專利名稱：破骨細(xì)胞形成抑制因子、其核苷酸序列和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯示抑制破骨細(xì)胞分化和/或成熟的活性的新型蛋白質(zhì)、即破骨細(xì)胞形成抑制因子(Osteoclastogenesis Inhibitory Factor；OCIF)及其制備方法。
背景技術(shù)：
人的骨胳是不斷反復(fù)地吸收與再形成的，在此過(guò)程中起核心功能的細(xì)胞是起骨形成作用的成骨細(xì)抱和起骨吸收作用的破骨細(xì)胞。因與這些細(xì)胞有關(guān)的骨代謝的異常而發(fā)生的疾病可列舉骨質(zhì)疏松癥為代表。這種疾病是由破骨細(xì)胞引起的骨吸收超過(guò)成骨細(xì)胞引起的骨形成而導(dǎo)致的疾病，然而，關(guān)于這種疾病的發(fā)生機(jī)制，目前仍未完全闡明。這種疾病發(fā)生骨痛，而由于骨脆弱成為骨折的原因。因而，隨著高齡人口的增加，這種疾病成為因骨折而臥床的老人的發(fā)生原因，也已成為社會(huì)問(wèn)題，其治療藥的開(kāi)發(fā)正成為當(dāng)務(wù)之急。這樣的骨代謝異常所致骨量減少癥，期望通過(guò)抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成或改善它們的平衡而加以治療。
與骨形成有關(guān)的細(xì)胞的增殖、分化或激活的促進(jìn)，或?qū)εc骨吸收有關(guān)的細(xì)胞的增殖，分化或激活的抑制，可望促進(jìn)骨形成。近年來(lái)，對(duì)具有這種生理活性的蛋白質(zhì)(細(xì)胞因子)的關(guān)注增多，并進(jìn)行了集中精力的研究。有人報(bào)導(dǎo)了促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖或分化的細(xì)胞因子有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子系列(fibroblast growthfactor；FGFRodan S.B.et al.，Endocrinology vol.121，p1917，1987)、胰島素樣生長(zhǎng)因子I(insulin like growth factor-I；IGF-I；Hock J.M.etal.，Endocrinology vol.122，p254，1988)、胰島素樣生長(zhǎng)因子II(IGF II；McCarthy T.et al.，Endocrinology vol.124，p301，1989)、激活素A(ActivinA；Centrella M.et al.，Mol.Cell.Biol.vol.11，p250，1991)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β；Noda M.，The Bone，vol.2，p29，1988)パスキユロトロピソ(Vasculotropin；Varonique M.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.199，p380，1994)、和骨形態(tài)發(fā)生蛋白系列(bonemorphogenetic protein；BMP；BMP-2；Yamaguchi，A et al.，J.Cell Biol.Vol.113，p682，1991，OP-1 Sampath T.K.et al.，J.Biol Chem.vol.267，p20532，1992、Knutsen R.et al.，Biochem，Biophys.Res.Commun.vol.194，p1352，1993)等細(xì)胞因子。
另一方面，作為抑制破骨細(xì)胞形成即破骨細(xì)胞的分化和/或成熟的細(xì)胞因子，據(jù)報(bào)告有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β；Chenu C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vos.85，p5683，1988)及白介素-4(interleukin-4；Kasano K.et al.，Bone-Miner.，vol.21，p179，1993)等。而抑制因破骨細(xì)胞所致骨吸收的細(xì)胞因子，據(jù)報(bào)告有降鈣素(calcitonin；Bone-Miner.，vol.17，p347，1992)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulating factor；Hattersley G.et al.J.Cell.Physiol.vol.137，p199，1988)、白介素-4(Watanabe，K.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.172，p1035，1990)、及γ-干擾素(interferon-γ；Gowen M.et al.，J.Bone Miner.Res.，vol.1，p469，1986)等。
這些細(xì)胞因子可望成為通過(guò)促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用而改善骨量減少癥的藥物。胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和骨形態(tài)發(fā)生蛋白系列的細(xì)胞因子等，就上述細(xì)胞因子的一部分而言，作為骨代謝改善劑，正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。而降鈣素作為骨質(zhì)疏松癥的治療藥和鎮(zhèn)痛藥已有市售。
目前，作為治療與骨有關(guān)的疾病及縮短治療周期的醫(yī)藥品，在臨床上使用的有活性型維生素D3、降鈣素及其衍生物、雌二醇等激素制劑、依普黃酮(ipriflavone)、維生素K2(menatetrenone)或鈣制劑等。然而，采用這些藥品的治療法，其效果和治療結(jié)果是不能令人滿意的，期望開(kāi)發(fā)代替這些醫(yī)藥品的新治療藥。如上所述，骨代謝是由骨形成和骨吸收的平衡來(lái)調(diào)節(jié)的，抑制破骨細(xì)胞的分化·成熟的細(xì)胞因子可望成為骨質(zhì)疏松等骨量減少癥的治療藥。
發(fā)明的揭示本發(fā)明從這樣的觀點(diǎn)出發(fā)，以提供新的破骨細(xì)胞形成抑制因子(OCIF)及高效制備方法為研究的課題。
具體而言，本發(fā)明涉及一種具有如下物理化學(xué)性質(zhì)、并有抑制破骨細(xì)胞分化和/或成熟的活性的蛋白質(zhì)(a)用SDS-PAGE測(cè)得的分子量還原條件下約60kD、非還原條件下約60kD和約120kD；(b)親和性對(duì)陽(yáng)離子交換劑和肝素具有親和性；(c)熱穩(wěn)定性于70℃熱處理10分鐘或56℃熱處理30分鐘，抑制破骨細(xì)胞分化成熟的活性降低，于90℃熱處理10分鐘則抑制破骨細(xì)胞分化成熟的活性喪失；(d)氨基酸序列具有序列表中序列1-3的氨基酸序列作為內(nèi)部氨基酸序列；(e)所述蛋白質(zhì)是從人衍生獲得的，其N(xiāo)末端序列表示為序列表中序列7的氨基酸。
在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)為人成纖維細(xì)胞所產(chǎn)生的。
本發(fā)明還涉及上述蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于將人成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)液經(jīng)離子交換柱、親和層析柱和反相層析柱的吸附和洗脫而加以精制。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，使用氧化鋁陶瓷片作為載體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列用序列表中序列4的氨基酸序列表示。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它編碼序列表中序列4所示氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它用序列表中序列6的堿基序列表示。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它編碼序列表中序列5所示氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它編碼序列表中序列4所示氨基酸序列的cDNA所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了制備蛋白質(zhì)的遺傳工程方法，其特征在于采用上述任一cDNA為基因，所述蛋白質(zhì)具有如下物理化學(xué)性質(zhì)、并有抑制破骨細(xì)胞分化和/或成熟的活性(a)用SDS-PAGE測(cè)得的分子量還原條件下約60kD、非還原條件下約60kD和約120kD；(b)親和性對(duì)陽(yáng)離子交換劑和肝素具有親和性；(c)熱穩(wěn)定性于70℃熱處理10分鐘或56℃熱處理30分鐘，抑制破骨細(xì)胞分化成熟的活性降低，于90℃熱處理10分鐘則抑制破骨細(xì)胞分化成熟的活性喪失；(d)氨基酸序列具有序列表中序列1-3的氨基酸序列作為內(nèi)部氨基酸序列，該方法的特征是采用上述任一cDNA作為基因。
在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，其中采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。更佳的是，宿主細(xì)胞為293/EBNA細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列8的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列8的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列9所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列10的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列10的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列11所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列12的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列12的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列13所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列14的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列14的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列15所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列83的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列83的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列62所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列86的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列86的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列65所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列87的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列87的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列66所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列92的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列92的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列71所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列94的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列94的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列73所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列95的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列95的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列74所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列96的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列96的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列75所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列97的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列97的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列76所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列100的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列100的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列79所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是序列表中序列101的堿基序列所表示的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它是由序列表中序列101的堿基序列所表示的cDNA表達(dá)所得的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列80所示氨基酸序列的cDNA。
本發(fā)明還提供了一種cDNA，它是編碼序列表中序列4氨基酸序列的基因組cDNA。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，它是以序列表中系列104和105表示的。
本發(fā)明還提供了一種抗體，該抗體對(duì)本發(fā)明的人破骨細(xì)胞形成抑制因子顯示特異性親和性。在較佳實(shí)施方案中，該抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。在另一較佳實(shí)施方案中，單克隆抗體為分子量約150,000的IgG1、IgG2a或IgG2b亞型。
本發(fā)明還提供了人破骨細(xì)胞形成抑制因子的測(cè)定方法，其特征在于使用本發(fā)明所述的抗體。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，該方法它包括下列步驟i)至iii)i)固定本發(fā)明所述的抗體；ii)使固定抗體與一測(cè)試樣品一起培育，和iii)用步驟i)中被固定的抗體之外的本發(fā)明所述其它抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)，它具有SEQ ID NO4或5所示氨基酸序列，該氨基酸序列中自380Leu起有1-204個(gè)氨基酸缺失。
本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的試劑，它包含上述任一蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或治療骨量減少的試劑，它包含上述任一蛋白質(zhì)。
本發(fā)明者們鑒于這樣的現(xiàn)狀進(jìn)行銳意探索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在人胎兒肺成纖維細(xì)胞IMR-90(保藏于ATCC-保藏號(hào)CCL186)的培養(yǎng)液中存在具有抑制破骨細(xì)胞形成作用即抑制破骨細(xì)胞分化·成熟的作用的蛋白質(zhì)OCIF。
又使用氧化鋁陶瓷片作為細(xì)胞培養(yǎng)的載體，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中積聚高濃度的本發(fā)明的破骨細(xì)胞形成抑制因子OCIF。可高效地加以精制。
本發(fā)明者進(jìn)而將上述培養(yǎng)液用離子交換柱、親和柱和反相柱依次進(jìn)行處理，反復(fù)進(jìn)行吸附和洗脫，確立了上述蛋白質(zhì)OCIF的高效精制方法。
接著，本發(fā)明者們基于所得的天然型OCIF蛋白質(zhì)的氨基酸序列的信息，成功地進(jìn)行了編碼此蛋白質(zhì)的cDNA的克隆化。本發(fā)明者們進(jìn)而用此cDNA、以遺傳工程的方法確立了具有破骨細(xì)胞分化和/或成熟抑制活性的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明涉及的蛋白質(zhì)特征在于來(lái)自人胎兒肺成纖維細(xì)胞；在還原條件下，在SDS-PAGE中分子量約為60kD，在非還原條件下，在SDS-PAGE中分子量約為60kD和120kD；對(duì)陽(yáng)離子交換劑和肝素柱具有強(qiáng)的親和性；70℃加熱處理10分鐘，或56℃加熱處理30分鐘，抑制破骨細(xì)胞分化·成熟的活性即降低。90℃加熱處理10分鐘則失去抑制破骨細(xì)胞分化·成熟的活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)OCIF的氨基酸序列與已知的破骨細(xì)胞形成抑制因子明顯不同。
本發(fā)明還涉及蛋白質(zhì)OCIF的制備方法，其特征在于培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，將培養(yǎng)液通過(guò)肝素柱處理，洗脫吸附部分，將此部分上陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行吸附、洗脫，再用親和柱、反相柱精制，收集上述蛋白質(zhì)。本發(fā)明中的柱處理不只是使培養(yǎng)液等在肝素瓊脂糖柱等中流下，而且分批將培養(yǎng)液與肝素瓊脂糖等混合可得與柱處理同樣的效果。本發(fā)明中使用的親和柱可舉出肝素柱和藍(lán)染料柱。藍(lán)染料柱尤以Cibacrone blue柱為佳。此Cibacrone blue柱的填充劑為例如以親水性合成高分子為載體，結(jié)合了色素Cibacrone blue-F3GA的物質(zhì)，此柱通常稱作藍(lán)染料柱。
本發(fā)明進(jìn)而涉及氧化鋁陶瓷片作載體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的高效的上述蛋白質(zhì)的制備方法。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)OCIF可從人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中高效、高收率地分離精制。從此原料分離精制本發(fā)明的蛋白質(zhì)OCIF，采用來(lái)自生物試料的蛋白性物質(zhì)的精制上廣泛使用的常規(guī)方法，可按照利用目的物OCIF的物理、化學(xué)性質(zhì)的各種精制方法來(lái)進(jìn)行。作為濃縮方法，可列舉超濾、冷凍干燥和鹽析等常規(guī)生化處理方法；作為精制方法，可將離子交換層析、親和層析、凝膠過(guò)濾層析、疏水性層析、反相層析、制備用電泳等常規(guī)的蛋白性物質(zhì)精制上利用的各種方法組合起來(lái)加以使用。特別令人滿意的是可用人胎兒肺成纖維細(xì)胞IMR 90(ATCC-CCL 186)作為用作原料的人成纖維細(xì)胞。且，作為原料的人胎兒肺成纖維細(xì)胞IMR 90的培養(yǎng)，可將人胎兒肺成纖維細(xì)胞IMR 90吸附在氧化鋁陶瓷上，用添加了5％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，在滾瓶中靜置培養(yǎng)一周至十日，將所得的培養(yǎng)液加以使用。在進(jìn)行精制處理中，以添加0.1％CHAPS(3-[(3cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate，作為表面活性劑進(jìn)行精制為好。
本發(fā)明蛋白質(zhì)OCIF的精制方法為先將培養(yǎng)液上肝素柱(肝素瓊脂糖CL-6B，Pharmacia公司制)，用含2M NaCl的10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗脫，得到肝素吸附性O(shè)CIF部分，將此部分上Q陽(yáng)離子交換柱(HiLoad-Q/FF，Pharmacia公司制)，收集其非吸附部分，可得到肝素吸附性堿性的OCIF部分。所得的OCIF活性部分可用S陽(yáng)離子交換柱(HiLoad-S/HP，Pharmacia公司制)、肝素柱(Heparin-5PW，TOSOH公司制)、Cibacrone blue柱(Blue-5PW TOSOH公司制)，反相柱(BU-300 C4，Perkin-Elmer公司制)進(jìn)行分離精制，此物質(zhì)按上述性質(zhì)進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)如此得到的天然型OCIF蛋白質(zhì)的氨基酸序列，將編碼此蛋白質(zhì)的cDNA克隆化，用此cDNA，以遺傳工程方法得到具有破骨細(xì)胞分化和/或成熟抑制活性的蛋白質(zhì)OCIF的方法。
即，將按本發(fā)明的方法精制所得的OCIF蛋白質(zhì)用エンドプロテア-ゼ(如賴氨酰內(nèi)肽酶)處理后，確定所得的肽的氨基酸序列，制成可編碼所得的內(nèi)部氨基酸序列的寡核苷酸的混合物。
然后，以制成的寡核苷酸混合物為引物，用PCR法(較佳為RT-PCR法)得到OCIF cDNA片斷。以此OCIF cDNA片斷為探針，從cDNA庫(kù)克隆OCIF的全長(zhǎng)cDNA。將所得的OCIF cDNA插入表達(dá)載體，制成表達(dá)OCIF的質(zhì)粒，將其引入各種細(xì)胞或菌株，通過(guò)表達(dá)，可制成重組OCIF。
本發(fā)明還涉及具有上述活性的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的變異體(variant)，新型蛋白質(zhì)OCIF2、OCIF3、OCIF4和OCIF5。
這些變異體是這樣得到的用IMR-90細(xì)胞的聚(A)+RNA制成cDNA庫(kù)，以O(shè)CIF cDNA片斷為引物，將cDNA庫(kù)雜交而成。將這些OCIF變異體的cDNA插入表達(dá)載體，將這種OCIF變異體表達(dá)載體在通常的宿主中表達(dá)，按常規(guī)方法進(jìn)行精制，可得到目的變異體蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及OCIF的突變體。
這些突變體是將可能與OCIF的二聚物形成有關(guān)的Cys殘基置換成Ser殘基或在天然型OCIF中引入缺失突變所致。用PCR法或用限制酶切斷，在OCIF cDNA中引入置換或缺失突變。將此cDNA插入具有適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)促進(jìn)劑的載體，轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物等的真核細(xì)胞中，將此細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從其培養(yǎng)液中按常規(guī)方法精制得到目的OCIF突變體。
本發(fā)明還涉及抗OCIF多克隆抗體及用其測(cè)定OCIF的方法。
抗OCIF多克隆抗體系以O(shè)CIF為免疫原按常法制成的。這時(shí)所用的抗原(免疫原)可采用從IMR-90培養(yǎng)液得到的天然型OCIF、用OCIF cDNA以微生物和真核細(xì)胞為宿主產(chǎn)生的基因重組OCIF，或根據(jù)OCIF的氨基酸序列設(shè)計(jì)的合成肽及OCIF的水解部分肽。用這些抗原，必要時(shí)再合用免疫佐劑，來(lái)免疫哺乳動(dòng)物，按常規(guī)方法從其血清進(jìn)行精制，可得到抗OCIF多克隆抗體。將所得的抗OCIF多克隆抗體用同位素或酶標(biāo)記，可使用于放射免疫測(cè)定(RIA)和酶聯(lián)免疫測(cè)定(EIA)系統(tǒng)。采用這一測(cè)定系統(tǒng)，可容易地測(cè)定血液、腹水等生物試樣及細(xì)胞培養(yǎng)液的OCIF濃度。
本發(fā)明還涉及抗OCIF單克隆抗體及用其測(cè)定OCIF的方法。
抗OCIF單克隆抗體系以O(shè)CIF為免疫原按常法制成的?？乖?免疫原)可采用從IMR-90培養(yǎng)液得到的天然型OCIF、用OCIF cDNA以微生物和真核細(xì)胞為宿主產(chǎn)生的基因重組OCIF，或根據(jù)OCIF的氨基酸序列設(shè)計(jì)的合成肽及OCIF的水解部分肽均可。用這些抗原免疫哺乳動(dòng)物，或?qū)⒂皿w外試驗(yàn)法免疫的細(xì)胞與哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞等融合，制成雜交瘤，從此雜交瘤選擇產(chǎn)生識(shí)別OCIF的抗體的克隆，將此克隆培養(yǎng)，可得到目的抗體。在雜交瘤的制備上，使用哺乳動(dòng)物時(shí)一般使用小鼠和大鼠等小動(dòng)物。免疫方法如下將OCIF用生理鹽水等稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?，靜脈或腹腔注射該溶液，必要時(shí)將其與佐劑合用，給動(dòng)物每2-20天注射2-5次。將如此免疫的動(dòng)物解剖，摘出脾臟，將脾細(xì)胞用作免疫細(xì)胞。來(lái)自免疫細(xì)胞和細(xì)胞融合的骨髓瘤可列舉如P3/x63-Ag8、p3-U1、NS-1、MPC-11、SP-2/0、FO、P3x63Ag8、653、S194等。而來(lái)自大鼠的細(xì)胞可為R-210等細(xì)胞株。在產(chǎn)生人型抗體的情況下，用體外試驗(yàn)法免疫人的淋巴細(xì)胞B，將以人骨髓瘤細(xì)胞和EB病毒等進(jìn)行了性狀轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株作為母本使用，可得到產(chǎn)生人型抗體的雜交瘤。
免疫細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞株的融合可采用公知的方法，如Koehler&Milstein等的方法(Koehler，G.Et al.，Nature，Vol.256，495-497，1975)或電脈沖法等。免疫細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞在用作細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS)中，按通常采用的細(xì)胞數(shù)之比混合，加入聚乙二醇進(jìn)行融合處理，用HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可選擇融合細(xì)胞。
在鑒別抗OCIF抗體產(chǎn)生株上，可采用ELISA法、空斑法、オクタロニ-法、凝集法等用于檢出通常的抗體的方法進(jìn)行選擇。用通常的方法可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，必要時(shí)冷凍保藏。將雜交瘤按常規(guī)方法培養(yǎng)雜交瘤，或移植在哺乳動(dòng)物的腹腔內(nèi)，可產(chǎn)生抗體?？贵w可用鹽析、凝膠過(guò)濾和親和層析等常規(guī)方法加以精制。
所得的抗體對(duì)OCIF有特異反應(yīng)，可用于OCIF的精制。在使用于OCIF的測(cè)定時(shí)，將抗體用同位素和酶等進(jìn)行標(biāo)記，可用于放射免疫測(cè)定(RIA)和酶聯(lián)免疫測(cè)定(EIA)等測(cè)定系統(tǒng)。特別是本發(fā)明所得的抗體，其抗原識(shí)別部位各異，因此具有可用于夾心免疫測(cè)定發(fā)的特征。用該測(cè)定系統(tǒng)可容易地測(cè)定血液和腹水等生物試樣和細(xì)胞培養(yǎng)液等的OCIF濃度。
OCIF活性可按久米川正等的方法(蛋白質(zhì)核酸酶，Vol.34，p999(1989))及Takahashi N.Et al.的方法(Endocrinology，Vol.122，p1373(1988))夾心測(cè)定。即將出生后17天的小鼠骨髓細(xì)胞作為靶細(xì)胞，可用耐酒石酸酸性磷酸酶活性誘導(dǎo)的抑制試驗(yàn)在活性維生素D3(骨化三醇)存在下破骨細(xì)胞形成的抑制。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)破骨細(xì)胞形成抑制因子OCIF作為以改善和治療骨質(zhì)疏松癥等骨量減少癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或變形性關(guān)節(jié)炎等骨代謝異常性疾病、或多發(fā)性骨髓瘤等骨代謝異常性疾病為目的的醫(yī)藥組合物，或作為確立這些疾病的免疫學(xué)診斷的抗原，都是有用的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可制成制劑，經(jīng)口或非經(jīng)口投與。即含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的制劑是含破骨細(xì)胞形成抑制因子OCIF作為有效成分的醫(yī)藥組合物，能對(duì)人和動(dòng)物安全地投藥。
醫(yī)藥組合物的形式可列舉注射用組合物、點(diǎn)滴用組合物、栓劑、鼻內(nèi)給藥劑、舌下劑、經(jīng)皮吸收劑等。注射用組合物為藥理有效量的本發(fā)明的破骨細(xì)胞形成抑制因子和制藥學(xué)上允許的載體的混合物其中可采用氨基酸、糖類、纖維素衍生物和其它有機(jī)/無(wú)機(jī)化合物等通常添加在注射用組合物中的賦形劑/激活劑。用本發(fā)明的破骨細(xì)胞形成抑制因子OCIF和這些賦形劑/激活劑配制注射劑時(shí)，必要時(shí)可添加pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、加溶劑等，按常規(guī)方法制成各種注射劑。
圖面的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1表示將HiLoad-Q/FF非吸附部分初步精制品(試樣3)上HiLoad-S/HP柱時(shí)的洗脫圖型。
圖2表示將肝素-5PW初步精制品(試樣5)上ブル——5PW柱時(shí)的洗脫圖型。
圖3表示將ブル——5PW洗脫流份49-50上反相柱時(shí)的洗脫圖型。
圖4表示最終精制品在還原條件和非還原條件下的SDS-PAGE的結(jié)果。
符號(hào)的說(shuō)明第1、4欄分子量標(biāo)志第2、5欄峰6第3、6欄峰7圖5表示在還原吡啶基乙基化后，將經(jīng)賴氨酰內(nèi)肽酶處理的峰7上反相柱時(shí)的洗脫圖型。
圖6表示天然(n)和重組(r)OCIF在非還原條件下的SDS-PAGE的結(jié)果。(E)表示用293/EBNA細(xì)胞所產(chǎn)生的，(C)表示用CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的。
符號(hào)的說(shuō)明第1欄分子量標(biāo)志第2欄單體型nOCIF第3欄二聚物型nOCIF第4欄單體型rOCIF(E)第5欄二聚物型rOCIF(E)第6欄單體型rOCIF(C)第7欄二聚物型rOCIF(C)圖7表示天然(n)和重組(r)OCIF在還原條件下的SDS-PAGE的結(jié)果。(E)表示用293/EBNA細(xì)胞所產(chǎn)生的，(C)表示用CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的。
符號(hào)的說(shuō)明第8欄分子量標(biāo)志第9欄單體型nOCIF第10欄二聚物型nOCIF第11欄單體型rOCIF(E)第12欄二聚物型rOCIF(E)第13欄單體型rOCIF(C)第14欄二聚物型rOCIF(C)圖8表示除去N-結(jié)合型糖鏈的天然(n)和重組(r)OCIF在還原條件下的SDS-PAGE的結(jié)果。(E)表示用293/EBNA細(xì)胞所產(chǎn)生的，(C)表示用CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的。
符號(hào)的說(shuō)明第15欄分子量標(biāo)志第16欄單體型nOCIF第17欄二聚物型nOCIF第18欄單體型rOCIF(E)第19欄二聚物型rOCIF(E)第20欄單體型rOCIF(C)第21欄二聚物型rOCIF(C)圖9表示OCIF和OCIF 2的氨基酸序列比較。
圖10表示OCIF和OCIF 3的氨基酸序列比較。
圖11表示OCIF和OCIF 4的氨基酸序列比較。
圖12表示OCIF和OCIF 5的氨基酸序列比較。
圖13表示用抗OCIF多克隆抗體時(shí)的OCIF標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖14表示用抗OCIF單克隆抗體時(shí)的OCIF標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖15表示OCIF對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療效果。
實(shí)施發(fā)明的最佳方案以下列舉實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。然而，它們僅僅是示例，本發(fā)明并不受其限制。
實(shí)施例1人成纖維細(xì)胞IMR 90培養(yǎng)液的配制人胎兒肺成纖維細(xì)胞IMR 90(ATCC CCL186)在滾瓶(490cm2，110×171cm，Coning公司制)中，附著于80g的氧化鋁陶瓷片(氧化鋁99.5％，東芝陶瓷公司制)上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)中使用60個(gè)轉(zhuǎn)滾瓶，每個(gè)滾瓶中用添加10mM HEPES緩沖液的DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司制)500ml，緩沖液中加有5％小牛血清，在5％CO2存在下于37℃靜置培養(yǎng)7-10天。培養(yǎng)后回收培養(yǎng)液，添加新的培養(yǎng)基，每次培養(yǎng)得到30升IMR 90培養(yǎng)液。所得的培養(yǎng)液作為試料1。
實(shí)施例2破骨細(xì)胞形成抑制活性的測(cè)定按久米川正好等的方法(蛋白質(zhì)、核酸、酵素Vol.34 p999(1989))和Takahashi N.等的方法(Endocrinology Vol.122 p1373(1988))，進(jìn)行本發(fā)明的蛋白性破骨細(xì)胞形成抑制因子的活性測(cè)定。即采用從出生后約17天的小鼠分離出的骨髓細(xì)胞，以耐酒石酸的酸性磷酸酶活性的誘導(dǎo)作為指標(biāo)，試驗(yàn)在活性型維生素D3存在下破骨細(xì)胞的形成，進(jìn)行其抑制活性的測(cè)定。即在96孔微量培養(yǎng)板上，加入以含2×10-8M活性型維生素D3和10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(Gibo BRL公司制)稀釋的樣品100μl，將得自出生后約17天的小鼠的骨髓細(xì)胞3×106個(gè)懸浮在含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基100μl中進(jìn)行接種，于5％CO2、37℃和100％濕度條件下培養(yǎng)一周。在培養(yǎng)第3天和第5天時(shí)，棄去培養(yǎng)液160μl，添加含1×10-8M活性型維生素D3和10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基稀釋的樣品160μl。培養(yǎng)7天后，用磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌，然后以乙醇/丙酮(1∶1)溶液將細(xì)胞室溫固定1分鐘，用酸性磷酸酶活性測(cè)定盒(酸性磷酸酶、白細(xì)胞、目錄No.387-A，Sigma公司制)，通過(guò)染色檢出破骨細(xì)胞的形成。以酒石酸存在下酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞的減少作為OCIF的活性。
實(shí)施例3OCIF的精制i)用肝素瓊脂糖CL-6B(Heparin Sepharose CL-6B)精制將約90升IMR 90培養(yǎng)液(試料1)用0.22μm濾膜(親水性Milidisk，2000cm2，Millipore公司制)過(guò)濾后，分3次上肝素瓊脂糖CL-6B柱(5×4.1cm，凝膠容量80ml)，該柱用含0.3M NaCl的10m M Tris-HCl緩沖液(下稱作Tris-HCl，)(pH7.5)平衡過(guò)。以流速500ml/小時(shí)的10mM Tris-HCl(pH7.5)洗滌后，用含2M NaCl的10mM Tris-HCl(pH7.5)洗脫，得肝素瓊脂糖CL-6B吸附部分900ml，所得組分作為試料2。
ii)用HiLoad-Q/FF精制將肝素瓊脂糖吸附部分(試料2)對(duì)10mM Tris-HCl(pH7.5)進(jìn)行透析后，加CHAPS使成0.1％，于4℃放置一夜，分2次上用含0.1％CHAPS的50mM Tris-HCl(pH7.5)平衡過(guò)的陰離子交換柱(HiLoad-Q/FF，2.6×10cm，Pharmacia公司制)，得非吸附部分1000ml。所得部分作為試料3。
iii)用HiLoad-S/HP精制將HiLoad-Q非吸附部分(試料3)上以含0.1％CHAPS的50mM Tris-HCl(pH7.5)平衡過(guò)的陽(yáng)離子交換柱(HiLoad-S/HP，2.6×10cm，Pharmacia公司制)。用含0.1％CHAPS的50mM Tris-HCl(pH7.5)洗滌后，在100分鐘內(nèi)，用NaCl 0-1M的線性梯度，以8ml/分的流速進(jìn)行洗脫，按12ml/流分進(jìn)行收集。將流分1-40匯集成4個(gè)部分，每個(gè)部分10個(gè)流分，各用100μl測(cè)定OCIF活性，在流分11-30發(fā)現(xiàn)有OCIF活性(圖1圖中，++表示抑制破骨細(xì)胞形成80％以上的活性；+表示抑制破骨細(xì)胞形成30-80％的活性；-表示未檢出活性)。以比活性較高的流分21-30作為試料4。
iv)用親和柱(肝素 5PW)精制將120ml試料4用240ml含0.1 CHAPS的50mM Tris-HCl(pH7.5)稀釋后，上以含0.1％CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)平衡過(guò)的親和柱(肝素5PW，0.8×7.5cm，TOSOH公司制)。用含0.1％CHAPS的50mM Tris-HCl(pH7.5)洗滌后，在60分鐘內(nèi)，以NaCl 0-2M的線性梯度、0.5ml/分的流速進(jìn)行洗脫，按0.5ml/流分進(jìn)行分取。各流分用50μl測(cè)定OCIF活性，得到約0.7-1.3M NaCl洗脫的OCIF活性部分10ml，作為試料5。
v)用親和柱(Blue-5PW)精制將10ml試ou 5用190ml含0.1％CHAPS的50mM Tris-HCl(pH7.5)稀釋后，上以含0.1CHAPS的50mM Tris-HCl(pH7.5)平衡過(guò)的親和柱(Blue-5PW，0.5×5.0cm，TOSOH公司制)。用含0.1％CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)洗滌后，在60分鐘內(nèi)，以NaCl 0-2M的線性梯度、0.5ml/分的流速進(jìn)行洗脫，按0.5ml/流分進(jìn)行分取。各流分用25μl測(cè)定OCIF活性，得到用約1.0-1.6M NaCl洗脫的OCIF活性流分49-70(圖2，圖中++表示抑制破骨細(xì)胞形成80％以上的活性，+表示抑制破骨細(xì)胞形成30-80％的活性)。
vi)用反相柱精制在所得的流分49-50ml中，加入25％TFA(三氟乙酸)10μl，然后上以含0.1％TFA的25％乙腈平衡過(guò)的反相柱(BU-300，C4，2.1×220mm，Perkin-Elmer公司制)，在60分鐘內(nèi)，用乙腈以0-55％的線性梯度、0.2ml/分的流速進(jìn)行洗脫，分取各峰(圖3)。用各峰流分100μl測(cè)定OCIF活性，在峰6和峰7檢出濃度依賴性的活性。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 從反相柱洗脫的OCIF活性

(表中，++表示抑制破骨細(xì)胞形成80％以上的活性，+表示抑制破骨細(xì)胞形成30-80％的活性，-表示未檢出活性。)實(shí)施例4OCIF分子量的測(cè)定用檢出OCIF活性的峰6和峰7各40μl，在還原或非還原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。即取各峰流份每份20μl各置2個(gè)試管中，減壓濃縮后，溶解于含1mM EDTA、2.5％SDS和0.01％溴酚藍(lán)的10mM Tris-HCl(pH8)1.5μl中，分別在非還原條件下及還原條件下(存在5％巰基乙醇)于37℃放置過(guò)夜后，各取1μl進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用10-15％丙烯酰胺梯度凝膠(Pharmacia公司制)，用Phast系統(tǒng)電泳裝置(Pharmacia公司制)進(jìn)行電泳。用磷酸化酶b(94kD)牛血清白蛋白(67kD)、卵白蛋白(43kD)、碳酸酐酶(30kD)、胰蛋白酶抑制劑(20.0kD)、α-乳白蛋白(14.4kD)作為分子量標(biāo)志。電泳結(jié)束后，用Phast凝膠銀染試劑盒(Pharmacia公司制)，進(jìn)行銀染。結(jié)果見(jiàn)圖4。
其結(jié)果，對(duì)于峰6，在還原條件下、非還原條件下檢出約60kD的蛋白帶，對(duì)于峰7，在還原條件下檢出約60kD、在非還原條件下檢出約120kD的蛋白帶。從而，認(rèn)為峰7是峰6的蛋白質(zhì)的同源二聚物。
實(shí)施例5OCIF的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)從Blue-5PW流份51-52混合后所得的樣品中取若干份，各20μl，加入10mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.2)30μl后，于70℃和90℃進(jìn)行10分鐘熱處理，或于56℃進(jìn)行30分鐘熱處理。用此樣品按實(shí)施例2所述方法測(cè)定OCIF的活性。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 OCIF的熱穩(wěn)定性

(表中，++表示抑制破骨細(xì)胞形成80％以上的活性，+表示抑制破骨細(xì)胞形成30-80％的活性，-表示未檢出活性。)實(shí)施例6內(nèi)部氨基酸序列的確定取Blue-5PW流份51-70，將每2個(gè)流份混合成1ml，在各個(gè)試樣中加入10μl的25％TFA后，將1ml分10次上以含0.1％TFA的25％乙腈平衡過(guò)的反相柱(BU-300，C4，2.1×220mm，Perkin-Elmer公司制)，在60分鐘內(nèi)用乙腈以0-55％的線性梯度、以0.2ml/分的流速進(jìn)行洗脫，收集峰6和峰7。所得的峰6和峰7的一部分分別用蛋白質(zhì)序列分析儀(PROCISE 494型，Perkin-Elmer公司制)，進(jìn)行N末端氨基酸序列分析，不能分析提示這些蛋白質(zhì)的N末端可能被保護(hù)。另外，解析這些蛋白質(zhì)的內(nèi)部氨基酸序列。即將峰6和峰7流份分別離心濃縮后，各加入100μg二硫蘇糖醇、含10mM EDTA、7M鹽酸胍和1％CHAPS的0.5MTris-HCl(pH8.5)50μl，室溫下放置4小時(shí)進(jìn)行還原后，加入0.2μl 4-乙烯基吡啶，在室溫暗處放置一夜，進(jìn)行吡啶基乙基化。在這些樣品中加入25％TFA 1μl，用含0.1％TFA的20％乙腈平衡過(guò)的反相柱(BU-300，C4，2.1×30mm，Perkin-Elmer公司制)，在30分鐘內(nèi)用乙腈以濃度0-50％的線性梯度、以0.3ml/分的流速進(jìn)行洗脫，得到還原吡啶基乙基化的OCIF樣品。將還原吡啶基乙基化的OCIF樣品分別離心濃縮，用含8M尿素和0.1％吐溫-80的0.1M Tris-HCl(pH9)25μl溶解后，用0.1M Tris-HCl(pH9)73μl稀釋，加入0.02μg的AP1(賴氨酰內(nèi)切蛋白酶，和光純藥社制)，37℃反應(yīng)15小時(shí)。在反應(yīng)液中加入25％TFA 1μl，上以0.1％TFA平衡過(guò)的反相柱(BU-300，C8，2.1×220mm，Perkin-Elmer公司制)，在70分鐘內(nèi)用乙腈以0-50％的線性梯度、以0.2ml/分的流速進(jìn)行洗脫，得到肽碎片(圖5)、對(duì)所得的肽碎片(P1-P3)用蛋白質(zhì)序列分析儀進(jìn)行氨基酸序列分析。結(jié)果見(jiàn)序列表序列1-3。
實(shí)施例7cDNA序列的確定i)從IMR-90細(xì)胞分離聚(A)+RNA用快速痕跡mRNA分離試劑盒(Invitrogen制)按照其手冊(cè)所述進(jìn)行分離。用此方法，從約1×108個(gè)IMR-90細(xì)胞獲得約10μg聚(A)+RNA。
ii)混合引物的制備以前面所得的肽(序列表序列2和3)的氨基酸序列為基礎(chǔ)，合成了2種混合引物。即合成了具有可編碼肽P2(序列2的肽)的第6(Gln)至第12位(Leu)氨基酸序列的全部堿基序列的寡核苷酸的混合物(混合引物No.2F)。又合成了與可編碼肽P3(序列3的肽)的第6(His)至第12位(Lys)氨基酸序列的全部堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸的混合物(混合引物No.3R)。所用的混合引物的堿基序列見(jiàn)表3。
表3＝No.2F＝5’-CAAGAACAAA CTTTTCAATT-3’G G G C C GCAG＝No.3R＝5’-TTTATACATT GTAAAAGAAT G-3’C G C G GCTGA CG Tiii)OCIF cDNA片段用PCR擴(kuò)增將實(shí)施例7-i)中所得的聚(A)+RNA 1μg作為模板，用Super Script IIcDNA合成試劑盒(Gibco公司制)，按該公司的方案合成單鏈cDNA，用此cDNA和實(shí)施例7-ii)所述的引物進(jìn)行PCR，得到OCIF cDNA片段。以下列出條件。
10x Ex Taq緩沖液(寶酒造社)5μl2.5mM dNTP4μlcDNA溶液 1μlEx Taq(寶酒造社) 0.25μl蒸餾水29.75μl40μM引物No.2F5μl40μM引物No.3F5μl將上述溶液在微量離心管中混合后，按以下條件進(jìn)行PCR。于95℃進(jìn)行3分鐘預(yù)處理后，將95℃30秒、50℃30秒、70℃2分鐘的3階段反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行30次，然后于70℃保溫5分鐘。將反應(yīng)液的一部分進(jìn)行瓊脂糖電泳，確認(rèn)得到約400bp的均一的DNA片段。
實(shí)施例8PCR擴(kuò)增所得的OCIF cDNA片段的克隆化及堿基序列測(cè)定將實(shí)施例7-iii)中所得的OCIF cDNA片段按Marchuk，D等的方法(NucleicAcid Res.，Vol.19，p1154，1991)，用DNA連接試劑盒Ver.2.(寶酒造社制)插入質(zhì)粒pBluescript II SK-(Strategene公司制)中，使大腸桿菌DH5α(Gibco BPL社)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。讓所得的轉(zhuǎn)化株增殖，將插入了約400bp的OCIF cDNA片段的質(zhì)粒按常規(guī)方法進(jìn)行精制。將此質(zhì)粒命名為pBCOCIF，將此質(zhì)粒中插入的OCIF cDNA的堿基序列用Taq雙脫氧鏈終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(Taq Dye Deoxy TerminatorCycle Sequencing kit；Perkin-Elmer公司制)進(jìn)行測(cè)定。此OCIF cDNA的長(zhǎng)度為397bp。在由從此堿基序列預(yù)測(cè)的132個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列中，用于混合引物設(shè)計(jì)的OCIF的內(nèi)部氨基酸序列(序列表中序列2和3)可分別見(jiàn)于N末端和C末端。OCIF的內(nèi)部氨基酸序列(序列1)還可見(jiàn)于此132個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列之中。從以上結(jié)果可確認(rèn)克隆化的397bp的cDNA為OCIF cDNA的片段。
實(shí)施例9DNA探針的制備將實(shí)施例8所制得的插入了397bp的OCIF cDNA片段的質(zhì)粒作為模板，在實(shí)施例7-iii)的條件下進(jìn)行PCR，將此OCIF cDNA的片段擴(kuò)增。用瓊脂糖電泳將397bp的OCIF cDNA片段分離后，用QIAEX凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司制)進(jìn)行精制。將此DNA用MegaprimeDNA標(biāo)記試劑盒(Amersham公司制)以[α32P]dCTP標(biāo)記，用作篩選全長(zhǎng)OCIF cDNA的探針。
實(shí)施例10cDNA文庫(kù)的制備以實(shí)施例7-i)所得的聚(A)+RNA2.5μg為模板，用Great Lengths cDNA合成試劑盒(Clontech公司制)，按該公司的方案用寡(dT)引物進(jìn)行cDNA合成、與EcoRI-Sal I-Not-I銜接頭相連接、按cDNA大小分級(jí)，用乙醇沉淀后，溶于10μl TE緩沖液。用T4DNA連接酶將所得的與銜接頭連接的cDNA0.1μg插入預(yù)先用EcoRI切斷的1μg的λZAP表達(dá)載體(Stratagene公司制)中。將如此所得的cDNA重組噬菌體DNA溶液用Gigapack Gold II(Stratagene公司制)供體外包裝反應(yīng)，制成λZAP表達(dá)重組載體噬菌體。
實(shí)施例11重組噬菌體的篩選將實(shí)施例10所得的重組噬菌體于37℃感染大腸桿菌XL1-Blue MRF’(Stratagene公司制)15分鐘，然后加入加溫至50℃的含0.7％瓊脂的NZY培養(yǎng)基，流入NZY瓊脂培養(yǎng)基平板。于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，在產(chǎn)生噬菌斑的平板上以HybondN(Amersham公司制)接觸30秒。將該濾膜按常規(guī)方法進(jìn)行堿變性后，中和，浸入2×SSC溶液后用UV交聯(lián)劑(Stratagene公司制)將DNA固定在濾膜上。將所得的濾膜于65℃在含100μg/ml的鮭精子DNA的雜交緩沖液(Amersham公司制)中浸漬4小時(shí)進(jìn)行預(yù)處理后，移入加有經(jīng)熱變性的上述DNA探針(2×105cpm/ml)的上述緩沖液中，于65℃進(jìn)行一夜雜交。反應(yīng)后，濾膜于65℃下用2×SSC洗2次、0.1×SSC和0.1％SDS溶液各洗2次，每次10分鐘。將所得的幾個(gè)陽(yáng)性克隆再按這樣的方法篩選2次進(jìn)行純化。將其中具有約1.6kb的插入片段的克隆用于下面的步驟。此純化的噬菌體稱作λOCIF。將純化的λOCIF按λZAP表達(dá)克隆化試劑盒(Stratagene公司制)的方案感染大腸桿菌XL1-Blue MRF’，然后用輔助噬菌體ExAssist(Stratagene公司制)進(jìn)行多重感染，將其培養(yǎng)上清液感染大腸桿菌XLOLR(Stratagene公司制)，然后通過(guò)選擇卡那霉素耐性株，得到具有在pBKCMV(Stratagene公司制)中插入上述1.6kb插入片段的質(zhì)粒pBKOCIF的轉(zhuǎn)化株。此轉(zhuǎn)化株稱作pBK/01F10，保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號(hào)FERM BP-5257(1995年10月25日根據(jù)布達(dá)佩斯條約將FERM P-14998原保藏物移存)。使具有此質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株增殖，按常規(guī)方法精制質(zhì)粒。
實(shí)施例12編碼OCIF全氨基酸序列的cDNA堿基序列的確定用Taq雙脫氧鏈終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(Taq Dye Deoxy Terminator CycleSequencing kit；Perkin-Elmer公司制)測(cè)定實(shí)施例11所得的OCIF cDNA的堿基序列。所用的引物為T(mén)3、T7引物(Stratagene公司制)及基于OCIF cDNA的堿基序列設(shè)計(jì)的合成引物，其序列見(jiàn)序列表序列16-29。
確定的OCIF堿基序列及從該序列推斷的氨基酸序列分別見(jiàn)序列6和序列5。
實(shí)施例13用293/EBNA細(xì)胞制備重組OCIFI)OCIF cDNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將實(shí)施例11得到的插入約1.6kb的OCIF cDNA的質(zhì)粒pBKOCIF以限制酶BamHI及XhoI消化，切出OCIF cDNA，經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，用QIAEX凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司制)。該OCIF cDNA用連接試劑盒Ver.2(寶酒造社制)插入預(yù)先以限制酶Bam HI及XhoI消化的表達(dá)質(zhì)粒pCEP4(Invitrogen公司)，使大腸桿菌DH5α(Gibco BR1公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。讓所得的轉(zhuǎn)化株增殖，用QIAGEN柱(QIAGEN公司)精制插入了OCIF cDNA的表達(dá)質(zhì)粒pCEPOCIF。以乙醇沉淀OCIF表達(dá)質(zhì)粒pCEPOCIF后，以無(wú)菌蒸餾水溶解后，用于以下操作。
ii)OCIF cDNA的瞬時(shí)表達(dá)及其活性測(cè)定用實(shí)施例13-i)所得的OCIF表達(dá)質(zhì)粒pCEPOCIF，以如下所述方法表達(dá)重組OCIF，并測(cè)定其活性。用含10％胎牛血清(Gibco BRL公司)的IMDM培養(yǎng)基(GibcoBRL公司)在6孔微量培養(yǎng)板的各孔中接種8×105個(gè)293/EBNA細(xì)胞(Invitrogen公司)，次日除去培養(yǎng)基后，以無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。按添加轉(zhuǎn)染用試劑Lipofectamine(Gibco BRL公司制)的方案，將預(yù)先以O(shè)PTI-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司制)稀釋的pCEPOCIF與Lipofectamine混合后，將此混合液加到各孔的細(xì)胞中。所用的pCEPOCIF及Lipofectamine的量各為3μg及12μl。38小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，加入1ml新的OPTI-MEM培養(yǎng)基，再經(jīng)30小時(shí)后，回收培養(yǎng)基，將它作為測(cè)定OCIF活性用的樣品。OCIF的活性測(cè)定按如下方法進(jìn)行。用耐酒石酸的酸性磷酸酶活性的誘導(dǎo)，試驗(yàn)出生后約17日的小鼠骨髓細(xì)胞在活性型維生素D3存在下的破骨細(xì)胞的形成，測(cè)定其活性的抑制，作為OCIF的活性。即在96孔微量培養(yǎng)板上加入以含2×10-8M活性型維生素D3及10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)稀釋的樣品100μl，取出生后約17日的小鼠骨髓細(xì)胞3×105個(gè)懸浮于含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基100μl中，進(jìn)行接種，在5％CO2中于37℃、溫度100％條件下培養(yǎng)一周。于培養(yǎng)第3日及第5日，棄去培養(yǎng)液160μl，加入以含1×10-8M活性型維生素D3及10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基稀釋的樣品160μl。培養(yǎng)7日后，以磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌后，用乙醇/丙酮(1∶1)溶液將細(xì)胞于室溫固定1分鐘，用酸性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒(Acid Phosphatase，Leucocyte，目錄No.387-A，Sigma公司)用染色法檢出破骨細(xì)胞的形成。將酒石酸存在下酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞的減少作為OCIF活性。結(jié)果如表4所示，確認(rèn)該培養(yǎng)液與以前由IMR-90的培養(yǎng)液得到的天然型OCIF具有同樣的活性。
表4293/EBNA細(xì)胞表達(dá)的培養(yǎng)液中的ICIF活性

(表中，++表示抑制破骨細(xì)胞形成達(dá)80％以上的活性，+表示抑制破骨細(xì)胞形成達(dá)30～80％的活性，-表示活性未檢出。)iii)來(lái)自293/EBNA細(xì)胞的重組OCIF的精制按實(shí)施例13-ii)所述大量培養(yǎng)293/EBNA細(xì)胞所得到的培養(yǎng)液1.8L，加CHAPS使成為0.1％，經(jīng)0.22μm的濾器(Steribecs GS，Millipore公司制)過(guò)濾后，上以10mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的50ml肝素瓊脂糖CL-6B柱(2.6×10cm、Pharmacia公司)。以含0.1％CHAPS的10mM Tris-HCl(pH7.5)洗滌后，在100分種內(nèi)用NaCl以0～2M的線性梯度、4ml/分的流速洗脫，按8ml/流分進(jìn)行收集。各流分用150μl按實(shí)施例2的方法測(cè)定OCIF的活性，得到以約0.6~1.2M NaCl洗脫的OCIF活性部分112ml。
所得的OCIF活性部分112ml以含0.1％CHAPS的10mM Tris-HCl(pH7.5)稀釋成1000ml后，上以含0.1％CHAPS的10mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的親和柱(肝素-5PW，0.8×7.5cm、ト-ソ-社)。以含0.1％CHAPS的10mM Tris-HCl(pH7.5)洗滌后，在60分鐘內(nèi)用NaCl以0～2M的線性梯度、0.5ml/分的流速進(jìn)行洗脫，按0.5ml/流分進(jìn)行收集。
所得的流分各取4μl按實(shí)施例4的方法，在還原及非還原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。其結(jié)果，流分30～32在還原條件下僅檢出約60kD、在非還原條件下僅檢出約60kD及約120kD的OCIF帶，收集流分30～32，作為純的來(lái)自293/EBNA細(xì)胞的重組OCIF(rOCIF(E))部分。以BSA作標(biāo)準(zhǔn)，用Lowry法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的結(jié)果，表明得到535μg/ml珠rOCIF(E)1.5ml。
實(shí)施例14
用CHO細(xì)胞制備重組OCIFi)OCIF表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建實(shí)施例11所得的插入約1.6kb的OCIFcDNA的質(zhì)粒pBKOCIF以限制酶SaL I及Eco RV消化，切出約1.4kb的OCIFcDNA片段，經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，以QIAEX凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)精制。另外，表達(dá)載體pcDL-SR 2296(Molecularand Cellular Biology，Vol.8，pp466-472，1988)用限制酶Pst I及Kpn I消化，經(jīng)瓊脂糖電泳分離約3.4kb的表達(dá)載體DNA片段后，用QIAEX凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)精制。用DNA平端化試劑盒(寶酒造社)，使這些經(jīng)精制的OCIFcDNA片段與表達(dá)載體DNA片段的末端平滑化。然后，用連接試劑盒Ver.2(寶酒造社)。將OCIFcDNA片段插入已經(jīng)平滑化的表達(dá)載體DNA片段，使大腸桿菌DH5α(Gibco BRL公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到含有OCIF表達(dá)質(zhì)粒pSRαOCIF的轉(zhuǎn)化株ii)表達(dá)質(zhì)粒的制備分別用常法使實(shí)施例13-i)所得的含有OCIF表達(dá)質(zhì)粒pSRαOCIF的轉(zhuǎn)化株以及WO92/01053號(hào)公報(bào)所揭示的含有小鼠DHFR基因表達(dá)質(zhì)粒pBAdDSV的轉(zhuǎn)化株增殖，按Maniatis等(Molecular cloning，第2版)的方法用堿法及聚乙二醇法處理，以氯化銫密度梯度離心法精制。
iii)以不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基馴化CHOdhFr-細(xì)胞用含10％胎牛血清(Gibco BRL公司)的IMDM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)繼代培養(yǎng)的CHOdhFr-細(xì)胞(ATCC-CRL9096)，以無(wú)血清培養(yǎng)基EX-CELL301(JRH Bioscience公司)馴化后，再以不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基EX-CELL PF CHO(JRH Bioscience公司)馴化。
iv)將OCIF表達(dá)質(zhì)粒和DHFR表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入CHOdhFr-細(xì)胞用實(shí)施例14-ii)制備的OCIF表達(dá)質(zhì)粒pSRαOCIF和DHFR表達(dá)質(zhì)粒pBAdDSV，以下述電穿孔法使實(shí)施例14-iii)制備的CHOdhFr-細(xì)胞轉(zhuǎn)化。將pSRαOCIF質(zhì)粒200μg和pBAdDSV質(zhì)粒20μg以無(wú)菌操作溶解于含10％胎牛血清(Gibco BRL公司)的IMDM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)0.8ml后，取其0.8ml懸浮2×107個(gè)CHOdhFr-細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液加入樣品池(Bio-Rad公司)，用基因脈沖發(fā)生器(Bio-Rad公司)，在360V、960μF的條件下以電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將已完成電穿孔的細(xì)胞懸液移入已加10ml EX-CELL PFCHO培養(yǎng)基的細(xì)胞懸浮用的T形瓶(住友ベ-クライト社)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2日。用EX-CELL PF CHO培養(yǎng)基以5000個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔微量培養(yǎng)板，培養(yǎng)約2周。由于EX-CELL PF CHO培養(yǎng)基不含核酸，親株CHOdhFr-在此培養(yǎng)基中不能增殖，所以只有表達(dá)DHFR的細(xì)胞株被選擇出來(lái)。由于OCIF表達(dá)質(zhì)粒的用量為DHFR表達(dá)質(zhì)粒的10倍，所以表達(dá)DHFR的細(xì)胞株大部分能表達(dá)OCIF。用實(shí)施例2所述測(cè)定方法，從所得到的表達(dá)DHFR的細(xì)胞株中篩選出培養(yǎng)上清液中OCIF活性高的細(xì)胞株。對(duì)所得到的OCIF高產(chǎn)株，采用EX-CELL PF CHO培養(yǎng)基，以有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，對(duì)所得的克隆，篩選培養(yǎng)上清液中OCIF活性高的細(xì)胞株，得出OCIF高產(chǎn)克隆5561。
v)重組OCIF的制備為制備重組OCIF(rOCIF)，在3升EX-CELL 301培養(yǎng)基中接種轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞(5561)，使?jié)舛葹?×105個(gè)細(xì)胞/ml，用旋動(dòng)燒瓶于37℃培養(yǎng)4～5日。至細(xì)胞的濃度約為1×10-6個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，回收約2.7升培養(yǎng)基。加入約2.7升EX-CELL301培養(yǎng)基，反復(fù)培養(yǎng)。用3個(gè)旋動(dòng)燒瓶，采取約20升培養(yǎng)液。
vi)來(lái)自CHO細(xì)胞的重組OCIF的精制在實(shí)施例14-v)所得到的培養(yǎng)液1升中加入CHAPS，使成0.1％的濃度，經(jīng)0.22μm濾器(Steribecks GS，Millipore公司)過(guò)濾后，上以10mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的50ml肝素瓊脂糖FF柱(2.6×10cm，Pharmacia公司)。此含0.1％CHAPS的10mM Tris-HCl(pH7.5)洗滌后，在100分鐘內(nèi)用NaCl以0～2M的線性梯度、4ml/分的流速洗脫，按8ml/流分進(jìn)行收集。各流分取150μl按實(shí)施例2的方法測(cè)定OCIF活性，得到以約0.6~1.2M洗脫的OCIF活性部分112ml。
將所得的OCIF活性部分112ml用含0.1％CHAPS的10mM Tris-HCl(pH7.5)稀釋成1200ml之后，上以含0.1％CHAPS的10mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的親和柱(藍(lán)染料-5PW，0.5×5cm，ト-ソ-社)。以含0.1％CHAPS的10mM Tris-HCl(pH7.5)洗滌后，在90分鐘內(nèi)用NaCl以0～3M的線性梯度、0.5ml/分的流速洗脫，按0.5ml/流分進(jìn)行收集。
所得流分各取4μl按實(shí)施例4的方法在還原及非還原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。其結(jié)果，流分的30～38在還原條件下僅檢出約60kD、在非還原條件下僅檢出約60kD與約120kD的OCIF帶，故合并流分30～38，作為精制的來(lái)自CHO細(xì)胞的重組OCIF(rOCIF(C))部分。以BSA作標(biāo)準(zhǔn)，按Lowry法定量蛋白的結(jié)果，表明得到113μg/ml的rOCIF(C)4.5ml。
實(shí)施例15重組OCIF的N-末端結(jié)構(gòu)解析取3μg精制rOCIF(E)及rOCIF(C)，用Pro Spin(Perkin-Elmer公司)固定于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，以20％甲醇洗滌后，用蛋白質(zhì)測(cè)序儀(PROCISE 492型，Perkin-Elmer公司)進(jìn)行N-末端氨基酸序列測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)序列表第7號(hào)序列。
搞清了rOCIF(E)及rOCIF(C)的N-末端的氨基酸是序列表序列5所記載的氨基酸序列的翻譯起始點(diǎn)Met起第22號(hào)的Glu，從Met至Gln的21個(gè)氨基酸是信號(hào)肽。而自IMR-90培養(yǎng)液精制得到的天然型OCIF的N-末端氨基酸序列不能分析，認(rèn)為是因N-末端的Glu在培養(yǎng)時(shí)或精制時(shí)轉(zhuǎn)變成了焦谷氨酸之故。
實(shí)施例16重組(r)OCIF及天然型(n)OCIF的生物活性I)由維生素D3誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞株破骨細(xì)胞形成的抑制在96孔微量培養(yǎng)板上，加入以含2×10-8M活性型維生素D3及10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)自250ng/ml開(kāi)始連續(xù)二倍稀釋的精制rOCIF(E)及nOCIF100μl。將出生后約17日的小鼠骨髓細(xì)胞3×105個(gè)懸浮于含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基100μl中，接種于各孔，在5％CO2中于37℃、溫度100％培養(yǎng)一周。培養(yǎng)7日后，按實(shí)施例2的方法用酸性磷酸酶測(cè)定試劑盒(Acid Phosphatase，Leucocyte，目錄No.387-A，Sigma公司)進(jìn)行染色，檢出破骨細(xì)胞的形成。將酒石酸存在下酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞的減少作為OCIF活性。酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞的減少率，從已染色細(xì)胞的色素的溶解、其吸光度的測(cè)定進(jìn)行計(jì)算。即在細(xì)胞已固定并染色的各孔中加入0.1N氫氧化鈉-二甲亞砜混合液(1∶1)100μl后充分振蕩。色素充分溶解后，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(Immunoreader NJ-2000，InterMed公司)于測(cè)定波長(zhǎng)590nm、對(duì)照波長(zhǎng)490nm測(cè)定吸光度。而用未加維生素D3的孔，作為測(cè)定吸光度時(shí)的空白孔。將未加OCIF孔的吸光度值作為100，用百分率表示結(jié)果，見(jiàn)表5。
表5由OCIF引起的小鼠骨髓細(xì)胞株破骨細(xì)胞形成的抑制(維生素D3)

rOCIF(E)與nOCIF同樣，在16ng/ml以上的濃度時(shí)出現(xiàn)劑量依賴性的破骨細(xì)胞形成抑制活性。
ii)基質(zhì)細(xì)胞與小鼠脾臟細(xì)胞共同培養(yǎng)體系中由維生素D3誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的抑制維生素D3誘導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞與小鼠脾臟細(xì)胞共同培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞形成的試驗(yàn)，按宇田川等的方法(Endocrinology，Vol 125，p1805-1813，1989)進(jìn)行。即在96孔微量培養(yǎng)板上，加入以2×10-8M活性型維生素D3、2×10-7M地塞米松及10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)連續(xù)稀釋的精制rOCIF(E)、rOCIF(C)及nOCIF 100μl。將來(lái)自小鼠骨髓的基質(zhì)細(xì)胞株ST2細(xì)胞(RIKEN Cell Bank RCB0224)5×103個(gè)以及出生后約8周的ddy小鼠脾臟細(xì)胞1×105個(gè)懸浮于含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基100μl中，接種于各孔，于5％CO2中于37℃及濕度100％培養(yǎng)5日。培養(yǎng)5日后以磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌，然后以乙醇/丙酮(1∶1)溶液將細(xì)胞室溫固定1分鐘，用鹽酸磷酸酶活性測(cè)定試劑盒(Acid Phosphatase，Leucocyte，目錄No.387-A，Sigma公司)染色，檢出破骨細(xì)胞的形成。將酒石酸存在下酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞的減少作為OCIF活性。而酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的減少率，按實(shí)施例16-i)記載的方法使已染色細(xì)胞的色素溶解，進(jìn)行計(jì)算。用rOCIF(E)及rOCIF(C)試驗(yàn)的結(jié)果分別列于表6及表7。
表6基質(zhì)細(xì)胞與小鼠脾臟細(xì)胞共同培養(yǎng)系統(tǒng)中由OCIF引起的破骨細(xì)胞形成的抑制

表7基質(zhì)細(xì)胞與小鼠脾臟細(xì)胞共同培養(yǎng)系統(tǒng)中由OCIF引起的破骨細(xì)胞形成的抑制

可見(jiàn)rOCIF(E)及rOCIF(C)與n OCIF一樣，在6～16ng/ml以上的濃度都具有劑量依賴性的破骨細(xì)胞形成抑制活性。
iii)對(duì)PTH誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的抑制PTH誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的試驗(yàn)，按高橋等的方法(Endocrinology，Vol 122，p1373-1382，1988)進(jìn)行。就是以含2×10-8M PTH及10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)從125ng/ml起連續(xù)稀釋nOCIF及精制rOCIF(E)，在96孔微量培養(yǎng)板上各加入100μl。將出生后約17日的小鼠骨髓細(xì)胞3×105個(gè)懸浮于含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基100μl，接種于各孔，在5％CO2中于37℃及濕度100％培養(yǎng)5日。培養(yǎng)5日后，以磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌，然后以乙醇/丙酮(1∶1)溶液將細(xì)胞于室溫固定1分鐘，用酸性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒(AcidPhosphatase，Leucocyte，目錄No.387-A，Sigma公司)染色，檢出破骨細(xì)胞的形成。將酒石酸存在下酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞的減少作為OCIF活性。而酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的減少率按實(shí)施例16-i)記載的方法，使已染色細(xì)胞的色素溶解進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果如表8所示。
表8OCIF引起的小鼠骨髓細(xì)胞系破骨細(xì)胞形成的抑制(PTH)

可見(jiàn)rOCF(E)與nOCIF一樣，在16ng/ml以上的濃度存在著劑量依賴性的破骨細(xì)胞形成抑制活性。
iv)對(duì)IL-11誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的抑制IL-11誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成試驗(yàn)，按田村等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol 90，p11924~11928，1993)進(jìn)行。即在96孔微量培養(yǎng)板上，加入以含20ng/ml IL-11和10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司制)稀釋的nOCIF及精制rOCIF(E)100μl。將來(lái)自新生小鼠頭蓋骨的成脂細(xì)胞株MC3T3-G2/PA6細(xì)胞(RIKEN Cell Bank-RCB 1127)5×103個(gè)以及出生后約8周的ddy小鼠脾臟細(xì)胞1×105個(gè)懸浮于含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基100μl，接種于各孔，于5％CO2中37℃、濕度100％培養(yǎng)5日。培養(yǎng)5日后以磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌，用乙醇/丙酮(1∶1)溶液將細(xì)胞于室溫固定1分鐘，用酸性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒(AcidPhosphatase，Leucocyte，目錄No.387-A，Sigma公司)染色，檢出破骨細(xì)胞的形成。對(duì)酒石酸存在下的酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將其減少作為OCIF活性。結(jié)果如表9所示。
表9IL-11誘導(dǎo)的酒石酸存在下的酸性磷酸酶活性陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

可見(jiàn)nOCIF以及rOCIF(E)在2ng/ml以上的濃度均存在著劑量依賴性的IL-11誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成抑制活性。
在利用如上種種靶細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成試驗(yàn)系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)OCIF對(duì)維生素D3、PTH以及IL-11等破骨細(xì)胞形成誘導(dǎo)因子引起的破骨細(xì)胞形成幾乎在相同濃度下均有抑制作用。因此提示OCIF對(duì)上述種種骨吸收促進(jìn)物質(zhì)誘導(dǎo)的不同類型的骨量減少癥的治療，均有可能有效地加以使用。
實(shí)施例17單體型和二聚物型OCIF樣品的制備在分別含rOCIF(E)及rOCIF(C)100μg的樣品中加1/100體積的25％TFA(三氟乙酸)后，上以含0.1TFA的30％乙腈平衡的逆相柱(PROTEIN-RP，2.0×250mm，YMC公司)，在50分鐘內(nèi)用乙腈以0～55％的線性梯度、0.2ml/分的流速進(jìn)行洗脫，分得各OCIF峰。將所得的峰部分冷凍干燥，得到單體型OCIF以及二聚物型OCIF。
實(shí)施例18重組OCIF的分子量測(cè)定按實(shí)施例3-vi)的方法用反相柱精制的單體型及二聚物型nOCIF，以及按實(shí)施例17記載的方法精制的單體型及二聚物型rOCIF，各取約含1μg的樣品減壓濃縮。這些樣品用實(shí)施例4的方法SDS處理、SDS-聚丙烯酰胺電泳以及銀染色。非還原條件下以及還原條件下電泳的結(jié)果分別示于圖6及圖7。
其結(jié)果，在非還原條件下，任一單體型樣品都檢出60kD的蛋白質(zhì)帶，而任一二聚物型樣品都檢出120kD的蛋白質(zhì)帶。而且在還原條件下任一樣品都只能檢出約60kD的蛋白質(zhì)帶。因此，說(shuō)明來(lái)自IMR-90細(xì)胞的nOCIF、來(lái)自293/EBNA細(xì)胞的重組OCIF以及來(lái)自CHO細(xì)胞的重組OCIF的各單體型和各二聚物型其分子量幾乎相同。
實(shí)施例19來(lái)自IMR-90細(xì)胞的天然型OCIF以及重組OCIF的N-結(jié)合型糖鏈的除去及分子量測(cè)定按實(shí)施例3-vi)的方法用反相柱精制的單體型和二聚物型nOCIF，以及按實(shí)施例17記載的方法精制的單體型和二聚物型rOCIF，各取約含5μg的樣品，減壓濃縮。在這些樣品中，加入已加有100mM2-巰基乙醇的50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.6)9.5μl，使其溶解，再加入250U/ml N-聚糖酶溶液(生化學(xué)工業(yè)社)0.5μl，于37℃放置1日。在這些樣品中加入含2mM MEDTA、5％SDS以及0.02％溴酚藍(lán)的20mMTris-HCl(pH8.0)10μl，于100℃加熱5分鐘。按實(shí)施例4的方法取這些樣品各1μl進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳后，進(jìn)行銀染色。結(jié)果如圖8所示。
結(jié)果表明，用N-聚糖酶處理而除去N-結(jié)合糖鏈的OCIF蛋白質(zhì)在還原條件下的分子量均約為40kD。未進(jìn)行去糖鏈處理的來(lái)自IMR-90細(xì)胞的n OCIF、來(lái)自293/EBNA細(xì)胞的rOCIF以及來(lái)自CHO細(xì)胞的rOCIF各自在還原條件下的分子量均為約60kD，說(shuō)明這些OCIF均為其分子內(nèi)含有N-結(jié)合糖鏈的糖蛋白。
實(shí)施例20OCIF變異體cDNA的克隆及堿基序列的測(cè)定如實(shí)施例10及11所示，從幾個(gè)純化的陽(yáng)性噬菌體之一，得到了具有OCIFcDNA插入pBKCMV(Stratagene公司)所得質(zhì)粒pBKOCIF的轉(zhuǎn)化株，這時(shí)從其他幾個(gè)陽(yáng)性噬菌體還得到具有插入了不同長(zhǎng)度插入片段的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株。使具有這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株增殖，并用常法精制質(zhì)粒。這些插入片段DNA的堿基序列用Taq Dye DeoxyTerminater Cycle Sequencing試劑盒(Perkin-Elmer公司)確定。所用的引物是T3、T7引物(Stratagene公司)及根據(jù)OCIFcDNA的堿基序列設(shè)計(jì)合成的引物。除原型OCIF之外，共存在4種OCIF變異體(OCIF2、3、4、5)。由已確定的序列8的OCIF2cDNA的堿基序列推斷的氨基酸序列以序列9表示。已確定的OCIF3cDNA的堿基序列以序列10表示，由該序列推斷的氨基酸序列以序列11表示。已確定的OCIF4cDNA的堿基序列以序列12表示，由該序列推斷的氨基酸序列以序列13表示。已確定的OCIF5cDNA的堿基序列以序列14表示，由該序列推斷的氨基酸序列以序列15表示。這些OCIF變異體結(jié)構(gòu)特征將根據(jù)圖9～12以及下面的敘述簡(jiǎn)單加以說(shuō)明。
OCIF2OCIFcDNA堿基序列(序列6)的第265位烏嘌呤至第285位烏嘌呤共21bp缺失，氨基酸序列中OCIF氨基酸序列(序列表序列5)的第68位谷氨酸(Glu)至第74位谷氨酰胺(Gln)共7個(gè)氨基酸缺失。
OCIF3OCIFcDNA的堿基序列(序列6)第9位的胞嘧啶被烏嘌呤替代，氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)的-19位天冬酰胺(Asn)被賴氨酸(Lys)替代。但這是信號(hào)序列中氨基酸的替換，據(jù)認(rèn)為對(duì)分泌的OCIF3沒(méi)有影響。
OCIFcDNA堿基序列(序列6)的第872位烏嘌呤至第989位烏嘌呤共缺失117bp，氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)第270位蘇氨酸(Thr)至第308位亮氨酸(Leu)39個(gè)氨基酸缺失。
OCIF4OCIFcDNA的堿基序列(序列6)第9位的胞嘧啶被烏嘌呤替代，氨基酸序列中OCIF氨基酸序列(序列表序列5)-19位的天冬酰胺(Asn)被賴氨酸(Lys)替代。另外，第22位的烏嘌呤被胸腺嘧啶替代，氨基酸序列中OCIF氨基酸序列(序列表序列5)-14位的丙氨酸(Ala)被絲氨酸(Ser)替代。但這些是信號(hào)序列中的氨基酸替換，據(jù)認(rèn)為對(duì)分泌的ICOF4設(shè)有影響。
OCIFcDNA堿基序列(序列6)第400位與第401位之間插入約4kb的內(nèi)含子2，開(kāi)放閱讀框架在這中間停止。氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)第112位的丙氨酸(Ala)之后增加由21個(gè)氨基酸組成的新氨基酸序列。
OCIF5OCIFcDNA的堿基序列(序列6)第9位胞嘧啶被烏嘌呤替代，氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)-19位天冬酰胺(Asn)被賴氨酸(Lys)替代。但這是信號(hào)序列中的氨基酸替換，據(jù)認(rèn)為，對(duì)分泌的ICIF5沒(méi)有影響。
OCIFcDNA的堿基序列(序列6)的第400位與第401位之間插入約1.8kb的內(nèi)含子2的后半部分，開(kāi)放閱讀框架在這中間停止。氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)第112位的丙氨酸(Ala)之后增加了由12個(gè)氨基酸組成的新氨基酸序列。
實(shí)施例21OCIF變異體的產(chǎn)生I)OCIF變異體cDNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建在實(shí)施例20所得的OCIF變異體cDNA中，OCIF2、3的cDNA所分別插入的質(zhì)粒pBKOCIF2、pBKOCIF3用限制酶XhoI及BamHI(寶酒造社)消化，分別切出OCIF2及3的cDNA，用瓊脂糖電泳分離后用QIAEX凝膠提取試劑盒(QIGEN公司)精制。用連接試劑盒Ver.2(寶酒造社)將上述OCIF2及3的cDNA插入預(yù)先用限制酶XhoI及BamHI(寶酒造社)消化的表達(dá)質(zhì)粒pCEP4(Invitrogen公司)，進(jìn)行大腸桿菌DH5α(Gibco BRL公司)的轉(zhuǎn)化。
另將實(shí)施例20得到的OCIF變異體cDNA中的OCIF4的cDNA所插入的質(zhì)粒pBKOCIF4用限制酶SpeI及XhoI(寶酒造社)消化。經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，用QIAEX凝膠提取試劑盒(QIGEN公司)精制。用連接試劑盒Ver.2(寶酒造社)將這一OCIF4的cDNA插入預(yù)先用限制酶NheI及XhoI(寶酒造社)消化的表達(dá)質(zhì)粒pCEP4(Invitrogen公司)，進(jìn)行大腸桿菌DH5α(Gibco BRL公司)的轉(zhuǎn)化。
另外，將實(shí)施例20得到的OCIF變體cDNA中的OCIF5的cDNA所插入的質(zhì)粒pBKOCIF5用限制酶Hind III(寶酒造社)消化，切出OCIF5cDNA的編碼區(qū)的5’區(qū)，用瓊脂糖電泳分離后，以QIAEX凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)精制。將實(shí)施例13-i)得到的OCIF表達(dá)質(zhì)粒pCEPOCIF用限制酶Hind III(寶酒造社)消化，除去OCIF cDNA的編碼區(qū)的5’區(qū)，用瓊脂糖電泳將含pCEP質(zhì)粒與OCIFcDNA的3’區(qū)的DNA片段pCEPOCIF-3’分離后，用QIAEX凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)精制。用連接試劑盒Ver.2(寶酒造社)將該OCIF5cDNA的Hind III片段插入pCEPOCIF-3’，進(jìn)行大腸桿菌DH5α(Gibco BRL公司)的轉(zhuǎn)化。
使所得到的轉(zhuǎn)化株增殖，用QIAGEN柱(QIAGEN公司)精制OCIF2、3、4、5的cDNA所插入的表達(dá)質(zhì)粒pCEPOCIF2、3、4、5。用乙醇使OCIF變異體表達(dá)質(zhì)粒沉淀，然后用無(wú)菌蒸餾水溶解，用于以下操作。
ii)OCIF變異體cDNA的瞬時(shí)表達(dá)及其活性測(cè)定用實(shí)施例21-i)得到的OCIF變異體表達(dá)質(zhì)粒pCEPOCIF2、3、4、5，按實(shí)施例13-ii)所述的方法使OCIF變異體瞬時(shí)表達(dá)，測(cè)定其活性。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些OCIF變異體具有弱的活性。
實(shí)施例22OCIF變異體的制備I)OCIF變異體cDNA亞克隆化用的質(zhì)粒載體的制備實(shí)施例11記載的質(zhì)粒載體5μg用限制酶BamHI及XhoI(寶酒造社)切斷。切斷的DNA供制備性瓊脂糖凝膠電泳使用。分離含OCIFcDNA全長(zhǎng)、約1.6kb的DNA片段，用QIAEX凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)精制，溶于20μl滅菌蒸餾水，得DNA溶液1。然后用限制酶BamHI及XhoI(寶酒造社)將pBluescriptIISK+(Stratagene公司)3μg切斷。切斷的DNA供制備性瓊脂糖凝膠電泳使用。分離約3.0kb的DNA片段，用QIAEX凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)精制，溶解于20μl滅菌蒸餾水，得DNA溶液2。將1μl的DNA溶液2與4μl的DNA溶液1混合，加DNA連接試劑盒Ver.2I液(寶酒造社)5μl，混合后，于16℃保溫30分鐘，進(jìn)行連接反應(yīng)。還有，以下的連接反應(yīng)均在16℃保溫30分鐘的條件下進(jìn)行。
用此連接反應(yīng)液，按以下的條件進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。以后的大腸桿菌轉(zhuǎn)化也按以下的條件進(jìn)行。將此連接反應(yīng)液5μl與大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(GibcoBRL公司)100μl在15ml滅菌試管(巖城玻璃公司)中混合，于冰水中放置30分鐘。于42℃保溫45秒后，加250μl培養(yǎng)基(1％胰酶解胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)于37℃攪拌培養(yǎng)。將50μl菌液涂布在含50g/ml氨芐青霉素的2ml L瓊脂培養(yǎng)基上。于37℃培養(yǎng)一夜，將繁殖成的6種集落在2ml的L氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中再培養(yǎng)一夜，檢查各株所包含的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。得到的質(zhì)粒(以后稱pSK+-OCIF)具有這樣的結(jié)構(gòu)，即在pBluescript IISK+的BamHI XhoI切斷部位插入了含有OCIFcDNA全長(zhǎng)的約1.6kb DNA片段。
ii)Cys被Ser替換的變異體的制備(1)變異的導(dǎo)入制造了序列表序列4記載的氨基酸序列中，第174、181、256、298及379位Cys殘基被Ser替換的變異體。分別命名如下174Cys被Ser替換的變異體稱為OCIF-C19S，181Cys被Ser替換的變異體稱為OCIF-C20S，256Cys被Ser替換的變異體稱為OCIF-C21S，298Cys被Ser替換的變異體稱為OCIF-C22S，379Cys被Ser替換的變異體稱為OCIF-C23S2。為制備變異體，首先將編碼各Cys殘基的堿基序列替換成編碼Ser殘基的堿基序列。變異體的導(dǎo)入通過(guò)兩步聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行。下面稱兩步PCR反應(yīng)。第一步由2個(gè)PCR反應(yīng)組成(PCR1及PCR2)。
PCR1反應(yīng)液10x Ex Taq緩沖液(寶酒造社)10μl2.5mM dNTP溶液8μl實(shí)施例11記載的質(zhì)粒載體(8ng/ml)2μl滅菌蒸餾水73.5μl20μM引物-1 5μl100μM引物-2(導(dǎo)入變異用) 1μlEx Taq(寶酒造社) 0.5μlPCR2反應(yīng)液10x Ex Taq緩沖液(寶酒造社)10μl2.5mM dNTP溶液8μl實(shí)施例11記載的質(zhì)粒載體(8ng/ml)2μl滅菌蒸餾水73.5μl20μM引物-3 5μl100μM引物-4(異入變異用) 1μlEx Taq(寶酒造社) 0.5μl導(dǎo)入各變異時(shí)，僅改變引物的種類，其他反應(yīng)組成相同。各反應(yīng)所用的引物列于表10，在序列表中序列20、23、27、30～40表示了這些序列。將PCR1反應(yīng)液與PCR2反應(yīng)液分別加入不同的微量離心管混合后，按以下條件進(jìn)行PCR。于97℃處理3分鐘，于95℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃3分鐘3步反應(yīng)共反復(fù)25次，之后于70℃保溫5分鐘。反應(yīng)液的一部分供瓊脂糖電泳，確認(rèn)有所需長(zhǎng)度的DNA片段被合成。第一步PCR反應(yīng)結(jié)束后，用Amicon microcon(Ami con公司)從反應(yīng)液中除去引物，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)最終液量為50μl，使用所得的DNA片段，再進(jìn)行第2步反應(yīng)(PCR3)。
PCR3反應(yīng)液10x Ex Taq緩沖液(寶酒造社)10μl2.5mM dNTP溶液8μlPCR1所得的DNA片段 5μl
PCR2所得的DNA片段5μl滅菌蒸蒸餾水 61.5μl20μM引物-1 5μl20μM引物-3 5μlEx Taq(寶酒造社)0.5μl表10

上述溶液加入微量離心管中混合后，與PCR1、PCR2在同樣條件下進(jìn)行PCR。反應(yīng)液的一部分提供瓊脂糖(1％或1.5％)電泳，確認(rèn)所需長(zhǎng)度的DNA片段已被合成。用乙醇使PCR所得的DNA沉淀，在真空中干燥，并溶解于40μl滅菌蒸餾水。稱含C19S變異體DNA片段的溶液為溶液A、稱含C20S變異體DNA片段的溶液為溶液B、稱含C21S變異體DNA片段的溶液為溶液C。稱含C22S變異體DNA片段的溶液為溶液D、稱含C23S變異體DNA片段的溶液為溶液E。
用限制酶NdeI及SphI(寶酒造社)切斷溶液A20μl中的DNA片段。用制備性電泳分離、精制約400bp的DNA片段，并溶解于20μl蒸餾水(DNA溶液3)。然后用限制酶NdeI及SphI(寶酒造社)切斷2μg的pSK+-OCIF，用制備性電泳分離、精制約4.2kb的DNA片段，溶解于20μl滅菌蒸餾水(DNA溶液4)。將2μl的DNA溶液3與3μl的DNA溶液4混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl，使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。從所得到的具氨芐青霉素耐藥性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)的解析選出具目標(biāo)質(zhì)粒DNA的細(xì)胞株。DNA的結(jié)構(gòu)，通過(guò)測(cè)定經(jīng)限制酶酶切所得到的片段的長(zhǎng)度并確定堿基序列，而進(jìn)行解析。所得的目標(biāo)質(zhì)粒DNA稱為pSK-OCIF-C19S。
用限制酶NdeI及SphI(寶酒造社)切斷溶液B20μl中的C20S變異體DNA片段。用制備性電泳分離、精制約400bp的DNA片段，溶解于20μl蒸餾水(DNA溶液5)。將2μl的DNA溶液5與3μl的DNA溶液4混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl，使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。從所得的耐氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)解析，選出具有目標(biāo)質(zhì)粒DNA的細(xì)胞株。通過(guò)測(cè)定用限制酶酶切所得片段的長(zhǎng)度并確定堿基序列對(duì)DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。所得的目標(biāo)質(zhì)粒DNA稱為pSK-OCIF-C20S.
用限制酶NdeI及SphI(寶酒造社)切斷溶液C20μl中的DNA片段。通過(guò)制備電泳分離、精制約400bp的DNA片段，溶解于20μl的蒸餾水(DNA溶液6)。將2μl的DNA溶液6與3μl的DNA溶液4混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl，使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。從所得到的耐氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)的解析，選出具有目標(biāo)質(zhì)粒DNA的細(xì)胞株。通過(guò)測(cè)定用限制酶酶切所得片段的長(zhǎng)度并測(cè)定堿基序列，對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。所得的目標(biāo)質(zhì)粒DNA稱為pSK-OCIF-C21S。
用限制酶NdeI及BstPI(寶酒造社)切斷溶液D20μl中的DNA片段。用制備性電泳分離、精制約600bp的DNA片段，并溶解于20μl蒸餾水(DNA溶液7)。然后用限制酶NdeI及BstPI(寶酒造社)切斷2μg的pSK+-OCIF，經(jīng)制備性電泳分離、精制約4.0kb的DNA片段，溶解于20μl蒸餾水(DNA溶液8)。將2μlDNA溶液7與3μl DNA溶液8混合，再加DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl，使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。從所得的耐氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)的解析選出含有目標(biāo)質(zhì)粒DNA的細(xì)胞株。通過(guò)測(cè)定限制酶酶切所得片段的長(zhǎng)度并確定堿基序列對(duì)DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。所得的目標(biāo)質(zhì)粒DNA稱為pSK-OCIF-C22S。
用限制酶BstpI及EcoRV(寶酒造社)切斷溶液E20μl中的DNA片段。通過(guò)制備性電泳分離、精制約120bp的DNA片段，并溶解于20μl滅菌蒸餾水(DNA溶液9)。然后用限制酶BstEII及EcoRV(寶酒造社)切斷2μg pSK+-OCIF，經(jīng)制備性電泳分離、精制約4.5kb的DNA片段，并溶解于20μl蒸餾水(DNA溶液10)。將2μlDNA溶液9與3μl DNA溶液10混合，再加DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl，使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。從所得的耐氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)的解析選出含目標(biāo)質(zhì)粒DNA的細(xì)胞株。通過(guò)測(cè)定經(jīng)限制酶酶切所得片段的長(zhǎng)度并確定堿基序列對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。所得和目標(biāo)質(zhì)粒DNA稱為pSK-OCIF-C23S。
(2)突變體表達(dá)載體的構(gòu)建用限制酶BamHI和XhoI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切所得的目標(biāo)質(zhì)粒DNA(pSK-OCIF-C19S，pSK-OCIF-C20S，pSK-OCIF-C21S，pSK-OCIF-C22S，pSK-OCIF-C23S)，分離、純化含OCIFcDNA全長(zhǎng)的約1.6kb的DNA片段(也含目標(biāo)突變)，溶解在滅菌蒸餾水20μl中。分別命名為C19SDNA溶液、C20SDNA溶液、C21SDNA溶液、C22SDNA溶液、C23SDNA溶液。然后，用限制酶BamHI和XhoI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切表達(dá)載體pCEP4(Invitrogen公司產(chǎn)品)5μg，分離、純化約10kb的DNA，溶解在滅菌蒸餾水40μl中(pCEP4DNA溶液)。將pCEP4DNA溶液1μl分別與C19SDNA溶液、C20SDNA溶液、C21SDNA溶液、C22SDNA溶液、C23SDNA溶液各6μl混合，往各混合液中加入7μl的DNA連接試劑盒ver.2I液，進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用7μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞液100ml。從所得耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有在pCEP4的BamHI-XhoI部位上插入了約1.6kb的各DNA片段的目標(biāo)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的菌株共5種。分別命名為pCEP4-OCIF-C19S、pCEP4-OCIF-C20S、pCEP4-OCIF-C21S、pCEP4-OCIF-C22S、pCEP4-OCIF-C23S。
ii)缺失結(jié)構(gòu)域的突變體的制備(1)缺失結(jié)構(gòu)域的突變的導(dǎo)入制備分別缺失了序列No.4所記載的氨基酸中2位Thr至42位Ala、43位Pro至84位Cys、85位Glu至122位Lys、123位Arg至164位Cys、177位Asp至251位Gln、253位Ile至326位His的各突變體。將分別缺失了2位Thr至42位Ala、43位Pro至84位Cys、85位Glu至122位Lys、123位Arg至164位Cys、177位Asp至251位Gln和253位Ile至326位His的各突變體命名為OCIF-DCR1、OCIF-DCR2、OCIF-DCR3、OCIF-DCR4、OCIF-DDD1和OCIF-DDD2。缺失結(jié)構(gòu)域的突變的導(dǎo)入也按實(shí)施例22-ii)中記載的二步PCR法進(jìn)行。各突變導(dǎo)入反應(yīng)中使用的引物見(jiàn)表11，其序列見(jiàn)序列表中的序列No.19、25、40-53和54。
表11

用乙醇使由PCR得到的DNA沉淀，在真空中干燥，溶解在40μl的滅菌蒸餾水中。將含DCR1突變DNA片段的溶液、含DCR2突變DNA片段的溶液、含DCR3突變DNA片段的溶液、含DCR4突變DNA片段的溶液、含DDD1突變DNA片段的溶液和含DDD2突變DNA片段的溶液分別命名為溶液F、溶液G、溶液H、溶液I、溶液J和溶液K。
將溶液F 20μl中的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切。通過(guò)制備性電泳將約500bp的DNA片段分離、純化，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中(DNA溶液11)。然后，用限制酶NdeI和XhoI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切2μg的pSK+-OCIF，通過(guò)制備性電泳將約4.0kb的DNA片段分離、純化，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中(DNA溶液12)。將2μl的DNA溶液11和3μl的DNA溶液12混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)解析，從所得的耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出OCIFcDNA中具有導(dǎo)入了目標(biāo)突變的質(zhì)粒DNA的菌株。DNA結(jié)構(gòu)是通過(guò)用限制酶酶切所得的片段的長(zhǎng)度的測(cè)定和堿基序列的測(cè)定來(lái)解析的。將所得的目標(biāo)質(zhì)粒DNA命名為pSK-OCIF-DCR1。將溶液G 20μl中的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切。通過(guò)制備性電泳將約500bp的DNA片段分離、純化，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中(DNA溶液13)。將2μl的DNA溶液13和3μl的DNA溶液12混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)解析，從所得的耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有目標(biāo)質(zhì)粒DNA的菌株。DNA結(jié)構(gòu)是通過(guò)用限制酶酶切所得的片段的長(zhǎng)度的測(cè)定和堿基序列的測(cè)定來(lái)解析的。將所得的目標(biāo)質(zhì)粒DNA命名為pSK-OCIF-DCR2。
將溶液H 20μl中的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切。通過(guò)制備性電泳將約500bp的DNA片段分離、純化，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中(DNA溶液14)。將2μl的DNA溶液14和3μl的DNA溶液12混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)解析，從所得的耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出OCIFcDNA中具有導(dǎo)入了目標(biāo)突變的質(zhì)粒DNA的菌株。DNA結(jié)構(gòu)是通過(guò)用限制酶酶切所得的片段的長(zhǎng)度的測(cè)定和堿基序列的測(cè)定來(lái)解析的。將所得目標(biāo)質(zhì)粒DNA命名為pSK-OCIF-DCR3。
將溶液I 20μl中的DNA片段用限制酶XhoI和SphI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切。通過(guò)制備性電泳將約900bp的DNA片段分離、純化，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中(DNA溶液15)。然后，用限制酶XhoI和SphI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切2μg的pSK+-OCIF，通過(guò)制備性電泳將約3.6kb的DNA片段分離、純化，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中(DNA溶液16)。將2μl的DNA溶液15和3μl的DNA溶液16混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)解析，從所得的耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有目標(biāo)質(zhì)粒DNA的菌株。DNA結(jié)構(gòu)是通過(guò)用限制酶酶切所得的片段的長(zhǎng)度的測(cè)定和堿基序列的測(cè)定來(lái)解析的。將所得目標(biāo)質(zhì)粒DNA命名為pSK-OCIF-DCR4。
將溶液J 20μl中的DNA片段用限制酶BstPI和NdeI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切。通過(guò)制備性電泳將約400bp的DNA片段分離、純化，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中(DNA溶液17)。將2μl的DNA溶液17和3μl的DNA溶液8混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)解析，從所得的耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有目標(biāo)質(zhì)粒DNA的菌株。DNA結(jié)構(gòu)是通過(guò)用限制酶酶切所得的片段的長(zhǎng)度的測(cè)定和堿基序列的測(cè)定來(lái)解析的。將所得目標(biāo)質(zhì)粒DNA命名為pSK-OCIF-DDD1。
將溶液K 20μl中的DNA片段用限制酶BstPI和NdeI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切。通過(guò)制備性電泳將約400bp的DNA片段分離、純化，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中(DNA溶液18)。將2μl的DNA溶液18和3μl的DNA溶液8混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)解析，從所得的耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有目標(biāo)質(zhì)粒DNA的菌株。DNA結(jié)構(gòu)是通過(guò)用限制酶酶切所得的片段的長(zhǎng)度的測(cè)定和堿基序列的測(cè)定來(lái)解析的。將所得目標(biāo)質(zhì)粒DNA命名為pSK-OCIF-DDD2。
(2)突變體表達(dá)載體的構(gòu)建用限制酶BamHI和XhoI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切所得的目標(biāo)質(zhì)粒DNA(pSK-OCIF-DCR1，pSK-OCIF-DCR2，pSK-OCIF-DCR3，pSK-OCIF-DCR4，pSK-OCIF-DDD1，pSK-OCIF-DDD2)，將含OCIFcDNA全長(zhǎng)的約1.4-1.5kb的DNA片段(也含目標(biāo)突變)分離、純化，溶解在滅菌蒸餾水20μl中。分別命名為DCR1DNA溶液、DCR2DNA溶液、DCR3DNA溶液、DCR4DNA溶液、DDD1DNA溶液和DDD2DNA溶液。分別將實(shí)施例22-ii)記載的pCEP4DNA溶液1μl與DCR1DNA溶液、DCR2DNA溶液、DCR3DNA溶液、DCR4DNA溶液、DDD1DNA溶液和DDD2DNA溶液各6μl混合，往各混合液中加入7μl的DNA連接緩沖液，進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用7μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從所得的耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有在pCEP4的BamHI-XhoI部位上各插入了1.4-1.5kb片段的結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的菌株共6種。將具有目標(biāo)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒分別命名為pCEP4-OCIF-DCR1、pCEP4-OCIF-DCR2、pCEP4-OCIF-DCR3、pCEP4-OCIF-DCR4、pCEP4-OCIF-DDD1和pCEP4-OCIF-DDD2。
iii)缺失C末端結(jié)構(gòu)域的突變體的制備(1)缺失C末端結(jié)構(gòu)域的突變的導(dǎo)入制備分別缺失了序列No.4所記載的氨基酸中379位Cys和380位Leu、331位Ser至380位Leu、252位Asp至380位Leu、177位Asp至380位Leu、123位Arg至380位Leu、86位Cys至380位Leu的各突變體。將缺失了379位Cys和380位Leu的突變體命名為OCIF-CL，將缺失了331位Ser至380位Leu的突變體命名為OCIF-CC，將缺失了252位Asp至380位Leu的突變體命名為OCIF-CDD2，將缺失了177位Asp至380位Leu的突變體命名為OCIF-CDD1，缺失了123位Arg至380位Leu的突變體命名為OCIF-CCR4，將缺失了86位Cys至380位Leu的突變體命名為OCIF-CCR3。
制備突變體OCIF-CL用的突變的導(dǎo)入按實(shí)施例22-ii)中記載的二步PCR法進(jìn)行。突變導(dǎo)入反應(yīng)中使用的引物見(jiàn)表12，其堿基序列見(jiàn)序列表中的序列No.23、40、55和56。用乙醇使由PCR得到的DNA沉淀，在真空中干燥，溶解在40μl的滅菌蒸餾水中(溶液L)。
將溶液L 20μl中的DNA片段用限制酶BstPI和EcoRV(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切。通過(guò)制備性電泳將約100bp的DNA片段分離、純化，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中(DNA溶液19)。然后，將2μl的DNA溶液9和3μl的實(shí)施例22-ii)中記載的DNA溶液10混合，再加入DNA連接試劑盒ver.2I液5μl，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液5μl使大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)解析，從所得的耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有目標(biāo)質(zhì)粒DNA的菌株。DNA結(jié)構(gòu)是通過(guò)用限制酶酶切所得的片段的長(zhǎng)度的測(cè)定和堿基序列的測(cè)定來(lái)解析的。將所得目標(biāo)質(zhì)粒DNA命名為pSK-OCIF-CL。使用一步PCR法進(jìn)行制備突變體OCIF-CC、突變體OCIF-CDD2、突變體OCIF-CDD1、突變體OCIF-CCR4、突變體OCIF-CCR3用的突變導(dǎo)入。反應(yīng)條件如下。
導(dǎo)入缺失C末端結(jié)構(gòu)域的突變用的PCR反應(yīng)液10X Ex Taq緩沖液(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)10μl2.5mM dNTP溶液 8μl實(shí)施例11記載的質(zhì)粒載體(8ng/ml) 2μl滅菌蒸餾水 73.5μl20μM引物OCIF Xho F 5μl100μM導(dǎo)入突變用的引物 1μlEx Taq(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品) 0.5μl表12

導(dǎo)入各突變時(shí)，僅改變引物的種類，其他反應(yīng)組成保持一致。在各反應(yīng)中導(dǎo)入突變用的引物見(jiàn)表13，其序列由序列表中的序列No.57-61所示。將PCR反應(yīng)液置入微量離心管中，混合后，在下述條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。在97℃處理3分鐘后，將95℃30秒、50℃30秒、70℃3分鐘的3步反應(yīng)重復(fù)25次，然后在70℃保溫5分鐘。取反應(yīng)液的一部分進(jìn)行瓊脂糖電泳，確認(rèn)合成了目標(biāo)長(zhǎng)度的DNA片段。用Amicon microcon(Amicon公司產(chǎn)品)除去引物，并用乙醇將DNA沉淀，在真空中干燥，然后溶解在40μl的滅菌蒸餾水中。用限制酶XhoI和BamHI酶切各含突變DNA片段的溶液20μl中的DNA片段。酶切結(jié)束后，用乙醇將DNA沉淀，在真空中干燥，溶解在20μl的滅菌蒸餾水中。將各溶液分別命名為CCDNA溶液、CDD2DNA溶液、CDD1DNA溶液、CCR4DNA溶液、CCR3DNA溶液。
表13

(2)突變體表達(dá)載體的構(gòu)建用限制酶BamHI和XhoI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切pSK-OCIF-CL，將含OCIFcDNA的約1.5kb的DNA片段(也含目標(biāo)突變)分離、純化，溶解在滅菌蒸餾水20μl中(CLDNA溶液)。分別將實(shí)施例22-ii)記載的pCEP4DNA溶液1μl與CLDNA溶液、CCDNA溶液、CDD2DNA溶液、CDD1DNA溶液、CCR4DNA溶液和CCR3DNA溶液各6μl混合，往各混合液中加入7μl的DNA連接試劑盒Ver.2I液，進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用7μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從所得耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有下述質(zhì)粒DNA的菌株共6種在所述質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)中，pCEP4的BamHI-XhoI部位上插入了具有目標(biāo)突變的OCIFcDNA片段。將具有目標(biāo)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒分別命名為pCEP4-OCIF-CL、pCEP4-OCIF-CC、pCEP4-OCIF-CDD2、pCEP4-OCIF-CDD1、pCEP4-OCIF-CCR4和pCEP4-OCIF-CCR3。
iv)缺失C末端的突變體的制備(1)缺失C末端的突變的導(dǎo)入分別制備序列No.4所記載的氨基酸中缺失了371位Gln至380位Leu但加入了Leu-Val二殘基的突變體(OCIF-CBst)、缺失了298位Cys至380位Leu但加入了Ser-Leu-Asp殘基的突變體(OCIF-CSph)、缺失了167位Asn至380位Leu的突變體(OCIF-CBsp)、缺失了62位Cys至380位Leu但加入了Leu-Val二殘基的突變體(OCIF-CPst)。用限制酶BstPI、SphI、PstI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)和BspEI(New England Biolabs公司產(chǎn)品)各酶切2μg的pSK+-OCIF，通過(guò)酚處理、乙醇沉淀來(lái)純化DNA，然后將其溶解在10μl的滅菌蒸餾水中。各取2μl溶液，用DNA平整試劑盒(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)將各DNA末端平整(最終容量5μl)。往該反應(yīng)液中加入含琥珀密碼子的XbaI接頭(5’-CTAGTCTAGACTAG-3’)1μg(1μl)和6μl的DNA連接試劑盒Ver.2I液，進(jìn)行連接反應(yīng)。用反應(yīng)后的連接溶液6μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。通過(guò)DNA結(jié)構(gòu)解析，從所得耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有目標(biāo)質(zhì)粒DNA的菌株。DNA結(jié)構(gòu)是通過(guò)用限制酶酶切所得的片段的長(zhǎng)度的測(cè)定和堿基序列的測(cè)定來(lái)解析的。將所得目標(biāo)質(zhì)粒DNA分別命名為pSK-OCIF-CBst、pSK-OCIF-CSph、pSK-OCIF-CBsp、pSK-OCIF-CPst。
(2)突變體表達(dá)載體的構(gòu)建用限制酶BamHI和XhoI(寶酒造株式會(huì)社產(chǎn)品)酶切所得到的質(zhì)粒DNA(pSK-OCIF-CBst、pSK-OCIF-CSph、pSK-OCIF-CBsp、pSK-OCIF-CPst)，將含OCIFcDNA全長(zhǎng)的約1.5kb的DNA片段(也含目標(biāo)突變)分離、純化，溶解在滅菌蒸餾水20μl中(分別命名為CBstDNA溶液、CSphDNA溶液、CBspDNA溶液、CPstDNA溶液)。分別將實(shí)施例22-ii)記載的pCEP4DNA溶液1μl與CBstDNA溶液、CSphDNA溶液、CBspDNA溶液、CPstDNA溶液各6μl混合，往各混合液中加入7μl的DNA連接試劑盒Ver.2I液，進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用7μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從所得耐氨芐青霉素轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出具有下述質(zhì)粒DNA的菌株共5種在所述質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)中，pCEP4的BamHI-XhoI部位間插入了具有目標(biāo)突變的OCIFcDNA片段。將具有目標(biāo)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒分別命名為pCEP4-OCIF-CBst、pCEP4-OCIF-CSph、pCEP4-OCIF-CBsp、pCEP4-OCIF-CPst。
v)突變體表達(dá)載體的制備使具有突變體表達(dá)載體的大腸桿菌(共21種)增殖，用QIAGEN柱(QIAGEN公司產(chǎn)品)純化各突變體表達(dá)載體。將各表達(dá)載體用乙醇沉淀后，溶解在滅菌蒸餾水中，用于下述操作。
vi)突變體cDNA的瞬時(shí)表達(dá)及其活性測(cè)定使用在實(shí)施例22-v)中純化的各種OCIF突變體表達(dá)質(zhì)粒，按實(shí)施例13的方法表達(dá)OCIF突變體。下面僅將變更之處進(jìn)行表述。使用24孔平板進(jìn)行DNA導(dǎo)入。使用含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，將2×105個(gè)293/EBNA細(xì)胞接種于各孔中。DNA導(dǎo)入時(shí)使用的突變體表達(dá)載體和lipofect AMINE試劑(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑)的量分別為1μg和4μl。用OPTI-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司產(chǎn)品)稀釋，使最終容量為0.5ml。往細(xì)胞中加入突變體表達(dá)載體和lipofect AMINE試劑的混合液，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，除去混合液，加入0.5ml的Ex-cell 301培養(yǎng)基(JSR公司產(chǎn)品)，再在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)?；厥张囵B(yǎng)基，將其作為突變體活性測(cè)定用的試樣。將所得各突變體的堿基序列和由該序列推斷出的氨基酸序列分別顯示在序列表的序列No.83-103和62-82。OCIF活性測(cè)定按實(shí)施例13的方法進(jìn)行。此外，用實(shí)施例24中記載的EIA法對(duì)OCIF的抗原量進(jìn)行了定量。在表14中，用與未改變的OCIF比較的比活性表示。
表14

(表中，++表示比活性超過(guò)未改變的OCIF活性的50％，+表示10-50％，±表示不滿10％或生物活性未能正確測(cè)定)vii)Western印跡分析將活性測(cè)定用的樣品10μl供給Western印跡分析。在10μl樣品中加入SDS-PAGE用樣品緩沖液(0.5M Tris-HCl、20％甘油、4％SDS、20μg/ml溴酚藍(lán)(pH6.8)10μl，于100℃煮沸3分鐘，于非還原條件下進(jìn)行10％SDS聚丙烯酰胺電泳。電泳結(jié)束后用半干印跡裝置(BIO-RAD公司制)，在PVDF膜(ProBlott，PerkinElmer公司制)上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。將此膜進(jìn)行印跡后，與實(shí)施例24所述的EIA用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗OCIF抗體一起于37℃保溫2小時(shí)。經(jīng)洗滌后，用ECL系統(tǒng)(Amersham公司制)檢出結(jié)合于抗OCIF抗體的蛋白質(zhì)。OCIF被檢出約120千道爾頓(kD)和60kD的區(qū)帶。對(duì)于OCIF-C23S、OCIF-CL、OCIF-CC，僅檢出60kD的區(qū)帶。而OCIF-CDD2和OCIF-CDD1分別檢出40-50kD和30-40kD的區(qū)帶為主要區(qū)帶。以上結(jié)果表明，OCIF具有序列表中序列4的氨基酸序列，其中第379位Cys殘基會(huì)形成二聚物，即便是單體也保持活性，及從第177位Asp至第380位Leu的殘基缺失也保持活性。
實(shí)施例23人OCIF基因組DNA的分離i)人基因組DNA文庫(kù)的篩選從STRATAGENE公司購(gòu)入用人胎盤(pán)染色體DNA和λFIX II載體制成的基因組文庫(kù)，以O(shè)CIF cDNA為探針進(jìn)行篩選。篩選基本上按基因組文庫(kù)所附的方案進(jìn)行，噬菌體、大腸桿菌、DNA的一般處理方法按“分子克隆化實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”進(jìn)行。
檢測(cè)購(gòu)入的基因組DNA文庫(kù)的效價(jià)后，使1×106pfu的噬菌體感染大腸桿菌XL1-Blue MRA，與每一平板9ml的頂層瓊脂糖一起鋪展在20塊平板(9×13cm)上。將平板于37℃培養(yǎng)一夜后，將Hybond-N尼龍膜(Amersham公司制)放在瓊脂平板上，使噬菌體轉(zhuǎn)移。將轉(zhuǎn)移有噬菌體的尼龍膜放在1.5M NaCl/0.5M NaOH溶液濕潤(rùn)的濾紙上一分鐘，然后分別用1M Tris-HCl(pH7.5)和1.5M NaCl/0.5MTris-HCl(pH7.5)處理1分鐘并中和，最后移到以2×SSC濕潤(rùn)的濾紙上。然后，在此尼龍膜上用STRATA接頭(STRATAGENE公司制)進(jìn)行1200微焦耳的UV照射，將噬菌體DNA固定在膜上，然后，將尼龍膜浸在快速雜交緩沖液(Amersham公司制)中進(jìn)行預(yù)雜交。1小時(shí)的預(yù)雜交之后，加入32P標(biāo)記的OCIF cDNA，于65℃雜交一夜。此cDNA探針是將具有實(shí)施例11所得的含1.6kb的OCIF cDNA的質(zhì)粒pBKOCIF用限制酶BamHI和XhoI切斷、將OCIF cDNA用瓊脂糖凝膠電泳分離后，將此OCIF cDNA用MegaprimeDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham公司制)以32P進(jìn)行標(biāo)記而制成。按標(biāo)記系統(tǒng)中所附的方案進(jìn)行標(biāo)記。在雜交中，使用每1ml雜交緩沖液約5×105cpm的探針。在雜交后，將尼龍膜在室溫下用2×SSC洗滌5分鐘，然后于65℃以0.5×SSC/0.1％SDS洗4次，每次20分鐘。第4次洗滌后，將尼龍膜干燥，用富士膠片社制的X線片、超級(jí)HR-H和增感屏幕，于-80℃進(jìn)行放射自顯影。在放射自顯影圖上檢出6個(gè)信號(hào)，從與各個(gè)信號(hào)對(duì)應(yīng)的瓊脂板上的位置切取頂層瓊脂糖，在加入了1％氯仿的0.5ml SM緩沖液中分別浸漬、放置一夜，提取噬菌體。將各噬菌體提取液用SM緩沖液稀釋1000倍，從其中取出1μl和20μl，再感染上述大腸桿菌，與頂層瓊脂糖一起按上述方法鋪展在瓊脂平板上。使噬菌體轉(zhuǎn)移至尼龍膜上之后，用上述方法進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、洗滌、干燥、放射自顯影。對(duì)當(dāng)初放射自顯影檢出的6個(gè)信號(hào)全部進(jìn)行該噬菌體的純化操作，將瓊脂板上的全部噬菌斑與cDNA探針?lè)磸?fù)進(jìn)行雜交。切下純化的噬菌斑，浸入含1％氯仿的SM緩沖液0.5ml，保存于4℃。將這樣得到的6種純化噬菌體分別取名為λOIF3、λOIF8、λOIF9、λOIF11、λOIF12和λOIF17。
ii)用限制酶消化和Southern印跡雜交進(jìn)行人OCIF基因組DNA克隆的分析按分子克隆化實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)中所寫(xiě)的方法，用平板裂解法將經(jīng)純化的6種噬菌體的DNA進(jìn)行精制。將這些DNA用限制酶消化，所得的片段用瓊脂糖電泳進(jìn)行分離。再將在瓊脂糖凝膠上分離出的片段用常規(guī)方法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，然后以O(shè)CIFcDNA為探針，進(jìn)行Southern印跡雜交。這些結(jié)果表明經(jīng)純化的6種噬菌體是各不相同的克隆。在用限制酶消化得出的DNA片段中，對(duì)與OCIFcDNA雜交的片段在質(zhì)粒載體上亞克隆以后按如下方法進(jìn)行堿基序列的分析。
iii)從基因組DNA克隆經(jīng)限制酶消化所得的DNA片段在質(zhì)粒載體上的亞克隆化和堿基序列的確定將λOIF8DNA用限制酶EcoRI及NotI消化，生成的片段用0.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離。用QIAEX II凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司制)按所附的指南從凝膠中提取5.8kb的EcoRI/NotI片段。用預(yù)先經(jīng)EcoRI和NotI酶切的pBluescriptIISK+載體(STRATAGENE公司制)和Ready-To-Go T4連接酶(Pharmacia公司制)按所附的指南將此片段進(jìn)行連接。將所得的重組質(zhì)粒引入感受態(tài)DH 5α大腸桿菌(Pharmacia公司制)后，鋪展在含有50μg/ml氨芐西林的瓊脂板上，選擇有質(zhì)粒的大腸桿菌。將如上制成的含有5.8kb EcoRI/NotI片段的重組質(zhì)粒命名為pBSG8-5.8。然后，將pBSG8-5.8用限制酶HindIII消化，將生成的0.9kb的DNA片段用瓊脂糖凝膠分離，按上述方法提取后，插入用HindIII預(yù)先酶切的pBluescriptII SK-(STRATAGENE公司制)中，按上述方法進(jìn)行克隆化。將這種具有0.9kb的HindIII片段的重組質(zhì)粒命名為pBS8H0.9。另外，將λOIF11的DNA用EcoRI消化后生成的6kb、3.6kb和2.6kb的片段分別分離出來(lái)，然后按上述同樣的方法插入pBluescriptII SK+載體中，按上述方法進(jìn)行克隆化。將這樣制成的含6kb、3.6kb和2.6kb的EcoRI片段的重組質(zhì)粒分別命名為pBSG11-6、pBSG11-3.6、pBSG11-2.6。再將用限制酶HindIII消化pBSG11-6所生成的2.2kb、1.1kb和1.05kb三種片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，分別插入pBluescriptIISK-的HindIII部位，進(jìn)行克隆化。這些具有2.2kb、1.1kb和1.05kb的HindIII片段的重組質(zhì)粒分別命名為pBS6H2.2、pBS6H1.1和pBS6H1.05。在基因組DNA的堿基序列分析時(shí)，使用ABI雙脫氧鏈終止循環(huán)測(cè)序快速反應(yīng)試劑盒(ABI DyedeoxyTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，PERKIN ELMER公司制)和373DNA測(cè)序系統(tǒng)(Applied Biosystems公司制)。按分子克隆化實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)上所寫(xiě)的方法制備pBSG8-5.8、pBS8H0.9、pBSG11-6、pBSG11-3.6、pBSG11-2.6、pBS6H2.2、pBS6H1.1、pBS6H1.05，用作堿基序列測(cè)定用的模板。人OCIF基因組DNA的堿基序列見(jiàn)序列表序列104和105。介于外顯子1和外顯子2之間的堿基序列未必全部確定，而確定有約17kb核苷酸介于序列表中序列104和序列105所示的堿基序列之間。
實(shí)施例24用EIA法進(jìn)行OCIF的定量i)家兔抗OCIF抗體的制備將rOCIF 200μg/ml與福氏完全佐劑(DIFCO公司制)等量混合制成乳劑，給雄性日本白色家兔(體重2.5-3.0kg，購(gòu)自北山LABES會(huì)社)3只皮下免疫，每次各1ml。以1周為間隔共進(jìn)行6次免疫，在末次免疫后第10天采全血。按如下方法從分離出的血清中精制抗體。即在以PBS二倍稀釋的抗血清中加入硫酸銨使終濃度為40w/v％，于4℃放置1小時(shí)后，以8000×g離心分離20分鐘，得到沉淀。將沉淀溶于少量PBS中，對(duì)PBS于4℃進(jìn)行透析后，上蛋白G-瓊脂糖柱(Pharmacia公司制)。用PBS洗滌后，用0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH3.0)洗脫免疫球蛋白G，立即用1.5M Tris鹽酸緩沖液(pH8.7)調(diào)節(jié)成中性pH。將洗脫的蛋白質(zhì)部分對(duì)PBS透析后，測(cè)定280nm處的吸光度以確定其濃度(E1％13.5)。用馬來(lái)酰亞胺活化的過(guò)氧化物酶試劑盒(Pierce公司制)制成以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗OCIF抗體。即在1ml精制抗體中加入80μg N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫代乙酸酯，于室溫下反應(yīng)30分鐘。加入5mg羥胺進(jìn)行脫乙?；螅瑢⒔?jīng)修飾的抗體用聚丙烯酰胺脫鹽柱進(jìn)行分離。將蛋白質(zhì)部分與1mg馬來(lái)酰亞胺活化的過(guò)氧化物酶混合，室溫下反應(yīng)1小時(shí)，得到酶標(biāo)記抗體。
ii)用夾層EIA法進(jìn)行OCIF定量在96孔微量滴定板(MaxiSorp Immunoplate，Nunc公司制)的各孔中加入100μl家兔抗OCIF抗體(2μg/ml，50mM碳酸緩沖液(pH9.6))，于4℃放置一夜，使抗體固相化。在每一孔中加入用PBS配制的25％BlockAce(雪印乳業(yè)株式會(huì)社制)各300μl，于37℃放置1小時(shí)進(jìn)行封閉后，加入試樣(100μl/孔)，于室溫下反應(yīng)2小時(shí)。用含0.05％吐溫20的PBS(PBST)洗滌3次后，加入10000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗OCIF抗體各100μl，室溫下保溫2小時(shí)。用PBST洗滌3次后，加入100μl酶底物溶液(TMB，ScyTek公司制)，使其在室溫下發(fā)色后停止反應(yīng)。用微板讀數(shù)儀(ImmunoReader，Nunc NJ2000，日本インタ-メツド株式會(huì)社制)測(cè)定450nm處的吸光度，從以精制的重組OCIF為標(biāo)準(zhǔn)品得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)試樣的OCIF濃度進(jìn)行定量。OCIF的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖13。
實(shí)施例25抗OCIF單克隆抗體i)產(chǎn)生人OCIF抗體的雜交瘤的制備培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞IMR-90，按實(shí)施例11所述方法從培養(yǎng)液中提純OCIF。提純的OCIF用PBS溶解成10μg/100μl的濃度，將此溶液每隔2周給BALB/c小鼠腹腔注射進(jìn)行免疫共3次。第一次和第二次免疫給予等量福氏完全佐劑混合物。在最后一次免疫的第3天摘出脾臟，分離B淋巴細(xì)胞，按通常所用的聚乙二醇方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3×63-AG8.653進(jìn)行細(xì)胞融合。然后為選擇融合細(xì)胞而在HAT培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，選擇雜交瘤細(xì)胞。為了確定所選擇的細(xì)胞是否產(chǎn)生OCIF特異性抗體，將溶解于0.1M碳酸氫鈉溶液的OCIF溶液(10μg/ml)100μl加到96孔微量滴定板(Nunc公司制)上用制成的固相ELISA進(jìn)行雜交瘤培養(yǎng)液中的OCIF特異性抗體的測(cè)定。發(fā)現(xiàn)有抗體產(chǎn)生的雜交瘤用有限稀釋法重復(fù)進(jìn)行3-5次克隆化，每次用ELISA法檢測(cè)抗體的產(chǎn)生量。從所得的抗體產(chǎn)生株中選擇抗體產(chǎn)生量高的克隆。
ii)單克隆抗體的產(chǎn)生將實(shí)施例25-i)中所得的抗體產(chǎn)生株按1×106個(gè)細(xì)胞/鼠分別移植到預(yù)先接種了Pristane(Aldrich公司制)的BALB/c系小鼠的腹腔中。移植2周后，采集蓄積的腹水，得到含本發(fā)明單克隆抗體的腹水。通過(guò)使用Affigel A蛋白瓊脂糖凝膠(BioRad公司制)的親和層析法從該腹水中得到精制抗體。即將腹水用等量結(jié)合緩沖液(BioRad公司制)稀釋，上A蛋白柱后，用同一緩沖液充分洗滌。用洗脫緩沖液(BioRad公司制)進(jìn)行IgG洗脫。所得的洗脫液對(duì)水透析后進(jìn)行冷凍干燥。所得的精制抗體用SDS-PAGE進(jìn)行純度測(cè)定，確認(rèn)為在分子量約150,000的位置上的均一區(qū)帶。
iii)對(duì)OCIF具有高親和性的單克隆抗體的選擇將實(shí)施例25-ii)中所得的抗體溶于PBS，用Lowry法進(jìn)行蛋白定量。然后將各抗體按同一蛋白濃度溶于PBS，將此溶液用連續(xù)稀釋法進(jìn)行稀釋，用實(shí)施例25-ii)所述固相ELISA選擇與OCIF反應(yīng)的單克隆抗體，直至高稀釋階段。其結(jié)果，得到A1G5、E3H8和D2F4三種抗體。
iv)抗體亞類的鑒定用免疫球蛋白類型及亞類分析試劑盒(Amersham公司制)鑒定實(shí)施例25-iii)中所選擇的本發(fā)明抗體的類型和亞類。鑒定按試劑盒中所指示的方案進(jìn)行。結(jié)果見(jiàn)表15。E3H8、A1G5和D2F4分別為IgG1、IgG2a和IgG2b。
表15

v)OCIF的ELISA測(cè)定法將實(shí)施例25-iv)中所得的A1G5、E3H8和D2F4三種單克隆抗體分別用作固相抗體和標(biāo)記抗體。通過(guò)各種組合構(gòu)建成夾層ELISA。用馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過(guò)氧化物酶試劑盒(Pierce公司制)進(jìn)行抗體的標(biāo)記。將各抗體用0.1M碳酸氫鈉溶解成濃度為10μg/ml，分別注入96孔免疫板(Nunc公司制)，每孔100μl，室溫放置一夜。然后，各板用1/2濃度的Blockace(雪印乳業(yè)株式會(huì)社制)進(jìn)行封閉，用含0.1％吐溫20的PBS(洗滌緩沖液)洗滌3次。將各濃度的OCIF用第一次反應(yīng)緩沖液(含1/2.5濃度的Blockace和0.1％吐溫20的0.2M Tris-鹽酸緩沖液，pH7.4)配制各濃度的OCIF。將所配制的各濃度的OCIF溶液100μl分別加入各孔中，37℃放置3小時(shí)，再用洗滌緩沖液洗滌3次。標(biāo)記抗體的稀釋使用第二次反應(yīng)緩沖液(含1/4濃度的Blockace和0.1％吐溫20的0.1M Tris-鹽酸緩沖液，pH7.4)。用第二次反應(yīng)緩沖液將各標(biāo)記抗體稀釋400倍，在各孔中分別加入100μl。將各板于37℃放置2小時(shí)，接著洗滌3次，然后在各孔中加入100μl底物溶液(含0.4mg/ml鹽酸鄰苯二胺、0.006％過(guò)氧化氫的0.1M檸檬酸-磷酸緩沖液，pH4.5)。于37℃暗室中放置15分鐘后，在各孔中加入6N硫酸50μl停止酶反應(yīng)，用免疫讀數(shù)儀(NJ2000，日本インタ-メツド社制)測(cè)定492nm的吸光度。將三種抗體分別作固相抗體或標(biāo)記抗體進(jìn)行組合，任何一種組合均得到良好的測(cè)定結(jié)果，并確認(rèn)三種抗體分別識(shí)別OCIF的不同表位。以A1G5為固相抗體，E3H8為標(biāo)記抗體，典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖14。
vi)人血清中OCIF的測(cè)定用實(shí)施例25-(v)圖14的ELISA系統(tǒng)測(cè)定5名健康常人血清中的OCIF。即與實(shí)施例25-(v)同樣地將A1G5在免疫板上固相化，在各孔中加入第一次反應(yīng)緩沖液50μl，接著加入各人血清50μl，于37℃放置3小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌3次后，在各孔中加入以第二次反應(yīng)緩沖液稀釋400倍的E3H8標(biāo)記抗體100μl，于37℃放置2小時(shí)。用洗滌緩沖液將板洗滌3次后，在各孔中加入上述底物溶液100μl，于37℃反應(yīng)15分鐘。在各孔中分別加入6N硫酸50μl使酶反應(yīng)停止，用免疫讀數(shù)儀測(cè)定492nm的吸光度。對(duì)含已知量的OCIF的第一次反應(yīng)緩沖液也進(jìn)行同樣的操作，作成如圖14所示的OCIF標(biāo)準(zhǔn)曲線，從血清試樣的吸光度求出血清中的OCIF量。結(jié)果見(jiàn)表16。
表16

實(shí)施例26對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療效果確定了OCIF對(duì)神經(jīng)切除引起的不動(dòng)性骨萎縮模型的治療效果。采用Fischer系雄性大鼠，在6周齡(體重約120g)時(shí)，切除左上肢神經(jīng)叢，引起左上肢不能運(yùn)動(dòng)，制成骨萎縮模型。OCIF以含0.01％吐溫80的PBS(-)配制，從次日起以5μg/kg和50μg/kg的用量按12小時(shí)間隔、一天兩次，連日靜脈注射2周。正常組施行假手術(shù)，對(duì)照組同樣地投與含0.01％吐溫80的PBS(-)。給藥結(jié)束后，摘出左上肢測(cè)定骨強(qiáng)度。結(jié)果見(jiàn)圖15。
結(jié)果，觀察到對(duì)照組比正常組骨強(qiáng)度降低，而OCIF50μg/kg給藥組可見(jiàn)情況改善。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明提供具有破骨細(xì)胞形成抑制活性的新型蛋白質(zhì)及其高效制備方法。本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有破骨細(xì)胞形成抑制活性，作為骨質(zhì)疏松癥等各種骨量減少性疾病的治療劑或免疫學(xué)診斷用的抗原等可加以利用。
關(guān)于保藏的微生物的說(shuō)明保藏機(jī)構(gòu)的名稱和地址名稱日本通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所地址日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)(郵政編碼305)保藏日1995年6月21日(原保藏日)(從1995年6月21日保藏的微工研菌寄第P-14998號(hào)移存，移存日1995年10月25日)保藏號(hào) FERM BP-5267
序列表<110>三共株式會(huì)社(SANKYO COMPANY LIMITED)<120>破骨細(xì)胞形成抑制因子、其核苷酸序列和制備方法<130>971726F1<150>JP 207508/1995<151>1995-07-21<150>JP 054977/1995<151>1995-02-20<160>108<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>X＝未知<400>1Xaa Tyr His Phe Pro Lys15<210>2<211>14<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
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<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>X＝未知<400>2Xaa Gln His Ser Xaa Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Xaa Lys1 5 10<210>3<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
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145 150 155 160Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser165 170 175Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys180 185 190Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn195 200 205Trp Leu Ser Val Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala210 215 220Glu Ser Val Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr225 230 235 240Phe Gln Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile245 250 255Val Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln260 265 270Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu275 280 285Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys290 295 300Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser305 310 315 320Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met325 330 335His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr340 345 350Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr355 360 365Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln370 375 380Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu385 390<210>107<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的序列<220>
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<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>n＝未知<400>108yttrtacatn gtraanswrt g2權(quán)利要求
1.一種DNA，它編碼具有抑制破骨細(xì)胞分化和/或成熟的生物活性的蛋白質(zhì)，其中所述DNA在下列雜交條件下與序列表中序列6的DNA雜交雜交條件在65℃在含100μg/ml的鮭精子DNA的雜交緩沖液(Amersham公司制)中培育一夜，然后于65℃下用2×SSC洗2次、每次10分鐘，再用0.1×SSC洗2次，每次10分鐘。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA，它具有如序列表序列號(hào)8、10、12或14所示的核苷酸序列。
3.一種蛋白質(zhì)，它由權(quán)利要求1或2的DNA編碼，它具有抑制破骨細(xì)胞分化和/或成熟的生物活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，它具有序列表中序列號(hào)9、11、13或15所示的氨基酸序列。
5.一種蛋白質(zhì)，它具有序列表中序列號(hào)4的氨基酸序列，其中第380位的Leu或從第380位開(kāi)始的具有2-204個(gè)氨基酸的連續(xù)序列缺失，其中所述蛋白質(zhì)具有抑制破骨細(xì)胞分化和/或成熟的生物活性。
6.一種蛋白質(zhì)，其中在權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)的C端增加最多3個(gè)氨基酸。
7.一種抗體，它與權(quán)利要求3-6任一所述的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。
全文摘要
具有抑制破骨細(xì)胞分化和/或成熟的活性的蛋白質(zhì)及其制備方法。此蛋白質(zhì)從人胎兒肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，在還原條件下分子量約為60kD，在非還原條件下分子量約為120kD。此蛋白質(zhì)可從該細(xì)胞的培養(yǎng)液中分離精制。還可用遺傳工程的方法進(jìn)行制備。本發(fā)明還包括遺傳工程制備中的cDNA、或與該蛋白質(zhì)有特異親和性的抗體，使用該抗體的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1763194SQ20051009113
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期1996年2月20日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月20日
發(fā)明者后藤雅昭, 津田英資, 望月伸一, 矢野和樹(shù), 小林文枝, 島伸行, 保田尚孝, 中川信明, 森永半法, 上田正次, 東尾侃二 申請(qǐng)人:三共株式會(huì)社