，經(jīng)過變性、復(fù)性的過程才能得到與天然構(gòu)象相似的結(jié)構(gòu)，因此純化工藝必須摸索出恰當(dāng)?shù)臈l件，保證表達(dá)的重組人干擾素α2b恢復(fù)到天然構(gòu)象。
為此目的，現(xiàn)有的工業(yè)化生產(chǎn)重組人干擾素α2b的工藝都是采用鹽析與超濾脫鹽、鹽濃度梯度洗脫與透析等流程，它們普遍存在的問題是(1)復(fù)性效率低傳統(tǒng)的稀釋復(fù)性法對(duì)樣品幾十倍、甚至上百倍的稀釋會(huì)使樣品的體積急劇增大，給后續(xù)的分離純化帶來很大的困難，而且復(fù)性過程中需要較大的復(fù)性容器；透析法耗時(shí)較長，而且要多次更換透析溶液。這兩種方法的共同缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中會(huì)發(fā)生聚集而產(chǎn)生大量沉淀，復(fù)性效率低，通常蛋白質(zhì)的活性回收率只有5-20％，而且復(fù)性后的蛋白質(zhì)溶液中含有大量的雜蛋白，需要進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化；(2)工藝路線煩瑣，生產(chǎn)周期長在傳統(tǒng)的重組蛋白質(zhì)分離純化工藝中，大多采用經(jīng)典的軟凝膠分離介質(zhì)，由于這種介質(zhì)的顆粒較大，分離效率較差，因此常常需要采用多種不同模式的色譜操作聯(lián)用對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，才能得到純度符合一定標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)蛋白質(zhì)。另外，這種色譜介質(zhì)的耐壓性很差，只能在流速較低的情況下進(jìn)行操作，分離純化時(shí)間較長；分離純化步驟多和分離時(shí)間長使得蛋白質(zhì)的質(zhì)量回收率和活性回收率很低；而且在傳統(tǒng)的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)工藝中，蛋白質(zhì)的復(fù)性和純化是生產(chǎn)過程中兩個(gè)獨(dú)立的單元操作，也在很大程度上制約著生產(chǎn)效率；(3)生產(chǎn)成本高，設(shè)備投資大由于復(fù)性和分離純化分別單獨(dú)進(jìn)行，而且分離純化步驟多，每一步都需要有與之配套的設(shè)備，致使設(shè)備投資大，生產(chǎn)成本高，隨著生產(chǎn)規(guī)模的增加，這種弊端會(huì)愈來愈嚴(yán)重。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的重組人干擾素α2b的分離純化方法，其包括下述步驟(1)破碎發(fā)酵完畢的重組人干擾素α2b大腸桿菌工程菌，離心得沉淀；(2)將沉淀按1∶5-20(重量/體積)比例加入4M尿素/TE溶液，離心得沉淀；
(3)將沉淀按1∶5-25(重量/體積)比例加入Tris-HCl溶液，離心得沉淀；(4)將沉淀按1∶2-10(重量/體積)加入8M鹽酸胍+DTT裂解液，離心，取上清液，測蛋白含量；(5)將上清液倒入H3BO3溶液中攪拌均勻，稀釋后的溶液蛋白含量為0.15-0.08mg/ml，復(fù)性，得復(fù)性液；(6)向復(fù)性液中緩慢滴加6M HCl，調(diào)PH2.0-3.0，離心，收集上清液，緩慢滴加6M NaOH(體積/體積)，調(diào)PH 7.8-8.0；(7)將硫酸銨粉末緩慢加入上清液中，溶解后過濾，取濾液；(8)依次進(jìn)行疏水柱M1柱層析、CM-Sepharose柱層析、疏水柱M2柱層析和S-100分子篩層析。
在上述的方法中，在步驟(5)中優(yōu)選地分兩步達(dá)到最終濃度，首先將上清液在H3BO3溶液中稀釋至蛋白含量為2-10mg/ml，然后再在H3BO3溶液中稀釋至蛋白含量為0.15-0.08mg/ml。
在上述的方法中，在步驟(5)中，復(fù)性優(yōu)選地是在2-10℃靜置10-24小時(shí)。
在上述的方法中，在步驟(8)中，疏水柱M1柱層析優(yōu)選地如下進(jìn)行將疏水凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用1M硫酸銨平衡液平衡5-15個(gè)柱體積后上樣；用1M硫酸銨溶液洗脫1-5個(gè)柱體積至基線平衡后，再用0.5M硫酸銨洗脫液洗脫，收集洗脫峰。
在上述的方法中，在步驟(8)中，CM-Sepharose柱層析優(yōu)選地如下進(jìn)行將CM-Sepharose凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用25mM AAB平衡液平衡5-15個(gè)柱體積后上樣；更換25mMAAB(300mM NaCl)緩沖液洗脫，收集洗脫峰。
在上述的方法中，在步驟(8)中，疏水柱M2柱層析優(yōu)選地如下進(jìn)行將疏水凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用1M(NH4)2SO4平衡液平衡5-15個(gè)柱體積后上樣；用1M硫酸銨溶液洗脫1-5個(gè)柱體積至基線平衡后，再用0.5M硫酸銨洗脫液洗脫，收集洗脫峰。
在上述的方法中，在步驟(8)中，S-100分子篩層析優(yōu)選地如下進(jìn)行將S-100凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用0.1M PB緩沖液平衡1-5個(gè)柱體積，至流出液pH7.2±0.1后上樣；用0.1M PB緩沖液洗脫，收集活性峰。
在步驟(8)的柱層析純化步驟中，(a)疏水柱M1柱層析可以去除未正確折疊的干擾素α2b及干擾素α2b多聚體，復(fù)性率超過30％；(b)CM-Sepharose柱層析可以去除熱原質(zhì)；(c)疏水柱M2柱層析可以濃縮樣品并有復(fù)性作用，重組人干擾素α2b盡可能地接近了天然干擾素α2b的構(gòu)象；(d)S-100柱層析可以更換緩沖系統(tǒng)，去除干擾素α2b多聚體。
本工藝減少了純化步驟，進(jìn)行純化過程的集成，使工藝流程順暢，無迂回，生產(chǎn)配置無瓶頸。本工藝CM、疏水柱M2、S-100可以在一天內(nèi)完成上樣洗脫的過程。疏水柱層析可以采用擴(kuò)張床技術(shù)，為大規(guī)模自動(dòng)化生產(chǎn)的再放大提供了可能。
本工藝采用疏水層析技術(shù)，柱膠便宜，柱膠清洗、再生容易，載量大，細(xì)菌或細(xì)胞裂解液可直接上樣，不需預(yù)處理，在國際上已成為一種大規(guī)模自動(dòng)化首選的純化工藝。
具體實(shí)施例方式
下面以實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1初制干擾素1、TE洗菌將菌體取出，置流水中迅速溶化，加入預(yù)冷的TE溶液，攪勻，4℃ 4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄上清留沉淀。
2、超聲破菌將懸濁菌液置冰浴環(huán)境中，1分鐘/次，間隔1分鐘，超聲25-30次。顯微鏡檢查，破菌率應(yīng)大于98％。按工程菌重量1∶5(重量/體積)比例加入預(yù)冷的TE溶液，攪勻，4℃，10000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，棄上清，稱沉淀重量。
3、尿素溶解沉淀按1∶10(重量/體積)比例加入預(yù)冷的4M尿素/TE溶液，吹打均勻，4℃ 10000轉(zhuǎn)/分離心25分鐘，棄上清留沉淀，稱沉淀重量。
4、Tris-HCl洗滌沉淀按1∶15(重量/體積)比例加入預(yù)冷的Tris-HCl溶液，吹打均勻后4℃ 10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄上清留沉淀，稱沉淀重量。
5、鹽酸胍裂解沉淀按1∶10(重量/體積)加入8M鹽酸胍+DTT裂解液，室溫裂解2小時(shí)。取裂解后菌液18000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄沉淀，取上清，記錄體積，取樣測蛋白含量。
6、硼酸復(fù)性6.1首次稀釋將5獲得的上清液入裝有H3BO3溶液的不銹鋼桶中，攪拌均勻，稀釋后的溶液蛋白含量為4mg/ml。
6.2二次稀釋將6.1溶液倒入裝有H3BO3溶液的不銹鋼桶中，攪拌均勻，稀釋后的溶液蛋白含量為0.1mg/ml。放置2-8℃冰箱復(fù)性過夜。
7、調(diào)PH值，離心將復(fù)性液邊攪拌邊緩慢滴加6M HCl，調(diào)PH2.0-3.0，于2-8℃放置2小時(shí)后，以18000轉(zhuǎn)/分連續(xù)離心，蠕動(dòng)泵流速(400ml/min，)收集的上清液邊攪拌邊緩慢滴加6M NaOH(體積/體積)調(diào)PH 7.8-8.0。
8、鹽溶，過濾將硫酸銨粉末緩慢加入7上清液中，邊加邊攪拌，完全溶解后用濾膜過濾鹽溶液，濾液即初制干擾素。
干擾素原液1、疏水柱M1層析將疏水凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用1M硫酸銨平衡液平衡約10個(gè)柱體積后上樣。加樣結(jié)束后，用1M硫酸銨溶液洗脫約2個(gè)柱體積至基線平衡后，再用0.5M硫酸銨洗脫液洗脫，收集洗脫峰。
2、CM-Sepharose柱層析將CM-Sepharose凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用25mM AAB平衡液平衡約10個(gè)柱體積后上樣。更換25mMAAB(300mM NaCl)緩沖液洗脫，收集洗脫峰。
3、疏水柱M2層析將疏水凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用1M(NH4)2SO4平衡液平衡約10個(gè)柱體積后上樣。加樣結(jié)束后，用1M硫酸銨溶液洗脫約2個(gè)柱體積至基線平衡后，再用0.5M硫酸銨洗脫液收集洗脫峰。
4、S-100分子篩層析將S-100凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用0.1M PB緩沖液平衡約2個(gè)柱體積至流出液pH7.2±0.1后上樣。用0.1M PB緩沖液，收集活性峰。
通過以上工藝可使重組人干擾素α2b最終產(chǎn)品的純度≥98％，多聚體含量≤5％，比活性≥2.5×108IU/mg，產(chǎn)量提高15倍。具體鑒別和相關(guān)項(xiàng)目檢驗(yàn)方法如下。
1、生物學(xué)活性測定用細(xì)胞病變抑制法，Wish細(xì)胞/VSV為檢測系統(tǒng)。用國家參考標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)。
2、蛋白含量采用Lowry-微量法，使用國家檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。
3、比活性測定將原液的蛋白濃度及活性單位數(shù)代入下計(jì)算待測樣品的比活性比活性(IU/mg)＝活性單位數(shù)(IU/ml)/蛋白質(zhì)含量(mg/ml)本品的比活性不低于2.5×108IU/mg蛋白方可判定合格。
4、純度4.1電泳純度采用非還原型SDS-PAGE電泳方法，加樣量不低于5μg(銀染法)或10μg(考馬斯亮藍(lán)染色法)，經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不小于98％4.2.高效液相色譜純度
Waters或其它型號(hào)HPLC儀性能、尺寸相應(yīng)的排阻層析HPLC柱，檢測波長280nm，結(jié)果應(yīng)為單一吸收峰，或主峰占總面積98％以上5、分子量測定采用還原型SDS-PAGE電泳方法，加樣量不低于5μg(銀染法)或10μg(考馬斯亮藍(lán)染色法)，加分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白參照物，制品的分子量與理論值比較，誤差不超過10％，應(yīng)為19.2kD±1.92kD。
6、內(nèi)毒素含量細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于5EU/300萬IU。
7、殘余外源性DNA含量用固相斑點(diǎn)雜交法，以地高辛標(biāo)記核酸法測定，其含量應(yīng)少于100pg/劑量。
8、宿主菌蛋白殘留量用ELISA酶標(biāo)法或其它敏感方法測定，宿主菌蛋白殘留量不得超過總蛋白的0.05％9、殘余抗生素活性應(yīng)用微生物學(xué)方法測定，使用2號(hào)培養(yǎng)基及26003號(hào)金黃色葡萄球菌，不應(yīng)有殘余氨芐青霉素活性。
10、等電點(diǎn)測定采用先預(yù)聚焦，后加樣聚焦方法進(jìn)行，rhIFN-α2b的等電點(diǎn)在5.7-6.7之間，且批間一致。
11、紫外光譜掃描應(yīng)有固定的最大吸收值278±3nm，批與批之間應(yīng)一致。
12、肽圖測定(至少每半年測定1次)用CNBr裂解SDS-PAGE電泳，待測樣品應(yīng)符合α2b的圖形，或用胰酶裂解C18柱反相色譜分析，批間一致，并與對(duì)照品一致。
13、N-末端氨基酸序列(至少每年測定1次)應(yīng)為(Met)-Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-Hi s-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-(Leu)。
采用上述方法生產(chǎn)的三批產(chǎn)品的相關(guān)項(xiàng)目如表1所示。
表1

實(shí)施例2本臨床試驗(yàn)證明，采用本工藝研制的注射用重組人干擾素α2b的安全性和抗HBV療效與原工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品相當(dāng)，二者在療效上無顯著性差異，并均具有良好的安全性。
臨床方案及數(shù)據(jù)如下本研究采用多中心、隨機(jī)雙盲、陽性藥物平行對(duì)照的試驗(yàn)方法，以北京凱因生物技術(shù)有限公司原工藝生產(chǎn)的注射用重組人a-2b干擾素作對(duì)照，評(píng)價(jià)該公司采用新工藝研制的注射用重組人α-2b干擾素治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的安全性和有效性。ITT人群為225例，脫落20例，脫落率為8.88％；PP人群為205例，其中完成試驗(yàn)全過程205例(91.71％)，17例僅完成治療未隨訪觀察。試驗(yàn)組和對(duì)照組受試者的基本人口學(xué)資料、主要基線值及慢性乙型肝炎病程比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明二組之間具有可比性。
研究結(jié)果顯示治療24周結(jié)束時(shí)，PP人群中，新工藝研制的重組人α-2b干擾素組(A組)完全抗病毒應(yīng)答為3.09％，部分應(yīng)答45.36％；原工藝生產(chǎn)的重組人α-2b干擾素組(B組)抗病毒完全應(yīng)答為6.48％，部分應(yīng)答為36.11％；總應(yīng)答率A組為48.45％，B組為42.59％，二組無顯著性差異。
治療結(jié)束時(shí)，PP人群中，A組生化完全應(yīng)答為44.33％，部分應(yīng)答16.49％；B組生化完全應(yīng)答41.12％，部分應(yīng)答20.56％；總應(yīng)答率A組為60.82％，B組為61.32％，二組無顯著性差異。
隨訪結(jié)束時(shí)，PP人群中，A組完全抗病毒應(yīng)答22.73％，部分應(yīng)答39.77％；B組抗病毒完全應(yīng)答19.00％，部分應(yīng)答42.00％；總應(yīng)答率A組為62.50％，B組為61.00％，二組無顯著性差異。
隨訪結(jié)束時(shí)，PP人群中，A組生化完全應(yīng)答為52.94％，部分應(yīng)答7.06％；B組生化完全應(yīng)答38.54％，部分應(yīng)答16.67％；總應(yīng)答率A組為60.00％，B組為55.20％，二組無顯著性差異。
試驗(yàn)過程中共發(fā)生不良醫(yī)學(xué)事件292例次，均為一般性不良醫(yī)學(xué)事件，其中286例次(97.60％)發(fā)生在治療期間(A組132例次，B組154例次)，多發(fā)生在接受治療的頭4周內(nèi)。多數(shù)不良醫(yī)學(xué)事件與臨床上用α-2b干擾素治療慢性乙型肝炎患者常見的副作用相似，因此判斷其發(fā)生與治療藥物有關(guān)或可能有關(guān)；除4例受試者因不良醫(yī)學(xué)事件自行退出試驗(yàn)外，均未因不良醫(yī)學(xué)事件中斷試驗(yàn)，表明試驗(yàn)藥物和對(duì)照藥物均具有良好的安全性。
實(shí)施例3本穩(wěn)定性試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品的穩(wěn)定性符合質(zhì)量要求。
方法1.穩(wěn)定性重點(diǎn)考查項(xiàng)目成品的外觀、溶解性、澄清度、生物學(xué)活性、pH值其它檢測項(xiàng)目無菌試驗(yàn)、水分。
(1)成品的外觀、溶解性、澄清度測定方法見《中華人民共和國藥典》附錄IX A、B及《中國生物制品規(guī)程》(2)生物學(xué)活性測定方法用細(xì)胞病變抑制法，Wish細(xì)胞/VSV為檢測系統(tǒng)。用國家參考標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)。
(3)pH值測定方法見《中華人民共和國藥典》附錄VI H(4)無菌試驗(yàn)見《中國生物制品規(guī)程》通則“生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程”A項(xiàng)進(jìn)行。
(5)水分見《中華人民共和國藥典》附錄VI H2.長期試驗(yàn)見《中華人民共和國藥典》附錄XIX C“藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”。供試品于2-8℃及25±2℃放置12個(gè)月，每3個(gè)月取樣一次，分別于0個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考查項(xiàng)目進(jìn)行檢測，12個(gè)月后繼續(xù)考查，分別于18個(gè)月、24個(gè)月、36個(gè)月取樣進(jìn)行檢測，將結(jié)果與0月比較，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)做無菌試驗(yàn)、水分檢測，將結(jié)果與0月比較。
結(jié)果與分析1.測定結(jié)果(1)2-8℃條件下生產(chǎn)工藝重大改革后(即本發(fā)明的工藝，下同)粉針連續(xù)3批生產(chǎn)樣品穩(wěn)定性考查結(jié)果見表2。
(2)室溫條件(25±2℃)生產(chǎn)工藝重大改革后粉針連續(xù)3批生產(chǎn)樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果見表3。
2.結(jié)果分析(1)外觀、溶解性、澄清度、pH值、無菌實(shí)驗(yàn)等指標(biāo)變化①連續(xù)3批注射用重組人干擾素α2b成品于2-8℃實(shí)際存放條件下，12個(gè)月后成品外觀、溶解性、澄清度、pH值、水分未發(fā)現(xiàn)變化，無菌試驗(yàn)均合格。
②連續(xù)3批注射用重組人干擾素α2b成品于室溫留樣存放條件下，12個(gè)月后成品外觀、溶解性、澄清度、pH值、水分未發(fā)現(xiàn)變化，無菌試驗(yàn)均合格。
(2)生物學(xué)活性變化生產(chǎn)工藝改革后連續(xù)3批成品2-8℃實(shí)際存放條件下經(jīng)12個(gè)月后生物學(xué)活性較穩(wěn)定，與改革前粉針對(duì)照樣品比較無差異，預(yù)測生產(chǎn)工藝重大改革后的成品的有效期與改革前凍干粉針效期一致。
結(jié)論生產(chǎn)工藝改革后的注射用重組人干擾素α2b在2-8℃實(shí)際保存條件下及室溫條件下12個(gè)月內(nèi)生物學(xué)活性穩(wěn)定。
表2注射用重組人干擾素α2b重大工藝改革樣品2-8℃穩(wěn)定性試驗(yàn)試驗(yàn)條件2-8℃試驗(yàn)樣品注射用重組人干擾素α2b(凍干粉針)，重大工藝改革300萬IU/支規(guī)格樣品生產(chǎn)日期2004年5月包裝2ml管制抗生素瓶，丁基抗生素瓶塞，鋁塑組合蓋

表3注射用重組人干擾素α2b重大工藝改革樣品25℃穩(wěn)定性試驗(yàn)試驗(yàn)條件25±2℃，60％±5％試驗(yàn)樣品注射用重組人干擾素α2b(凍干粉針)，300萬IU/支規(guī)格樣品生產(chǎn)日期2000年2月 包裝2ml管制抗生素瓶，丁基抗生素瓶塞，鋁塑組合蓋

權(quán)利要求
1.一種新的重組人干擾素α2b的分離純化方法，其包括下述步驟(1)破碎發(fā)酵完畢的重組人干擾素α2b大腸桿菌工程菌，離心得沉淀；(2)將沉淀按1∶5-20(重量/體積)比例加入4M尿素/TE溶液，離心得沉淀；(3)將沉淀按1∶5-25(重量/體積)比例加入Tris-HCl溶液，離心得沉淀；(4)將沉淀按1∶2-10(重量/體積)加入8M鹽酸胍+DTT裂解液，離心，取上清液，測蛋白含量；(5)將上清液倒入H3BO3溶液中攪拌均勻，稀釋后的溶液蛋白含量為0.15-0.08mg/ml，復(fù)性，得復(fù)性液；(6)向復(fù)性液中緩慢滴加6M HCl，調(diào)PH2.0-3.0，離心，收集上清液，緩慢滴加6M NaOH(體積/體積)，調(diào)PH7.8-8.0；(7)將硫酸銨粉末緩慢加入上清液中，溶解后過濾，取濾液；(8)依次進(jìn)行疏水柱M1柱層析、CM-Sepharose柱層析、疏水柱M2柱層析和S-100分子篩層析。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(5)中分兩步達(dá)到最終濃度，首先將上清液在H3BO3溶液中稀釋至蛋白含量為2-6mg/ml，然后再在H3BO3溶液中稀釋至蛋白含量為0.15-0.08mg/ml。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(5)中，復(fù)性是在2-10℃靜置10-24小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(8)中，疏水柱M1柱層析如下進(jìn)行將疏水凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用1M硫酸銨平衡液平衡5-15個(gè)柱體積后上樣；用1M硫酸銨溶液洗脫1-5個(gè)柱體積至基線平衡后，再用0.5M硫酸銨洗脫液洗脫，收集洗脫峰。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(8)中，CM-Sepharose柱層析如下進(jìn)行將CM-Sepharose凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用25mM AAB平衡液平衡5-15個(gè)柱體積后上樣；更換25mMAAB(300mMNaCl)緩沖液洗脫，收集洗脫峰。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(8)中，疏水柱M2柱層析如下進(jìn)行將疏水凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用1M(NH4)2SO4平衡液平衡5-15個(gè)柱體積后上樣；用1M硫酸銨溶液洗脫1-5個(gè)柱體積至基線平衡后，再用0.5M硫酸銨洗脫液洗脫，收集洗脫峰。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(8)中，S-100分子篩層析如下進(jìn)行將S-100凝膠均勻裝入處理好的柱內(nèi)，用0.1M PB緩沖液平衡1-5個(gè)柱體積，至流出液pH7.2±0.1后上樣；用0.1M PB緩沖液洗脫，收集活性峰。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的重組人干擾素α2b的分離純化方法，其包括下述步驟破碎重組人干擾素α2b大腸桿菌工程菌，尿素溶解，Tris－HCl洗滌，鹽酸胍裂解，硼酸復(fù)性，調(diào)pH值，鹽溶，疏水柱M 1柱層析，CM－Sepharose柱層析，疏水柱M2柱層析和S－100分子篩層析。本方法減少了純化步驟，進(jìn)行純化過程的集成，使工藝流程順暢，無迂回，生產(chǎn)配置無瓶頸，為大規(guī)模自動(dòng)化生產(chǎn)的再放大提供了可能。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1749274SQ200510080478
公開日2006年3月22日 申請日期2005年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日
發(fā)明者張春麗 申請人:北京凱因生物技術(shù)有限公司