專利名稱：從小麥線粒體中提取核糖核酸rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)，具體地說是從植物線粒體中提取核糖核酸(RNA)的方法，特別是從小麥中提取線粒體核糖核酸的方法。
背景技術(shù)：
小麥核糖核酸(RNA)是遺傳物質(zhì)的重要載體。線粒體是植物機(jī)體內(nèi)普遍存在的特別細(xì)胞器，它與細(xì)胞核一樣包含遺傳信息。目前沒有發(fā)現(xiàn)從小麥線立體中提取核糖核酸的方法?，F(xiàn)有技術(shù)從其他植物提取線粒體中核糖核酸的方法一般流程很長，使得線粒體中核糖核酸在提取過程中降解，很難保證所獲得的高質(zhì)量的核糖核酸用于分子生物學(xué)研究。
與本發(fā)明較相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)是《植物分子生物學(xué)》2001年第19期刊登的“從馬鈴薯組織中分離線粒體核糖核酸”該文獻(xiàn)提到了從馬鈴薯組織中分離線粒體核糖核酸(RNA)的提取方法，將1-15克新鮮馬鈴薯組織加液氮研磨，加入4℃預(yù)冷的25毫升提取液A(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，1.3M NaCl，25mM EDTA(pH8.0)，0.2％BSA)，過25目的紗布，4℃條件下500g離心10分鐘去除大片段，再2600g離心15分鐘，10分鐘去除大分子物質(zhì)。用14500g離心15分鐘沉淀線粒體，并用提取液A洗滌重懸，離心14500g離心15分鐘沉淀線粒體。獲得的線粒體采用異硫氰胍方法加入5毫升提取液B(4M異硫氰胍，25mM檸檬酸鈉(pH 7.0)，0.5％桂酸鈉)65℃ 2分鐘，而后加入十分之一體積的2M乙酸鈉溶液，混懸加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)離心3000g×5分鐘，取出水相并加入等體積的異丙醇，-20℃放置2小時(shí)，18,000g離心20分鐘沉淀得到線粒體核糖核酸，70％乙醇洗滌沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 上述方法過程概括如下提取液A去除雜質(zhì)----分級分離得到完整線粒體----通過溶液B來使線粒體裂解----水飽和酚∶氯仿∶異戊醇提取抽提----異丙醇沉淀----乙醇洗滌線粒體核糖核酸。
由此可見，該技術(shù)所提及的方法較為繁瑣，更主要的是提取的線粒體核糖核酸效率和質(zhì)量都很一般，受葉綠體和核糖核酸的污染機(jī)率很高，有時(shí)候影響后面的實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行，因此有必要提供一個(gè)簡單，有效的從線粒體中提取線粒體核糖核酸的方法，應(yīng)用于小麥線立體核糖核酸RNA的提取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從小麥線粒體中提取核糖核酸RNA的方法，應(yīng)用這種方法，可有效地從小麥組織中提取線粒體核糖核酸，以利于隨后的分析檢測，該方法能夠有效地克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種從小麥線立體中提取核糖核酸RNA的方法，具有如下步驟步驟1)、首先在低溫預(yù)留的提取液中加入一定量的蛋白酶K，并分離出含完整線粒體的水相；步驟2)、然后增加一步用蛋白酶K降解線粒體內(nèi)的復(fù)合蛋白，使核糖核酸盡可能多的從這些復(fù)合物中釋放出來；步驟3)、最后用異丙醇沉淀，乙醇洗滌線粒體核糖核酸。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，在上述步驟1)和2)所述的抽提過程中加入蛋白酶K的處理過程，并分別分離出完整線粒體和線粒體核糖核酸。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，整個(gè)過程在4℃低溫下進(jìn)行操作。
這種從植物組織中提取核糖核酸，不受其它物質(zhì)污染的方法，其關(guān)鍵在于分離過程嚴(yán)格低溫和加上適當(dāng)分解蛋白的試劑，提取方法采用如下具體步驟A、首先新鮮組織中加入液氮研磨粉碎，加入4℃預(yù)冷的25毫升改良的提取液A(加入3‰巰基乙醇和1％體積的10毫克/毫升蛋白酶K)。過25目的紗布。
B、4℃條件下500g離心10分鐘去除大片段，再2600g離心15分鐘，10分鐘去除大分子物質(zhì)。用14500g離心15分鐘沉淀線粒體，并用改良提取液A洗滌重懸，離心14500g離心15分鐘沉淀線粒體。
C、獲得的線粒體采用異硫氰胍方法加入5毫升提取液B 65℃ 2分鐘，加入1％體積的10毫克/毫升蛋白酶K 37℃ 2分鐘。
D、冰浴，而后加入十分之一體積的2M乙酸鈉溶液，混懸加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)離心3000g×5分鐘，取出水相并加入等體積的氯仿抽提2次，加入等體積的異丙醇，-20℃放置2小時(shí)，18,000g離心20分鐘沉淀得到線粒體核糖核酸，70％乙醇洗滌沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明方法，首先采用不含葉綠體污染的組織，第二，在分離到線粒體前，用有蛋白酶K的提取液，使得部分大分子蛋白被分解為較小分子，易于與線粒體分離，第三在分離到線粒體后，用脫氧核糖核酸酶來分解可能來自核脫氧核糖核酸的污染，第四，獲得線粒體后，裂解線粒體中加入蛋白酶K，使得核糖核酸能完全從蛋白復(fù)合體中釋放出來，提高提取效率和減少蛋白質(zhì)污染。
在獲得完整線粒體前，我們加入蛋白酶K使得那些不完整的線粒體被蛋白酶K降解，便于去除，脫氧核糖核酸酶分解核脫氧核糖核酸；在獲得線粒體后，加入蛋白酶K使得雜蛋白被分解，便于被抽提。
本發(fā)明適宜于從小麥細(xì)胞器中提取到其中的核糖核酸。應(yīng)用該方法提取到的線粒體核糖核酸，適宜于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和文庫構(gòu)建。
按本發(fā)明所述的從線粒體中提取線粒體核糖核酸的方法，采用以下簡單過程改良提取液A去除雜質(zhì)和分解雜蛋白----分級分離得到完整線粒體----通過改良的溶液B來使線粒體裂解----水飽和酚∶氯仿∶異戊醇提取抽提----蛋白酶K的裂解----異丙醇沉淀----乙醇洗滌線粒體核糖核酸。
使用本提取方法，能夠高效率，高質(zhì)量地從小麥線粒體中獲得高質(zhì)量的線粒體核糖核酸。
下面，結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但它并非用于對本發(fā)明的限定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取10克新鮮小麥花藥，加入液氮研磨粉碎，加入4℃預(yù)冷的25毫升改良的提取液A(加入3‰巰基乙醇和1％體積的10毫克/毫升蛋白酶K)。過25目的紗布。濾過液4℃條件下500g離心10分鐘取上清，再2600g離心15分鐘，10分鐘取上清(去除大分子物質(zhì))。用14,500g離心15分鐘取沉淀獲得線粒體，并用改良提取液A洗滌重懸，離心14,500g離心15分鐘沉淀線粒體。獲得的線粒體加入5毫升提取液B 65℃ 2分鐘，同時(shí)加入1％體積的10毫克/毫升蛋白酶K 37℃ 2分鐘，而后置冰浴上1分鐘，而后加入十分之一體積的2M乙酸鈉溶液，混懸加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)離心3000g×5分鐘，取出水相并加入等體積的氯仿抽提2次，加入等體積的異丙醇，-20℃放置2小時(shí)，18000g離心20分鐘沉淀得到線粒體核糖核酸，70％乙醇洗滌沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2取5克新鮮小麥黃花苗，加入液氮研磨粉碎，加入4℃預(yù)冷的25毫升改良的提取液A(加入3‰巰基乙醇和1％體積的10毫克/毫升蛋白酶K)。過25目的紗布。屢過液4℃條件下500g離心10分鐘取上清，再2600g離心15分鐘，10分鐘取上清(去除大分子物質(zhì))。用14500g離心15分鐘取沉淀獲得線粒體，并用改良提取液A洗滌重懸，離心14500g離心15分鐘沉淀線粒體。獲得的線粒體加入5毫升提取液B 65℃ 2分鐘，同時(shí)加入1％體積的10毫克/毫升蛋白酶K 37℃ 2分鐘，而后置冰浴上1分鐘，而后加入十分之一體積的2M乙酸鈉溶液，混懸加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)離心3000g×5分鐘，取出水相并加入等體積的氯仿抽提2次，加入等體積的異丙醇，-20℃放置2小時(shí)，18000g離心20分鐘沉淀得到線粒體核糖核酸，70％乙醇洗滌沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3取5克新鮮小麥須根，加入液氮研磨粉碎，加入4℃預(yù)冷的25毫升改良的提取液A(加入3‰巰基乙醇和1％體積的10毫克/毫升蛋白酶K)。過25目的紗布。濾過液4℃條件下500g離心10分鐘取上清，再2600g離心15分鐘，10分鐘取上清(去除大分子物質(zhì))。用14500g離心15分鐘取沉淀獲得線粒體，并用改良提取液A洗滌重懸，離心14500g離心15分鐘沉淀線粒體。獲得的線粒體加入5毫升提取液B 65℃ 2分鐘，同時(shí)加入1％體積的10毫克/毫升蛋白酶K 37℃ 2分鐘，而后置冰浴上1分鐘，而后加入十分之一體積的2M乙酸鈉溶液，混懸加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)離心3000g×5分鐘，取出水相并加入等體積的氯仿抽提2次，加入等體積的異丙醇，-20℃放置2小時(shí)，18000g離心20分鐘沉淀得到線粒體核糖核酸，70％乙醇洗滌沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)為高效率，高質(zhì)量地從小麥組織中提取線粒體的核糖核酸。
權(quán)利要求
1.一種從小麥線立體中提取核糖核酸RNA的方法，其特征在于，所述提取方法具有如下步驟1)、首先在低溫預(yù)留提取液中加入一定量的蛋白酶K，并分離出含完整線粒體的水相；2)、然后增加一步用蛋白酶K降解線粒體內(nèi)的復(fù)合蛋白，使核糖核酸盡可能多的從這些復(fù)合物中釋放出來；3)、最后用異丙醇沉淀，乙醇洗滌線粒體核糖核酸。
2.如權(quán)利要求1所述的從植物中提取線粒體核糖核酸的方法，其特征在于步驟1)和2)所述的抽提過程中加入蛋白酶K的處理過程，并分別分離出完整線粒體和線粒體核糖核酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的從植物中提取線粒體核糖核酸的方法，其特征在于整個(gè)過程在4℃低溫下進(jìn)行操作。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從小麥線粒體中提取核糖核酸RNA的方法。通過改良提取液，分別可以去除和降解大分子蛋白，同時(shí)使得核糖核酸(RNA)更容易從蛋白復(fù)合物中釋放出來，并同時(shí)得到更高效率的提取；其使用方法是通過對小麥線粒體核糖核酸(RNA)的提取，得到高純度小麥線粒體核糖核酸(RNA)，可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈脫氧核糖核酸(dscDNA)，進(jìn)而可以進(jìn)行其它的分子生物學(xué)操作，如PCR反應(yīng)和建文庫。
文檔編號C07H21/02GK1733790SQ20051010244
公開日2006年2月15日 申請日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
發(fā)明者楊典洱, 林曉怡 申請人:楊典洱