專利名稱：含人抗體λ輕鏈基因的人類人工染色體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過修飾染色體或其片段可高效遺傳傳遞至下一代的人類人工染色體、將所述人類人工染色體高效遺傳傳遞至下一代的非人動物及其后代、由所述非人動物或其后代生產(chǎn)抗體的方法和生產(chǎn)人抗體的小鼠。
背景技術(shù)：
業(yè)已開發(fā)出一種由含染色體片段的微細(xì)胞和多能細(xì)胞融合所獲得的雜交細(xì)胞生產(chǎn)嵌合體動物的技術(shù)(WO 97/07671)。該技術(shù)使得能夠生產(chǎn)具有非常長外源基因的非人動物，而在此之前這是不可能的。
對引入到非人動物中的染色體片段進(jìn)行修飾是有用的，因為其實(shí)現(xiàn)了(1)去除不必要的基因，(2)加入目的基因，(3)穩(wěn)定染色體片段等。WO 98/37757概述了一種用于修飾引入到非人動物中的染色體片段的方法，而且通過將端粒序列靶向保持在小雞源DT40細(xì)胞中的人染色體而高效獲得缺失型目的染色體。該公告還描述了一種穩(wěn)定保持在小鼠ES細(xì)胞和小鼠個體中并具有高遺傳傳遞效率的人染色體片段。WO 00/10383描述了一種生產(chǎn)更穩(wěn)定人類人工染色體(下文可將其縮寫為“HAC”)的方法，在該方法中人類染色體中的目的區(qū)域易位至穩(wěn)定的染色體片段(染色體載體)。
近來，Kuroiwa等人(Nature Biotech.181086，2000)在世界上首次成功生產(chǎn)出保有百萬堿基(Mb)大小的特定人類染色體區(qū)域作為插入片段的人類人工染色體(HAC)。該HAC(λHAC)為一種人工染色體，其獲得方法是使用穩(wěn)定且可遺傳傳遞的源自人染色體14的SC20片段作為染色體載體，并將人染色體22上的含人抗體λ輕鏈基因的10Mb染色體區(qū)作為插入片段易位并克隆至該載體。他們證實(shí)該λHAC的穩(wěn)定性基本等同于用作載體的SC20片段，而各種不穩(wěn)定染色體來源的區(qū)域也可通過易位和克隆至SC20獲得穩(wěn)定。而且，他們將該λHAC引入到小鼠中，由此成功產(chǎn)生一種穩(wěn)定攜帶λHAC的嵌合體小鼠。
對于非人動物來說，將引入的人類染色體遺傳傳遞至下一代不僅對通過雜交大量生產(chǎn)同種轉(zhuǎn)染色體動物(即其中異源染色體片段已通過種系遺傳傳遞的非人動物)很重要，而且對通過引入人類染色體的種系分析結(jié)構(gòu)和功能很重要。此前已將若干類人類染色體引入到小鼠中，其遺傳傳遞能力據(jù)認(rèn)為取決于引入的人類染色體的結(jié)構(gòu)。為進(jìn)行遺傳傳遞，開始時必須獲得其中ES細(xì)胞高效生成生殖細(xì)胞且嵌合程度高的嵌合體小鼠。此嵌合程度據(jù)認(rèn)為與所導(dǎo)入人類染色體的結(jié)構(gòu)相關(guān)，即在導(dǎo)入的染色體上存在哪種類型的人基因。例如，當(dāng)引入人染色體2或14的片段時，獲得的嵌合體小鼠嵌合程度接近100％且遺傳傳遞效率高(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97722-727，2000)。相反，當(dāng)引入人染色體22的片段時，大多數(shù)情況下所獲得的嵌合體小鼠嵌合程度低(即50％或以下)。這可能是因為在人染色體22上存在對小鼠發(fā)育有不利影響的有害人基因。實(shí)際上，據(jù)報道，引起基因表達(dá)水平依賴性遺傳病(例如貓眼綜合癥、DiGeorge綜合癥和der22綜合癥)的區(qū)域存在于人染色體22上的22q11區(qū)中，在該區(qū)中存在人抗體Igλ基因(例如A.Puech等，PNAS 9710090，2000)。如上所述，去除這些引起遺傳病的區(qū)域，僅將人染色體22上由HCF2基因座至LIF基因座的10Mb區(qū)域易位并克隆至SC20染色體載體來構(gòu)建λHAC，然后將λHAC引入小鼠中。結(jié)果，據(jù)報道，與引入全長人染色體22的情況相比，由保持λHAC的ES細(xì)胞產(chǎn)生的嵌合體小鼠的嵌合程度增加。
在上述形勢下，本發(fā)明人嘗試進(jìn)一步改進(jìn)所述人類人工染色體，以獲得比常規(guī)λHAC更有效的遺傳傳遞，并研究遺傳傳遞效率。
更具體地說，本發(fā)明的一個目的在于提供一種通過修飾人染色體22或其片段而高效遺傳傳遞至下一代的人類人工染色體，并提供攜帶所述人類人工染色體的非人動物及其后代。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用所述非人動物或其后代生產(chǎn)人抗體的方法。
本發(fā)明人為達(dá)到上述目的已進(jìn)行了專門研究。結(jié)果，他們修飾人染色體22，選擇兩種含抗體λ輕鏈基因(Igλ)區(qū)的結(jié)構(gòu)明了的區(qū)域，并構(gòu)建一種其中每種所選區(qū)域都易位至人染色體14片段的人類人工染色體，由此產(chǎn)生一種攜帶所述人類人工染色體的高嵌合程度小鼠。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所述人類人工染色體通過在嵌合體小鼠中減數(shù)分裂高效遺傳傳遞至下一代的后代，由此完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主題如下。
本發(fā)明一方面提供一種人類人工染色體，其中含人類染色體22的抗體λ輕鏈基因的約3.5Mb至約1Mb的區(qū)域結(jié)合至通過非人動物種系可傳遞給后代的染色體片段，所述染色體片段來源于另一個人類染色體。
按照一個實(shí)施方案，得自另一個人類染色體的染色體片段可為任何人類染色體片段，只要其穩(wěn)定且可遺傳傳遞。例如，染色體片段可以為人染色體14片段、人染色體21或其片段或者含人染色體1的lp22區(qū)的小副染色體(SAC)(Genomes Res.，11124-136，2001)，其優(yōu)選可為人染色體14的片段，例如來源于人染色體14的SC20染色體載體(Kuroiwa等，如上所述)。SC20染色體載體可用于克隆目標(biāo)染色體片段，方法是例如通過同源重組將loxP序列插入位于14p12位的RNR2基因座(Kuroiwa等，如上所述)。保持SC20染色體載體的小雞DT-40細(xì)胞(SC20)于2001年5月9日保藏于國際專利微生物保藏單位國立高級工業(yè)科學(xué)與技術(shù)研究所(Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏號為FERM BP-7583。還可以按照WO 97/07671公開的方法獲得另一個人類染色體的染色體片段，優(yōu)選生產(chǎn)攜帶長度約20Mb或更小的各種人染色體片段的嵌合體非人動物，并選擇所述嵌合體非人動物后代穩(wěn)定保持的片段。通過位點(diǎn)特異性重組序列(如loxP序列)介導(dǎo)的易位或插入，使含人染色體22的抗體λ輕鏈基因的區(qū)域結(jié)合至可遺傳傳遞的人染色體片段。當(dāng)用端粒序列和loxP序列作為兩個末端切出含抗體λ輕鏈基因的區(qū)域時，如以下實(shí)施例所述，則經(jīng)易位產(chǎn)生結(jié)合。相反，當(dāng)在兩個末端通過插入loxP序列切出含抗體λ輕鏈基因的區(qū)域時，則在可遺傳傳遞的人染色體片段上的loxP序列位點(diǎn)發(fā)生插入。
按照另一個實(shí)施方案，含人染色體22的抗體λ輕鏈基因的區(qū)域的長度約為2.5Mb至約1.5Mb。
按照再另一個實(shí)施方案，含人染色體22的抗體λ輕鏈基因的區(qū)域的長度約為2.5Mb或約1.5Mb。所述長度區(qū)域的具體實(shí)例為分別含小雞DT-40細(xì)胞(ΔHAC)(保藏號FERM-BP-7582)保持的ΔHAC和小雞DT-40細(xì)胞(ΔΔHAC)(保藏號FERM-BP-7581)保持的ΔΔHAC的人類人工染色體(參見以下的實(shí)施例)。
本發(fā)明的另一方面提供一種攜帶本發(fā)明人類人工染色體的非人動物。在本說明書中，術(shù)語“非人動物”是指非人類的脊椎動物，優(yōu)選指哺乳動物。
按照一個實(shí)施方案，所述非人動物或者具有ΔHAC人類人工染色體，或者具有ΔΔHAC人類人工染色體。
按照另一個實(shí)施方案，所述非人動物為哺乳動物。哺乳動物優(yōu)選為小鼠。
本發(fā)明再一方面提供一種生產(chǎn)非人動物的方法，包括通過微細(xì)胞法將本發(fā)明的人類人工染色體引入非人動物的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中；將獲得的ES細(xì)胞注射入非人動物的胚胎中；將產(chǎn)生的注射胚胎移植入代孕母親；由代孕母親分娩獲得嵌合體非人動物；以及篩選具有所述人類人工染色體的嵌合體非人動物。
為引入到ES細(xì)胞中，可生產(chǎn)保持人類人工染色體的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，從而通過CHO細(xì)胞將所述人類人工染色體引入ES細(xì)胞中。
按照一個實(shí)施方案，上述方法還包括生產(chǎn)所篩選嵌合體非人動物的后代，并篩選具有所述人類染色體的后代。
按照另一個實(shí)施方案，由上述方法獲得的非人動物能夠表達(dá)人抗體免疫球蛋白重鏈和λ鏈蛋白。
按照再一個實(shí)施方案，所述非人動物為哺乳動物，優(yōu)選為小鼠。
本發(fā)明再一方面提供具有本發(fā)明人類人工染色體的非人動物，其可通過本發(fā)明的方法獲得。
本發(fā)明再一方面提供本發(fā)明非人動物的后代動物。所述后代動物具有本發(fā)明的人類人工染色體。
按照一個實(shí)施方案，所述后代動物能夠表達(dá)人抗體免疫球蛋白重鏈和λ輕鏈蛋白。
按照另一個實(shí)施方案，所述后代動物能夠表達(dá)人抗體免疫球蛋白重鏈、κ輕鏈和λ輕鏈蛋白。
按照再一個實(shí)施方案，所述后代動物為小鼠。
本發(fā)明再一方面提供一種生產(chǎn)抗體的方法，包括用目標(biāo)抗原免疫接種本發(fā)明的非人動物或本發(fā)明的后代動物；并由所述動物獲得抗所述抗原的人多克隆抗體。
按照一個實(shí)施方案，所述人多克隆抗體由所述動物的血獲得。
本發(fā)明再一方面提供一種生產(chǎn)抗體的方法，包括用目標(biāo)抗原免疫接種本發(fā)明的小鼠或本發(fā)明的后代小鼠；通過將小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤；以及生產(chǎn)由人免疫球蛋白重鏈和輕鏈組成的抗所述抗原的人單克隆抗體。
本發(fā)明再一方面提供一種生產(chǎn)抗體的方法，包括用目標(biāo)抗原免疫接種本發(fā)明的小鼠或本發(fā)明的后代小鼠；通過將小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤；由所述雜交瘤分離人抗體基因；將人抗體基因?qū)雱游锛?xì)胞、酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞；在能夠表達(dá)人抗體基因的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及生產(chǎn)由人免疫球蛋白重鏈和輕鏈組成的抗所述抗原的人單克隆抗體。
本發(fā)明再一方面提供一種生產(chǎn)抗體的方法，包括用目標(biāo)抗原免疫接種本發(fā)明的小鼠或本發(fā)明的后代小鼠；通過噬菌體展示方法選擇小鼠B細(xì)胞抗體基因；將選定的人抗體基因?qū)雱游锛?xì)胞、酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞；在能夠表達(dá)人抗體基因的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及生產(chǎn)由人免疫球蛋白重鏈和輕鏈組成的抗所述抗原的人單克隆抗體。
表達(dá)方法可按照常規(guī)方法進(jìn)行(例如Sambrook，J.等，MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版(1989)，Cold Spring Harbor Press描述的方法)。作為宿主的動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞包括例如CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、面包酵母細(xì)胞和SF9細(xì)胞。
本發(fā)明再一方面提供一種生產(chǎn)人抗體的小鼠，其在血清中表達(dá)含人抗體Igγ同種型的人抗體重鏈、人抗體κ輕鏈和人抗體λ輕鏈。所述生產(chǎn)人抗體的小鼠具有未重排的人抗體重鏈基因座、人抗體κ輕鏈基因座和人抗體λ輕鏈基因座，并且至少內(nèi)源抗體重鏈和κ輕鏈的兩種等位基因都破壞或失活。
在上述生產(chǎn)人抗體的小鼠中，通過在B細(xì)胞分化時重排人抗體基因，使特定可變區(qū)的節(jié)段發(fā)生連接(重鏈中的V-D-J，輕鏈中的V-J)。優(yōu)選在B細(xì)胞成熟時對抗體基因可變區(qū)進(jìn)行的體細(xì)胞誘變后，在血清中產(chǎn)生作為基因產(chǎn)物的人抗體。
具體地說，術(shù)語“未重排”是指在B細(xì)胞分化時抗體基因座能夠在重鏈中進(jìn)行V-D-J重組和在輕鏈中進(jìn)行V-J重組的狀態(tài)，而重鏈中的V-D-J重組或輕鏈中的V-J重組尚未出現(xiàn)時，所述抗體基因座保持在小鼠未分化B細(xì)胞中。
在一個實(shí)施方案中，生產(chǎn)人抗體的小鼠具有至少40％的人抗體κ輕鏈可變區(qū)。
在另一個實(shí)施方案中，生產(chǎn)人抗體的小鼠具有人抗體重鏈、人抗體κ輕鏈和人抗體λ輕鏈的所有可變區(qū)。
在再一個實(shí)施方案中，人抗體重鏈基因座、人抗體κ輕鏈基因座和人抗體λ輕鏈基因座保持在人源染色體片段上。
在再一個實(shí)施方案中，人抗體重鏈基因座和人抗體λ輕鏈基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC人類人工染色體上。
在再一個實(shí)施方案中，人抗體κ輕鏈基因座保持在人源染色體片段上。
在再一個實(shí)施方案中，人抗體κ輕鏈基因座插入到小鼠染色體中。
在再一個實(shí)施方案中，所述生產(chǎn)人抗體的小鼠不是嵌合體小鼠。生產(chǎn)人抗體的小鼠優(yōu)選能夠遺傳傳遞人抗體重鏈基因座、人抗體κ輕鏈基因座和人抗體λ輕鏈基因座。
1.人類人工染色體(HAC)和轉(zhuǎn)染色體非人動物的生產(chǎn)及用途本發(fā)明涉及構(gòu)建一種新的人類人工染色體，其制備方法是將含人染色體22上的Igλ基因的片段易位和克隆至人染色體14來源的染色體片段；將所述人類人工染色體遺傳傳遞至小鼠；以及生產(chǎn)具有人類人工染色體的轉(zhuǎn)染色體非人動物(例如哺乳動物，如小鼠)。
在本說明書中，所述人類人工染色體(HAC)是指通過將人染色體上的目標(biāo)區(qū)域易位至穩(wěn)定的染色體片段(染色體載體)而生產(chǎn)的人工染色體。所述術(shù)語“轉(zhuǎn)染色體非人動物”是指不同物種的染色體片段通過種系遺傳傳遞的非人動物。
生產(chǎn)人類人工染色體，該染色體僅保持目標(biāo)基因區(qū)域外周，其作為插入片段(染色體插入片段)，生產(chǎn)方法是例如通過同源重組將loxP序列和人端粒序列插入人染色體上的目標(biāo)基因區(qū)域周圍，并僅將夾在兩個序列中間的目標(biāo)基因區(qū)域外周特定易位至另一個染色體片段上的對應(yīng)loxP序列插入位點(diǎn)(染色體片段最好穩(wěn)定且可遺傳傳遞；例如來自人染色體14的SC20染色體載體)(Kuroiwa等，NatureBiotech.，181086，2000)。
在生產(chǎn)人類人工染色體時，本發(fā)明人認(rèn)為推測對染色體導(dǎo)入動物發(fā)育有不利影響的染色體區(qū)最好盡可能地由染色體插入片段中去除，以便不對染色體導(dǎo)入動物(如小鼠)的發(fā)育產(chǎn)生副作用，但是，因為此前對于人染色體結(jié)構(gòu)(例如詳細(xì)的序列)幾乎沒有或沒有信息，所以有時難以在目標(biāo)基因附近插入例如loxP序列和人端粒序列。在此情況下，因為兩種序列所夾的區(qū)域包含有目標(biāo)基因以外的許多基因，所以，當(dāng)這些外部基因?qū)胄∈蟮戎袝r，擔(dān)心它們可能對發(fā)育有不利影響。而且，含目標(biāo)基因的染色體插入片段的長度與染色體導(dǎo)入動物的嵌合程度及遺傳傳遞效率之間的關(guān)系并不清晰。
本發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其中存在Igλ基因的人染色體22的結(jié)構(gòu)信息(例如I.Dunham等，Nature 402489，1999)，對于給定長度范圍的含Igλ基因的染色體插入片段，染色體導(dǎo)入動物的嵌合程度和遺傳傳遞效率顯著增加。因此，由人類人工染色體中去除額外基因能夠生產(chǎn)出保持Igλ基因區(qū)域的特定外周作為插入片段的新人類人工染色體。在本說明書中，術(shù)語“額外基因”是指對染色體導(dǎo)入動物的發(fā)育有不利影響的有害基因，其實(shí)例包括引起基因表達(dá)水平依賴性遺傳病的區(qū)域。與保持Igλ基因區(qū)外周(10Mb)作為插入片段的常規(guī)λHAC相比，本發(fā)明的人類人工染色體總體上長度減小，遺傳傳遞效率較高。
因此，修飾人染色體22能夠產(chǎn)生僅保持特定的目標(biāo)Igλ基因區(qū)作為插入片段而去除了對小鼠等發(fā)育有不利影響的有害基因的人類人工染色體。修飾的結(jié)果是導(dǎo)入的人類人工染色體總體上長度減小，并且還可避免減數(shù)分裂時不正常染色體(在本例中為導(dǎo)入的人類人工染色體)的消除機(jī)制(例如P.Hunt等，Hum.Mol.Genet.，42007.1995)。而且，與常規(guī)λHAC(Kuroiwa等，如上所述)相比，導(dǎo)入的人類人工染色體更易于傳遞至人類人工染色體導(dǎo)入動物(例如小鼠)的后代，可以更有效生產(chǎn)具有完整人抗體重鏈區(qū)和λ輕鏈區(qū)的轉(zhuǎn)染色體非人動物。
可使用由此獲得的轉(zhuǎn)染色體非人動物表達(dá)外源染色體上的基因或其片段，收集其產(chǎn)物，由此產(chǎn)生生物活性物質(zhì)。更具體地說，在可表達(dá)外源染色體上的基因或其片段的條件下，繁殖個體轉(zhuǎn)染色體非人動物，然后可由所述動物的血液、腹水等收集表達(dá)產(chǎn)物。
在可表達(dá)外源染色體上的基因或其片段的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染色體非人動物的組織、細(xì)胞或固定化細(xì)胞(例如通過與骨髓瘤細(xì)胞融合固定化的雜交瘤)等，然后由培養(yǎng)物收集表達(dá)產(chǎn)物。
或者，將由這些轉(zhuǎn)染色體非人動物的組織、細(xì)胞或固定化細(xì)胞提取的外源染色體或其片段、構(gòu)建外源染色體或其片段的DNA或衍生自保持在轉(zhuǎn)染色體非人動物的組織、細(xì)胞或固定化細(xì)胞中的外源染色體或其片段的cDNA導(dǎo)入動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、面包酵母細(xì)胞或SF9細(xì)胞)中，在可表達(dá)外源染色體上的基因或其片段的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，然后由培養(yǎng)物收集表達(dá)產(chǎn)物(例如特定抗原特異性的抗體蛋白)。按照常規(guī)方法(如離心)收集表達(dá)產(chǎn)物。此外，可按照常規(guī)方法(例如硫酸銨分級分離、分配層析、凝膠過濾層析、吸附層析或制備型薄層層析)對其進(jìn)行純化。生物活性物質(zhì)包括所有在外源染色體上編碼的物質(zhì)，其實(shí)例包括抗體，特別是人抗體。例如，可由得自轉(zhuǎn)染色體非人動物的脾細(xì)胞或其固定化細(xì)胞(例如骨髓瘤)克隆染色體上的人抗體基因，并將其導(dǎo)入中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或骨髓瘤細(xì)胞中，由此產(chǎn)生人抗體(Lynette等，Biotechnology，101121，1992；Bebbington等，Biotechnology，10169，1992；Babcook等，PNAS，937843，1996)。
除了通過選擇雜交瘤選擇產(chǎn)生目標(biāo)抗體的細(xì)胞的常規(guī)方法之外，還可以通過最近開發(fā)的噬菌體展示法(Winter等，Annu.Rev.Immunol.，12433，1994)選擇目標(biāo)抗體。為了獲得在其表面表達(dá)各種特異性人抗體的噬菌體文庫，可以使用得自本發(fā)明轉(zhuǎn)染色體非人動物(還沒有對任何抗原敏化或已經(jīng)對特定抗原敏化)的脾或淋巴組織的人免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA。
下文更詳細(xì)地描述生產(chǎn)高遺傳傳遞效率的人類人工染色體的方法。
為了生產(chǎn)包含、穩(wěn)定攜帶并遺傳傳遞目標(biāo)人染色體區(qū)的非人動物，需要一種有目的地加工染色體的技術(shù)來取代使用偶然產(chǎn)生的染色體片段。例如，在目標(biāo)位點(diǎn)切割人染色體以去除有害基因，或僅使目標(biāo)染色體片段連接至另一個穩(wěn)定且可遺傳傳遞的染色體。這種技術(shù)稱為“染色體工程”。迄今為止，此技術(shù)主要是以位點(diǎn)特異性方式切割小鼠ES細(xì)胞(WO 98/54348)中的內(nèi)源小鼠染色體，或同源染色體之間的重組(易位)引起特定基因區(qū)的缺失、反轉(zhuǎn)或增加。因此，已經(jīng)生產(chǎn)了具有這種修飾染色體的變異小鼠(R.Ramirez-Solis等，Nature 378720，1995)。該技術(shù)也可應(yīng)用于本發(fā)明。
當(dāng)獲得其中保持人染色體或其片段的ES細(xì)胞生成生殖細(xì)胞的高嵌合程度非人動物(例如小鼠之類的哺乳動物)時，下一個考慮的問題就是如果減數(shù)分裂時沒有去除導(dǎo)入的人染色體，則是否可形成保持導(dǎo)入的人染色體的精子或卵子。如上所述，一般認(rèn)為在減數(shù)分裂時去除了不正常的染色體。因此，保持導(dǎo)入的人染色體的細(xì)胞有可能在減數(shù)分裂時去除，結(jié)果這些細(xì)胞不能分化成精子或卵子。這是因為雖然減數(shù)分裂時需要同源染色體之間配對，但僅有一個導(dǎo)入的人染色體。因此，配對基本上是不可能的。因此，導(dǎo)入的人染色體可能因為減數(shù)分裂排除。實(shí)際上，Tomizuka等(Nature Genet.，16133，1997)報道，導(dǎo)入大約50Mb或更大的人染色體14片段導(dǎo)致嵌合體雄性小鼠不育。相反，在遺傳傳遞估計約10-20Mb長的人染色體2或14(SC20)片段時，認(rèn)為導(dǎo)入染色體的大小對通過減數(shù)分裂來說是一個重要因素(Tomizuka等，Nature Genet.，16133，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97卷，722-727，2000)。SC20染色體載體(10-20Mb)可遺傳傳遞，在小鼠ES細(xì)胞和小鼠個體中還高度穩(wěn)定(Shinohara等，Chromosome Res.，8713-725，2000)。可通過WO 97/07671和WO98/37757描述的方法獲得和選擇可遺傳傳遞并在小鼠個體中穩(wěn)定的天然染色體片段。Voet等(Genome Res.，11124-136，2001)的報告也描述了可遺傳傳遞并在小鼠個體中穩(wěn)定的天然人染色體片段。此外，使用嵌合體小鼠穩(wěn)定攜帶的人染色體14(約100Mb，Tomizuka等，Nature Genet.，16133，1997)或染色體21(約50Mb，Shinohara等，第45屆日本人類遺傳協(xié)會年會，2000年8月)作為原料，可通過染色體工程技術(shù)將其減至20Mb或更小(Kuroiwa等，Nature Biotech.181086，2000)。按照本發(fā)明，通過使用上述技術(shù)將導(dǎo)入染色體的大小減至特定長度范圍，可獲得在小鼠個體中穩(wěn)定并具有高遺傳傳遞效率的人工染色體。
例如，通過僅將特定長度范圍的目標(biāo)基因區(qū)易位和克隆至可遺傳傳遞的SC20載體構(gòu)建HAC，通過SC20片段載體的作用使HAC可遺傳傳遞。在此情況下，可通過易位改變SC20的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，或者HAC總體長度可變得比原先的SC20載體大。因此，要易位的染色體插入片段(含人染色體22上的免疫球蛋白λ基因)的長度可小于λHAC(10Mb)，即一般約3.5Mb至約1Mb，優(yōu)選約3Mb至約1.2Mb，更優(yōu)選約2.5Mb至約1.5Mb。要易位的染色體插入片段的著絲粒側(cè)末端優(yōu)選為HCF2基因座，更優(yōu)選為AP000553區(qū)(I.Dunham等，Nature 402489，1999)。擬修飾染色體(例如人染色體22)全部序列的闡明明顯有助于精確修飾如上所述的染色體。因此，如果闡明了完整人染色體的序列，則通過僅將含人染色體22以及各種人染色體上的目標(biāo)基因外周區(qū)精確易位和克隆至SC20染色體載體，可有效進(jìn)行遺傳傳遞。
如上所述，要實(shí)現(xiàn)導(dǎo)入人染色體在非人動物(如小鼠)中遺傳傳遞存在幾個障礙，特別是人們認(rèn)為人染色體22上的Igλ基因區(qū)難以有效遺傳傳遞。但是，本發(fā)明解決了該問題。
具體地說，在本發(fā)明中，將含人染色體22上的抗體λ輕鏈基因的2.5Mb和1.5Mb區(qū)易位和克隆至SC20染色體載體，以產(chǎn)生人類人工染色體(ΔHAC和ΔΔHAC)，隨后，將每個ΔHAC和ΔΔHAC導(dǎo)入小鼠個體，對比嵌合體小鼠的嵌合程度和λHAC(Kuroiwa等，如上所述)，由此證實(shí)嵌合程度提升，并實(shí)現(xiàn)了所述人類人工染色體的有效遺傳傳遞。嵌合程度代表嵌合體動物中ES細(xì)胞的生成比率，一般可通過目測評價嵌合體動物身體表面上由ES細(xì)胞產(chǎn)生的毛色比率確定。該具體實(shí)施例將更詳細(xì)描述。
2.ΔHAC、ΔΔHAC和轉(zhuǎn)染色體小鼠的生產(chǎn)與應(yīng)用通過已熟知的方法可獲得含人抗體λ輕鏈基因或其片段的人染色體22。更具體地說，可通過微細(xì)胞法將人染色體或其片段在小鼠A9細(xì)胞中構(gòu)建成文庫(Koi等，Jpn.J.Cancer Res.80413-418，1989)。可通過PCR等檢測所獲文庫中對人抗體λ輕鏈基因特異性的序列，以選擇保持人染色體22或其片段的克隆。為以后修飾方便起見，更優(yōu)選可通過微細(xì)胞法將人染色體22或其片段轉(zhuǎn)移入小雞DT-40細(xì)胞(RIKEN Cell BankRCB 1464，ATCCCRL-2111)中。
在染色體22上的22q11.2存在人抗體λ輕鏈基因簇(例如J.E.Collins等，Nature 377367，1995)。對上述λHAC，將HCF2基因座至LIF基因座的10Mb區(qū)作為染色體插入片段易位并克隆。在此10Mb插入片段中，在Igλ基因區(qū)的端粒側(cè)包含7Mb的額外染色體區(qū)，而在著絲粒側(cè)含1Mb的額外染色體區(qū)。為了首先去除7Mb區(qū)，通過端粒平截在非常接近于Igλ基因區(qū)存在并在端粒側(cè)(約400Kb端粒側(cè))的AP000344區(qū)(I.Dunham等，Nature 402489，1999)切割染色體22或其修飾片段(HCF2基因座中插入loxP序列并在LIF基因座端粒平截的片段)(例如Kuroiwa等，Nucleic Acid Research，263447，1998)。隨后，通過同源重組將loxP序列插入非常接近于Igλ基因區(qū)并在著絲粒側(cè)(約300Kb著絲粒側(cè))的AP000553區(qū)(I.Dunham等，Nature402489，1999)。這些修飾能夠僅將HCF2-Igλ-AP000344片段(約2.5Mb)或AP000553-Igλ-AP000344片段(約1.5Mb)作為染色體插入片段易位和克隆至SC20染色體載體。通過常規(guī)方法將構(gòu)建的HAC導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞，然后生產(chǎn)嵌合體小鼠。在證實(shí)嵌合體小鼠中保持HAC后，進(jìn)行雜交獲得后代小鼠。對所獲后代小鼠進(jìn)行HAC保持驗證能夠判斷HAC的遺傳傳遞情況。
按照本發(fā)明，通過ΔHAC遺傳傳遞人抗體λ輕鏈(Igλ)基因的全部區(qū)域，可有效生產(chǎn)具有人抗體重鏈和λ輕鏈基因的轉(zhuǎn)染色體非人動物(例如小鼠之類的哺乳動物)。據(jù)信用非人動物生產(chǎn)可為藥物候選物的人抗體是有用的。在人血清中，含λ輕鏈的抗體占大約40％，Vλ基因片段的數(shù)量(70)和Vκ鏈基因的數(shù)量(76)大致相等。因此，有人認(rèn)為含λ鏈的抗體明顯有利于不同人抗體的構(gòu)建(Popov，A.V.，J.Exp.Med.，1891611，1999)。相反，在目前世界上用作藥物的大多數(shù)人源化抗體或人抗體中，輕鏈由κ輕鏈組成。本發(fā)明的ΔHAC和ΔΔHAC轉(zhuǎn)染色體小鼠對開發(fā)含λ輕鏈的人抗體藥物有用。ΔHAC和ΔΔHAC轉(zhuǎn)染色體小鼠可遺傳傳遞不同物種的染色體片段，因此可通過雜交大量生產(chǎn)同基因性狀的轉(zhuǎn)染色體小鼠。而且，具有含人抗體κ輕鏈基因的染色體片段的小鼠(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97722-727，2000)或含人抗體κ輕鏈基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(Fishwild等，NatureBiotechnol.，14845-851，1996；Mendez等，Nature Genet.，15146-156，1997)可與ΔHAC和ΔΔHAC轉(zhuǎn)染色體小鼠雜交，生產(chǎn)產(chǎn)生含全部人抗體重鏈、κ輕鏈和λ輕鏈的人抗體的人抗體生產(chǎn)小鼠。Nicholson等(J.Immunol.，1636898，1999)報導(dǎo)了同時表達(dá)人重鏈、κ鏈和λ鏈的小鼠品系。他們通過組合具有酵母人工染色體(YAC，分別包含導(dǎo)入其中的部分人Ig重鏈、κ鏈和λ鏈)的轉(zhuǎn)基因小鼠和內(nèi)源Ig重鏈和κ鏈剔除小鼠，產(chǎn)生了含人重鏈/κ鏈和和人重鏈/λ鏈分子的小鼠。但是，在該小鼠品系中表達(dá)的人免疫球蛋白的多樣性和分子組成明顯與人不同。例如，(i)人Ig重鏈YAC僅由μ和δ恒定區(qū)組成，而另一個同種型(特別是為最大組分的Igγ同種型)在該小鼠品系中不表達(dá)，和(ii)三種類型的YAC中包含的可變區(qū)的數(shù)量少，推測該小鼠品系表達(dá)的人抗體的多樣性有限。
在本文公開的同時表達(dá)人Ig重鏈、κ鏈和λ鏈的小鼠品系中，人類表達(dá)抗體的多樣性、分子組成等更忠實(shí)地重現(xiàn)。例如，因為(i)表達(dá)Igγ同種型(全部4種亞型)和(ii)包含重鏈、κ鏈和λ鏈的所有可變區(qū)，可再現(xiàn)類似于人的多樣性。
用合適的抗原免疫接種這些生產(chǎn)人抗體的轉(zhuǎn)染色體小鼠，并通過ELISA篩選經(jīng)脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤融合獲得的雜交瘤(Ando，Chiba，“Tan-kurohn Koutai Jikken Sousa Nyuumon(單克隆抗體實(shí)驗和操作指引)，”Kodansha Scientific，1991)。因此，可獲得生產(chǎn)由人免疫球蛋白重鏈和λ輕鏈組成的完整人單克隆抗體的雜交瘤。這些人單克隆抗體可用作藥用抗體。
據(jù)認(rèn)為，多克隆抗體作為治療性抗體治療感染性疾病等比單克隆抗體的治療作用更大。而且，人多克隆抗體還可以開發(fā)成所謂的γ球蛋白制劑。已經(jīng)證明，實(shí)際上由本發(fā)明產(chǎn)生的保持ΔHAC或ΔΔHAC的ES細(xì)胞可獲得高嵌合程度(約80％-100％，優(yōu)選約85％-100％)的嵌合體小鼠，而導(dǎo)入的人類人工染色體高效遺傳傳遞，并在從受精卵態(tài)到分娩成后代小鼠的整個發(fā)育過程中始終保持。用不同物種抗原接種非人動物(如小鼠)能夠大量生產(chǎn)抗原特異性人多克隆抗體(含人λ輕鏈的抗體)。具有可取代單克隆抗體的抗體藥物的希望，因為單克隆抗體難以大量生產(chǎn)。
本發(fā)明的人類人工染色體可導(dǎo)入小鼠以及其它非人動物(例如大鼠或豬之類的哺乳動物)中。Iannaccone等，Dev.Biol.，163288，1994(大鼠)和Wheeler等，Reprod.Fertil.Dev.，6563，1994(豬)報導(dǎo)了在小鼠以外的動物物種中建立ES細(xì)胞或ES樣細(xì)胞。此外，還嘗試使用了小軟鰭魚科、小雞等(“轉(zhuǎn)基因動物”，蛋白質(zhì)、核酸、酶，1995年10月，號外，KYORITSU SHUPPAN CO.，LTD.)。使用ES或ES樣細(xì)胞作為受體細(xì)胞的人類人工染色體遷移能夠生產(chǎn)具有人類人工染色體或其片段并表達(dá)人類人工染色體上的基因的非人動物，如同小鼠的案例一樣。而且，可使用這些非人動物生產(chǎn)含人λ輕鏈的抗體。


圖1顯示了人類人工染色體ΔHAC和ΔΔHAC的生產(chǎn)。
圖2顯示了表達(dá)盒載體pTELhisD。
圖3顯示了靶向載體pTELhisDλI。
圖4顯示了靶向載體p553loxPHyg。
本說明書包括在日本專利申請第2001-142371號說明書中公開的部分或全部內(nèi)容，所述申請是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。
具體實(shí)施例方式
參照以下的實(shí)施例將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例不限制本發(fā)明。
以下的實(shí)施例1至實(shí)施例14描述了人類人工染色體ΔHAC和ΔΔHAC的生產(chǎn)，ΔHAC和ΔΔHAC的制備方法是將人染色體22上的抗體λ輕鏈基因的2.5Mb和1.5Mb外周區(qū)易位和克隆至SC20染色體載體(圖1)。此外，描述了將每種所生產(chǎn)的HAC導(dǎo)入小鼠個體中以及將HAC傳遞至嵌合體小鼠的后代。
生產(chǎn)表達(dá)盒載體pTELhisD用限制酶NotI(Boehringer)切割表達(dá)盒載體pTELPuro(Kuroiwa等，Nature Biotech.，181086-，2000)，并使用DNA平端試劑盒(ToyoboCo.，Ltd.)于72℃平端5分鐘。平端后使用細(xì)菌來源的堿性磷酸酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)于65℃去磷酸化1小時。此后，加入限制酶BglII接頭(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，使用連接試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)進(jìn)行連接。由此產(chǎn)生BgIII接頭取代pTELPuro質(zhì)粒中的PGKPuro表達(dá)盒的質(zhì)粒pTELBg。用限制酶BglII切割該質(zhì)粒，并以相同方式去磷酸化。此后，使用CHROMA SPIN-TE 400(Clontech)經(jīng)凝膠過濾純化。隨后，用限制酶BamHI從質(zhì)粒#1-132(由Kyoto大學(xué)的Shun-ichiTakeda教授提供)中切出hisD片段，以相同方式加入其進(jìn)行連接反應(yīng)。由此產(chǎn)生hisD表達(dá)盒取代pTELPuro質(zhì)粒中的PGKPuro表達(dá)盒的表達(dá)盒載體pTELhisD(圖2)。
生產(chǎn)靶向載體pTELhisDλI按以下方式生產(chǎn)靶向載體pTELhisDλI，該載體用于將人端粒序列插入到非常接近于人染色體22上的Igλ基因座并在端粒一側(cè)(約400Kb端粒側(cè))的AP000344區(qū)。開始時，使用以下引物通過PCR擴(kuò)增AP000344基因組區(qū)。
1269D1-F；5′-TCGAGGATCCGACAAGTTCTCTTCTCTTTTCCTTCTGCCC-3′(SEQ ID NO1)1269D1-R；5′-TCGAGGATCCGCTGCTAAGCTACTGTTCTCTTTTTTCCCC-3′(SEQ ID NO2)使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生產(chǎn))作為熱循環(huán)儀，使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作為Taq聚合酶進(jìn)行PCR，并按照推薦的條件使用連接緩沖液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。對于溫度和循環(huán)條件，于94℃熱變性1分鐘后，以98℃10秒和68℃11分鐘進(jìn)行35個循環(huán)。用蛋白酶K(Gibco)處理PCR產(chǎn)物，然后用CHROMA SPIN-TE 400(Clontech)進(jìn)行凝膠過濾。此后，用限制酶BamHI(Boehringer)切割PCR產(chǎn)物，然后用CHROMA SPIN-TE 400(Clontech)進(jìn)行凝膠過濾。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pTELhisD的BamHI位點(diǎn)。因為AP000344基因組序列的方向是由著絲粒至端粒，所以測定和人端粒序列相同方向的克隆AP000344基因組片段作為目的靶向載體pTELhisDλI(圖3)。
生產(chǎn)靶向載體p5531oxPHyg按以下方式生產(chǎn)靶向載體p553loxPHyg，該載體用于將Cre重組酶識別序列l(wèi)oxP序列插入非常接近于人染色體22上的Igλ基因座并在著絲粒一側(cè)(約300Kb著絲粒側(cè))的AP000553區(qū)。開始時，使用以下引物通過PCR擴(kuò)增AP000553基因組區(qū)。
553-F3；5′-TCGAGTCGACTGTAGCTGACTTTAGCCACCCACAAGTAC-3′(SEQID NO3)553-R3；5′-TCGAGTCGACCTTGCTGATTATACCTCATCTCCTTCCCTC-3′(SEQID NO4)使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生產(chǎn))作為熱循環(huán)儀，使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作為Taq聚合酶進(jìn)行PCR，并按照推薦的條件使用連接緩沖液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。對于溫度和循環(huán)條件，于94℃熱變性1分鐘后，以98℃10秒和68℃15分鐘進(jìn)行35個循環(huán)。用蛋白酶K(Gibco)處理PCR產(chǎn)物，然后用CHROMA SPIN-TE 400(Clontech)進(jìn)行凝膠過濾。此后，用限制酶SalI(Boehringer)切割PCR產(chǎn)物，然后用CHROMA SPIN-TE 1000(Clontech)進(jìn)行凝膠過濾。將該P(yáng)CR片段克隆到質(zhì)粒pBluescriptII(先缺失NotI位點(diǎn)，然后將SrfI接頭插入SacII位點(diǎn))的SalI位點(diǎn)(pBS553)。隨后，用限制酶HpaI(Boehringer)切割pBS553并去磷酸化，然后通過連接插入NotI接頭(pBS553N)。用限制酶NotI切割pBS553N并去磷酸化后，用限制酶NotI(Boehringer)由表達(dá)盒載體ploxPHyg中切出含loxP的DNA片段，然后連接。經(jīng)測定與克隆的AP000553基因組片段相同方向的含loxP序列的載體作為靶向載體p553loxPHyg(圖4)。
位點(diǎn)特異性切割小雞DT-40細(xì)胞中的人染色體22將實(shí)施例2產(chǎn)生的靶向載體pTELhisDλI轉(zhuǎn)染入小雞DT-40細(xì)胞(克隆52-18)和DT-40細(xì)胞(克隆HF38)，其中克隆52-18保持有通過WO 98/37757描述的方法生產(chǎn)的全長人染色體22，而克隆HF38保持有已經(jīng)在LIF基因座切割的人染色體22片段，將人端粒序列插入AP000344基因組區(qū)，以嘗試在插入位點(diǎn)切割染色體22。
用包含加入其中的10％胎牛血清(Gibco，下文稱之為“FBS”)、1％小雞血清(Gibco)和10-4M 2-巰基乙醇(Sigma)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)小雞DT-40細(xì)胞。用無填加物的RPMI 1640培養(yǎng)基清洗約107細(xì)胞一次，并懸浮在0.5ml無填加物的RPMI 1640培養(yǎng)基中。加入25-30μg用限制酶SrfI(Toyobo Co.，Ltd.)線性化的靶向載體pTELhisDλI，并將其轉(zhuǎn)移入杯(Bio-Rad)進(jìn)行電穿孔，使其在室溫下靜置10分鐘。將所述杯置于Gene Pulser(Bio-Rad)中，施加550V、25μF，的電壓。使杯在室溫下靜置10分鐘后，將其培養(yǎng)24小時。24小時后，用含組氨醇(0.5mg/ml)的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液分至10個96孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行約2周的選擇性培養(yǎng)。使用Puregene DNA分離試劑盒(CentraSystem)由組氨醇抗性克隆中提取基因組DNA，使用用于檢測HCF2(Kuroiwa等，Nature Biotech.，181086，2000)、Igλ(Tomizuka等，Nature Genet.，16133，1997)、D22S1174、D22S315、D22S275(BIOS)和LIF(Kuroiwa等，Nucleic Acid Research，263447-3448，1998)的引物通過PCR證實(shí)人染色體22在AP000344基因組區(qū)切割。
使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生產(chǎn))作為熱循環(huán)儀，使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作為Taq聚合酶進(jìn)行PCR，并按照推薦的條件使用連接緩沖液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。對于溫度和循環(huán)條件，于94℃熱變性1分鐘后，以98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒進(jìn)行35個循環(huán)。在轉(zhuǎn)染克隆52-18時，篩選48個克隆，發(fā)現(xiàn)1個克隆(T32)為目的克隆。在轉(zhuǎn)染HF38時，篩選96個克隆，發(fā)現(xiàn)2個克隆(HT69、HT72)為目的克隆。
此外，通過FISH分析證實(shí)染色體22是否在AP000344區(qū)切割。
為了目測判斷人染色體22在AP000344基因組區(qū)切割，使用能夠檢測靶向載體中的hisD抗性基因的探針進(jìn)行FISH分析。按照Kuroiwa等(Nucleic Acid Research，263447-3448，1998)實(shí)施該方法。根據(jù)COT1染色(羅丹明標(biāo)記，紅色)，發(fā)現(xiàn)相比于全長人染色體22，T32、HT69和HT72中的染色體22片段化。而且，在端粒末端檢測到hisD探針產(chǎn)生的信號(FITC標(biāo)記，黃色)。這表明，插入到靶向載體中的AP000344是染色體22片段的端粒末端。
由以上結(jié)果推斷，T32、HT69和HT72的人染色體22在AP000344區(qū)切割。
在小雞DT-40細(xì)胞的人染色體22上位點(diǎn)特異性插入loxPHyg表達(dá)盒在以上的HT69和72中，loxP序列已經(jīng)插入到HCF2基因座(Igλ基因座的約1Mb著絲粒側(cè))中。因此，對于克隆T32，將實(shí)施例3產(chǎn)生的靶向載體p553loxPHyg轉(zhuǎn)染入非常接近Igλ基因座并在著絲粒側(cè)(約300Kb的著絲粒側(cè))的AP000553區(qū)，以嘗試插入loxP序列。
以上述相同的方式將已用限制酶SrfI(Toyobo Co.，Ltd.)線性化的靶向載體p553loxPHyg轉(zhuǎn)染入克隆T32中，并用含潮霉素B(1mg/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行約2周的選擇性培養(yǎng)。由潮霉素B抗性克隆提取基因組DNA，使用以下2組引物通過PCR鑒定同源重組物。
553-F4；5′-GCTAAGGCACTTCGGTTCTCTTTGTGTTC-3′(SEQ ID NO5)553-R4；5′-GGTTGTCTTTAAAAGCAGGGATAAGGATG-3′(SEQ ID NO6)553-F5；5′-AGAAGAAAGGAGTGGGTGCTAAACATTCAG-3′(SEQ ID NO7)553-R5；5′-GGTTAGATGGCACCAAATGAAAGGAGAAG-3′(SEQ ID NO8)使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生產(chǎn))作為熱循環(huán)儀，使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作為Taq聚合酶進(jìn)行PCR，并按照推薦的條件使用連接緩沖液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。對于溫度和循環(huán)條件，于94℃熱變性1分鐘后，以98℃10秒和68℃15分鐘進(jìn)行35個循環(huán)。篩選69個克隆，結(jié)果鑒定出3個克隆(553-2、6、14)為同源重組物。
通過將2.5Mb的人抗體λ輕鏈基因區(qū)(HCF2-Igλ-AP000344)易位和克隆至SC20染色體載體制備人類人工染色體ΔHAC構(gòu)建物開始時，將實(shí)施例4獲得的克隆HT72和保持有SC20染色體載體的DT-40細(xì)胞的克隆R進(jìn)行細(xì)胞融合(Kuroiwa等，Nature Biotech.181086，2000)，以產(chǎn)生保有人染色體22片段和染色體14片段(SC20染色體載體)的DT-40雜種細(xì)胞。
(1)生產(chǎn)同時保有人染色體22片段和SC20染色體載體的DT-40雜種細(xì)胞用含殺稻瘟素S(10μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)克隆R，并用含潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)克隆HT72。將兩種克隆分別以1-2×107的量互相混合并離心，然后用無血清RPMI1640培養(yǎng)基清洗兩次。完全去除殘余培養(yǎng)基后，漸漸加入于37℃預(yù)加熱的0.5ml 50％PEG 1500(Boehringer)，使用吸液管劇烈攪拌混合物2分鐘。此后，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，然后在約3分鐘內(nèi)加入9ml無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，使混合物在37℃靜置10分鐘。此后，于1,200rpm離心混合物5分鐘，并在含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48小時。此后，用含殺稻瘟素S(10μg/ml)和潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液分至5個24孔培養(yǎng)板中，接著培養(yǎng)3-4周。由雙抗性克隆提取基因組DNA，使用以下的引物進(jìn)行PCR，以驗證保持有兩個片段，即人染色體14片段(SC20染色體載體)和染色體22片段。
檢測人染色體14的引物VH3-F；5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′(SEQ ID NO9)VH3-R；5′-GTTGTGCTACTCCCATCACT-3′(SEQ ID NO10)檢測人染色體22的引物Igλ-F；5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3′(SEQ ID NO11)Igλ-R；5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′(SEQ ID NO12)
使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生產(chǎn))作為熱循環(huán)儀，使用Ex Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作為Taq聚合酶進(jìn)行PCR，并按照推薦的條件使用連接緩沖液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。對于溫度和循環(huán)條件，于94℃熱變性1分鐘后，以98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒進(jìn)行35個循環(huán)。PCR后發(fā)現(xiàn)6個克隆(56HT2、3、4、5、6、7)為陽性。此外，使用人COT1DNA作為探針的FISH分析結(jié)果證實(shí)，所有這些克隆都保有互相獨(dú)立的兩種人染色體片段。由以上結(jié)果推斷，這6個雜種克隆都保有兩種片段，即人染色體14片段(SC20染色體載體)和染色體22片段。
(2)將人染色體22的2.5Mb區(qū)(HCF2-Igλ-AP000344)位點(diǎn)特異性易位至DT-40雜種克隆(56HT2)的SC20染色體載體(2)-1構(gòu)建Cre重組酶的穩(wěn)定表達(dá)載體pBS185Puro按照Kuroiwa等(如上所述)的方法，使用Cre-loxP系統(tǒng)在人染色體之間進(jìn)行位點(diǎn)特異性易位。因為預(yù)期非同源染色體之間的重組效率即使在該系統(tǒng)中也非常低，所以相信Cre酶應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定表達(dá)，而不是瞬時表達(dá)。因此，構(gòu)建以下類型的表達(dá)載體。
用EcoRI由質(zhì)粒(其將質(zhì)粒PGKPuro(由WIHTEHEAD研究所的Peter W.Laird教授提供)中的NotI位點(diǎn)替換為EcoRI位點(diǎn))中切出PGKPuro片段，將其克隆入Cre重組酶表達(dá)載體pBS185(Gibco)的EcoRI位點(diǎn)中(pBS 185Puro)。
(2)-2使用Cre-loxP系統(tǒng)將人染色體22的2.5Mb區(qū)(HCF2-Igλ-AP000344)位點(diǎn)特異性易位至DT-40雜種克隆的SC20染色體載體以上述相同的方式，將已用限制酶KpnI(Boehringer)線性化的穩(wěn)定Cre重組酶表達(dá)載體pBS185Puro轉(zhuǎn)染入56HT2雜種克隆中，將培養(yǎng)液分至24孔板中，在嘌呤霉素(3μg/ml)存在下進(jìn)行約2周的選擇性培養(yǎng)。由每個孔提取基因組，使用以下兩組引物進(jìn)行嵌套式PCR，以確定SC20染色體載體和人染色體22片段之間是否已發(fā)生易位。
PGK-1；5′-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3′(SEQ ID NO13)GFP-1；5′-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3′(SEQ ID NO14)PGK-2；5′-TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3′(SEQ ID NO15)GFP-2；5′-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3′(SEQ ID NO16)使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生產(chǎn))作為熱循環(huán)儀，使用Ex Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作為Taq聚合酶進(jìn)行PCR，并按照推薦的條件使用連接緩沖液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。作為首個PCR，于94℃熱變性1分鐘后，使用PGK-1和GFP-1作為引物，以98℃10秒、61℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)。使用該反應(yīng)溶液的一部分作為模板，然后使用PGK-2和GFP-2作為引物，以98℃10秒、59℃30秒和72℃30秒進(jìn)行35個循環(huán)。培養(yǎng)通過PCR發(fā)現(xiàn)易位的孔中的細(xì)胞混合物，直至細(xì)胞數(shù)達(dá)到107，將混合物懸浮在4ml含加入其中的5％FBS和1μg/ml碘化丙錠(PI)的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)中，并通過FACS Vantage(Becton Dickinson)進(jìn)行分析。如Kuroiwa等(如上所述)所報導(dǎo)，當(dāng)loxP之間發(fā)生重組或易位時，GFP基因重構(gòu)并表達(dá)。因此，可通過FACS檢測易位細(xì)胞。重復(fù)兩次分選據(jù)認(rèn)為是GFP陽性的細(xì)胞組分。每次分選操作后都用含潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果將GFP陽性細(xì)胞富集至98-99％的純度。
隨后，使用PGK-2和GFP-2作為引物通過PCR驗證FACS克隆的GFP陽性克隆(ΔH21)中的loxP之間是否如預(yù)期一樣發(fā)生重組。此外，使用人染色體14特異性探針(羅丹明標(biāo)記)和人染色體22特異性探針(FITC標(biāo)記)，對克隆ΔH21進(jìn)行FISH分析(Kuroiwa等，如上所述)。結(jié)果，證實(shí)存在其中人染色體22區(qū)明顯易位至SC20染色體載體(人染色體14片段)的人工染色體。
根據(jù)以上結(jié)果推斷，克隆ΔH21中構(gòu)建的人類人工染色體ΔHAC其人抗體λ輕鏈基因區(qū)(HCF2-Igλ-AP000344)的2.5Mb外周區(qū)域易位并克隆至SC20染色體載體。
保有ΔHAC的小雞DF-40細(xì)胞(ΔHAC)于2001年5月9日保藏于國際專利微生物保藏單位國立高級工業(yè)科學(xué)與技術(shù)研究所(TsukubaCentral 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏號為FERM BP-7582。
通過將人抗體λ輕鏈基因區(qū)的1.5Mb外周區(qū)(AP000553-Igλ-AP000344)易位并克隆至SC20染色體載體制備人類人工染色體ΔΔHAC構(gòu)建物在以上的ΔHAC中，在Igλ和HCF2之間仍保留約1Mb的額外區(qū)。為了精確去除外染色體區(qū)并僅易位和克隆Igλ基因區(qū)的外周區(qū)域，嘗試構(gòu)建其中1.5Mb的AP000553-Igλ-AP000344區(qū)易位和克隆至SC20染色體載體的人類人工染色體ΔΔHAC。
開始時，將實(shí)施例5獲得的克隆553-2和克隆R進(jìn)行細(xì)胞融合，以產(chǎn)生同時保有人染色體22片段和染色體14片段(SC20染色體載體)的DT-40雜種。
(1)生產(chǎn)同時保有人染色體22片段和SC20染色體載體的DT-40雜種細(xì)胞用含殺稻瘟素S(10μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)克隆R，并用含潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)克隆553-2。將兩種克隆分別以1-2×107的量互相混合并離心，然后用無血清RPMI1640培養(yǎng)基清洗兩次。完全去除殘余培養(yǎng)基后，漸漸加入于37℃預(yù)加熱的0.5ml 50％PEG 1500(Boehringer)，使用吸液管劇烈攪拌混合物約2分鐘。此后，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，然后在約3分鐘內(nèi)加入9ml無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，使混合物在37℃靜置10分鐘。此后，于1,200rpm離心混合物5分鐘，并在含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48小時。此后，用含殺稻瘟素S(10μg/ml)和潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液分至5個24孔培養(yǎng)板中，接著培養(yǎng)3-4周。由獲得的雜種克隆(如克隆553R1)提取基因組DNA，使用和實(shí)施例6所用相同的引物進(jìn)行PCR，以驗證保有兩種片段，即人染色體14片段和染色體22片段。此外，使用人COT1DNA作為探針進(jìn)行FISH分析，結(jié)果證實(shí)存在互相獨(dú)立的兩種人染色體片段。由以上實(shí)驗推斷，雜種克隆553R1保有兩種片段，即人染色體14片段(SC20染色體載體)和染色體22片段。
(2)將人染色體22的1.5Mb區(qū)(AP000553-Igλ-AP000344)位點(diǎn)特異性易位至DT-40雜種克隆(553R1)的SC20染色體載體以和上述相同的方式，將已用限制酶KpnI(Boehringer)線性化的穩(wěn)定Cre重組酶表達(dá)載體pBS 185Puro轉(zhuǎn)染入雜種克隆553R1中，將培養(yǎng)液分至12孔板中，在嘌呤霉素(3μg/ml)存在下進(jìn)行約2周的選擇性培養(yǎng)。由每個孔提取基因組，使用以下兩組引物進(jìn)行嵌套式PCR，以確定SC20染色體載體和人染色體22片段之間是否已發(fā)生易位。
PGK-1；5′-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3′(SEQ ID NO13)GFP-1；5′-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3′(SEQ ID NO14)PGK-2；5′-TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3′(SEQ ID NO15)GFP-2；5′-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3′(SEQ ID NO16)使用GeneAmp 9600(Perkin-Elmer生產(chǎn))作為熱循環(huán)儀，使用ExTaq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作為Taq聚合酶進(jìn)行PCR，并按照推薦的條件使用連接緩沖液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。作為首個PCR，于94℃熱變性1分鐘后，使用PGK-1和GFP-1作為引物，以98℃10秒、61℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)。使用該反應(yīng)溶液的一部分作為模板，使用PGK-2和GFP-2作為引物，以98℃10秒、59℃30秒和72℃30秒進(jìn)行35個循環(huán)。擴(kuò)增通過PCR發(fā)現(xiàn)易位的孔中的細(xì)胞混合物(2種混合物DDH5、6)，直至細(xì)胞數(shù)達(dá)到107，將混合物懸浮在4ml含加入其中的5％FBS和1μg/ml碘化丙錠(PI)的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)中，并通過FACS Vantage(Becton Dickinson)進(jìn)行分析。重復(fù)兩次分選據(jù)認(rèn)為是GFP陽性的細(xì)胞組分。每次分選操作后用含潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果將GFP陽性細(xì)胞富集至98-99％的純度。
隨后，使用PGK-2和GFP-2作為引物通過PCR驗證FACS克隆的GFP陽性克隆(ΔΔH5、6)中的loxP之間是否如預(yù)期一樣發(fā)生重組。此外，使用人染色體14特異性探針(羅丹明標(biāo)記)和人染色體22特異性探針(FITC標(biāo)記)，對克隆ΔΔH5、6進(jìn)行FISH分析(Kuroiwa等，如上所述)。結(jié)果，證實(shí)兩種克隆中都存在其中人染色體22區(qū)明顯易位至SC20染色體載體(人染色體14片段)的人工染色體。
根據(jù)以上結(jié)果推斷，兩種克隆ΔΔH5、6中構(gòu)建的人類人工染色體ΔΔHAC其人抗體λ輕鏈基因區(qū)(AP000553-Igλ-AP000344)的1.5Mb外周區(qū)易位并克隆至SC20染色體載體。
保有ΔΔHAC的小雞DF-40細(xì)胞(ΔΔHAC)于2001年5月9日保藏于國際專利微生物保藏單位國立高級工業(yè)科學(xué)與技術(shù)研究所(Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏號為FERM BP-7581。
含ΔHAC的DT-40雜種細(xì)胞和中國倉鼠CHO細(xì)胞之間的細(xì)胞融合如Kuroiwa等(如上所述)所報導(dǎo)，首先嘗試將構(gòu)建的HAC導(dǎo)入CHO細(xì)胞中，以將構(gòu)建的HAC導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞。但是，含ΔHAC的DT-40雜種細(xì)胞ΔH21形成微細(xì)胞的能力低，因此通過微細(xì)胞法將ΔHAC導(dǎo)入CHO細(xì)胞中并不成功(WO 00/10383)。因此，最近嘗試通過含ΔHAC的DT-40雜種細(xì)胞ΔH21和CHO細(xì)胞之間的細(xì)胞融合將ΔHAC導(dǎo)入CHO細(xì)胞中。
將1-2×1O7的ΔH21克隆和1×107的CHO細(xì)胞混合并離心，然后用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗混合物兩次。完全去除殘余培養(yǎng)基后，漸漸加入于37℃預(yù)加熱的0.5ml 50％PEG 1500(Boehringer)，使用吸液管劇烈攪拌混合物2分鐘。此后，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml無血清DMEM培養(yǎng)基，然后在約3分鐘內(nèi)加入9ml無血清DMEM培養(yǎng)基，使混合物在37℃靜置10分鐘。此后，于1,200rpm離心混合物5分鐘，并在含血清的F12培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)24小時。此后，用含G418(1mg/ml)和潮霉素B(0.6mg/ml)的f12培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液分至3個24孔培養(yǎng)板中，接著培養(yǎng)3-4周。
由抗性克隆中提取基因組，以和實(shí)施例6相同的方式使用檢測VH3和Igλ的引物進(jìn)行PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個克隆(D15、ΔC30)為PCR陽性。此外，以和實(shí)施例6相同的方式，使用人染色體14特異性探針和人染色體22特異性探針，通過雙染色對這兩個克隆進(jìn)行FISH分析，以驗證ΔHAC的存在。關(guān)于DT40和CHO之間的細(xì)胞融合，DT40的大部分染色體丟失，核型和野生型CHO細(xì)胞大致相同。這使通過DT40細(xì)胞和CHO細(xì)胞之間的細(xì)胞融合生產(chǎn)保有ΔHAC的CHO細(xì)胞最終成為可能。這表明，對于DT40克隆微細(xì)胞形成能力低的情況，細(xì)胞融合作為一種替代性方法可能有效。
將ΔΔHAC由含ΔΔHAC的DT-40雜種細(xì)胞導(dǎo)入CHO細(xì)胞含ΔΔHAC的DT-40雜種克隆ΔΔH5、6的微細(xì)胞形成能力并非不足，因此如Kuroiwa等(如上所述)報導(dǎo)使用微細(xì)胞法。
用8個T225搖瓶(Sumiron)分別培養(yǎng)DT-40雜種克隆ΔΔH5、6，當(dāng)搖瓶內(nèi)容物鋪滿時，用含加入其中的20％FBS、1％小雞血清、10-4M2-巰基乙醇和0.05μg/ml秋水仙酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)細(xì)胞24小時，以形成微細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在24ml血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，以每份2ml的量分至12個預(yù)先用100μg/ml L-細(xì)胞溶素包被的25cm2搖瓶中進(jìn)行離心(Corning)，并于37℃培養(yǎng)1小時。然后使細(xì)胞粘附在搖瓶底部。取出培養(yǎng)液，將于37℃預(yù)加熱的松胞菌素B(10μg/ml，Sigma)溶液注入搖瓶進(jìn)行離心，以34℃、8000rpm離心1小時。將微細(xì)胞懸浮在無血清DMEM培養(yǎng)基中，通過8μm、5μm和3μm濾膜進(jìn)行純化。純化后，以1,700rpm離心微細(xì)胞10分鐘，并將其懸浮在5ml無血清DMEM培養(yǎng)基中。分別通過胰蛋白酶處理對約107CHO細(xì)胞揭皮，用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗兩次，并懸浮在5ml無血清DMEM培養(yǎng)基中。再以1,700rpm離心微細(xì)胞10分鐘，將5ml以上的CHO懸浮液輕輕放于其上，不用取出上清液。離心后，取出培養(yǎng)液，加入0.5ml PEG 1500溶液(Boehringer)，并使用吸液管劇烈攪拌混合物2分鐘。此后，在約3分鐘內(nèi)緩慢加入10ml無血清DMEM培養(yǎng)基，使混合物在37℃靜置10分鐘。離心后，將細(xì)胞懸浮在含10％FBS(Gibco)的F12培養(yǎng)基中，將其分至5-6個24孔培養(yǎng)板中，接著于37℃培養(yǎng)24小時。此后，用含800μg/mlG418的F12培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，并進(jìn)行3-4周的選擇性培養(yǎng)。
由G418抗性克隆提取基因組DNA，在與上述相同的條件下，使用檢測Igλ和VH3的引物和PGK-2及GFP-2引物進(jìn)行PCR，以鑒定保持ΔΔHAC的CHO克隆(例如ΔΔC10、13)。此外，使用人染色體14特異性探針和人染色體22特異性探針，對通過PCR發(fā)現(xiàn)陽性的克隆進(jìn)行FISH分析，以目測驗證ΔΔHAC的存在。根據(jù)這些結(jié)果推斷，獲得了保持ΔΔHAC的CHO細(xì)胞克隆。
將ΔHAC或ΔΔHAC由CHO細(xì)胞導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞為了生產(chǎn)具有ΔHAC或ΔΔHAC的嵌合體小鼠，通過微細(xì)胞法將ΔHAC或ΔΔHAC由實(shí)施例8或9獲得的保有ΔHAC或ΔΔHAC的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞(野生型TT2F)。
按照Tomizuka等(Nature Genet.16133，1997)的方法，由保有約108ΔHAC或ΔΔHAC的CHO細(xì)胞(D15、ΔΔC10、ΔΔC13等)純化微細(xì)胞，并懸浮在5ml DMEM中。通過胰蛋白酶處理使約107小鼠ES細(xì)胞TT2F揭皮，用DMEM清洗三次，并懸浮在5ml DMEM中，將其加入到離心的微細(xì)胞中，以1,250rpm離心10分鐘。然后徹底去除上清液。通過輕敲使沉淀徹底松軟，加入0.5ml 1∶1.4PEG溶液[5g PEG 1000(Wako Pure Chemicals Industries Ltd.)和1ml DMSO(Sigma)的6ml DMEM溶液]，將混合物徹底攪拌約1.5分鐘。此后，緩慢加入10ml DMEM，將混合物于1,250rpm離心10分鐘，并懸浮在30ml ES培養(yǎng)基中，將其分至預(yù)先裝有飼養(yǎng)細(xì)胞的3個培養(yǎng)皿(Corning，直徑100mm)中，然后進(jìn)行培養(yǎng)。24小時后用含300μg/mlG418的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，并進(jìn)行約1周的選擇性培養(yǎng)。
結(jié)果，使用檢測Igλ和VH3的引物通過PCR從D15克隆(保有ΔHAC)中發(fā)現(xiàn)14個陽性克隆，從ΔΔC10(保有ΔΔHAC)中發(fā)現(xiàn)8個陽性克隆，從ΔΔC13(保有ΔΔHAC)中發(fā)現(xiàn)8個陽性克隆。此外，由使用人COT1 DNA探針(Tomizuka等，Nature Genet.16133，1997)的FISH分析結(jié)果證實(shí)，存在可用COT1探針特異性檢測的ΔHAC和ΔΔHAC。
根據(jù)以上結(jié)果推斷，由保有ΔHAC的TT2F細(xì)胞中獲得14個克隆，而從保有ΔΔHAC的TT2F細(xì)胞中獲得16個克隆。
生產(chǎn)具有人類人工染色體ΔHAC和ΔΔHAC的嵌合體小鼠按照Tomizuka等(Nature Genet.，16133，1997)的方法，使用實(shí)施例10獲得的ES細(xì)胞克隆生產(chǎn)嵌合體小鼠。使用MCH(ICR)(白色，購自CLEA Japan，Inc.)或通過抗體重鏈剔除小鼠雌雄雜交獲得的8細(xì)胞期胚胎(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)作為宿主。根據(jù)其毛色可確定通過將注射胚胎移植入代孕母親獲得的后代小鼠是否為嵌合體。將野生型TT2F/ΔHAC克隆(實(shí)施例10獲得的TΔ#6)注射入400個胚胎中，并將注射胚胎移植入代孕母親。結(jié)果生育了7只嵌合體小鼠(按毛色的咖啡色部分識別)。更具體地說，其顯示了保有人類人工染色體ΔHAC的ES細(xì)胞株(TT2F)具有形成嵌合體的能力，即具有分化為小鼠個體正常組織的能力。
以和上述相同的方式，將實(shí)施例10獲得的野生型TT2F/ΔΔHAC克隆(TΔΔ#21)注射入180個胚胎中，并將注射胚胎移植入代孕母親。結(jié)果生育了2只嵌合體小鼠(按毛色的咖啡色部分識別)。其中一只為嵌合程度約100％的個體，即基本觀察不到白色部分。更具體地說，其顯示了保有人類人工染色體ΔΔHAC的ES細(xì)胞株(TT2F)具有形成嵌合體的能力，即具有分化為小鼠個體正常組織的能力。
在由保有人類人工染色體ΔHAC和ΔΔHAC的ES細(xì)胞生產(chǎn)的嵌合體小鼠體細(xì)胞中保持人工染色體通過Tomizuka等(Nature Genet.，16133，1997)報導(dǎo)的方法由TT2F/ΔHAC克隆(TΔ#6)(嵌合程度約85％)在實(shí)施例11生產(chǎn)的嵌合體小鼠，由其尾部制備基因組DNA，并以和上述相同的方式，使用檢測Igλ和VH3的引物進(jìn)行PCR，以檢查ΔHAC的保持情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對兩種引物都呈陽性，證實(shí)嵌合體小鼠體細(xì)胞保持ΔHAC。收集嵌合體小鼠(嵌合程度約85％)和另一只由TΔ#6生產(chǎn)的嵌合體小鼠(嵌合程度約90％)的血清，通過ELISA檢測人μ鏈和人λ鏈蛋白的表達(dá)(Tomizuka等，Nature Genet.，16133，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)。結(jié)果兩只嵌合體小鼠的人μ鏈和λ鏈都是陽性。
同樣，發(fā)現(xiàn)得自由保有ΔΔHAC的ES細(xì)胞克隆(TΔΔ#21)生產(chǎn)的嵌合體小鼠(嵌合程度約100％，實(shí)施例11)尾部的DNA對以上兩種引物都呈陽性，證實(shí)保持ΔΔHAC。此外，和以上類似的ELISA分析表明，具有ΔΔHAC的嵌合體小鼠血清中人μ鏈和λ鏈都為陽性。
得自保有λHAC的ES細(xì)胞的具有λHAC的嵌合體小鼠的嵌合程度最大約為80％，但是，由ΔHAC獲得嵌合程度約85％和90％的嵌合體小鼠，由ΔΔHAC獲得嵌合程度約100％的嵌合體小鼠。使用高嵌合程度小鼠可導(dǎo)致保有導(dǎo)入染色體的ES細(xì)胞高效分化為生殖細(xì)胞并遺傳傳遞導(dǎo)入的染色體。即預(yù)期使用ΔHAC和ΔΔHAC可增強(qiáng)小鼠中含抗體免疫球蛋白λ鏈基因的人染色體22片段的遺傳傳遞效率。
由具有人類人工染色體ΔHAC和ΔΔHAC的嵌合體小鼠遺傳傳遞人工染色體使實(shí)施例11由TT2F/ΔHAC克隆(TΔ#6)生產(chǎn)的嵌合體雌性小鼠(嵌合程度約85％)與雄性小鼠MCH(ICR)(白色，購自CLEA Japan，Inc.)雜交。在由所述嵌合體小鼠生育的10只后代小鼠中，4只毛色為咖啡色，表明保持了來自ES細(xì)胞的顯性基因型。即發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞株和保有ΔHAC的TΔ#6在嵌合體雌性小鼠中分化為功能性卵細(xì)胞。將4只咖啡色后代小鼠的尾部切除一部分，由樣品制備基因組DNA。以和上述相同的方式使用檢測Igλ和VH3的引物對獲得的DNA進(jìn)行PCR。由對ΔHAC保持的檢查結(jié)果可知，發(fā)現(xiàn)全部4只小鼠對兩種引物都呈陽性，證實(shí)嵌合體小鼠后代保持ΔHAC。此外，收集4只小鼠中3只的血清，通過ELISA檢測人μ鏈和人λ鏈的表達(dá)情況(Tomizuka等，Nature Genet.，16133，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所檢測的全部3只小鼠人μ鏈和λ鏈都呈陽性。以相同方式表明實(shí)施例11的克隆TT2F/ΔΔHAC生產(chǎn)的嵌合體小鼠遺傳傳遞ΔΔHAC。
在分別具有并遺傳傳遞ΔHAC或ΔΔHAC的小鼠品系中，通過對尾部制備的成纖維細(xì)胞進(jìn)行ELISA分析等檢測每種HAC的穩(wěn)定保持情況。結(jié)果顯示所述小鼠品系體細(xì)胞穩(wěn)定保持每種HAC。
在具有并遺傳傳遞ΔHAC或ΔΔHAC的小鼠品系中，通過ELISA等證實(shí)由人Igλ鏈/重鏈組成的全人抗體分子的表達(dá)情況。此外，使分別具有并遺傳傳遞ΔHAC或ΔΔHAC的小鼠品系與缺失內(nèi)源抗體重鏈和輕鏈κ基因的小鼠品系反復(fù)雜交，由此獲得具有每種HAC并根據(jù)內(nèi)源抗體重鏈和κ鏈基因缺失為同源的小鼠品系。這些小鼠品系主要生產(chǎn)含人Ig重鏈和λ鏈的全人抗體。
構(gòu)建同時表達(dá)人免疫球蛋白重鏈、輕鏈λ和輕鏈κ的小鼠品系通過以下品系(A)和品系(B)之間的雜交可生產(chǎn)一種小鼠品系，其同時生產(chǎn)人Ig重鏈、κ輕鏈和λ輕鏈，并生產(chǎn)主要由含人Ig重鏈和κ輕鏈或λ輕鏈的分子組成的抗體。
(A)TC(ΔHAC)，一種具有并遺傳傳遞ΔHAC的小鼠品系，或TC(ΔΔHAC)，一種具有并遺傳傳遞ΔΔHAC的小鼠品系(參見實(shí)施例13)。
(B)TC(W23)/ΔH/Δκ，一種內(nèi)源抗體重鏈和κ鏈基因缺失的純合子小鼠品系，其攜帶并遺傳傳遞染色體2的W23片段(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)。
通過實(shí)施例13描述的方法和Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的報導(dǎo)分析品系(A)和品系(B)之間雜交獲得的后代小鼠。該雜交獲得的全部后代小鼠都是內(nèi)源抗體重鏈缺失和κ鏈缺失的雜合子，由其中選擇具有ΔHAC(或ΔΔHAC)的個體和具有W23片段的個體，使其與其它所獲后代雜交。最后選擇為內(nèi)源抗體重鏈缺失和κ鏈缺失的純合子并同時具有ΔHAC(或ΔΔHAC)和片段W23的個體(品系(D))。
通過Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的報導(dǎo)和(WO 98/37757)描述的方法證實(shí)品系(D)表達(dá)人免疫球蛋白重鏈、κ鏈和λ鏈。
構(gòu)建具有ΔHAC并且內(nèi)源Ig重鏈和κ輕鏈基因等位基因同時破壞的小鼠品系使實(shí)施例13生產(chǎn)的TC(ΔHAC)與Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的報導(dǎo)所描述的內(nèi)源Ig重鏈和κ輕鏈剔除小鼠品系回交。通過PCR和ELISA分析所獲得的小鼠個體的基因型(參見實(shí)施例12和Tomizuka等的報告)。
結(jié)果，獲得具有ΔHAC、為內(nèi)源Ig重鏈剔除純合子和內(nèi)源Igκ鏈剔除純合子的個體(后文稱之為“TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ”)。
在兩只TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ個體(8周齡)的血清中，通過Tomizuka等(Nature Biotechnol.，181086-，2000)的報告所描述的ELISA分析人Ig重鏈和λ鏈蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果，每只小鼠的表達(dá)水平如下人Igμ鏈430μg/ml、Igγ鏈180μg/ml、Igλ鏈330μg/ml；以及人Igμ鏈720μg/ml、Igγ鏈320μg/ml、Igλ鏈520μg/ml。
構(gòu)建具有含ΔHAC和人Igκ鏈基因的人染色體2片段并且內(nèi)源Ig重鏈和κ鏈基因的等位基因同時破壞的小鼠品系通過使具有含人Igκ鏈基因的人染色體2片段(hCF(W23))以及Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的報告所描述的內(nèi)源Ig重鏈和κ鏈剔除小鼠的遺傳背景的小鼠品系(后文稱之為“TC(W23)/ΔH/Δκ”)和實(shí)施例15生產(chǎn)的TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ品系雜交獲得小鼠個體，以和實(shí)施例15相同的方式分析其基因型。
結(jié)果，獲得的個體同時具有ΔHAC和hCF(W23)，并且是內(nèi)源Ig重鏈剔除的純合子和內(nèi)源Igκ鏈剔除的純合子(后文稱之為“TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ”)。
此外，可如Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的報告和Kuroiwa等(Nature Biotechnol.，181086-，2000)的報告所述，通過ELSIA分析TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ個體的血清。由此分別檢測人Igμ鏈、γ鏈、λ鏈和κ鏈蛋白的表達(dá)情況。
構(gòu)建具有含ΔHAC和人Igκ鏈基因的酵母人工染色體并且內(nèi)源Ig重鏈和κ鏈基因的等位基因同時破壞的小鼠品系通過使具有含人Igκ鏈基因(KCo5含大約40％的人κ輕鏈基因可變區(qū))的轉(zhuǎn)基因以及Fishwild等(Nature Biotechnol.，14845-851，1996)的報告所描述的內(nèi)源Ig重鏈和κ鏈剔除小鼠的遺傳背景的小鼠品系[得自Medarex，U.S.A.，后文稱之為“Kco5/ΔH/Δκ”]和實(shí)施例15生產(chǎn)的TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ品系雜交獲得小鼠個體，以和實(shí)施例15相同的方式通過PCR和ELISA分析其基因型。
結(jié)果，獲得的個體同時具有ΔHAC和KCo5，并且是內(nèi)源Ig重鏈剔除的純合子和內(nèi)源Igκ鏈剔除的純合子(后文稱之為“TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ”)。
保有酵母人工染色體或由轉(zhuǎn)基因KCo5組成的質(zhì)粒的微生物保藏于ATCC(U.S.A.)。保藏號如下。保有酵母人工染色體y17的酵母ATCC PTA-3842號，保有質(zhì)粒pKV4的大腸桿菌ATCC PTA-3843號，保有質(zhì)粒pKCIB的大腸桿菌ATCC PTA-3844號。
以和實(shí)施例16相同的方式，通過ELISA分析TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ個體的血清，由此檢測人Igμ鏈、γ鏈、λ鏈和κ鏈蛋白。所測定的3只個體的γ鏈平均值高于μ鏈平均值。
以小鼠品系TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ生產(chǎn)抗G-CSF抗體用人G-CSF免疫接種實(shí)施例15生產(chǎn)的2只TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ小鼠個體。使用TiterMaxGold(CytRx)作為佐劑。首先，用總共37.5μg人G-CSF在三個不同部位皮下免疫接種。然后，分別在首次免疫接種后第14天和38天，同首次免疫接種一樣，以總共10μg在三個不同部位皮下進(jìn)行第2次和第3次免疫接種。首次免疫接種后第48天，通過靜脈注射10μg沒有任何佐劑的G-CSF進(jìn)行最后一次免疫接種。在最后一次免疫接種后3天進(jìn)行抽血，并如Kuroiwa等(NatureBiotechnol.，181086-，2000)的報告所述，通過ELSIA檢測血清中抗G-CSF人Ig G抗體和人Igλ抗體的效價。結(jié)果，在2只個體中都觀察到抗人G-CSF人Ig G抗體和人Igλ抗體效價高。
此外，通過ELISA篩選經(jīng)融合免疫個體小鼠的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞所獲得的雜交瘤(Ando，Chiba，“Tan-kurohn Koutai JikkenSousa Nyuumon(單克隆抗體實(shí)驗和操作指引)，”Kodansha Scientific，1991)，可獲得生產(chǎn)含人Ig重鏈和輕鏈λ的全人單克隆抗體的雜交瘤。
以小鼠品系TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ生產(chǎn)抗G-CSF抗體以和實(shí)施例18相同的方式，用人G-CSF免疫接種實(shí)施例16生產(chǎn)的TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ小鼠個體。通過ELISA檢測該小鼠血清中抗G-CSF人IgG抗體、人Igλ抗體和人Igκ抗體的效價，以證實(shí)抗人G-CSF人IgG抗體、人Igλ抗體和人Igκ抗體效價升高。
以和實(shí)施例18相同的方式，通過融合免疫個體小鼠的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞，可進(jìn)一步獲得生產(chǎn)含人Ig重鏈和λ輕鏈或κ輕鏈的全人單克隆抗體的雜交瘤。
以小鼠品系TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ生產(chǎn)抗G-CSF抗體以和實(shí)施例18相同的方式，用人G-CSF免疫接種實(shí)施例17生產(chǎn)的TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ小鼠個體，通過ELISA檢測血清中抗G-CSF人Ig G抗體、人Igλ抗體和人Igκ抗體的效價。結(jié)果證實(shí)抗人G-CSF人IgG抗體、人Igλ抗體和人Igκ抗體的效價升高。
以和實(shí)施例18相同的方式，通過融合免疫個體小鼠的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞，進(jìn)一步獲得生產(chǎn)含人Ig重鏈和λ輕鏈或κ輕鏈的全人單克隆抗體的雜交瘤。
本文引用的所有公開出版物、專利和專利申請都在此整體引作參考。
工業(yè)適用性本發(fā)明提供一種人類人工染色體，其保有人抗體重鏈和λ輕鏈基因的全部區(qū)域，并可高效遺傳傳遞至下一代。本發(fā)明還提供高效遺傳傳遞所述人類人工染色體至下一代的非人動物及其后代。此外，本發(fā)明還能夠生產(chǎn)人抗體。
序列表獨(dú)立文本SEQ ID NO1；人工序列描述引物SEQ ID NO2；人工序列描述引物SEQ ID NO3；人工序列描述引物SEQ ID NO4；人工序列描述引物SEQ ID NO5；人工序列描述引物SEQ ID NO6；人工序列描述引物SEQ ID NO7；人工序列描述引物SEQ ID NO8；人工序列描述引物SEQ ID NO9；人工序列描述引物SEQ ID NO10；人工序列描述引物SEQ ID NO11；人工序列描述引物SEQ ID NO12；人工序列描述引物SEQ ID NO13；人工序列描述引物SEQ ID NO14；人工序列描述引物SEQ ID NO15；人工序列描述引物SEQ ID NO16；人工序列描述引物說明書的核苷酸和氨基酸序列表<110>Kirin Beer Kabushiki Kaisha<120>含人抗體(輕鏈基因的人類人工染色體和保有可傳遞給后代的人類人工染色體的非人動物<130>PH-1574-PCT<150>JP 2001-142371<151>2001年5月11日<160>16<170>PatentIn版本2.0<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>1tcgaggatcc gacaagttct cttctctttt ccttctgccc40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2tcgaggatcc gctgctaagc tactgttctc ttttttcccc40<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3tcgagtcgac tgtagctgac tttagccacc cacaagtac 39<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4tcgagtcgac cttgctgatt atacctcatc tccttccctc40<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5gctaaggcac ttcggttctc tttgtgttc29<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6ggttgtcttt aaaagcaggg ataaggatg29<210>7<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7agaagaaagg agtgggtgct aaacattcag 30<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8ggttagatgg caccaaatga aaggagaag29<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9agtgagataa gcagtggatg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10gttgtgctac tcccatcact 20<210>11<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11gagagttgca gaaggggtga ct 22<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12ggagaccacc aaaccctcca aa 22<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13atagcagctt tgctccttcg 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14ttctctcctg cacatagccc 20<210>15
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>15tgttctcctc ttcctactct cc 22<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>16tgaaggtagt gaccagtgtt gg 2權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)人抗體的小鼠，其具有(a)未重排的人抗體重鏈基因座；(b)未重排的人抗體κ輕鏈基因座和(c)未重排的人抗體λ輕鏈基因座，其中(a)、(b)和(c)中的至少一種保持在人源染色體片段上，(a)、(b)和(c)中的至少一種插入小鼠染色體中，而且其中至少內(nèi)源重鏈的兩種等位基因和內(nèi)源κ輕鏈的兩種等位基因失活，并且所述小鼠在其血清中表達(dá)人抗體重鏈、人抗體κ輕鏈和人抗體λ輕鏈。
2.權(quán)利要求1的生產(chǎn)人抗體的小鼠，其中所述小鼠具有保持在人源染色體片段上的未重排人抗體重鏈基因座、插入小鼠染色體中的未重排人抗體κ輕鏈基因座和人源染色體片段上的人抗體λ輕鏈基因座。
3.權(quán)利要求1的生產(chǎn)人抗體的小鼠，其中所述人抗體重鏈基因座保持在人源染色體片段上。
4.權(quán)利要求3的生產(chǎn)人抗體的小鼠，其中所述人抗體重鏈基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC上。
5.權(quán)利要求1的生產(chǎn)人抗體的小鼠，其中所述人抗體λ輕鏈基因座保持在人源染色體片段上。
6.權(quán)利要求5的生產(chǎn)人抗體的小鼠，其中所述人抗體λ輕鏈基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC上。
7.權(quán)利要求1的生產(chǎn)人抗體的小鼠，其中所述人抗體κ輕鏈基因座插入到小鼠染色體中。
8.權(quán)利要求7的生產(chǎn)人抗體的小鼠，其中所述人抗體κ轉(zhuǎn)基因KCo5插入到小鼠染色體中。
9.權(quán)利要求1的生產(chǎn)人抗體的小鼠，其中所述人抗體重鏈基因座和λ輕鏈基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC上，而人抗體κ轉(zhuǎn)基因KCo5插入到小鼠染色體中。
10.權(quán)利要求1的生產(chǎn)人抗體的小鼠，其中所述小鼠不是嵌合體小鼠。
11.一種生產(chǎn)抗體的方法，該方法包括免疫接種權(quán)利要求1-10任一項的小鼠，并由所述小鼠獲得多克隆抗體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述多克隆抗體得自所述小鼠的血液。
13.一種生產(chǎn)抗體的方法，該方法包括用目標(biāo)抗原免疫接種權(quán)利要求1-10任一項的小鼠；通過融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞和所述小鼠來源的脾細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤；以及生產(chǎn)包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈的抗所述抗原的單克隆抗體。
14.一種生產(chǎn)抗體的方法，該方法包括用目標(biāo)抗原免疫接種權(quán)利要求1-10任一項的小鼠；通過融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞和所述小鼠來源的脾細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤；由所獲得的雜交瘤分離至少人抗體基因可變區(qū)；將所述人抗體基因?qū)雱游锛?xì)胞、酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞；在能夠表達(dá)所述人抗體基因的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及生產(chǎn)至少包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)的抗所述抗原的單克隆抗體。
15.一種生產(chǎn)抗體的方法，該方法包括用目標(biāo)抗原免疫接種權(quán)利要求1-10任一項的小鼠；通過噬菌體展示方法至少選擇所述小鼠B細(xì)胞的人抗體基因可變區(qū)；將所述選定的人抗體基因?qū)雱游锛?xì)胞、酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞；在能夠表達(dá)所述人抗體基因的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及生產(chǎn)至少包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗所述抗原的單克隆抗體。
全文摘要
一種可高效轉(zhuǎn)移至后代(下一代)的人類人工染色體及其使用方法。即這樣一種人類人工染色體其中含人第22號染色體來源的抗體λ輕鏈基因的約3.5Mb至約1Mb區(qū)域連接至另一個人類染色體來源的染色體片段，其可通過非人動物生殖系統(tǒng)傳遞至后代；具有該人工人類染色體的的非人動物及其后代；構(gòu)建所述非人動物的方法；使用所述非人動物或其后代構(gòu)建人抗體的方法；以及具有上述人類人工染色體的生產(chǎn)人抗體的小鼠。
文檔編號C07K16/00GK1789416SQ20051011376
公開日2006年6月21日 申請日期2002年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月11日
發(fā)明者黑巖義巳, 富塚一磨, 吉田均, 石田功 申請人:麒麟麥酒株式會社, 米德列斯公司