專利名稱：病毒核酸提取試劑及核酸純化柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從液體中提取和純化病毒核酸的試劑、方法及其生產(chǎn)工藝，是分子生物學(xué)試驗最基本的步驟之一，涉及了病毒學(xué)研究、核酸檢測、基因克隆等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)研究的快速進展，對疾病相關(guān)的病毒載量的測定，成為對疾病可靠診斷、病程預(yù)后、藥物治療效果評價、疫苗保護作用評價的重要手段，而從生物材料中高效、簡便地分離和純化到完整的、高純度的目標(biāo)核酸是很重要的技術(shù)。傳統(tǒng)的核酸純化方法采用變性劑、蛋白酶K等裂解組織，釋放出核酸后，用苯酚、氯仿萃取，異丙醇沉淀，去除上清后得到核酸。步驟繁瑣，耗時長，提取率低，重復(fù)性差。
目前，已經(jīng)商品化的病毒核酸提取試劑盒的價格都比較昂貴，面對如此昂貴的價格，我國的絕大多數(shù)病毒感染者(如艾滋病和病毒性肝炎患者)無能力接受常規(guī)檢測，這也嚴(yán)重影響了我國對這些疾病的及時監(jiān)控與預(yù)防。因此，迫切需要研究開發(fā)價格便宜、高效、穩(wěn)定和簡便的病毒核酸提取試劑盒。
1990年R.Boom等在《臨床微生物期刊》發(fā)表的文章介紹了核酸在高濃度Chaotropic鹽的條件下可以和硅材料發(fā)生結(jié)合，而改變環(huán)境后核酸又可以洗脫下來，利用硅材料的這種特性可以快速地分離和純化得到核酸。用于病毒核酸的提取的試劑盒，應(yīng)包括病毒核酸提取過程中需要的各種試劑和用于吸附核酸的核酸吸附介質(zhì)。我們對不同的Chaotropic鹽(如鹽酸胍，異硫氰酸胍，碘化鈉，氯化鈉，高氯酸鈉，溴化鉀等)進行了分析研究，配制了含鹽酸胍的混合試劑作為病毒裂解液。同時還配制了促吸附液，去蛋白液，洗滌液和洗脫液，它們與裂解液組成完整的核酸提取試劑。通過研究，發(fā)現(xiàn)玻璃纖維深層截留濾膜對核酸具有良好的吸附性能，經(jīng)加工后可作為核酸吸附介質(zhì)，即純化柱的濾膜。將各種提取試劑與純化柱組合即成為小量柱離心式病毒核酸提取試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過艱苦摸索，獲得了一種病毒核酸的提取方法以及用于該方法的試劑盒以及在該提取過程中所需要的試劑。令人驚訝的，該方法超出了現(xiàn)有技術(shù)的預(yù)料，不但能夠安全、高效、完整地提取病毒核酸，而且不需要在提取過程中使用有機溶劑，從而避免產(chǎn)物中有機物污染的產(chǎn)生。
本發(fā)明在第一方面提供了一種用于提取病毒核酸的純化柱，包括柱體和柱體內(nèi)的吸附介質(zhì)，其特征在于以玻璃纖維濾膜作為吸附核酸的吸附介質(zhì)，該濾膜具有與核酸可逆性的結(jié)合的特點。所述柱體的結(jié)構(gòu)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。柱體通常包括諸如進樣孔的進樣構(gòu)件、能夠容納吸附介質(zhì)容器和諸如流出孔的流出構(gòu)件，例如，樣品液可以從進樣孔中加入，流經(jīng)容器中的吸附介質(zhì)，最后從流出孔中排除柱體之外?，F(xiàn)在已經(jīng)有許多商品化的柱體了，如上海生工有限公司銷售的質(zhì)粒提取試劑盒中的柱體、上海華舜生物工程有限公司及Roche公司核酸提取試劑盒中的柱體。吸附介質(zhì)是指硅材料，尤其是指具有的與核酸可逆性的結(jié)合特點的硅材料，這樣可以有效地分離和純化核酸。本發(fā)明中優(yōu)選以玻璃纖維濾膜作為核酸的吸附介質(zhì)，將其制備成一定規(guī)格后裝入聚丙乙烯材料制備的中空柱體中，壓入墊圈固定即可作為純化柱使用。玻璃纖維濾膜對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。已經(jīng)有多種商品化的玻璃纖維濾膜可供選擇，如美國Millipore和英國Whatman公司生產(chǎn)的玻璃纖維深層截流濾膜(初濾用)。
本發(fā)明的核酸提取試劑共有病毒裂解液，促吸附液，去蛋白液，洗滌液和洗脫液5個部分。
本發(fā)明在第二方面提供了一種用于提取病毒核酸的裂解液，其能夠徹底裂解病毒，釋放核酸，并且促進核酸與吸附介質(zhì)(玻璃纖維濾膜)結(jié)合。優(yōu)選該裂解液含有6mol/L鹽酸胍和20％ Triton X-100，而且pH為酸性，同時還包括尿素、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)。優(yōu)選該裂解液的pH為3.5-4.5，更優(yōu)選為4。鹽酸胍(濃度為6mol/L)、TritonX-100和尿素作為變性劑，這種組合可以保證完全裂解病毒并釋放出病毒核酸，并且有利于核酸與玻璃纖維膜的結(jié)合；三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)作為pH緩沖劑。
本發(fā)明在第三方面提供了一種用于提取病毒核酸的促吸附液，其主要成分是異丙醇，優(yōu)選該促吸附液是含有大于80％異丙醇的水溶液或純異丙醇，可以提高核酸在高濃度鹽酸胍溶液中與玻璃纖維膜的結(jié)合。
本發(fā)明在第四方面提供了一種用于提取病毒核酸的去蛋白液，所述去蛋白液是含醇和鹽酸胍的溶液，其特征在于其中鹽酸胍的濃度大于5mol/L，pH大于6，醇的濃度為30-70％，優(yōu)選醇是乙醇，濃度為50％；優(yōu)選其中鹽酸胍的濃度為5mol/L。而且優(yōu)選該去蛋白液的pH為5.5-6.5，更優(yōu)選pH為6。該去蛋白液可以去除玻璃纖維膜上吸附的蛋白及其它雜質(zhì)。
本發(fā)明在第五方面提供了一種用于提取病毒核酸的洗滌液，所述洗滌液是含醇和低鹽的溶液，如含醇和氯化鈉的溶液，其特征在于其中氯化鈉濃度為20mmol/L，醇的濃度大于80％，而且pH為7-8。該洗滌液可以去除玻璃纖維膜上吸附的蛋白及其它雜質(zhì)，如多糖、纖維素、脂等。優(yōu)選該洗滌液的pH為7.5，優(yōu)選其中的優(yōu)選醇是乙醇。
本發(fā)明在第六方面提供了一種用于提取病毒核酸的洗脫液，所述洗脫液是一種不含核酸酶的蒸餾水，而且pH為7-8。該洗脫液的pH優(yōu)選為7.5。優(yōu)選制備本發(fā)明的洗脫液的方式是將水經(jīng)過焦磷酸二乙酯(DEPC)處理，從而可以將玻璃纖維膜上吸附的核酸洗脫下來。
本發(fā)明在第七方面提供了一種病毒核酸的提取方法，該方法的步驟包括(1)在含有病毒的液體中加入本發(fā)明第二方面所述的裂解液，50-95℃作用1-30分鐘，再加入本發(fā)明第三方面所述的促吸附液，混合均勻。其中，優(yōu)選在70℃作用10分鐘。
(2)將步驟(1)得到的混合溶液加入本發(fā)明第一方面的純化柱的柱體中，棄流出液。其中，流出液可以通過重力作用從流出孔流出，優(yōu)選通過離心讓流出液流出并棄去。
(3)在步驟(2)得到的純化柱的柱體中加入本發(fā)明第四方面所述的去蛋白液，棄流出液。其中，流出液可以通過重力作用從流出孔流出，優(yōu)選通過離心讓流出液流出并棄去。
(4)在步驟(3)得到的純化柱的柱體中加入本發(fā)明第五方面所述的洗滌液，棄流出液，再加入權(quán)利要求5所述的洗滌液洗滌1次。其中，流出液可以通過重力作用從流出孔流出，優(yōu)選通過離心讓流出液流出并棄去。
(5)在步驟(4)得到的純化柱的柱體中加入本發(fā)明第六方面所述的洗脫液，收集流出液。其中，流出液可以通過重力作用從流出孔流出，從而獲得病毒核酸的溶液，優(yōu)選通過離心讓流出液流出并將病毒核酸的溶液收集在干凈的容器內(nèi)，。
本發(fā)明第七方面所述的方法中，病毒核酸可以是DNA或RNA。
本發(fā)明第七方面所述的方法中，含有病毒的液體可以是血漿、尿液或病毒培養(yǎng)上清。
本發(fā)明在第八方面提供了一種小量柱離心式病毒核酸提取試劑盒，包括病毒核酸提取過程中需要的玻璃纖維濾膜和本發(fā)明第二至六方面的產(chǎn)品。
本發(fā)明的純化柱的制備可以是在中空的柱體內(nèi)裝入玻璃纖維膜，壓入墊圈固定即可。結(jié)構(gòu)簡單，成本低，制備方便。
本發(fā)明提供了一種操作簡便，快捷、提取完整性好、純度高的病毒核酸提取試劑及方法。所提取的核酸可以直接進行PCR及RT-PCR擴增檢測。
通過上述要素的組合可以達(dá)到安全、高效、快速提取病毒核酸。無需使用有機溶劑，不存在產(chǎn)物中有機物污染的問題。病毒核酸提取過程簡潔，核酸純度高，提取效率高。提取產(chǎn)物可直接用于PCR、RT-PCR及基因克隆等分子生物學(xué)實驗研究及臨床檢測。
附圖的簡要說明附

圖1為病毒滴度與CT值的相關(guān)性曲線，相關(guān)系數(shù)為0.99。
附圖2為初始病毒量與CT值的相關(guān)性曲線。
發(fā)明簡述1、制備核酸提取純化柱玻璃纖維濾膜的主要成分為硅酸鹽，具有與核酸可逆性結(jié)合的特點，可以用于核酸的分離和純化。純化柱的柱體可以委托加工(如江蘇省海門聯(lián)合塑料制品公司)，材料為聚丙乙烯(PP)，可耐高溫、高壓。將玻璃纖維濾膜用打孔器制成直徑為7毫米膜片，再將膜片壓入純化柱的柱體中，作為核酸吸附介質(zhì)。
柱質(zhì)量的評價方法以商品化的核酸提取試劑盒(購自上海華舜生物工程有限公司)中的提取試劑，配合本發(fā)明的純化柱對病毒核酸進行提取，通過常規(guī)的熒光實時定量PCR技術(shù)對所提取的核酸進行病毒載量測定，以CT值的高低為評價指標(biāo)(在實時定量PCR檢測中，CT值的含義為反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達(dá)到所設(shè)定閾值的循環(huán)次數(shù)，CT值的高低與起始模板數(shù)成反比)。通過比較CT值的大小，可以分析不同純化柱吸附介質(zhì)(玻璃纖維濾膜)的核酸吸附效率。
2、配制試劑完整的核酸提取試劑的組合由本發(fā)明的裂解液，促吸附液，去蛋白液，洗滌液和洗脫液5種試劑組成。其中裂解液是由鹽酸胍、Triton X-100等組成混合溶液，洗滌液為含鹽的醇溶液，洗脫液為經(jīng)DEPC處理的蒸餾水。
試劑質(zhì)量評價方法以商品化的核酸提取試劑盒中的純化柱，配合本發(fā)明的5種試劑提取病毒核酸，以熒光實時定量PCR技術(shù)進行病毒載量測定，以CT值為評價指標(biāo)，分析本發(fā)明的各種提取試劑的提取效率，并對配方進行優(yōu)化。
3、提取效率評價將含病毒(如HIV、HBV、HCV等)的血漿與正常人血漿混合后進行10倍梯度稀釋，設(shè)6個梯度，用本發(fā)明的核酸提取試劑和純化柱提取病毒核酸，并與商品化的病毒核酸提取試劑盒提取的同一份核酸進行提取量的比較。以常規(guī)的熒光實時定量PCR技術(shù)進行病毒載量測定，以CT值為評價指標(biāo)，分析本發(fā)明的核酸提取試劑及純化柱的提取效率。
4、回收率評價將含病毒的血漿與正常人血漿混合，用本發(fā)明的核酸提取試劑盒，分別進行兩份相同樣品的提取。進行一次提取，提取得到了核酸溶液，其中一份再將得到的核酸溶液重復(fù)一次核酸提取過程，將兩份核酸進行熒光定量檢測，比較其CT值。
5、純度評價將提取到的病毒核酸用紫外分光光度計測定樣品在260nm和280nm的吸光度(OD值)，根據(jù)A260/A280比值判斷核酸的純度。
6、病毒滅活效率評價按我國衛(wèi)生部《消毒與滅菌效果的評價方法與標(biāo)準(zhǔn)》(GB15981-1995)要求完成。
7、工藝設(shè)備7.1制膜委托江蘇省海門聯(lián)合塑料制品公司生產(chǎn)本發(fā)明所需的純化柱柱體；根據(jù)柱體的結(jié)構(gòu)，用打孔器將玻璃纖維濾膜加工成圓型的玻璃纖維膜片。
7.2組裝設(shè)備委托江蘇省海門聯(lián)合塑料制品公司生產(chǎn)組裝設(shè)備，用該設(shè)備將制備好的玻璃纖維膜片和墊片壓入純化柱的柱體內(nèi)。
實施例1以玻璃纖維深層截流濾膜(購自Millipore公司)作為核酸吸附介質(zhì)，用打孔器制成直徑為7mm膜片。將膜片裝入聚苯乙烯材料制備的中空柱體中，壓入墊圈，將膜片固定在柱體底部即可。
實施例2裂解液是一種含鹽酸胍的變性劑取分析純鹽酸胍(Guanidine Hydrochloride分子式CH5N3HCl，分子量為95.53)28克、尿素0.03克，三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCL)0.06克、曲拉通(Triton X-100)10毫升，然后用蒸餾水20毫升溶解，用鹽酸調(diào)至pH4即可。促吸附液是純異丙醇。去蛋白液是一種含醇和鹽酸胍的溶液取鹽酸胍23克、三(羥甲基)氨基甲烷0.12克，加入15毫升蒸餾水溶解，用鹽酸調(diào)至pH 6，再加入20毫升95％乙醇即可。洗滌液是一種含醇和氯化鈉的溶液取氯化鈉0.1克、三(羥甲基)氨基甲烷0.025克、加入20毫升蒸餾水溶解，再加入80毫升95％乙醇即可。洗脫液焦磷酸二乙酯(DEPC)處理后的蒸餾水經(jīng)高溫滅菌即可。
實施例3按實施例2制備好試劑后，核酸提取操作按以下方法進行1)裂解病毒在1.5ml離心管中加入200μl含病毒的血漿，再加入500μl裂解液，混勻，置于70℃溫浴10分鐘。
2)核酸吸附在離心管中再加入600μl的促吸附液，混勻。移取650μl至純化柱的柱體中，8,000g離心1分鐘，將純化柱柱體移入新收集管中。將剩下的650μl裂解物移入純化柱的柱體中，8000g離心1分鐘。將純化柱柱體移入新收集管中。
3)洗滌加入500μl去蛋白溶液，8,000g離心1分鐘。棄收集管中的液體，將純化柱柱體移入新收集管中，加入500μl洗滌液，8,000g離心1分鐘。將純化柱的柱體移入新收集管中，加入500μl洗滌液，8,000g離心1分鐘。
4)核酸洗脫將純化柱柱體移入新收集管中。在純化柱的柱體的玻璃纖維膜中央加入50μl洗脫液，室溫靜置1分鐘后，8,000g離心1分鐘，收集洗脫液。
實施例4將含病毒(HIV、HBV及HCV)的血漿5倍梯度稀釋，共6個梯度，用本發(fā)明的核酸提取試劑和純化柱進行核酸提取，并且用常規(guī)的熒光實時定量PCR技術(shù)對所提取的核酸進行病毒載量測定。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)其提取量與初始病毒量具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.99。(圖1、圖2)。
實施例5將含病毒HIV的血漿用本發(fā)明的核酸提取試劑和純化柱進行核酸提取并且做如下測定1)檢測RNA溶液的吸光度(OD)A260/A280＝1.8，其比值在RNA純度的正常質(zhì)量范圍內(nèi)。
2)根據(jù)RNA溶液的吸光度(OD)A260＝1的溶液其RNA含量約為40μg/ml的計算公式，我們得出本試劑盒純化柱核酸吸附力為140μg。
3)對同一含病毒的血漿進行多個提取，用常規(guī)的熒光實時定量PCR技術(shù)對所提取的核酸進行病毒載量測定，核酸提取量的變異系數(shù)小于25％。
4)試劑盒中的試劑裂解液、促吸附液、去蛋白溶液、洗滌液及洗脫液，置室溫保存，未開封可以保存一年，開封后半年內(nèi)用完。樣品起始量為200μl血清/其它液體樣品，得率大于85％。
實施例6柱質(zhì)量的評價方法將含病毒(如HIV和HBV)的血漿與正常人血漿混合后進行10倍梯度稀釋，設(shè)6個梯度，用本發(fā)明的純化柱和商品化的核酸提取純化柱(購自上海華舜生物工程有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號W6751)配與商品化(華舜)的核酸提取試劑進行病毒核酸提取，以深圳匹基公司生產(chǎn)的熒光實時定量PCR試劑盒進行病毒載量測定(HIV和HBV)。以CT值為評價指標(biāo)(在實時定量PCR檢測中，CT值的含義為反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達(dá)到所設(shè)定閾值的循環(huán)次數(shù)，CT值的高低與起始模板數(shù)成反比)。比較本發(fā)明的純化柱與商品化試劑盒中純化柱核酸吸附效率。檢測顯示，用本發(fā)明的純化柱提取的病毒核酸經(jīng)過常規(guī)的熒光實時定量PCR測定，其CT值低于所比較的商品化純化柱的CT值，即本發(fā)明的純化柱提取到的核酸量高于所比較的商品化純化柱，并且其CT值與病毒濃度梯度具有良好的線性關(guān)系，證明本發(fā)明的純化柱具有優(yōu)良的核酸吸附效率。
提取試劑質(zhì)量評價方法將含病毒(如HIV和HBV)的血漿與正常人血漿混合后進行10倍梯度稀釋，設(shè)6個梯度，用本發(fā)明的核酸提取試劑和商品化的核酸提取試劑(購自上海華舜生物工程有限公司，產(chǎn)品編號W6751)配與商品化(華舜)的核酸提取純化柱進行病毒核酸提取，以深圳匹基公司生產(chǎn)的熒光實時定量PCR試劑盒進行病毒載量測定(HIV和HBV)。以CT值為評價指標(biāo)，比較本發(fā)明的病毒核酸提取試劑與商品化的核酸提取試劑的提取效率。檢測顯示，用本發(fā)明的核酸提取試劑提取的核酸經(jīng)過常規(guī)的熒光實時定量PCR測定，其CT值等于所比較的商品化純化柱的CT值，證明本發(fā)明的病毒核酸提取試劑具有可靠的核酸提取效率。
權(quán)利要求
1.一種用于提取病毒核酸的純化柱，包括柱體和柱體內(nèi)的吸附介質(zhì)，其特征在于以玻璃纖維濾膜作為吸附核酸的吸附介質(zhì)，該濾膜具有與核酸可逆性的結(jié)合的特點。
2.一種用于提取病毒核酸的裂解液，其含有6mol/L鹽酸胍和20％Triton X-100，而且pH為3.5-4.5，同時還包括尿素、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)。
3.一種用于提取病毒核酸的促吸附液，其主要成分是異丙醇。
4.一種用于提取病毒核酸的去蛋白液，所述去蛋白液是含醇和鹽酸胍的溶液，其特征在于其中鹽酸胍的濃度為5mol/L，而且pH為5.5-6.5。
5.一種用于提取病毒核酸的洗滌液，所述洗滌液是含醇和氯化鈉的溶液，其特征在于其中氯化鈉濃度為20mmol/L，醇的濃度大于80％，而且pH為7-8。
6.一種用于提取病毒核酸的洗脫液，所述洗脫液是一種不含核酸酶的蒸餾水，而且pH為7-8。
7.一種病毒核酸的提取方法，該方法的步驟包括(1)在含有病毒的液體中加入權(quán)利要求2中所述的裂解液，50-95℃作用1-30分鐘，再加入權(quán)利要求3中所述的促吸附液，混合均勻；(2)將步驟(1)得到的混合溶液加入權(quán)利要求1的純化柱的柱體中，棄流出液；(3)在步驟(2)得到的純化柱的柱體中加入權(quán)利要求4所述的去蛋白液，棄流出液；(4)在步驟(3)得到的純化柱的柱體中加入權(quán)利要求5所述的洗滌液，棄流出液，再加入權(quán)利要求5所述的洗滌液洗滌1次；(5)在步驟(4)得到的純化柱的柱體中加入權(quán)利要求6所述的洗脫液，收集流出液。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中病毒核酸是DNA或RNA。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中含有病毒的液體是血漿、尿液或病毒培養(yǎng)上清。
10.一種小量柱離心式病毒核酸提取試劑盒，包括病毒核酸提取過程中需要的玻璃纖維濾膜和權(quán)利要求2-6的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒核酸(DNA/RNA)的提取試劑、提取方法及材料制備，適用于各種分子生物學(xué)研究及臨床檢測。本發(fā)明的核酸提取試劑包括裂解液、促吸附液、去蛋白液、洗滌液及洗脫液；核酸提取的純化柱包括柱體和核酸吸附膜兩部分。本發(fā)明使病毒核酸提取過程安全、簡潔，提取的核酸完整、純度高，提取產(chǎn)物(DNA/RNA)可直接用于PCR、RT－PCR及基因克隆等分子生物學(xué)實驗研究及臨床檢測。
文檔編號C07H1/00GK1786013SQ20051009018
公開日2006年6月14日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者陶劍, 賁昆龍, 李衛(wèi)云, 任若通, 李汝潤 申請人:李衛(wèi)云, 李燕琴