專利名稱：防治鴨病毒性肝炎的異源蛋黃抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎疾病的異源蛋黃抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎病是一種主要侵害雛鴨的急性、敗血性、接觸性傳染病。本病多發(fā)于3-7日齡的雛鴨，發(fā)病后往往為急性經(jīng)過，發(fā)病率可達(dá)100％，死亡率高達(dá)80-100％。10日齡以上的鴨也可感染發(fā)病，但感染后往往呈亞臨床或隱性感染，死亡率隨著日齡的增大而降低。本病給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，是養(yǎng)鴨業(yè)危害最大的疫病。
本病在世界各地均有暴發(fā)，且常常蔓延流行迅速。由于本病發(fā)病日齡較早，無母源抗體的雛鴨2-3日齡即可發(fā)病。如果進(jìn)行疫苗免疫，一般往往需5-7天才能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，故用疫苗免疫來控制鴨病毒性肝炎疾病在生產(chǎn)實際中存在著諸多的困難。在國外，控制本病一般使用疫苗免疫產(chǎn)蛋母鴨通過母源抗體讓后代獲得免疫用于控制本病的發(fā)生。而我國，由于規(guī)?；曫B(yǎng)程度不高，種鴨養(yǎng)殖戶和小鴨孵抱、飼養(yǎng)均為不同的人群，種鴨養(yǎng)殖戶免疫意識淡薄或根本不進(jìn)行種鴨的免疫，造成我國鴨病毒性肝炎疾病的流行。因此，制備特異性的高免血清和高免蛋黃抗體預(yù)防和控制鴨病毒性肝炎疾病，成為控制本病暴發(fā)流行的最經(jīng)濟(jì)有效的辦法。
80年代末，鴨病毒性肝炎高免抗血清和特異性蛋黃抗體制劑在我國開始廣泛推廣應(yīng)用。由于蛋黃抗體療效顯著、制作方法簡便、成本低廉的特點(diǎn)，深受廣大養(yǎng)殖戶的歡迎。
眾所周知，鴨病毒性肝炎蛋黃抗體一般采用動物試驗或鴨胚的中和試驗測定抗體效價。而不能用瓊擴(kuò)或其它方法進(jìn)行簡便的測定。因動物或鴨胚的來源、品種、檢測日齡等差異，因此在生產(chǎn)實際中的檢驗結(jié)果以及重復(fù)性較差，生產(chǎn)的產(chǎn)品因檢測方法的差異導(dǎo)致效果時好時壞。同時采用動物試驗或鴨胚的中和試驗測定抗體效價，檢測時間長，造成生產(chǎn)的產(chǎn)品不能及時進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用。
結(jié)合這種實際情況，我們使用免疫產(chǎn)蛋雞的方法生產(chǎn)雞抗鴨病毒性肝炎高免蛋黃抗體，用于預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎。用本方法生產(chǎn)的蛋黃抗體，可以使用瓊擴(kuò)方法檢驗抗體的效價，且檢驗結(jié)果重復(fù)性較好，及時準(zhǔn)確，有效的解決了生產(chǎn)實際中存在的上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎疾病的異源蛋黃抗體的制備方法，使用異源動物雞用于鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的生產(chǎn)，即通過使用鴨病毒性肝炎滅活油乳劑疫苗免疫健康產(chǎn)蛋雞，從雞蛋黃中提取免疫球蛋白。
本發(fā)明中使用了瓊脂擴(kuò)散的檢測方法進(jìn)行鴨病毒性肝炎蛋黃抗體效價的檢測，檢測結(jié)果迅速準(zhǔn)確，重復(fù)性好。
用本方法生產(chǎn)的抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體，解決了本動物垂直傳播疾病的危險和血清的高過敏原性，同時降低了生產(chǎn)成本和使用成本。
用鴨病毒性肝炎油乳劑疫苗免疫產(chǎn)蛋母雞生產(chǎn)的蛋黃抗體，用于鴨病毒性肝炎的預(yù)防和治療，效果確實。
在提取蛋黃抗體的過程中，蛋黃用3倍體積的生理鹽水稀釋后，充分?jǐn)嚢杈鶆?，用三氯甲烷進(jìn)行提取精制，制備蛋黃抗體進(jìn)行注射使用。
在分離的上清液中加入終濃度為0.05％的甲醛溶液，充分?jǐn)嚢杌靹颍?7℃保溫密封8-12小時，以殺滅蛋黃抗體中可能污染或垂直傳播的微生物，從而確保產(chǎn)品的安全性。
提取蛋黃抗體的性質(zhì)穩(wěn)定，可在室溫下保存18個月以上，對于用戶在運(yùn)輸、使用上具有獨(dú)特的優(yōu)勢。
具體實施例方式
1、種毒準(zhǔn)備及增殖1.1將冷凍保存的鴨病毒性肝炎病料(肝毒)用滅菌生理鹽水做成1∶5搗碎，凍融2次后，離心收集上清液，經(jīng)56℃處理1小時，加入青、鏈霉素處理，經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾除菌，接種9-11日齡非免疫鴨胚尿囊腔，在37℃的恒溫箱中孵育，棄去48小時內(nèi)的死亡鴨胚，收集48-120小時內(nèi)死亡的胚，采集尿囊液及羊水。死亡胚應(yīng)出現(xiàn)典型的出血等病理變化。
1.2配制油乳劑抗原將收獲的尿囊毒液中加入0.1％甲醛溶液，37℃密閉滅活48小時。期間每4-6小時振搖一次。滅活完成后，按滅活毒液96份，吐溫-80 4份配制，即為制苗用抗原。按油相3份、水相1份的比例進(jìn)行配制。取油相、水相攪拌均勻，加入高壓均質(zhì)機(jī)中，調(diào)節(jié)壓力為35mpa，乳化制備成鴨病毒性肝炎滅活油乳劑疫苗，分裝，加入1％硫柳汞溶液使之終濃度為萬分之一，搖勻備用。
按照油乳佐劑疫苗的相關(guān)檢驗項目進(jìn)行檢驗，檢驗合格后，即為免疫用油乳劑抗原。置4℃避光保存，6個月內(nèi)有效。
2、產(chǎn)蛋雞免疫基礎(chǔ)免疫以制備的鴨病毒性肝炎滅活油乳劑抗原頸部皮下注射0.5ml/只。
強(qiáng)化免疫2周后，以制備的鴨病毒性肝炎滅活油乳劑抗原頸部皮下注射1.0ml/只，進(jìn)行強(qiáng)化免疫。間隔2周后用滅活油乳劑抗原再次強(qiáng)化免疫一次，頸部皮下注射2.0ml/只。
以后間隔8周進(jìn)行一次強(qiáng)化免疫，每次頸部皮下注射2.0ml/只。
3、高免蛋收集第二次強(qiáng)化免疫后第7天開始，每隔三天抽樣用瓊脂擴(kuò)散方法測定高免雞蛋蛋黃中抗鴨病毒性肝炎特異抗體效價。蛋黃與生理鹽水按1∶3(V/V)稀釋后，加蛋黃等體積三氯甲烷萃提，若上清液抗體效價達(dá)到1∶64以上即可集蛋，用于制備鴨病毒性肝炎蛋黃抗體。高免雞蛋在15℃-25℃可貯存3天，4-10℃貯存期不得超過10天。
4、提取雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體4.1蛋殼消毒 將高免雞蛋浸入加熱至42℃的0.1％新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘。蛋殼污染嚴(yán)重的，應(yīng)事先選出，單獨(dú)消毒并用清水沖洗干凈后，再浸泡消毒一次。然后將新潔爾滅消毒后的高免雞蛋浸入水溫為90-95℃的水浴中消毒5秒鐘，取出后晾干或吹干備用。
4.2蛋黃分離 采取手工或機(jī)械打蛋。打蛋時應(yīng)充分除去蛋清(白)、胚盤和系帶，收集蛋黃。
4.3萃提 于蛋黃中加入3倍體積的生理鹽水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后在蛋黃液中加入與蛋黃等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合均勻，室溫作用60分鐘，以3500-4000rpm離心30分鐘，收集上層清液備用。
4.4加入滅活劑 在分離的上清液中加入終濃度為0.05％的甲醛溶液，充分?jǐn)嚢杌靹颍?7℃保溫密封8-12小時。
4.5除菌過濾 用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，定量分裝，即為雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體。
5、產(chǎn)品檢驗
5.1無菌檢驗 應(yīng)無菌生長。
5.2物理性狀 本品為微黃色或淡黃色的透明液體。久置后瓶底有少許細(xì)小的白色沉淀。pH值5.5-6.5。
5.3安全檢驗 18-22g健康小鼠5只，各皮下注射本品0.5ml；3日齡易感雛鴨10只，各皮下注射本品3.0ml。觀察10天，小鼠和雛鴨均應(yīng)全部健活。
5.4抗體效價測定 瓊擴(kuò)抗體效價應(yīng)達(dá)到1∶64及以上。
5.5效力檢驗 用鴨效檢3-5日齡易感雛鴨30只，隨機(jī)分為三組。第一組為健康對照組，不注射任何藥品，隔離飼養(yǎng)。第二和三組每只雛鴨皮下接種鴨病毒性肝炎強(qiáng)毒SCG99株腸道病料毒lOOLD50。于攻毒后24小時分別給第二組皮下注射本品2.0ml，第三組皮下注射生理鹽水2.0ml。觀察每組雛鴨發(fā)病、死亡情況至第10天。
結(jié)果判定第一組為健康對照組，試驗期間全部雛鴨應(yīng)健康無病。第三組為攻毒對照組，應(yīng)于攻毒后3-7天發(fā)病，96小時后開始死亡，10天內(nèi)應(yīng)死亡8只以上。第二組為早期感染治療組，注射本品后48小時，即攻毒后3天后，試驗雛鴨開始發(fā)病，但發(fā)病率不得超過30％，至觀察結(jié)束時試驗雛鴨應(yīng)存活8只及以上。該制品判為合格。
使用油乳劑滅活疫苗免疫產(chǎn)蛋母鴨，從蛋黃中提取免疫球蛋白，該免疫球蛋白對鴨病毒性肝炎疾病具有特異性的預(yù)防和治療作用，且用藥后動物體內(nèi)不存在藥物殘留，同時藥效期長達(dá)5-7天，是一種高效、特效、無殘留的新型獸藥。雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體對鴨病毒性肝炎疾病的預(yù)防和治療實驗情況實驗一400只1日齡小鴨，隨機(jī)分成兩組，每組200只，按照常規(guī)飼養(yǎng)方法進(jìn)行飼養(yǎng)；第一組實驗鴨每只腿部肌肉注射1.0ml雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體，第二組實驗鴨每只腿部肌肉注射1.0ml生理鹽水，分別于注射后24小時、72小時，120小時及168小時從各組中隨機(jī)抽取50只實驗鴨用于攻毒試驗，攻毒結(jié)果觀察并記錄直至攻毒后10天。結(jié)果表明第一組實驗鴨在注射雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體后24小時、72小時、120小時攻毒后100％存活。在168小時攻毒后存活率為84％，而第二組實驗鴨在相同時間攻毒后，其存活率分別為34％、42％、48％、62％。結(jié)果詳見下表一和表二表一注射雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體后不同時間的攻毒保護(hù)結(jié)果

表二對照組在不同日齡的攻毒結(jié)果

實驗二200只2日齡小鴨，隨機(jī)分成四組，每組50只，按照常規(guī)飼養(yǎng)方法進(jìn)行飼養(yǎng)；在實驗室條件下人工感染鴨病毒性肝炎。第1、2、3組試驗鴨分別在感染后24小時、48小時、72小時每只鴨腿部肌肉注射雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體1.0ml進(jìn)行治療。第4組實驗鴨作為空白對照，觀察各組的發(fā)病及死亡情況并記錄直至攻毒后10天。保護(hù)試驗結(jié)果表明實驗鴨在攻毒后24小時、48小時、72小時的保護(hù)率分別為100％(50/50)、100％(50/50)、86％(43/50)。而第4組實驗鴨存活率為38％(19/50)。結(jié)果詳見下表三表三攻毒后不同時間雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的治療效果


從上述結(jié)果可以看出，雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體對雛鴨鴨病毒性肝炎疾病具有良好的預(yù)防和治療效果。
雖然本文參照優(yōu)選的實施例說明了本發(fā)明的各方面和特征，但上述實施例只是說明性的，并不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求書來限制。在不背離權(quán)利要求書的實質(zhì)和范圍的條件下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于對本發(fā)明進(jìn)行適當(dāng)?shù)母膭踊蚋淖?，因此這些改動或改變也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體制備方法，包括下列步驟(a)將凍干保存的鴨病毒性肝炎病毒以1∶1000稀釋后，稀釋液56℃處理1小時，經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾除菌后，接種13-15日齡非免疫鴨胚尿囊腔，37℃孵育，棄去48小時內(nèi)的死亡鴨胚，收集48-96小時內(nèi)的死亡鴨胚，采集尿囊液及羊水；(b)將收獲的尿囊毒液中加入0.1％甲醛溶液，37℃密閉滅活48小時；滅活完成后，按滅活毒液96份，吐溫-80 4份配制，即為制苗用抗原；按油相3份、水相1份的比例取油相、水相攪拌均勻，加入高壓均質(zhì)機(jī)中，調(diào)節(jié)壓力為35mpa，乳化制備成鴨病毒性肝炎滅活油乳劑疫苗，并加入1％硫柳汞溶液使之終濃度為萬分之一；(c)以制備的鴨病毒性肝炎滅活油乳劑抗原頸部皮下注射0.5ml/只；2周后，以制備的鴨病毒性肝炎滅活油乳劑抗原頸部皮下注射1.0ml/只，進(jìn)行強(qiáng)化免疫；間隔2周后用滅活油乳劑抗原再次強(qiáng)化免疫一次，頸部皮下注射2.0ml/只；以后間隔8周進(jìn)行一次強(qiáng)化免疫，每次頸部皮下注射2.0ml/只；(d)第二次強(qiáng)化免疫后第7天開始，每隔三天抽樣用瓊脂擴(kuò)散方法測定高免雞蛋蛋黃中抗鴨病毒性肝炎特異抗體效價；蛋黃與生理鹽水按1∶3(V/V)稀釋后，加等體積三氯甲烷萃提，若上清液瓊擴(kuò)抗體效價達(dá)1∶64以上即可集蛋，用于制備鴨病毒性肝炎蛋黃抗體；(e)將蛋殼消毒，打蛋并充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集蛋黃；于蛋黃中加入3倍體積的生理鹽水，充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓笤诘包S液中加入與蛋黃等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合均勻，室溫作用60分鐘，以3500-4000rpm離心30分鐘，收集上層清液備用；(f)在分離的上清液中加入終濃度為0.05％的甲醛溶液，充分?jǐn)嚢杌靹颍?7℃保溫密封8-12小時；用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得瓊擴(kuò)抗體效價達(dá)到1∶32及以上的雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的制備方法，其特征在于使用異源動物雞用于鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的生產(chǎn)，即通過使用鴨病毒性肝炎滅活油乳劑疫苗免疫健康產(chǎn)蛋雞，從雞蛋黃中提取免疫球蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的制備方法，其特征在于使用了瓊脂擴(kuò)散的檢測方法進(jìn)行鴨病毒性肝炎蛋黃抗體效價的檢測，檢測結(jié)果迅速準(zhǔn)確，重復(fù)性好。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的制備方法，其特征在于用本方法生產(chǎn)的抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體，解決了本動物垂直傳播疾病的危險和血清的高過敏原性，同時降低了生產(chǎn)成本和使用成本。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的制備方法，其特征在于用鴨病毒性肝炎油乳劑疫苗免疫產(chǎn)蛋母雞生產(chǎn)的蛋黃抗體，用于鴨病毒性肝炎的預(yù)防和治療，效果確實。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的制備方法，其特征在于在提取蛋黃抗體的過程中，蛋黃用3倍體積的生理鹽水稀釋后，充分?jǐn)嚢杈鶆?，用三氯甲烷進(jìn)行提取精制，制備蛋黃抗體進(jìn)行注射使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的制備方法，其特征在于在分離的上清液中加入終濃度為0.05％的甲醛溶液，充分?jǐn)嚢杌靹颍?7℃保溫密封8-12小時，以殺滅蛋黃抗體中可能污染或垂直傳播的微生物，從而確保產(chǎn)品的安全性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法，其特征在于提取蛋黃抗體的性質(zhì)穩(wěn)定，可在室溫下保存18個月以上，對于用戶在運(yùn)輸、使用上具有獨(dú)特的優(yōu)勢。
全文摘要
本發(fā)明為一種用于雛鴨病毒性肝炎的預(yù)防和治療的蛋黃抗體的制備方法。本發(fā)明改用異源動物雞進(jìn)行抗鴨病毒性肝炎蛋黃抗體的制備。即用雛鴨鴨病毒性肝炎病毒滅活油乳劑疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，從雞蛋蛋黃中提取特異性的免疫球蛋白，用于預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎疾病。經(jīng)臨床試驗和使用結(jié)果表明用本方法制備的鴨病毒性肝炎蛋黃抗體用于預(yù)防和治療，預(yù)防率和治愈率高、藥效期長，藥物效果顯著，且可避免同源抗體垂直傳播疾病的危險。
文檔編號C07K16/10GK1927884SQ20051009836
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
發(fā)明者何洪章 申請人:重慶永健生物技術(shù)有限責(zé)任公司