專利名稱：包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及包含氨基氧基的分子，它們能夠以共價(jià)方式與其他分子結(jié)合。確切地說，本申請涉及包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子，一個(gè)或多個(gè)分子、例如生物活性分子可以與之結(jié)合形成軛合物。
背景技術(shù)：
“化合價(jià)平臺”是具有一個(gè)或多個(gè)(通常為多個(gè))結(jié)合位點(diǎn)的分子，可以用來以共價(jià)方式與有關(guān)生物活性分子結(jié)合形成共用的腳手架。與生物活性分子結(jié)合形成共用腳手架提供了多價(jià)軛合物，其中有多個(gè)生物活性分子拷貝以共價(jià)方式連接于相同的平臺?！跋薅ǖ摹被颉盎瘜W(xué)限定的”化合價(jià)平臺是具有限定結(jié)構(gòu)的平臺，因而具有限定數(shù)量的結(jié)合點(diǎn)和限定的化合價(jià)。限定的化合價(jià)平臺軛合物是具有限定結(jié)構(gòu)并且具有限定數(shù)量的所結(jié)合的生物活性化合物的軛合物。生物活性分子的實(shí)例包括寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、藥物等。例如，生物活性化合物可以特異性地與蛋白質(zhì)受體發(fā)生相互作用。
某些種類的化學(xué)限定的化合價(jià)平臺、它們的制備方法、包含它們的軛合物和這些軛合物的制備方法已經(jīng)描述在美國專利Nos.5,162,515；5,391,785；5,276,013；5,786,512；5,726,329；5,268,454；5,552,391；5,606,047和5,663,395中。包含氨基甲酸酯鍵的化合價(jià)平臺分子描述在1999年12月8日提交的美國臨時(shí)專利申請No.60/111,641和09/457,607中。
發(fā)明的公開本申請?zhí)峁┝税被趸姆肿蛹捌渑c其他分子、例如生物活性分子的軛合物和它們的合成方法。氨基氧基提供了用于與其他分子共價(jià)結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。
在一種實(shí)施方式中，提供了包含氨基氧基的聚氧化乙烯分子、或者更確切為聚乙二醇分子，它們能夠與包括多(氨基酸)在內(nèi)的多種生物活性分子共軛化合。在另一種實(shí)施方式中，提供了包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子。氨基氧基可以用來與生物分子、例如多(氨基酸)形成共價(jià)鍵。氨基氧基例如可以與經(jīng)過修飾含有羰基、例如乙醛酸化多(氨基酸)反應(yīng)，生成化合價(jià)平臺分子與生物活性分子經(jīng)由肟鍵結(jié)合的軛合物。包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子在軛合物形成中有利地是反應(yīng)性的，它們還可以是易于合成的，形成多分散性非常低的組合物。
包含氨基氧基、優(yōu)選為3個(gè)或以上氨基氧基的分子、例如包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子可以以共價(jià)方式連接一個(gè)或多個(gè)、例如3個(gè)或以上生物活性分子，例如包括寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope或藥物。
在一種實(shí)施方式中，提供了包含氨基氧基的分子，其中該分子包含氧化烯基，例如氧乙烯基或聚氧乙烯基。該分子例如可以包含至少3個(gè)氨基氧基，或者4、5個(gè)或以上氨基氧基。
本文所用的“氧乙烯、氧丙烯和氧化烯”與“氧化乙烯、氧化丙烯和烯化氧”是可互換使用的。
在另一種實(shí)施方式中，提供了包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，化合價(jià)平臺分子包含至少3個(gè)氨基氧基?；蟽r(jià)平臺分子可以進(jìn)一步包含氧化烯基，例如氧乙烯基或聚氧乙烯基，例如-(CH2CH2O)n-，其中n是200至500。
還提供了組合物，它包含一種分子、例如化合價(jià)平臺分子、例如本文所公開的那些，包含氨基氧基，并且多分散性小于1.2、例如小于1.1或者小于1.07。
在一種實(shí)施方式中，提供了具有下式結(jié)構(gòu)的化合價(jià)平臺分子R-(ONH2)m式1
其中在一種實(shí)施方式中m是1-50或以上，例如3-50；R是有機(jī)部分，包含1-1000或10000個(gè)原子或以上，選自由H、C、N、O、P、Si和S原子組成的組。
在另一種實(shí)施方式中，提供了具有下式結(jié)構(gòu)的化合價(jià)平臺分子Rc[G1(ONH2)n]y式2其中在一種實(shí)施方式中y是1至16；n是1至32；其中在一種實(shí)施方式中，y*n(y乘以n)的結(jié)果至少是3；Rc和每個(gè)G1獨(dú)立地是有機(jī)部分。
在一種實(shí)施方式中，Rc和每個(gè)G1獨(dú)立地是有機(jī)部分，包含選自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子，并且可選地包含氧化烯基。在多分散性小于1.2的組合物中可以提供這些分子。
在另一種實(shí)施方式中，提供了具有下式結(jié)構(gòu)的化合價(jià)平臺分子，選自下組Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y式3；Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y式4；Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y式5；Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y式6；Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y式7；和Rc[S-G2(ONH2)n]y式8；
其中，例如y是1至16；n是1至32；其中在一種實(shí)施方式中，y*n(y乘以n)的結(jié)果至少是3；R1是H、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基或G2-(ONH2)n；Rc和每個(gè)G2獨(dú)立地是有機(jī)部分，包含選自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子。
在一種實(shí)施方式中，Rc和每個(gè)G2獨(dú)立地選自下組烴基，僅由H和C原子組成，并且具有1至200個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧和氫原子組成，并且具有1至200個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧、氮和氫原子組成，并且具有1至200個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧、硫和氫原子組成，并且具有1至200個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧、硫、氮和氫原子組成，并且具有1至200個(gè)碳原子。
在化合價(jià)平臺分子的一種實(shí)施方式中，Rc選自由C1-200烴部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基團(tuán)的C1-200烴部分組成的組。
Rc可選地可以包含氧化烯部分，例如氧乙烯部分(-CH2CH2O-)。在一種實(shí)施方式中，Rc包含氧乙烯單元-(CH2CH2O)n-；其中n是1-500，例如200-500、1-200、1-100或1-20。
在一種實(shí)施方式中，每個(gè)G2獨(dú)立地包含官能團(tuán)，選自由烷基、雜烷基、芳基和雜芳基組成的組。
在另一種實(shí)施方式中，每個(gè)G2獨(dú)立地包含官能團(tuán)，選自由C1-200烴部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基團(tuán)的C1-200烴部分組成的組。
每個(gè)G2獨(dú)立地可以包含氧化烯部分，例如氧乙烯部分(-CH2CH2O-)。
在一種實(shí)施方式中，每個(gè)G2獨(dú)立地包含氧乙烯單元-(CH2CH2O)n-；其中n是1-500，例如1-200、200-500、1-100或1-20。
在化合價(jià)平臺分子的一種實(shí)施方式中，每個(gè)G2獨(dú)立地包含選自下組的官能團(tuán)胺；酰胺；酯；醚；酮；醛；氨基甲酸酯；硫醚；哌嗪基；哌啶基；醇；聚胺；聚醚；酰肼；肼；羧酸；酸酐；鹵素；磺?；?；磺酸酯；砜；氰酸酯；異氰酸酯；異硫氰酸酯；甲酸酯；碳二亞胺；硫醇；肟；亞胺；氨基氧基；和馬來酰亞胺。
在一種實(shí)施方式中，在化合價(jià)平臺分子中，每個(gè)G2-ONH2獨(dú)立地選自

圖17所示部分。
在另一種實(shí)施方式中，化合價(jià)平臺分子是用連接劑合成的，該連接劑在一個(gè)末端包含氨基氧基或被保護(hù)的氨基氧基。另一端可以包括胺，如化合物11與100、實(shí)施例3與17和圖3與25所述；碳酸酯，如化合物18與28和實(shí)施例4與6以及圖4與7所述；硫醇，如化合物22a與22b、實(shí)施例5a與5b和圖5與6所述；氨基氧基，如化合物37、實(shí)施例8和圖9所述；羧酸或活化衍生物，如化合物105與106、實(shí)施例16與20和圖24與28所述。
在另一種實(shí)施方式中，提供了圖19所示式9-13化合物。式9-13中，在一種實(shí)施方式中，Rc和G2是如上定義的，n是約1-500，例如200-500、1-200、1-100或1-50。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了具有下式結(jié)構(gòu)的化合價(jià)平臺分子 其中n是約503，或者例如大于約500、大于約600或大于約700或800或以上；
其中n是約112，或者例如大于約500、大于約600或大于約700或800或以上；或者 其中n是約481，或者例如大于約500、大于約600或大于約700或800或以上。
還提供了包含氨基氧基的分子與生物活性分子的軛合物，前者分子例如本文所公開的任意化合價(jià)平臺分子。生物活性分子例如可以包括多糖、多(氨基酸)、核酸、脂質(zhì)和藥物，和它們的組合。軛合物包括肟軛合物或其修飾形式，例如還原產(chǎn)物，例如氨基氧基，和烷基化形式。
還提供了制備包含氨基氧基的分子與生物活性分子的軛合物的方法，前者分子例如本文所公開的任意化合價(jià)平臺分子，其中該方法包括使包含氨基氧基的分子、例如化合價(jià)平臺分子上的氨基氧基與生物活性分子上的反應(yīng)性官能團(tuán)、例如醛基或酮基的羰基反應(yīng)，生成肟軛合物。在其中生物活性分子是多(氨基酸)的實(shí)施方式中，該方法可以進(jìn)一步包括在共軛之前修飾該多(氨基酸)，以包括末端醛基。
還提供了藥學(xué)上可接受的組合物，包含本文公開的軛合物和可選的藥學(xué)上可接受的載體。
附圖的簡要說明圖1顯示氨基轉(zhuǎn)移多肽的合成。
圖2顯示氨基氧基乙酰基化合價(jià)平臺分子的合成。
圖3顯示烷基氨基氧基化合價(jià)平臺分子的合成。
圖4顯示烷基氨基氧基化合價(jià)平臺分子合成的另一種實(shí)施方式。
圖5和6顯示包含硫醚團(tuán)能度的烷基氨基氧基化合價(jià)平臺分子的合成。
圖7顯示烷基氨基氧基化合價(jià)平臺分子合成的另一種實(shí)施方式。
圖8顯示烷基氨基氧基化合價(jià)平臺分子合成的另一種實(shí)施方式。
圖9顯示包含哌嗪部分和肟鍵的烷基氨基氧基化合價(jià)平臺分子的合成。
圖10顯示烷基氨基氧基化合價(jià)平臺分子的合成。
圖11顯示包含哌嗪部分的氨基氧基乙?；蟽r(jià)平臺分子與多肽的軛合物的合成。
圖12顯示烷基氨基氧基化合價(jià)平臺分子與多肽的軛合物的合成。
圖13是模型烷基氨基氧基化合物和模型氨基氧基乙?；衔锏能椇衔锷伤俾蕦Ρ葓D。
圖14顯示模型烷基氨基氧基化合物和模型氨基氧基乙?；衔锏暮铣珊退鼈兣c乙醛酸化多肽的反應(yīng)。
圖15顯示烷基氨基氧基化合價(jià)平臺分子與多(氨基酸)的軛合物合成的另一種實(shí)施方式。
圖16顯示利用含有氨基氧基連接劑的硫醇和鹵代乙?；脚_制備多肽的另一種方法。
圖17顯示化合價(jià)平臺分子上的示范性G2-ONH2。
圖18顯示包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子的一些示范性結(jié)構(gòu)式。
圖19顯示包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子結(jié)構(gòu)式的另一種實(shí)施方式。
圖20顯示包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子的實(shí)施方式。
圖21顯示包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子的其他實(shí)施方式。
圖22顯示包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子的另一些實(shí)施方式。
圖23顯示化合物85的合成圖。
圖24顯示化合物86的合成圖。
圖25顯示化合物91的合成圖。
圖26顯示化合物92的合成圖。
圖27顯示化合物113的合成圖。
圖28顯示包含不同分子量聚氧化乙烯基的多價(jià)平臺分子的合成圖。
圖29顯示包含聚氧化乙烯基和分支基團(tuán)的多價(jià)平臺分子的合成圖。
圖30顯示包含一個(gè)聚氧化乙烯基和一個(gè)分支基團(tuán)的一個(gè)多價(jià)平臺分子的合成圖。
圖31顯示包含聚乙二醇基的多價(jià)平臺分子的合成圖。
圖32顯示包含一個(gè)聚乙二醇基的一個(gè)多價(jià)分子的合成圖。
圖33顯示化合價(jià)平臺分子與生物活性分子的一些示范性軛合物的結(jié)構(gòu)。
圖34顯示包含聚氧化乙烯的八聚平臺的合成，其中n例如是112。
圖35顯示包含兩個(gè)聚氧化乙烯基的化合價(jià)平臺分子的合成，其中n例如是500或以上。
實(shí)施發(fā)明的方式提供了包含氨基氧基的分子。氨基氧基可以被提供在諸如聚合物等分子上，例如在末端位置，以提供結(jié)合位點(diǎn)，用于與其他分子、例如生物活性分子結(jié)合。例如，多種聚合物經(jīng)過修飾可以含有氨基氧基，例如聚環(huán)氧烷聚合物，包括聚(氧化乙烯)聚合物，確切為聚乙二醇。氨基氧基是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢杂脕砼c含有反應(yīng)性基團(tuán)、例如醛基或酮基的其他分子迅速反應(yīng)，生成與其他分子的共價(jià)軛合物，收率良好。氨基氧基在與醛或酮反應(yīng)生成C＝N鍵形式的穩(wěn)定軛合物中，提供優(yōu)于其他含氮官能團(tuán)的結(jié)果，例如胺、酰肼、卡巴肼和半卡巴肼。氨基氧基縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了產(chǎn)物收率。
經(jīng)過修飾可以包括氨基氧基的其他分子包括分支、線性、嵌段和星形聚合物與共聚物，例如包含聚氧化烯部分的那些，例如聚氧乙烯分子，確切為聚乙二醇。聚乙二醇的分子量優(yōu)選地小于約10000道爾頓。在一種實(shí)施方式中，可以使用多分散性低的聚合物。例如，聚氧丙烯和聚氧乙烯聚合物與共聚物、包括聚乙二醇經(jīng)過修飾可以包括氨基氧基，其中聚合物具有低的多分散性，例如小于1.5或小于1.2，或者可選地小于1.1或1.07。優(yōu)選地，聚合物包含至少3個(gè)氨基氧基，或者至少4、5、6、7、8個(gè)或以上。
非聚合分子經(jīng)過修飾也可以包括如本文公開的氨基氧基。例如，化學(xué)限定的非聚合化合價(jià)平臺分子經(jīng)過修飾可以包括氨基氧基，例如美國專利No.5,552,391所述的那些。
還提供了包含這些分子和軛合物的組合物，例如是藥學(xué)上可接受的形式，例如包含藥學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域所述用于不同給藥途徑、包括口服、靜脈內(nèi)和氣霧劑給藥的載體例如參見《Remington藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐》(“RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy”)，Mack Publishing Company，Pennsylvania，1995，其公開內(nèi)容引用在此作為參考文獻(xiàn)。載體例如可以包括水、糖、多糖、緩沖劑、賦形劑和生物可降解的聚合物，例如聚酯、聚酐、聚氨基酸和脂質(zhì)體。
藥學(xué)上可接受的組合物是適合于對個(gè)體給藥的組合物，例如對個(gè)體進(jìn)行全身或局部給藥，采取單位劑型、無菌的腸胃外溶液或懸液、無菌的非腸胃外溶液或口服溶液或懸液、水包油或油包水型乳劑等。
化合價(jià)平臺在一方面提供了包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子、其與諸如生物活性分子等分子的軛合物和這些平臺與軛合物的制備方法。
各種化合價(jià)平臺分子是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的是化學(xué)限定的化合價(jià)平臺分子。制備化合價(jià)平臺分子的方法例如描述在美國專利Nos.5,162,515；5,391,785；5,276,013；5,786,512；5,726,329；5,268,454；5,552,391；5,606,047；5,663,395和5,874,409以及U.S.Serial No.60/111,641和PCT US 97/10075。一般來說，這些平臺含有核心基團(tuán)或分支的核心基團(tuán)，它們終止于羥基、羧基、氨基、醛、酮或烷基鹵。這些基團(tuán)經(jīng)過進(jìn)一步修飾，可以得到所需的反應(yīng)性基團(tuán)，得到優(yōu)選包含至少三個(gè)氨基氧基的化合價(jià)平臺分子。
化合價(jià)平臺是從含有所需化合價(jià)的核心基團(tuán)制備的。鏈的化合價(jià)可以是一或二，這取決于鏈?zhǔn)侨绾谓K止的。分支的鏈的化合價(jià)可以是三或以上，這取決于分支或側(cè)鏈的數(shù)量。例如，三甘醇的化合價(jià)為二，乙醇的化合價(jià)為一，季戊四醇的化合價(jià)為四。它們是終止于羥基的鏈，經(jīng)過進(jìn)一步修飾可以提供所需的反應(yīng)性基團(tuán)。鏈也可以終止于其他基團(tuán)，例如胺、硫醇、烷基鹵、羧基、醛、酮或可被進(jìn)一步修飾的其他基團(tuán)。
這些鏈可以充當(dāng)核心基團(tuán)。通過用分支部分衍生末端官能度可以增加核心基團(tuán)的化合價(jià)。例如，通過將三甘醇轉(zhuǎn)化為雙-氯甲酸酯衍生物，化合價(jià)為二的三甘醇可以轉(zhuǎn)化為化合物為四的平臺。雙-氯甲酸酯與適當(dāng)取代的二亞乙基三胺衍生物反應(yīng)，得到四價(jià)平臺，如實(shí)施例6所述。類似地，三甘醇雙-氯甲酸酯與亞氨基二乙酸反應(yīng)，可以得到終止于羧基的四價(jià)平臺，如實(shí)施例7所示。
本領(lǐng)域已知用于制備化合價(jià)平臺分子的方法例如包括增長法或分段法。這樣的方法經(jīng)過適當(dāng)試劑的修飾，可以在所得分子上提供氨基氧基。例如，可以使反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)，例如鹵化物基團(tuán)、羥基、氨基、醛、酮或羧基，而與諸如連接劑等分子結(jié)合，后者包含可選被保護(hù)的氨基氧基。本文實(shí)施例證明了示范性方法。
使用化合價(jià)平臺分子的優(yōu)點(diǎn)包括易于合成，利用例如不同的烯氧基或二醇胺基能夠調(diào)節(jié)化合價(jià)平臺“臂”的長度與水溶性，通過選擇核心基團(tuán)能夠進(jìn)一步減弱化合價(jià)平臺的性質(zhì)。
在一方面，提供了基本上是單分散的化合價(jià)平臺分子。氨基氧基化合價(jià)平臺分子有利地具有較窄的分子量分布。氨基氧基化合價(jià)平臺分子樣本分子量分布寬度的量度是樣本的多分散性。多分散性用作聚合物樣本分子量均一性或非均一性的量度。多分散性是重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)的計(jì)算值。Mw/Mn值對完全單分散的聚合物來說是一致的。多分散性(Mw/Mn)是用本領(lǐng)域可得到的方法測量的，例如凝膠滲透色譜法。氨基氧基化合價(jià)平臺分子樣本的多分散性(Mw/Mn)優(yōu)選地小于2，更優(yōu)選地小于1.5，或者小于1.2、小于1.07、小于1.02，或者例如約1.05至約1.5或約1.05至1.2。典型的聚合物的多分散性一般是2-5，或者在有些情況下是20或以上。低多分散性化合價(jià)平臺分子的優(yōu)點(diǎn)包括提高了生物可相容性與生物利用度，因?yàn)檫@些分子基本上是大小均勻的，并且減少了由分子量差異大而引起的生物活性差異。低多分散性分子因而是藥物制劑的優(yōu)選，并且是易于分析的。進(jìn)而在樣本中存在化合價(jià)受控制的分子群。
在有些實(shí)施方式中，由于連續(xù)分支點(diǎn)的存在，化合價(jià)平臺分子可以被描述為“樹狀”。樹狀化合價(jià)平臺分子具有多個(gè)末端，通常為4個(gè)或以上末端，例如8個(gè)末端或16個(gè)末端。
在一種實(shí)施方式中，提供了化學(xué)限定的化合價(jià)平臺分子，它們包含氨基氧基，并且包含除氨基甲酸酯以外的官能團(tuán)。
請注意，本文公開的結(jié)構(gòu)式試圖涵蓋“對稱的”和“不對稱的”化合價(jià)平臺。在一種實(shí)施方式中，化合價(jià)平臺是對稱的。在另一種實(shí)施方式中，化合價(jià)平臺是不對稱的。
通式在一種實(shí)施方式中，提供了包含末端氨基氧基的化合價(jià)平臺分子，例如1至100個(gè)、例如1-50、2-16、4-16個(gè)、或者例如2、3、4、8、16、32個(gè)或以上氨基氧基。在一種實(shí)施方式中，提供了這樣的化合價(jià)平臺分子，它具有至少3或4個(gè)氨基氧基，并且可選地進(jìn)一步包含氧化烯基，例如氧乙烯基或其聚合物。
在一種實(shí)施方式中，提供了具有下式結(jié)構(gòu)的化合價(jià)平臺分子R-(ONH2)m式1其中m是1至100，例如1-50、1-16、2-16、4-16，或者例如2、4、8、16、32或以上，在一種實(shí)施方式中，至少是3，例如3-50；R是有機(jī)部分，例如包含1至10000個(gè)原子、1至1000個(gè)原子，或者例如1-100個(gè)原子，例如包括H、C、N、O、P、Si和S原子以及鹵原子。例如，R可以包括1至1000、或者例如1-100個(gè)C、H、N和O原子。
在另一種實(shí)施方式中，化合價(jià)平臺分子具有下式結(jié)構(gòu)Rc[G1(ONH2)n]y
式2其中y例如是1至100，例如1-50、1-32、1-16、2-16、4-16，或者例如1、2、3、4、8、16、32或以上；n例如是1至100，例如1-50、1-32、1-16、2-16、4-16，或者例如2、3、4、8、16、32或以上；其中在一種實(shí)施方式中，y*n(y乘以n)的結(jié)果至少是3；Rc和每個(gè)G1獨(dú)立地是有機(jī)部分，例如包含選自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子，例如小于1000個(gè)原子、1000至10000個(gè)或以上。
在一種實(shí)施方式中，Rc是如下定義的，G1同G2是如下所定義的。在一種實(shí)施方式中，式2分子包含氧化烯基。
在另一種實(shí)施方式中，提供了具有下式之一結(jié)構(gòu)的化合價(jià)平臺分子，也如圖18所示Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y式3；Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y式4；Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y式5；Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y式6；Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y式7；和Rc[S-G2(ONH2)n]y式8；其中，在一種實(shí)施方式中y是1至100，例如1-50、1-32、1-16、2-16、4-16，或者例如1、2、3、4、6、8、16、32、64或以上；n是1至100，例如1-50、1-32、1-16、2-16、4-16，或者例如2、3、4、6、8、16、32、64或以上；其中在一種實(shí)施方式中，y*n(y乘以n)的結(jié)果至少是3；R1如果存在的話，例如是H、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基或者可選地是如本文所定義的G2-(ONH2)n；Rc和每個(gè)G2獨(dú)立地是有機(jī)部分，例如包含選自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子，或者可選地包含鹵原子，例如1至10000個(gè)、1至1000個(gè)原子或1至100個(gè)原子。
R1因而可以在一種實(shí)施方式中是任意包括碳和氫的烷基部分，例如甲基、乙基或丙基或者其他包括直鏈、支鏈或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的烴，它們可以是飽和或不飽和的；或者可以是雜烷基，進(jìn)一步包含例如O、S或N原子；或者可以是芳基或雜芳基。
在一種實(shí)施方式中，Rc和每個(gè)G2獨(dú)立地包含例如直鏈、支鏈或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且獨(dú)立地選自下組烴基，僅由H和C原子組成，并且具有1至5000、1-500、1至200、1至100個(gè)、或者例如1至20個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧和氫原子組成，并且具有1-5000、1至500、1至200、1至100個(gè)、或者例如1至20個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧、氮和氫原子組成，并且具有1-5000、1至500、1至200、1至100個(gè)、或者例如1至20個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧、硫和氫原子組成，并且具有1至5000、1至500、1至200、1至100個(gè)、或者例如1至20個(gè)碳原子；或有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧、硫、氮和氫原子組成，并且具有1-5000、1至500、1至200、1至100個(gè)、或者例如1至20個(gè)碳原子。
式中Rc表示“核心基團(tuán)”，也就是構(gòu)成化合價(jià)平臺核心的有機(jī)基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)有機(jī)基團(tuán)與之結(jié)合。在一種實(shí)施方式中，核心基團(tuán)的化合價(jià)相當(dāng)于y。如果y是1，那么Rc是一價(jià)的；如果y是2，那么Rc是二價(jià)的；如果y是3，那么Rc是三價(jià)的；如果y是4，那么Rc是四價(jià)的，等等。
Rc例如可以是烷基、雜烷基、芳基、雜芳基，并且例如可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀的。
在一種實(shí)施方式中，Rc是烴基(即僅由碳和氫組成)，具有1-2000或1至200個(gè)碳原子，例如1至100個(gè)碳原子或1至50個(gè)碳原子。Rc例如可以是線性的或分支的，或者可以包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，Rc是環(huán)狀的。Rc可以是飽和的或者完全或部分不飽和的。Rc可以包含或者是芳族結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，Rc是芳族基團(tuán)，例如芐基，其化合價(jià)例如是1至6。Rc例如可以是-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-或C(CH2-)4。Rc進(jìn)一步例如可以是-(CH2)n-，其中n是1至20。
在一種實(shí)施方式中，Rc是這樣的有機(jī)基團(tuán)，它僅由碳、氧和氫原子組成，并且例如具有1至5000、1至500、1-200、1至50或1-20個(gè)碳原子，或者例如1至10個(gè)碳原子或1至6個(gè)碳原子。Rc可以是或者包含烷氧基。在一種實(shí)施方式中，Rc是或包含聚氧化烯基或者是從其衍生的，例如聚氧乙烯基或聚氧丙烯基。Rc可以是或者包含二價(jià)聚氧化烯基，例如二價(jià)聚氧乙烯基或聚氧丙烯基。在一種實(shí)施方式中，Rc是或者包含二價(jià)聚氧丙烯基，例如包括約1-5000、1至500、1-200、1-100或1-50個(gè)氧丙烯單元，或者例如1-20、1-10個(gè)或1、2、3、4或5個(gè)氧丙烯單元。在另一種實(shí)施方式中，Rc是或者包含二價(jià)氧乙烯基，例如包括約1至5000、1至500、1-200、1-100或1-50個(gè)氧乙烯單元，或者例如1-20、1-10個(gè)或1、2、3、4或5個(gè)氧乙烯單元。
在一種實(shí)施方式中，Rc是 其中p是從2至約500的正整數(shù)，例如2-200，例如2至約50、2至約20、2至約10或2至約6。在一種實(shí)施方式中，p是2、3、4、5或6。
在一種實(shí)施方式中，Rc是這樣的有機(jī)基團(tuán)，它僅由碳、氧、氮和氫原子組成，并且具有1至5000、1至500個(gè)、例如1-200或1至20個(gè)碳原子，例如1至10個(gè)碳原子或1至6個(gè)碳原子。這類核心基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于僅由碳、氧、氮和氫原子組成的那些。
在一種實(shí)施方式中，Rc是這樣的有機(jī)基團(tuán)，它僅由碳、氧、硫和氫原子組成，并且具有1至5000、1至500或1至200個(gè)碳原子，例如1至100個(gè)碳原子或1至10個(gè)碳原子。
Rc例如可以是C1-200烴部分、C1-200烷氧基部分或包含芳族基團(tuán)的C1-200烴部分。
Rc可以是或者包含具有兩個(gè)羥基的含有核心化合物的醇，例如乙二醇、二甘醇(也稱為DEG)、三甘醇(也稱為TEG)、四甘醇、五甘醇、六甘醇、聚乙二醇(也稱為PEG)，其中n通常從1至約200，和1，4-二羥甲基苯。具有三個(gè)羥基的含有核心化合物的醇實(shí)例包括藤黃酚(也已知為1，3，5-三羥基苯)、1，3，5-三羥甲基苯和1，3，5一三羥基環(huán)己烷。
具有四個(gè)羥基的含有核心化合物的醇實(shí)例包括季戊四醇。
式中G2可以表示有機(jī)“連接劑”。G2在一種實(shí)施方式中是或者包含諸如烷基、雜烷基、芳基或雜芳基等有機(jī)基團(tuán)，并且可以是或者可以含有例如直鏈、支鏈或環(huán)狀結(jié)構(gòu)。G2例如可以包含烴基、乙烯氧基、聚乙烯氧基、丙烯氧基或聚丙烯氧基，或者它們的組合。G2可選地可以包含其他雜原子，包括S和N。
G2也可以包含這樣的官能團(tuán)，例如胺、酰胺、酯、醚、酮、醛、氨基甲酸酯和硫醚。G2也可以包含這樣的官能團(tuán)，例如伯、仲與叔、飽和或不飽和的烷基胺基，例如哌嗪基或哌啶基。G2也可以包含這樣的官能團(tuán)，包括聚醇；聚胺；聚醚；酰肼；肼；羧酸；酸酐；鹵素；磺?；?；磺酸酯；砜；亞氨酸酯；氰酸酯；異氰酸酯；異硫氰酸酯；甲酸酯；硫醇；醇；肟；亞胺；氨基氧基；和馬來酰亞胺。
在一種實(shí)施方式中，G2是烴基(即僅由碳和氫組成)，包含1至5000、1至約500或1至約200個(gè)碳原子，例如1至100個(gè)碳原子或1至10個(gè)碳原子。在一種實(shí)施方式中，G2是或者包含烷基，例如-(CH2)q-，其中q是1至20。在一種實(shí)施方式中，G2是或者包含線性、分支或環(huán)狀結(jié)構(gòu)。G2可以是完全或部分不飽和的或飽和的。
在一種實(shí)施方式中，G2包含芳族結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，G2是芳香性的。在一種實(shí)施方式中，G2是二價(jià)的。在一種實(shí)施方式中，G2是或者包含-(CH2)q-，其中q是1至約20，例如1至約10或1至約6或1至約4。在一種實(shí)施方式中，G2是-CH2-。在一種實(shí)施方式中，G2是或者包含-CH2CH2-。在一種實(shí)施方式中，G2是或者包含-CH2CH2CH2-。
在一種實(shí)施方式中，G2是這樣的有機(jī)基團(tuán)，它僅由碳、氧和氫原子組成，并且具有1至5000、1至500、1至200、1至50個(gè)、例如1-20個(gè)碳原子，或者例如1至10個(gè)碳原子或1至6個(gè)碳原子。在一種實(shí)施方式中，G2是從聚氧化烯基衍生的。在一種實(shí)施方式中，G2是或者包含二價(jià)聚氧化烯基。在一種實(shí)施方式中，G2是或者包含二價(jià)聚氧乙烯基。在一種實(shí)施方式中，G2是二價(jià)聚氧丙烯基。在一種實(shí)施方式中，G2是或者包含 其中p是2至約200或500，例如2至約50，或2至約20，或2至約10，或2至約6。在一種實(shí)施方式中，p是2、3、4、5或6。
在一種實(shí)施方式中，G2是這樣的有機(jī)基團(tuán)，它僅由碳、氧、氮和氫原子組成，并且具有1至5000、1至500個(gè)、例如1至200個(gè)碳原子，例如1至100個(gè)碳原子或1至10個(gè)碳原子。
G2例如可以是C1-200烴部分、C1-200烷氧基部分或包含芳族基團(tuán)的C1-200烴部分。
在一種實(shí)施方式中，化合價(jià)平臺分子具有圖19所示任意式9-13結(jié)構(gòu)之一。式9-13中，在一種實(shí)施方式中，Rc和G2是如上定義的，n是約1-500，例如1-200、1-100或1-50，例如1-20、1-10，或者例如1、2、3、4或5。在一種實(shí)施方式中，G2-ONH2具有圖17所示任意結(jié)構(gòu)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，化合價(jià)平臺分子具有圖20、21和22所示任意結(jié)構(gòu)。
在本文公開的每種化合物和結(jié)構(gòu)式的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，化合價(jià)平臺分子所包含的氨基氧基是氨基氧基烷基，例如-CH2CH2ONH2。
包含氨基氧基的分子的制備各種分子經(jīng)過修飾可以包含如本文公開的反應(yīng)性氨基氧基。例如，多種聚合物經(jīng)過修飾可以含有氨基氧基，例如聚(烯化氧)聚合物，包括聚(氧化乙烯)聚合物，確切為聚乙二醇，其分子量例如小于10000道爾頓。
其他經(jīng)過修飾可以包括氨基氧基的分子包括分支、線性、嵌段和星形聚合物與共聚物，例如包含聚(烯化氧)部分的那些，例如聚(氧化乙烯)分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了聚乙二醇分子，它們包括至少三個(gè)氨基氧基，并且可選地分子量小于約10000。
在一方面，化合價(jià)平臺分子經(jīng)過修飾可以包含氨基氧基。用于制備化合價(jià)平臺分子的方法例如描述在美國專利Nos.5,162,515；5,391,785；5,276,013；5,786,512；5,726,329；5,268,454；5,552,391；5,606,047；5,663,395和5,874,409以及U.S.SerialNo.60/111,641和PCT US97/10075中。
本領(lǐng)域已知用于制備化合價(jià)平臺分子的方法例如包括增長法或分段法。這樣的方法經(jīng)過適當(dāng)試劑的修飾，可以在所得分子上提供氨基氧基。例如，可以使反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)，例如鹵化物基團(tuán)或羥基，而與諸如連接劑等分子結(jié)合，后者包含可選被保護(hù)的氨基氧基。本文實(shí)施例證明了示范性方法。
化合價(jià)平臺可以從分段法制備，其中片段是獨(dú)立地合成的，隨后與核心基團(tuán)連接。分段法的替代選擇是核心繁殖過程，這是一種可以用于產(chǎn)生樹狀結(jié)構(gòu)的反復(fù)過程。
核心化合物的實(shí)例包括含有核心化合物的醇甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇與甲氧基聚乙二醇、單羥基胺、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇、六甘醇、1，4-雙-(羥甲基)苯和聚乙二醇HO(CH2CH2O)nH，其中例如n是約1-500或1-200，例如1-10或1至5，或者具有兩個(gè)羥基的伯胺或仲胺。
氨基氧基平臺例如可以制備成四價(jià)。
式2化合價(jià)平臺分子可以如實(shí)施例所述進(jìn)行制備，例如實(shí)施例9。這些分子可以從四價(jià)的化合價(jià)平臺分子制備，后者具有可以轉(zhuǎn)化為氨基氧基的端基。一般來說，可以使用良好的離去基團(tuán)，例如鹵化物或磺酸酯，它們可以用被保護(hù)的羥胺衍生物的氧置換。利用氧雜環(huán)乙亞胺(oxaziridine)型試劑或Mitsunobu化學(xué)，羥基也能夠轉(zhuǎn)化為氨基氧基。本例制備了四烷基鹵化物平臺，將鹵化物用N-(四丁氧羰基)羥胺的氧原子置換。除去Boc(N-(叔丁氧羰基))保護(hù)基團(tuán)得到氨基氧基平臺。
其他實(shí)施例涉及制備適當(dāng)被保護(hù)的烷氧基胺雙官能連接劑，它與平臺的端基連接。式3化合價(jià)平臺分子可以用實(shí)施例所述方法、例如實(shí)施例3所述從終止于羥基的化合價(jià)平臺分子進(jìn)行制備。羥基被轉(zhuǎn)化為活化的碳酸酯。所制備的二價(jià)連接劑具有游離氨基和被保護(hù)的氨基氧基。通過游離氨基與碳酸酯反應(yīng)生成氨基甲酸酯鍵，使連接劑連接到平臺上，再除去氨基氧基的保護(hù)基團(tuán)，釋放出氨基氧基平臺。
式4化合價(jià)平臺分子例如可以經(jīng)由實(shí)施例、例如實(shí)施例7詳細(xì)描述的方法從終止于羧基的化合價(jià)平臺分子進(jìn)行制備。所制備的二價(jià)連接劑具有游離氨基和被保護(hù)的氨基氧基。將羧基活化，通過游離氨基與活化的羧基反應(yīng)生成酰胺鍵，使連接劑連接到平臺上。除去氨基氧基的保護(hù)基團(tuán)，釋放出氨基氧基平臺。
式5化合價(jià)平臺分子例如可以經(jīng)由實(shí)施例、例如實(shí)施例2詳細(xì)描述的方法從終止于氨基的化合價(jià)平臺分子進(jìn)行制備。所制備的二價(jià)連接劑具有活化的羧基和被保護(hù)的氨基氧基。平臺上的氨基與連接劑上的活化羧基反應(yīng)，生成酰胺鍵。除去氨基氧基的保護(hù)基團(tuán)，釋放出氨基氧基平臺。
式6化合價(jià)平臺分子例如可以經(jīng)由實(shí)施例詳細(xì)描述的方法、例如實(shí)施例4和6所述從終止于氨基的化合價(jià)平臺分子進(jìn)行制備。所制備的二價(jià)連接劑具有活化的碳酸酯基和被保護(hù)的氨基氧基。平臺上的氨基與連接劑上的活化碳酸酯基反應(yīng)，生成氨基甲酸酯鍵。除去氨基氧基的保護(hù)基團(tuán)，釋放出氨基氧基平臺。
式7化合價(jià)平臺分子例如可以經(jīng)由實(shí)施例詳細(xì)描述的方法、例如實(shí)施例8所述從終止于醛或酮基的化合價(jià)平臺分子進(jìn)行制備。所制備的二價(jià)連接劑具有兩個(gè)游離的氨基氧基。平臺上的醛或酮基(實(shí)施例8為酮)與過量的二價(jià)雙-氨基氧基連接劑反應(yīng)，得到氨基氧基平臺。
式8化合價(jià)平臺分子例如可以經(jīng)由實(shí)施例詳細(xì)描述的方法、例如實(shí)施例5a和5b所述從終止于烷基鹵基團(tuán)的化合價(jià)平臺分子進(jìn)行制備。在所提供的實(shí)施例中，使用反應(yīng)性鹵代乙酰基。所制備的二價(jià)連接劑具有游離硫醇和被保護(hù)的氨基氧基。平臺上的鹵化物(或其他適合的離去基團(tuán))與連接劑上的游離硫醇反應(yīng)，生成硫醚鍵。除去氨基氧基的保護(hù)基團(tuán)，釋放出氨基氧基平臺。
如圖34所示，在一種實(shí)施方式中，bPEG八聚平臺M是通過這樣一種過程合成的，四聚PNP碳酸酯(化合物50a)與化合物133反應(yīng)，導(dǎo)致化合物K的生成。除去化合物K的Boc保護(hù)基團(tuán)，所得八胺與化合物106反應(yīng)，導(dǎo)致化合物L(fēng)的生成。除去化合物M的Boc保護(hù)基團(tuán)，導(dǎo)致化合物M的生成。
在另一種實(shí)施方式中，結(jié)合有兩條PEG鏈的四價(jià)氨基氧基平臺是如圖35所示從結(jié)合有兩條PEG鏈的中間體122合成的?；衔?22與NHS酯O(Shearwater Polymer)反應(yīng)，生成平臺P?！癙EG”或“聚乙二醇”或“聚氧化乙烯”在本文中可互換地用來稱謂氧化乙烯的聚合物。
軛合物、其制備方法和用途諸如聚氧乙烯聚合物和各種化合價(jià)平臺分子等分子上的氨基氧基是反應(yīng)性基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)分子、例如生物活性分子可以以共價(jià)方式與之結(jié)合形成軛合物。
術(shù)語“生物活性分子”在本文中用于稱謂具有生物活性的分子，優(yōu)選為體內(nèi)活性。在一種實(shí)施方式中，生物活性分子是特異性地與受體蛋白質(zhì)相互作用者。生物活性分子例如可以是多肽或核酸。根據(jù)平臺的化合價(jià)，平臺分子軛合物可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)或以上生物活性分子，或者例如16、18、32、36個(gè)或以上。
軛合物可以用在治療需要這類治療的個(gè)體的抗體介導(dǎo)疾病或其他疾病的方法中，包括將有效量的軛合物對該個(gè)體給藥。軛合物還可以用在誘導(dǎo)個(gè)體特異性B細(xì)胞對免疫原無變應(yīng)性的方法中，包括將有效量的軛合物對該個(gè)體給藥。軛合物還可以用在治療個(gè)體的抗體介導(dǎo)病變的方法中，其中響應(yīng)于免疫原而產(chǎn)生了所不需要的抗體，該方法包括將有效量的軛合物對該個(gè)體給藥。
在一種實(shí)施方式中，優(yōu)選的是軛合物的總分子量不超過200,000道爾頓，例如為了使軛合物是有效的功能耐受原。
在一種實(shí)施方式中，生物活性分子是β2GPI的第1結(jié)構(gòu)域多肽，例如U.S.Serial No.60/103,088；1999年6月8日提交的U.S.Serial No.09/328,199；和1999年12月16日公布的PCTUS99/13194，其公開內(nèi)容引用在此作為參考文獻(xiàn)。第1結(jié)構(gòu)域軛合物可以用在樣本β2GPI-依賴性抗磷脂抗體(或特異性與第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽結(jié)合的抗體)的檢測方法中使樣本中的抗體與軛合物在允許生成穩(wěn)定的抗原-抗體配合物的條件下接觸；檢測所生成的穩(wěn)定配合物，若有的話。軛合物還可以用在誘發(fā)個(gè)體耐受性的方法中，該方法包括將有效量的軛合物對個(gè)體給藥，確切為包含缺乏T細(xì)胞表位的第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽的軛合物，其中的有效量是足以誘發(fā)耐受性的量。
在另一種實(shí)施方式中，提供了化合價(jià)平臺分子與至少一種與抗αGal抗體特異性結(jié)合的αGal表位或其類似物的軛合物。在另一方面，提供了減少個(gè)體抗αGal抗體循環(huán)水平的方法，包括將有效量的軛合物對該個(gè)體給藥，其中的有效量是足以減少抗αGal抗體循環(huán)水平或中和抗αGal抗體循環(huán)水平的量。在另一方面，提供了誘發(fā)免疫耐受性(一般是對異種移植抗原、更具體為αGal的耐受性)的方法，該方法包括將有效量的包含αGal表位或其類似物的軛合物給藥。軛合物還可以用于檢測生物樣本中抗αGal抗體的存在和/或含量。還提供了進(jìn)行個(gè)體異種移植術(shù)的方法，包括將軛合物對該個(gè)體給藥；再向個(gè)體引入異種組織。在另一方面，提供了抑制移植組織排斥的方法，包括將足以抑制排斥的量的軛合物對該個(gè)體給藥。這些方法一般描述在PCT US99/29338中。
軛合物還可以用于狼瘡的免疫耐受性治療，可選地根據(jù)對個(gè)體抗體(即與狼瘡有關(guān)的抗體，也就是抗雙鏈DNA抗體)的最初親和性的評價(jià)結(jié)果，用作選擇治療個(gè)體的基礎(chǔ)，或者根據(jù)評價(jià)抗體親和性，用在鑒別適合于治療的個(gè)體的方法中。治療個(gè)體系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的方法包括將軛合物對該個(gè)體給藥，該軛合物包含(a)非免疫原性化合價(jià)平臺分子和(b)兩個(gè)或以上與個(gè)體抗體特異性結(jié)合的多核苷酸，該抗體與雙鏈DNA特異性結(jié)合。這些方法一般描述在PCT US99/29336中。
因而，化合價(jià)平臺可以以共價(jià)方式連接一個(gè)或多個(gè)生物活性分子形成軛合物，該生物活性分子包括寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素與藥物、脂質(zhì)、脂肪酸或它們的混合物。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”在本文中可互換地用來稱謂任意長度的氨基酸聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，它可以包含經(jīng)過修飾的氨基酸，并且可以被非氨基酸所中斷。它還可以是天然修飾的或者被干涉修飾；例如二硫鍵形成、葡基化、肉豆蔻基化、乙?；⑼榛?、磷酸化或脫磷酸化。該定義還包括含有一種或多種氨基酸類似物(例如包括非天然氨基酸)以及本領(lǐng)域已知其他修飾的多肽。
化合價(jià)平臺與其他包含氨基氧基的分子的軛合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠增強(qiáng)所結(jié)合的生物活性分子對其結(jié)合配偶體的親和性，例如當(dāng)結(jié)合配偶體締合成簇時(shí)。大量生物活性分子與化合價(jià)平臺分子的共價(jià)結(jié)合提高了生物分子的局部濃度，因?yàn)樗鼈兝缭谄脚_分子上締合在一起?；蟽r(jià)平臺的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠促進(jìn)多配體的結(jié)合，這對B細(xì)胞耐受性是有用的。例如，軛合物可以用作呈遞多價(jià)表位的耐受原，誘發(fā)B細(xì)胞表面上成簇?；蟽r(jià)平臺的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠在“核心”上包括官能度，核心經(jīng)過獨(dú)立地修飾，可以使適應(yīng)特定目的的軛合物的制備成為可能。
一般來說，包含氨基氧基的分子與第二種包含羰基、例如醛或酮的分子反應(yīng)，生成肟軛合物。第二種分子經(jīng)過修飾可以含有該反應(yīng)性醛或酮。肟鍵可以被進(jìn)一步修飾。例如，按照已知方法，它可以經(jīng)由還原或與親核試劑的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氨基氧基鍵，生成氨基氧基軛合物。
在一種實(shí)施方式中，提供了制備天然多肽或蛋白質(zhì)與包含氨基氧基的多價(jià)(優(yōu)選為非免疫原性)化合價(jià)平臺分子的、化學(xué)限定的多價(jià)軛合物的方法，其中如果需要的話，該多肽經(jīng)過選擇性修飾，在該多肽的特定位置產(chǎn)生醛或酮部分。多肽然后與含有氨基氧基的多價(jià)化合價(jià)平臺分子反應(yīng)，在平臺與多肽之間形成一條或多條肟鍵。
事實(shí)上為任意多肽或其他分子的胺、例如N-末端的胺通過本領(lǐng)域已知為氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的反應(yīng)可以轉(zhuǎn)化為醛或酮。實(shí)質(zhì)上，氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)將碳-氮單鍵轉(zhuǎn)化為碳-氧雙鍵。例如，N-末端甘氨酸可以反應(yīng)生成乙醛基、醛，如圖1所示。大多數(shù)其他氨基酸依靠氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)生成酮。
另一種在N-末端產(chǎn)生乙醛基的方法是用高碘酸鈉氧化N-末端絲氨酸或蘇氨酸。這種氧化作用裂解N-末端絲氨酸或蘇氨酸羥基與氨基之間的碳-碳鍵，得到乙醛基。因而在一種實(shí)施方式中，通過在N-末端生成醛或酮，可以對多肽進(jìn)行位置特異性修飾。合成多肽和其他藥物或生物活性分子經(jīng)過類似修飾，可以包括可用于生成肟鍵的醛或酮。
含有氨基氧基反應(yīng)性基團(tuán)的多價(jià)平臺允許經(jīng)過選擇性修飾的多肽與該平臺結(jié)合。化合價(jià)平臺分子例如可以包含氨基氧基乙?；虬被趸榛?。
本文所用的“氨基氧基乙酰基”指的是具有α羰基的氨基氧基，例如-COCH2-ONH2，而“氨基氧基烷基”指的是第一個(gè)碳上的氨基氧基，其中該第一個(gè)碳優(yōu)選地不直接與吸電子基團(tuán)結(jié)合，例如作為羰基一部分的第二個(gè)碳。一種優(yōu)選的氨基氧基烷基是-CH2-CH2-ONH2。氨基氧基烷基的其他實(shí)施方式包括-CH(OH)CH2ONH和CH2CH(CH3)ONH2。
通過用N-保護(hù)的氨基氧基乙酰基?；?，然后除去保護(hù)基團(tuán)，可以使氨基氧基乙酰基(AOA)與含有胺基的多價(jià)平臺結(jié)合。乙醛基多肽與氨基氧基乙?；姆磻?yīng)進(jìn)行緩慢，在多肽與氨基氧基官能化平臺之間生成肟鍵。長反應(yīng)時(shí)間對該反應(yīng)來說是必要的，這可能發(fā)生副反應(yīng)。由除甘氨酸以外的N-末端氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移作用所生成的N-末端α-酮基-酰胺甚至反應(yīng)更加緩慢，或者根本不反應(yīng)生成多價(jià)軛合物。
氨基氧基烷基(AO烷基)是優(yōu)選的，它們比氨基氧基乙?；菀着c酮和醛反應(yīng)生成肟。烷基鏈(例如三甘醇鏈)上的氨基氧基例如在生成肟的反應(yīng)性上十倍于相似的氨基氧基乙酰基。氨基氧基乙?；姆磻?yīng)性一般小于其他不與羰基相鄰的氨基氧基(氨基氧基烷基)。據(jù)信由于吸電子效應(yīng)，氨基氧基乙酰基的羰基降低了反應(yīng)性。
在一種實(shí)施方式中，提供了能夠與平臺上的乙醛基多肽反應(yīng)的末端氨基氧基烷基，它們預(yù)期增強(qiáng)了生成肟的反應(yīng)性。在一種實(shí)施方式中，提供了三甘醇或己基鏈上的氨基氧基；不過任意其他鏈也是可能的，包括包含碳、氧、氮或硫原子的那些。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，平臺分子中的氨基氧基是氨基氧基烷基，例如-CH2CH2ONH2。
實(shí)施例中提供了生物分子與醛或酮官能度經(jīng)由肟鍵生成作用結(jié)合成為氨基氧基平臺的實(shí)例。實(shí)施例10和11描述氨基轉(zhuǎn)移的多肽或者經(jīng)過醛或酮基修飾的多肽如何與氨基氧基平臺反應(yīng)。在這些情況下，在酸性水溶液中將平臺用乙醛基多肽處理，使氨基轉(zhuǎn)移的第1結(jié)構(gòu)域與四價(jià)平臺結(jié)合。優(yōu)選的酸性條件是100mM pH4.6乙酸鈉。在制備四價(jià)第1結(jié)構(gòu)域軛合物的情況下，使用超過四當(dāng)量、例如六當(dāng)量的氨基轉(zhuǎn)移的第1結(jié)構(gòu)域。氨基氧基烷基的反應(yīng)性大于氨基氧基乙?；?，使反應(yīng)更容易發(fā)生，生成副產(chǎn)物的機(jī)會更小。實(shí)施例10描述與氨基氧基乙?；脚_生成軛合物。實(shí)施例11描述與氨基氧基烷基平臺生成軛合物。
制備四價(jià)第1結(jié)構(gòu)域軛合物的兩種替代方法如實(shí)施例13和14所示。這兩種實(shí)施例都涉及使連接劑經(jīng)由肟鍵與氨基轉(zhuǎn)移的第1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，然后利用該連接劑使平臺與適合的反應(yīng)性基團(tuán)結(jié)合。連接劑先與氨基轉(zhuǎn)移的第1結(jié)構(gòu)域結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)是可以加入過量的連接劑，以驅(qū)使肟生成反應(yīng)完全。
實(shí)施例13描述雙-氨基氧基連接劑如何先與第1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，結(jié)合有氨基氧基連接劑的多肽再與酮衍生的平臺反應(yīng)，得到所需的四價(jià)軛合物。
實(shí)施例14證明雜二官能連接劑如何能夠用來使硫醇連接劑經(jīng)由肟鍵與第1結(jié)構(gòu)域結(jié)合。結(jié)合有硫醇連接劑的第1結(jié)構(gòu)域再與反應(yīng)性烷基鹵平臺反應(yīng)，得到四價(jià)軛合物。
顯然，實(shí)施例13和14所生成的軛合物與若連接劑先與平臺結(jié)合、再與氨基轉(zhuǎn)移的第1結(jié)構(gòu)域共軛化合所生成的軛合物是相同的。
本文所引用的所有出版物、專利、專利申請和公布的專利申請都全文引用在此作為參考文獻(xiàn)。
下列非限制性實(shí)施例將有助于進(jìn)一步理解發(fā)明。
實(shí)施例下列實(shí)施例中，使用下列縮寫DCC1，3-二環(huán)已基碳二亞胺；DIC1，3-二異丙基碳二亞胺；DBU1，8-二氮雜二環(huán)并[5.4.0]十一碳-7-烯；NHSN-羥基琥珀酰亞胺；HOBt1-羥基苯并三唑；DMF二甲基甲酰胺。
實(shí)施例1-第1結(jié)構(gòu)域的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)氨基轉(zhuǎn)移的第1結(jié)構(gòu)域(TA/D1)的合成將水和乙酸鈉緩沖液用氦噴射備用。使用β2GPI的第1結(jié)構(gòu)域多肽，參見1998年10月5日提交的U.S.Serial No.60/103,088，filed October 5，1998；1999年6月8日提交的U.S.Serial No.09/328,199；和PCT US99/13194，其公開內(nèi)容引用在此作為參考文獻(xiàn)。第1結(jié)構(gòu)域多肽如圖1所示，具有N-末端甘氨酸。在聚丙烯試管內(nèi)，將第1結(jié)構(gòu)域(10.55mg，1.49μmol)溶于0.5mL H2O，加入4.0mL 2M pH5.5NaOAc緩沖液。向混合物中加入3.73mg(14.9μmol)CuSO4的0.5mL H2O溶液，再加入2.75mg(29.9μmol)乙醛酸在0.5mL 2M pH5.5NaOAc緩沖液中的溶液。將混合物保持在氮?dú)夥障?，輕微攪拌18h，此時(shí)經(jīng)分析型HPLC顯示反應(yīng)完全，條件是4.6mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac，Hesperia，CA)，在280nm下檢測(1mL/min；梯度25％-45％B，0-20min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。大致的保留時(shí)間如下D1，13.2min；TA/D1，13.7min；氧化的TA/D1，13.4min。將混合物用0.1％TFA/H2O稀釋至體積為20mL，過濾，經(jīng)HPLC純化(22.4mm×250mm，300A，10μm，二苯基柱(Vydac)(12mL/min；梯度25％-40％B，0-40min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。收集經(jīng)分析型HPLC證實(shí)含有純TA/D1的部分，冷凍干燥，得到5.0mg(48％)TA/D1。反應(yīng)流程如圖1所示。
實(shí)施例2-氨基氧基乙?；?PITG平臺的合成合成流程如圖2所示。
4-硝基苯基-N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙酸酯，2在0℃下，向攪拌著的1.5g(7.85mmol)N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙酸(AldrichChemical Co.，St.Louis，MO)、即化合物1的35mL無水THF溶液中加入1.09g(7.85mmol)4-硝基苯酚，再加入1.62g(7.85mmol)DCC。將混合物在0℃氮?dú)夥障聰嚢?.5h，在室溫下攪拌18h。將混合物過濾，以除去二環(huán)己脲，將濾液濃縮，經(jīng)硅膠色譜純化(95/5 CHCl3/異丙醇)，得到2.30g(94％)化合物2，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.51(s，9H)，4.73(s，2H)，7.36(d，2H)，7.73(s，1H)，8.32(d，2H).
Boc-保護(hù)的氨基氧基乙酰基/PITG平臺4的合成將化合物3(300mg，0.235mmol；如PCT/US97/10075所述制備)用1.5mL 30％HBr的乙酸溶液處理30min。加入二乙醚使所得四胺的HBr鹽沉淀出來。將混合物離心，取出上清液，棄去。將剩余固體用乙醚洗滌，在真空下干燥，溶于9mL DMF。向所得混合物中加入294μL(1.69mmol)二異丙基乙胺，再加入410mg(1.31mmol)化合物2的3mL DMF溶液。將混合物在氮?dú)夥障聰嚢?h，在15/1 CHCl3/MeOH與鹽水之間分配。將含水層用15/1 CHCl3/MeOH洗滌兩次，將合并后的有機(jī)層干燥(Na2SO4)，濃縮，得到680mg油。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度95/5至75/25CHCl3/MeOH)，得到215mg(65％)化合物4，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.49(s，36H)，3.40-3.73(m，40H)，4.24(m，12H)，4.59(重疊的單峰，8H)，8.21(s，2H)，8.32(s，2H).
氨基氧基乙?；?PITG平臺，化合物5向攪拌著的67mg(.047mmol)化合物4的10/1/1 EtOAc/CHCl3/MeOH溶液中通入HCl氣達(dá)15min，另將混合物攪拌15min。將混合物在真空下濃縮，在真空下保持16h，得到43mg(78％)化合物5，為白色固體1H NMR(DMSO)δ3.33-3.67(m，40H)，4.08(m，4H)，4.18(s，8H)，4.90(s，8H)；質(zhì)譜(ES)m/z 計(jì)算C40H69N14O18(M+H)1033.實(shí)測1033.
實(shí)施例3-AOTEG/DEA/DEG平臺的合成合成流程如圖3所示。
2-[2-(2-碘乙氧基)乙氧基]乙醇，化合物7將2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(Aldrich Chemical Co.)(12.66g，75.1mmol)和碘化鈉(33.77g，225.3mmol)溶于250mL丙酮。在燒瓶上連接回流冷凝器，將混合物加熱回流18h。冷卻后，將混合物濃縮，將殘余物用400mLCH2Cl2和300mL水與100mL飽和亞硫酸氫鈉水溶液的混合物搖動。含水層用400mL CH2Cl2洗滌兩次，將合并后的CH2Cl2層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到18.3g(94％)7，為淺黃色油，無需進(jìn)一步純化即可用在下一步1H NMR(CDCl3)δ2.43(brd s，1H)，3.28(t，2H)，3.61(m，2H)，3.68(s，4H)，3.78(m，4H)；質(zhì)譜(ES)m/z計(jì)算C6H13O3INa (M+Na)283.0.實(shí)測283.0.
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙醇，化合物8向5.85g(1.50mmol)2-[2-(2-碘乙氧基)乙氧基]乙醇、即化合物7中加入2.00g(1.00mmol)N-(叔丁氧羰基)羥胺(AldrichChemical Co.)和3.36mL(3.42g，1.50mmol)DBU。將混合物攪拌，得到粘性液體，觸摸可知變熱，在55℃油浴中放置18h，導(dǎo)致白色沉淀的生成，使混合物固化。將混合物溶于20mL CH2Cl2，加入到500mL攪拌著的EtOAc中，導(dǎo)致沉淀的生成，過濾除去之，將濾液濃縮，得到棕黃色油。經(jīng)過快速色譜純化(50％丙酮/己烷)，得到2.61g(67％)8，為一種油1H NMR(CDCl3)δ1.50(s，9H)，3.65(t，2H)，3.70(brd s，4H)，3.76(m，4H)，4.06(t，2H)，7.83(brd s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.0，61.3，68.9，70.1，70.3，72.5，72.6，75.1，81.2，157.1.
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙基溴，化合物9將溴(約0.283mmol)滴加到50mg(0.188mmol)化合物8、74mg(0.283mmol)三苯膦與31μL(30mg，0.377mmol)吡啶的2mL CH2Cl2溶液中，直至持續(xù)為橙色。將混合物在室溫下攪拌0.5h，加入1mL飽和亞硫酸氫鈉溶液，以猝滅過量的溴。然后使混合物在10mL H2O與2x15mL EtOAc之間分配。將合并后的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(35/65丙酮/己烷)，得到54mg化合物9，為一種油1H NMR(CDCl3)δ1.49(s，9H)，3.48(t，2H)，3.68(s，4H)，3.73(m，2H)，3.84(t，2H)，4.03(t，2H)，7.50(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.3，30.4，69.4，70.6(兩種信號)，713，75.5，81.7，156.9.
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙基疊氮化物，化合物10從化合物9合成將100mg(0.305mmol)化合物9的0.25mL無水DMF溶液加入到159mg(2.44mmol)疊氮化鈉的0.5mL無水DMF溶液中。另用0.25mL DMF將殘留的9沖洗到反應(yīng)混合物中，將混合物在115℃下加熱3h。冷卻后，使混合物在3mL H2O與4×3mL CH2Cl2之間分配。將合并后的有機(jī)層用10mL H2O洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮，得到黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(35/65丙酮/己烷)，得到67mg(76％)10，為一種油1H NMR(CDCl3)δ1.47(s，9H)，3.41(t，2H)，3.69(brd s，4H)，3.73(m，4H)，4.03(t，2H)，7.50(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.1，50.5，69.1，70.1，70.4(兩種信號)，75.2，81.3，156.7.
從化合物13合成10在氮?dú)夥障?，?58mg(0.69mmol)化合物13的5mL DMF溶液中加入358mg(5.50mmol)疊氮化鈉。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，加入100mL水，將混合物用3×50mL EtOAc萃取。合并EtOAc層，用50mL水洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮，得到294mg無色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(30/70丙酮/己烷)，得到化合物10，為無色的油。
化合物11將化合物10(1.36g，4.70mmol)和三苯膦(1.48g，5.64mmol)溶于24mL THF與8mL H2O，將所得溶液在室溫下攪拌2小時(shí)。加入約160μL(八滴)1N NaOH，將混合物攪拌18小時(shí)。將混合物在真空下濃縮，濃縮液經(jīng)過硅膠色譜純化(80/8/2 CH3CN/H2O/濃NH4OH)，得到1.16g(94％)11，為黃色的油1H NMR(CDCl3)δ1.50(s，9H)，1.90(brd，2H)，2.88(t，2H)，3.56(t，2H)，3.65(m，4H)，3.71(m，2H)，4.01(m，2H).
1，2-雙(2-碘乙氧基)乙烷，化合物12將10.0g(5.3mmol)1，2-雙(2-氯乙氧基)乙烷(Aldrich Chemical Co.)與16.0g(107mmol)碘化鈉的110mL丙酮溶液加熱回流18h。將混合物濃縮，將殘余物用CHCl3研制，以溶解產(chǎn)物，所剩余的鹽是不溶的。將混合物過濾，將濾液濃縮，得到橙色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度，10/90 EtOAc/己烷至15/85 EtOAc/己烷)，得到17.8g(90％)橙色的油1H NMR(CDCl3)δ3.28t，4H)，3.67(s，4H)，3.78(t，4H)；13C NMR(CDCl3)δ3.6，70.5，72.2.
化合物13將DBU(284μL，290mg，1.90mol)加入到266mg(2.0mmol)N-(叔丁氧羰基)羥胺(Aldrich Chemical Co.)與2.96g(8.0mmol)化合物12的混合物中，將混合物密封，搖動直至均勻。15分鐘后，混合物固化，放置45分鐘。向混合物中加入5mL CH2Cl2，再次搖動混合物，以溶解固體。將所得溶液加入到200mL EtOAc中。另加入50mL EtOAc，將混合物過濾以除去固體。將濾液濃縮，得到一種油，使其在100mL EtOAc與3×50mL 1N HCl溶液之間分配。將EtOAc層用2×50ml 1N NaOH洗滌，再用2×50mL 5％亞硫酸氫鈉溶液洗滌，濃縮，得到2.6g黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度，20/80至45/55 EtOAc/己烷)，得到515mg(69％)化合物13，為黃色的油1H NMR(CDCl3)δ1.50(s，9H)，3.28(t，2H)，3.68(s，4H)，3.72(m，4H)，4.02(t，2H)，7.72(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ2.9，28.3，68.9，69.4，70.2，70.6，72.0，75.4，81.6，156.9.
二甘醇雙-4-硝基苯基碳酸酯，化合物60將吡啶(30.5mL，377mmol)緩慢加入到0℃的5.0g(47.11mmol)二甘醇與23.74g(118mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的500mL THF溶液中。除去冷卻浴，將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將混合物冷卻回至0℃，用6N HCl酸化，在400mL 1N HCl與2×400mL CH2Cl2之間分配。將合并后的有機(jī)層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到24.3g白色固體。從己烷/EtOAc中結(jié)晶，得到16.0g(78％)化合物60，為白色粉末mp 110℃；1H NMR(CDCl3)δ3.89(t，4H)，4.50(t，4H)，7.40(d，4H)，8.26(d，4H).
化合物61將2.5g(5.73mmol)化合物60的17mL吡啶溶液加入到0℃的1.8g(17.2mmol)二乙醇胺的3mL吡啶溶液中。除去冷卻浴，將混合物在室溫下攪拌5小時(shí)，得到化合物61，不經(jīng)分離而原樣用在下一步中。
化合物14將來自前步的混合物冷卻回至0℃，加入40mL CH2Cl2，再加入11.55g(57.3mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的60mL CH2Cl2溶液，將混合物在室溫下攪拌20小時(shí)。將混合物冷卻回至0℃，用1N HCl酸化，在300mL 1N HCl與2×200mL CH2Cl2之間分配。將合并后的有機(jī)層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到13.6g黃色固體。經(jīng)過硅膠色譜純化(CH2Cl2/MeOH和EtOAc/己烷)，得到4.91g(83％)化合物14，為粘性無定形固體1H NMR(CDCl3)δ3.72(m，12H)，4.31(t，4H)，4.48(m，8H)，7.40(m，8H)，8.29(m，8H).

BOC-保護(hù)的AOTEG/DEA/DEG平臺，化合物15將三乙胺(157μL，114mg，1.13mmol)加入到攪拌著的193mg(0.188mmol)化合物14(如上所述和1998年12月9日提交的U.S.Serial No.60/111,641所述制備)中，再加入298mg(1.13mmol)化合物11。使混合物達(dá)到室溫，攪拌過夜。將混合物冷卻至0℃，用1N HCl酸化，在20mL 1N HCl與4×20mL CH2Cl2之間分配。將合并后的有機(jī)層用飽和NaHCO3溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到279mg黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(97/3 CH2Cl2/MeOH)，得到138mg(48％)15，為一種油1H NMR(CDCl3)δ1.49(s，36H)，3.35(m，8H)，3.46-3.78(m，44H)，4.04(t，8H)，4.21(m，12H)，5.80(m，4H)，7.91(s，4H)；質(zhì)譜(ES)m/z 計(jì)算C62H117N10O33(M+H)1528.8.實(shí)測1528.5.
化合物16將化合物15(60mg，39.2μmol)溶于10mL 1/9三氟乙酸/CH2Cl2，將混合物在室溫下保持3h。利用微弱的氮?dú)饬髡舭l(fā)溶劑，將殘余物溶于少量色譜溶劑(5/7.5/87.5濃NH4OH/H2O/CH3CN)，用來將混合物裝上硅膠柱。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度，5/7.5/87.5至5/10/85濃NH4OH/H2O/CH3CN)，得到36mg(82％)16，為無色的油1H NMR(CDCl3)δ3.37(m，8H)，3.58(m，16H)，3.67(s，16H)，3.71(m，12H)，3.86(m，8H)，4.17-4.29(m，12H)，4.93(brd，8H)，5.91(m，4H)；13C NMR(CDCl3)□40.9，47.7，48.2，62.9，64.7，69.4，69.6，70.2，70.3，70.5，74.8，156.1，156.6；質(zhì)譜(ES)m/z 計(jì)算C42H85N10O25(M+H)1129.實(shí)測1129.
為了用分析型HPLC檢查純度，如下制備四丙酮肟。在HPLC樣本小瓶內(nèi)，將化合物16(0.38mg，0.34μmol)溶于240μL 0.1M NaOAc緩沖液。向該溶液中加入49μL丙酮在2.0mL 0.1M NaOAc緩沖液中的10μL溶液。將混合物放置1h，用HPLC分析試樣(4.6mm C柱，1mL/min，210nm檢測，梯度，10-60％B 20min，A＝0.1 ％TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN，tR＝19min)；所收集洗脫部分的質(zhì)譜(ES)m/z C54H101N10O25(M+H)計(jì)算1289.實(shí)測1289.
實(shí)施例4-AOTEG/PIZ/DEA/DEG平臺的合成合成流程如圖4所示。
化合物17將吡啶(610μL，596mg，7.54mmol)緩慢加入到攪拌著的500mg(1.88mmol)化合物8與760mg(3.77mmol)對-硝基苯基氯甲酸酯的14mL CH2Cl2溶液中，將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將混合物冷卻至0℃，用1N含水HCl酸化。使所得混合物在100mL 1N含水HCl與3×100mL CH2Cl2之間分配。將合并后的有機(jī)層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到1.05g粘型固體。經(jīng)過硅膠色譜純化(6/4己烷/EtOAc)，得到505mg(62％)化合物17，為淺黃色油1H NMR(CDCl3)δ1.47(s，9H)，3.67-3.78(m，6H)，3.80(m.2H)，4.02(m，2H)，4.48(m，2H)，7.40(d，2H)，7.50(s，1H)，8.29(d，2H)；質(zhì)譜(ES)m/z 計(jì)算C18H26N2O10Na(M+Na)453.1.實(shí)測453.0.
Boc-保護(hù)的AOTEG/PIZ/DEA/DEG平臺，化合物19向化合物18(如1998年12月9日提交的U.S.Serial No60/111,641所述制備)的含水碳酸氫鈉與二噁烷溶液中加入四當(dāng)量化合物17的二噁烷溶液。反應(yīng)一旦完全，使混合物在水與CH2Cl2之間分配。將CH2Cl2層濃縮，干燥，經(jīng)過硅膠色譜純化，得到化合物19。
AOTEG/PIZ/DEA/DEG平臺，化合物20按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物19的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到化合物20。
實(shí)施例5a-AOTEG/SA/AHAB/TEG平臺的合成合成流程如圖5所示。
S-乙酰基-2-[2-(2-N-叔丁氧羰基氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙基硫醇，化合物21a向500mg(1.52mmol)化合物9a的30mL丙酮溶液中加入191mg(1.68mmol)硫代乙酸鉀(Aldrich Chemical Co.)。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，過濾除去所得沉淀。將濾液濃縮，在300mLEtOAc與2×80mL鹽水之間分配。將EtOAc層干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮，得到460mg(93％)化合物21a，為淺棕色油1HNMR(CDCl3)δ1.48(s，9H)，2.35(s，3H)，3.12(t，2H)，3.61(t，2H)，3.64(m，4H)，3.73(m，2H)，4.02(m，2H)，5.52(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.3，28.8，30.6，69.3，69.8，70.2，70.5，75.3，81.5，156.8，195.3.
2-[2-(2-N-叔丁氧羰基氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙基硫醇，化合物22a在室溫氮?dú)夥罩?，將化合?1a用氮噴射的4/16N NH4OH/CH3CN溶液處理1小時(shí)。將混合物在真空下濃縮，得到化合物22a，無需進(jìn)一步純化即可使用。
Boc-保護(hù)的AOTEG/SA/AHAB/TEG平臺，24a將化合物23(如Jones等《醫(yī)藥化學(xué)雜志》(J.Med.Chem.)1995，38，2138-2144所述制備)加入到四當(dāng)量化合物22a的氮噴射10/90 H2O/CH3CN溶液中。向所得溶液中加入四當(dāng)量二異丙基乙胺。反應(yīng)一旦完全，使混合物在水與CH2Cl2之間分配。將CH2Cl2層濃縮，干燥，經(jīng)過硅膠色譜純化，得到化合物24a。
AOTEG/SA/AHAB/TEG平臺，25a按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物24a的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到化合物25a。
實(shí)施例5b-AOHEX/SA/AHAB/TEG平臺的合成合成流程如圖6所示。
1-碘-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己烷，化合物9b向140mg(1.05mmol)N-(叔丁氧羰基)羥胺(Aldrich Chemical Co.)與658μL(1.35mg，4.0mmol)化合物12的不均勻混合物中加入149μL(152mg，1.0mmol)DBU。將混合物在室溫下攪拌30秒鐘，此時(shí)反應(yīng)混合物固化。將固體物質(zhì)放置過夜，溶于50mL CH2Cl2。將溶液用2×25mL 1N NaOH和3×25mL 1N HCl洗滌。將合并后的堿性含水層用25mL CH2Cl2萃取，將合并后的酸性含水層用25mL CH2Cl2萃取。將合并后的CH2Cl2層干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮，得到黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度；1/99/0.1至15/85/0.1 EtOAc/己烷/MeOH)，得到216mg(68％)9b，為黃色的油1H NMR(CDCl3)δ1.40(m，4H)，1.48(s，9H)，1.62(m，2H)，1.83(m，2H)，3.20(t，2H)，3.84(t，2H)，7.10(s，1H).
S-乙?；?6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己-1-硫醇，化合物21b將化合物9b(209mg，0.61mmol)加入到硫代乙酸鉀的15mL丙酮溶液中，將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。在真空下除去丙酮，使殘余物在50mLCH2Cl2與3×25mL 1N NaOH之間分配。將CH2Cl2層干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮，得到棕色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(15/85 EtOAc/己烷)，得到166mg(94％)化合物21b，為無色的油1H NMR(CDCl3)δ1.39(m，4H)，1.48(s，9H)，1.59(m，4H)，2.32(s，3H).2.86(t，2H)，3.82(t，2H)，7.10(s，1H).
6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己-1-硫醇，化合物22b如下制備22b的純凈樣本。將化合物21b(50mg，172μmol)和22μL(17.4mg，85.8μmol)三正丁膦放置在氮下，向混合物中加入2mL氮噴射的1MNaOH的MeOH溶液。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，加入172μL(180mg，3mmol)三氟乙酸。使混合物在25mL EtOAc與3×25mL 1N HCl之間分配。將合并后的含水層用25mL EtOAc萃取，干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮，得到一種油。經(jīng)過硅膠色譜純化(15/85/0.1 EtOAc/己烷/MeOH)，得到28mg 22b，為無色的油1H NMR(CDCl3)δ1.32(t，1H)，1.40(m，4H)，1.49(s，9H)，1.62(m，4H)，2.53(d of t，2H).3.84(t，2H)，7.09(s，1H).
Boc-保護(hù)的AOHEX/SA/AHAB/TEG平臺，24b將化合物21b(13mg，45μmol)和6μL(4.5mg，22.3μmol)三正丁膦放置在氮下，向混合物中加入3mL氮噴射的4/16N NH4OH/CH3CN溶液。將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，在真空下濃縮。將殘余物溶于3mL氮噴射的10/90水/CH3CN溶液。向保持在氮?dú)夥障碌乃萌芤褐屑尤?0mg(7.44μmol)化合物23，再加入8μL(5.77mg，44.6μmol)二異丙基乙胺。將混合物攪拌18小時(shí)，在真空下濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(多級梯度，1/99至5/95至7.5/92.5至10/90至15/85MeOH/CH2Cl2)，得到14mg(93％)24b，為無色的油TLC(10/90 MeOH/CH2Cl2)，Rf＝0.3；質(zhì)譜(ES)m/zm/z 計(jì)算C92H174N14O26S4(M+2H)/21010.實(shí)測1010.
AOHEX/SA/AHAB/TEG平臺，25b按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物24b的Boc-保護(hù)基團(tuán)。
實(shí)施例6-AOHOC/DT/TEG平臺的合成合成流程如圖7所示。
6-(叔丁氧羰基氨基氧基)己-1-醇，化合物27向179μL(183mg，1.2mmol)DBU的1mL CH2Cl2溶液中加入133mg(1.0mmol)N-(叔丁氧羰基)羥胺(Aldrich Chemical Co.)和157μL(217mg，1.2mmol)6-溴己-1-醇(Aldrich Chemical Co.)，將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將混合物濃縮，得到黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(35/5/65EtOAc/MeOH/己烷)，得到180mg(77％)化合物27，為無色的油1H NMR(CDCl3)δ1.39(m，4H)，1.48(s，9H)，1.59(m，4H)，3.63(t，2H)，3.85(t，2H)，7.42(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ25.6，25.8，28.1，28.4，62.8，76.8，81.7，157.2.
化合物28在0℃下，向100mg(0.428mmol)化合物27的2mLCH2Cl2溶液中加入90μL(88.1mg，1.11mmol)吡啶，再加入113mg(0.557mg)對-硝基苯基氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)。將混合物在室溫下攪拌4小時(shí)。冷卻至0℃，用1N HCl酸化，在20mL 1N HCl與3×20mL CH2Cl2之間分配。將合并后的CH2Cl2層用NaHCO3飽和溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化，得到化合物28。
化合物29向二亞乙基三胺的EtOAc溶液中加入兩當(dāng)量二異丙基乙胺，再加入兩當(dāng)量化合物28。將混合物攪拌，直至反應(yīng)完全。除去溶劑，產(chǎn)物、即化合物29經(jīng)過硅膠色譜純化。
Boc-保護(hù)的AOHOC/DT/TEG平臺，30向三甘醇雙-氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)的吡啶溶液中加入兩當(dāng)量化合物29。將混合物攪拌，直至反應(yīng)完全，在1N HCl與CH2Cl2之間分配。將CH2Cl2層干燥，濃縮，產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜純化，得到化合物30。
AOHOC/DT/TEG平臺，化合物31按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物30的Boc-保護(hù)基團(tuán)。
實(shí)施例7-AOTEG/IDA/TEG平臺的合成合成流程如圖8所示。
化合物32向三甘醇雙-氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)的吡啶溶液中加入兩當(dāng)量亞氨基二乙酸(Aldrich Chemical Co.)。將混合物攪拌，直至反應(yīng)完全，在1N HCl與CH2Cl2之間分配。將CH2Cl2層干燥，濃縮，產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜純化，得到化合物32。
化合物33將化合物32的THF溶液用6當(dāng)量NHS和6當(dāng)量DCC處理1小時(shí)。向混合物中加入4當(dāng)量化合物11，將混合物攪拌，直至反應(yīng)完全。加以乙酸以猝滅過量的DCC，過濾除去所得固體。將濾液濃縮，經(jīng)過硅膠色譜純化，得到化合物33。
化合物34按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物33的Boc-保護(hù)基團(tuán)。
實(shí)施例8-AOTEGO/LEV/PITG平臺的合成合成流程如圖9所示。
對-硝基苯基乙酰丙酸酯，化合物35向800mg(6.89mmol)乙酰丙酸(Aldrich Chemical Co.)的4.25mL吡啶溶液中加入1.78g(7.58mmol)4-硝基苯基三氟乙酸酯(Aldrich Chemical Co.)。將所得溶液攪拌15分鐘，在28mL水與2×28mL CH2Cl2之間分配。將合并后的CH2Cl2層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。濃縮液經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度，25/75至30/70 EtOAc/己烷)，得到1.06g(74％)化合物351H NMR(CDCl3)δ2.28(s，3H)，2.87(m，4H)，7.29(d，2H)，8.28(d，2H).
1，2-Bis(2-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙氧基)乙烷，化合物36向243mg(0.66mmol)化合物12中加入219mg(1.64mmol)N-(叔丁氧羰基)羥胺(Aldrich Chemical Co.)，再加入246μL(250mg，1.64mmol)DBU。將混合物在室溫下攪拌，直至固化(約1小時(shí))。另放置一小時(shí)后，將混合物溶于2mL CH2Cl2，將所得溶液加入到100mL EtOAc中，以沉淀出DBU的碘化氫鹽。另加入50mL EtOAc，將混合物過濾。將濾液用2×50mL 1N HCl、2×50mL 5％亞硫酸氫鈉溶液和25mL鹽水洗滌。將EtOAc層干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮，得到一種油。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度，40/60至50/50至80/20 EtOAc/己烷)，得到164mg(65％)化合物36，為無色的油1H NMR(CDCl3)δ1.48(s，18H)，3.65(s，4H)，3.72(t，4H)，4.02(t，4H)，7.80(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ28.2，69.0，70.3，75.2，81.3，156.8.
1，2-Bis(2一氨基氧基乙氧基)乙烷，化合物37將化合物36(559mg，1.47mmol)溶于15mL EtOAc，向溶液中通入HCl氣達(dá)30分鐘。將混合物在真空下濃縮，得到72mg(90％)化合物37的HCl鹽，為粘性殘余物1H NMR(D2O)δ3.75(s，4H)，3.87(m，4H)，4.27(m，4H)；質(zhì)譜(ES)m/z 計(jì)算C6H17N2O4(M+H)181.1.實(shí)測181.1.
化合物38將化合物3用30％HBr的乙酸溶液處理，以除去CBZ保護(hù)基團(tuán)，得到四胺的溴化氫鹽。將四胺溶于碳酸氫鈉的水與二噁烷溶液，向所得溶液中加入四當(dāng)量化合物35。反應(yīng)一旦完成，使混合物在水與CH2Cl2之間分配。將CH2Cl2層濃縮，干燥，經(jīng)過硅膠色譜純化，得到化合物38。
AOTEGO/LEV/PITG平臺，化合物39向化合物38在0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的溶液中加入二十當(dāng)量化合物37。反應(yīng)一旦完全，使混合物在水與CH2Cl2之間分配。將CH2Cl2層濃縮，干燥，經(jīng)過硅膠色譜純化，得到化合物39。
實(shí)施例9-AO/DEGA/DEG平臺的合成合成流程如圖10所示。
化合物41將溴(約六當(dāng)量)滴加到化合物40、六當(dāng)量三苯膦與8當(dāng)量吡啶的CH2Cl2溶液中，直至持續(xù)為橙色。將混合物在室溫下攪拌0.5h或者直至反應(yīng)完全，加入亞硫酸氫鈉飽和溶液以破壞過量的溴。然后使混合物在H2O與EtOAc之間分配。將合并后的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮，經(jīng)過硅膠色譜純化，得到化合物41。
化合物42向化合物41中加入六當(dāng)量N-(叔丁氧羰基)羥胺(Aldrich Chemical Co.)和六當(dāng)量DBU。必要時(shí)將混合物加熱足夠的時(shí)間，使反應(yīng)完全。冷卻后，將混合物溶于CH2Cl2，將所得溶液加入到EtOAc中，導(dǎo)致沉淀的生成，過濾除去之，將濾液濃縮。經(jīng)過快速色譜純化，得到42。
化合物43按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物42的Boc-保護(hù)基團(tuán)。
實(shí)施例10-四價(jià)D1軛合物的合成合成流程如圖11所示。
四價(jià)D1軛合物、即化合物44的合成在聚丙烯試管內(nèi)，將如實(shí)施例1所述制備的TA/D1(0.90mg，1.28×10-7mol)溶于250μL 0.1M乙酸鈉pH 4.60緩沖液。向該混合物中加入16.6μL(18.9μg，1.60×10-8mol)0.97μmol/mL AOA/PITG平臺、即化合物5在0.1M乙酸鈉pH 4.60緩沖液中的溶液。將混合物在氮下輕微攪拌6天，此時(shí)經(jīng)分析型HPLC顯示反應(yīng)完全，條件是4.6mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac)，在280nm下檢測(1mL/min；梯度25％-45％B，0-20min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TFA/CH3CN)。大致的保留時(shí)間如下TA/D1，13.7min；化合物44，17.2min。將混合物用95/5水/乙腈稀釋至體積為1mL，經(jīng)HPLC純化(10mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac)(3mL/min；梯度25％-45％B，0-40min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TFA/CH3CN)。收集經(jīng)分析型HPLC證實(shí)含有純44的部分，冷凍干燥，得到0.4mg(25％)44質(zhì)譜(ES，平均m/z)C1320H2032N338O370S20計(jì)算29,198.實(shí)測29,218.
實(shí)施例11-四價(jià)D1軛合物的合成合成流程如圖12所示。
四價(jià)D1軛合物、即化合物45的合成在聚丙烯試管內(nèi)，將如實(shí)施例1所述制備的TA/D1(5.20mg，7.37×10-7mol)溶于2.0mL He噴射的0.1M乙酸鈉pH4.60緩沖液。向該混合物中加入15.07μL(139μg，1.23×10-7mol)8.147μmol/mL AOTEG/DEA/DEG平臺、即化合物16在0.1M乙酸鈉pH4.60緩沖液中的溶液。將混合物在氮下輕微攪拌23天，此時(shí)經(jīng)分析型HPLC顯示反應(yīng)完全，條件是4.6mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac)，在280nm下檢測(1mL/min；梯度25％-45％B，0-20min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。大致的保留時(shí)間如下TA/D1，13.7min；44，17.2min。將混合物用水稀釋至體積為5mL，經(jīng)HPLC純化(10mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac)(3mL/min；梯度25％-45％B，0-40min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TEA/CH3CN)。收集經(jīng)分析型HPLC證實(shí)含有純45的部分，冷凍干燥，45質(zhì)譜(ES，平均m/z)計(jì)算C1322H2048N334O377S2029,294.實(shí)測29,294.
實(shí)施例12-模型氨基氧基化合物的制備和與乙醛基肽的反應(yīng)性比較合成流程如圖14所示。
乙醛基肽、即化合物47的合成利用N-Fmoc保護(hù)的氨基酸，在Wang樹脂上按照標(biāo)準(zhǔn)的固相合成法制備化合物46(SEQ.ID No.1)。用3當(dāng)量N-Fmoc保護(hù)的氨基酸、3當(dāng)量DIC和3當(dāng)量HOBt的DMF溶液進(jìn)行偶聯(lián)。用20％吡啶的DMF溶液進(jìn)行去保護(hù)。肽從樹脂上裂解，經(jīng)過反相HPLC純化(C梯度，10-30％B，0-40min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。將經(jīng)分析型HPLC(4.6×250mm C18，1mL/min，梯度，10-60％B，0-20min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN，Tr＝10.3min)證實(shí)為純的部分冷凍干燥，得到化合物46，為絨毛狀白色固體質(zhì)譜(ES)(M+H)C4) H67Ni20n計(jì)算903.5.實(shí)測903.5.
向163mg(0.18mmol)化合物46在3.67mL CH3CN與19mL 10mM磷酸鈉pH7.0緩沖液中的溶液中加入77.2mg(0.361mmol)高碘酸鈉的5.4mL水溶液。將混合物在室溫下攪拌30分鐘，加入100μL乙酸。將混合物過濾，濾液經(jīng)過HPLC純化(C18，梯度，15-30％B，0-40min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。將經(jīng)分析型HPLC(4.6×250mm C18，1mL/min，梯度，10-35％B，0-20min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN，Tr＝10.3min)證實(shí)為純的部分冷凍干燥，得到124mg(79％)化合物47(SEQ ID No.2)，為白色固體質(zhì)譜(ES)(M+H)C40H62N11O11872.5.實(shí)測872.5.
化合物49的合成向250mg(0.801mmol)化合物2的5mL CH2Cl2溶液中加入158μL(166mg，1.58mmol)氨基二甘醇(Aldrich ChemicalCo.)。向所得溶液中加入298μL(221mg，1.71mmol)二異丙基乙胺，將混合物在室溫氮?dú)夥障聰嚢?.5小時(shí)。使混合物在100mL CH2Cl2與20mL飽和Na2CO3溶液之間分配，將CH2Cl2層連續(xù)用兩份20mL飽和Na2CO3溶液、兩份20mL 1N HCl和20mL鹽水洗滌。將含水HCl層用五份50mL CH2Cl2萃??；將含水Na2CO3層用兩份50mL CH2Cl2萃取。將合并后的有機(jī)層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(70/30 EtOAc/己烷)，得到164mg(73％)化合物49的Boc-保護(hù)的前體，為粘性無色的油1H NMR(CDCl3)δ1.48(s，9H)，3.52(m，2H)，3.62(m，4H)，3.77(m，2H)，4.35(s，2H)，7.64(s，1H)，8.33(brds，1H).
如下除去Boc保護(hù)基團(tuán)。將Boc保護(hù)的前體(164mg，0.59mmol)溶于5mL 50/50三氟乙酸/CH2Cl2，將混合物在室溫下攪拌兩小時(shí)。在微弱氮?dú)饬飨抡舭l(fā)混合物，將殘余物再次溶于CH2Cl2。將溶液在真空下濃縮，得到179mg(理論收率104％，其余假定為TFA)化合物49的三氟乙酸鹽，為無色的油質(zhì)譜(ES)(M+H) C6H15N2O4計(jì)算179.2.實(shí)測179.1.
化合物50的合成向5.0mg(5.62μmol)化合物47在7.6mL 0.1MpH 4.6乙酸鈉緩沖液中的溶液中加入3.29mg化合物49(估計(jì)純度96％，1.70mg，5.82μmol)在10mL 0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的582μL溶液，將混合物攪拌六天。混合物直接經(jīng)過HPLC純化(C18；梯度，25％-45％ B，0-40min，A＝含水pH7.0磷酸三乙銨(制備方法是將500mL 0.1％ H3PO4與約500mL 0.3％ Et3N混合，得到pH為7.0)，B＝CH3CN)。將含有產(chǎn)物的部分冷凍干燥，得到0.3mg化合物50質(zhì)譜(ES)(M+H) C46H74N13O14計(jì)算1032.5.實(shí)測1032.6.
化合物51的合成將化合物8(100mg，0.38mmol)溶于25mL 1/9三氟乙酸/CH2Cl2，將混合物在室溫下放置2小時(shí)。在微弱氮?dú)饬飨抡舭l(fā)混合物，將殘余物再次溶于CH2Cl2。將溶液在真空下濃縮，得到152mg(理論收率145％，其余假定為TFA)化合物51的三氟乙酸鹽，為無色的油質(zhì)譜(ES)(M+H) C6H16NO4計(jì)算165.1.實(shí)測165.1.
化合物52的合成向5.0mg(5.62μmol)化合物47在7.6mL 0.1MpH 4.6乙酸鈉緩沖液中的溶液中加入845μL 3.29mg化合物51(估計(jì)純度69％，1.63mg，5.82μmol)在在10mL 0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的溶液，將混合物攪拌21小時(shí)。混合物直接經(jīng)過HPLC純化(C18；梯度，25％-45％B，0-40min，A＝含水pH7.0磷酸三乙銨(制備方法是將500mL 0.1％H3PO4與約500mL 0.3％ Et3N混合，得到pH為7.0)，B＝CH3CN)。將含有產(chǎn)物的部分冷凍干燥，得到3mg化合物52質(zhì)譜(ES)計(jì)算(M+H) C46H75N12O141019.5.實(shí)測1019.5.
49轉(zhuǎn)化為50和51轉(zhuǎn)化為52的速率比較49(AOA-ADEG-OH，包含氨基氧基乙?；?轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物50和51(AO-TEG-OH，包含氨基氧基烷基)轉(zhuǎn)化為52的速率是這樣測量的，在不同時(shí)間點(diǎn)將反應(yīng)混合物試樣注射到分析型HPLC上，用分析型HPLC測量該時(shí)間的產(chǎn)物含量(C18，梯度，10-60％B，0-40min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。如圖13所述，包含氨基氧基烷基的化合價(jià)平臺分子更加迅速地與模型肽生成肟軛合物。
實(shí)施例13-利用化合物37作為雙官能連接劑制備四價(jià)軛合物的替代方法作為使氨基轉(zhuǎn)移的第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽或任意其他乙醛基化多肽直接與四價(jià)氨基氧基平臺反應(yīng)的替代選擇，可以使氨基轉(zhuǎn)移的多肽與過量化合物37在pH4.6 100mM乙酸鈉緩沖液中反應(yīng)，得到化合物53，其中氨基氧基連接劑經(jīng)由肟鍵與該多肽(這里是第1結(jié)構(gòu)域多肽)結(jié)合。合成流程如圖15所示。從過量連接劑中分離化合物53，使四價(jià)的化合物53與平臺38在pH4.6 100mM乙酸鈉緩沖液中反應(yīng)，生成第二套肟鍵，得到四價(jià)軛合物、即化合物54。
實(shí)施例14-利用化合物21作為雙官能連接劑前體制備四價(jià)軛合物的替代方法將化合物21a用氫氧化銨處理，以除去乙?；虮Ｗo(hù)基團(tuán)，然后用三氟乙酸處理，以Boc保護(hù)基團(tuán)，得到連接劑55。含有乙醛基的多肽在這種情況下是TA/D1，使其與化合物55反應(yīng)，得到化合物56，即經(jīng)由肟鍵結(jié)合有巰基連接劑的第1結(jié)構(gòu)域。四價(jià)化合物56可以與平臺23反應(yīng)，得到四價(jià)的第1結(jié)構(gòu)域多肽軛合物，即化合物57。合成流程如圖16所示。
實(shí)施例15-化合物85的合成，圖21按照本質(zhì)上與化合物20的合成(如圖4所示)相同的方式進(jìn)行氨基氧基平臺、即化合物85的合成；不過，使用化合物28代替化合物17。使化合物18與化合物28反應(yīng)，如圖23所示，得到Boc-保護(hù)的平臺99。按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物99的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到85。
實(shí)施例16-化合物86的合成，圖21化合物86的制備涉及制備Boc-保護(hù)的氨基氧基己酸、即化合物105，再用其?；陌被脚_、即化合物108，如圖24流程B所示。
6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己酸乙酯，化合物104歷經(jīng)約一分鐘的時(shí)間，向磁攪拌著的500mg(3.76mmol)N-(叔丁氧羰基)羥胺(Aldrich Chemical Co.)與267μL(335mg，1.50mmol)6-溴己酸乙酯的混合物中加入1.12mL(1.14g，7.51mmol)DBU。將混合物攪拌24小時(shí)，此時(shí)它已部分固化。將混合物溶于100mL CH2Cl2，將所得溶液在分液漏斗內(nèi)與四份25mL 1N HCl和25mL鹽水搖動。棄去含水層，將CH2Cl2層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。所得黃色的油經(jīng)過硅膠色譜純化(3/7 EtOAc/己烷)，得到285mg化合物1041H NMRCDCl3(δ)1.25(t，3H)，1.42(m，2H)，1.50(s，9H)，1.65(m，4H)，2.30(t，2H)，3.83(t，2H)，4.12(q，2H)，7.28(s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)14.4，24.9，25.6，27.8，28.4，34.3，60.4，76.6，81.7，157.1，173.8；HRMS(MALDI-FTMS)計(jì)算(M+Na) C13H25NaNO5298.1630.實(shí)測298.1631.
6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己酸，化合物105向1.50g(5.44mmol)化合物104的20mL EtOH溶液中加入5.44mL(54.4mmol)10N NaOH，將混合物攪拌18小時(shí)。使混合物在100mL 1N HCl與四份100mL CH2Cl2之間分配。將CH2Cl2層合并，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(50/50/1己烷/EtOAc/HOAc)，得到1.22g(90％)化合物105，為無色的油1HNMR CDCl3(δ)1.45(m，2H)，1.48(s，9H)，1.66(m，4H)，2.37(t，2H)，3.85(t，2H)，7.21(s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)24.6，25.5，27.8，28.4，34.0，76.6，82.0，157.5，179.3.
N-羥基琥珀酰亞胺基6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己酸酯，化合物106向1.07g(4.32mmol)化合物105與497mg(4.32mmol)N-羥基琥珀酰亞胺的20mL CH2Cl2溶液中加入818mg(1.01mL，6.48mmol)二異丙基碳二亞胺。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，加入1mL HOAc。另將混合物攪拌3小時(shí)，在真空下濃縮。將殘余物溶于75％EtOAc/己烷，過濾除去不溶物。濃縮濾液，所得黃色的油經(jīng)過硅膠色譜純化(50/50 EtOAc/己烷)，得到1.31g(88％)化合物106，為無色的油1H NMR CDCl3(δ)1.50(s，9H)，1.52(m，2H)，1.69(m，2H)，1.80(m，2H)，2.63(t，2H)，2.84(s，4H)，3.88(t，2H)，7.25(s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)24.4，25.1，25.6，27.5，28.2，30.8，76.1，81.5，157.3，168.6，169.4.
Boc-保護(hù)的氨基氧基己?；?AHAB/TEG平臺、即109的合成如前人所述(美國專利No.5,633,395反應(yīng)流程4)得到化合物107并轉(zhuǎn)化為化合物108。向50mg(0.058mmol)化合物108的1mL THF溶液中加入38μL(37mg，0.464mmol)吡啶，再加入120mg(0.348mmol)化合物106的1mL THF溶液。將混合物攪拌18小時(shí)，用1N HCl酸化，在15mL 1N HCl與三份15mL CH2Cl2之間分配。將合并后的CH2Cl2層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。所得的油經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度；95/5CH2Cl2/MeOH至90/10CH2Cl2/MeOH至80/20CH2Cl2/MeOH)，得到25mg(24％)化合物109，為一種膠1H NMR CDCl3(δ)1.32(M，18H)，1.47(s，9H)，1.65(m，18H)，2.20(t，16H)，1.80(m，2H)，3.21(m，8H)，3.40(brd s，16H)，3.68(m，8H)，3.82(t，8H)，6.52(t，2H)，6.60(t，2H)，7.13(t，2H)，7.21(t，2H)，7.88(s，1H)；質(zhì)譜(ESI)(M+H)計(jì)算C84H157N14O261777.實(shí)測1778.
氨基氧基己?；?AHAB/TEG平臺，86按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物109的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到86。
實(shí)施例17-化合物91的合成，圖221-疊氮基-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己烷、即化合物99的合成將300mg(0.874mmol)1-碘-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己烷(化合物98，如Jones et al.《四面體快報(bào)》(Tetrahedron Letters)2000，41，1531-1533所述制備)與455mg(7.00mmol)疊氮化鈉的4mL DMF溶液在氮下攪拌72小時(shí)。使混合物在50mL EtOAc與三份25mL H2O之間分配。將EtOAc層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化(15/85EtOAc/己烷)，得到219mg(97％)化合物99，為無色的油1H NMRCDCl3(δ)1.41(m，4H)，1.49(s，9H)，1.63(m，4H)，3.28(t，2H)，3.83(t，2H)，7.22(s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)25.7，26.7，28.0，2g.4，28.9，51.5，76.7，81.7，157.1.
化合物96的合成在裝有干冰冷凝器的反應(yīng)容器內(nèi)，將液氨加入到化合物22a(6.6-8.8mmol)中，將所得混合物攪拌5min。加入全-6-脫氧-6-碘-環(huán)糊精(1mmol，Ashton等《有機(jī)化學(xué)雜志》(J.Org.Chem.)1996，61，903；Gadelle和Defaye，《應(yīng)用化學(xué)國際英文版》(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)1991，30，78)。攪拌6h后，蒸發(fā)氨，將殘余物在真空下進(jìn)一步干燥，經(jīng)過快速色譜純化，得到化合物96。
1-氨基-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己烷、即化合物100的合成將180mg(0.697mmol)化合物99與219mg(0.836mmol)三苯膦的4mLTHF與1mL H2O溶液在室溫下攪拌18小時(shí)。經(jīng)TLC證實(shí)仍然存在原料，因此另加入55mg(0.209mmol)三苯膦，將混合物攪拌7小時(shí)。將混合物濃縮，經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度；2/5/93至2/10/88濃NH4OH/H2O/CH3CN)，得到151mg化合物100，為無色的油1H NMR CDCl3(δ)1.35(m，4H)，1.49(s，9H)，1.61(m，4H)，2.69(t，2H)，3.82(t，2H)；13C NMR CDCl3(δ)25.8，26.7，28.1，28.3，33.2，41.9，76.7，81.3，157.1.
化合物101的合成向84mg(81.8μmol)化合物14的1mL CH2Cl2溶液中加入114mg(491μmol)化合物100的0.5mL CH2Cl2溶液，再加入86μL(63mg，491μmol)二異丙基乙胺。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，用38μL(39mg，654μmol)乙酸猝滅，濃縮得到一種油。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度；2/98至7.5/92.5MeOH/CH2Cl2)，得到115mg(100％)101，為一種油1HNMR CDCl3(δ)1.38(m，16H)，1.47(s，36H)，1.59(m，16H)，3.13(m，8H)，3.50(m，8H)，3.69(t，4H)，3.82(t，8H)，4.18(m，4H)，4.22(m，8H)，5.42(m，2H)，5.56(m，2H)；質(zhì)譜(ESI)(M+Na)計(jì)算C62H116NaN10O251423.實(shí)測1423化合物91按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物101的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到91。反應(yīng)流程如圖25所示。
實(shí)施例18-化合物92的合成，圖22如圖26所述制備化合物92。如PCT US99/29338所述制備四N-Boc-氨基平臺39b’。使二甘醇與對-硝基苯基氯甲酸酯反應(yīng)，得到二對-硝基苯基碳酸酯化合物，然后與二乙醇胺反應(yīng)，生成四羥基化合物，進(jìn)而與對-硝基苯基氯甲酸酯反應(yīng)，得到四對-硝基苯基碳酸酯化合物，進(jìn)而與四丁基N-(2-氨基乙基)氨基甲酸酯反應(yīng)，得到39b’。將化合物39b’用三氟乙酸去保護(hù)，得到四胺化合物102。
化合物103向20mg(0.023mmol)化合物102在0.5mL飽和碳酸氫鈉溶液中的溶液中加入60mg(0.140mmol)化合物17的0.5mL二噁烷溶液。將混合物在室溫下攪拌5小時(shí)，冷卻至0℃，滴加1N HCl進(jìn)行酸化。使混合物在7mL H2O與四份10mL CH2Cl2之間分配。將合并后的CH2Cl2層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。經(jīng)過制備型HPLC純化(C18，梯度，30％ B至50％ B 40min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)，得到12mg(27％)103，為粘性的油1H NMR CDCl3(δ)1.48(s，36H)，3.26(m，16H)，3.51(m，8H)，3.68(m，44H)，4.02(m，8H)，4.21(m.12H)，6.12(brd m，8H)，8.09(brd s，4H)；質(zhì)譜(ESI)(M+Na)計(jì)算C79H136NaN14O411900.實(shí)測1900.
化合物92按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物103的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到92。反應(yīng)流程如圖26所示。
實(shí)施例19-八聚平臺113的合成在0℃下，向氮噴射的0.50g(1.71mmol)化合物21b的8mL MeOH溶液中加入537μL 25％ NaOMe的MeOH溶液(2.57mmol)，將混合物在0℃下攪拌2小時(shí)，加入5.14mL(5.14mmol)氮噴射的1M KHCO3溶液，將混合物在0℃氮下攪拌15分鐘。向混合物中滴加283mg(0.14mmol)化合物111(如Xeno專利所述制備)的10mL 2/1MeOH/水溶液。濃縮反應(yīng)混合物，以除去MeOH，將濃縮液再次溶于乙腈。然后將反應(yīng)混合物在室溫氮下攪拌3天，濃縮，在40mL EtOAc與20mL水之間分配。濃縮EtOAc層，產(chǎn)物經(jīng)過Amberchrom色譜純化(70/30乙腈/H2O)，得到100mg化合物112，為白色粉末1H NMR(CD3OD)δ1.36(m，48H)，1.42(s，72H)，1.57(m，64H)，2.14(m，8H)，2.55(m，16H)，3.11(m，36H)，3.24(m，8H)，3.30(brd s，16H)，3.71(t，16H)，4.2(m，4H)；13C NMR(CD3OD)δ24.31，25.58，26.73，27.77，28.82，29.16，29.73，29.78，30.17，30.24，30.35，33.21，33.69，36.35，36.53，37.17，38.87，39.09，40.43，40.53，54.95，66.07，70.50，71.65，77.44，82.00，158.25，159.20，172.63，172.78，173.97，176.28；質(zhì)譜(ESI)(M+2Na)/2計(jì)算C168H312Na2N26O46S81866.實(shí)測1866.
化合物113按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物112的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到113。反應(yīng)流程如圖27所示。
實(shí)施例20-化合物125的合成化合物115向8.00g(13.4mmol)化合物114(如美國專利No.5,552,391所述制備)的80mL無水DMF溶液中加入4.00g(16.1mmol)N-(芐氧羰基氧基)琥珀酰亞胺(Aldrich Chemical Co.)。將混合物在室溫氮下攪拌2小時(shí)，此時(shí)將其倒入600mL冰水中，用四份100mL CH2Cl2萃取。將合并后的CH2Cl2層用100mL H2O洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮。從庚烷中濃縮有助于使粗產(chǎn)物固化。從EtOAc中重結(jié)晶，得到化合物115，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ12.6(m，4H)，1.43-1.62(m，8H)，2.05(m，4H)，3.16(q，4H)，3.40(brd s，8H)，4.98(s，2H)重疊與5.08(s，4H)和5.11(s，2H)，6.31(s，1H)，6.44(s，1H)，7.26-7.38(m，15H).
三胺化合物116的合成向9.0g(12.3mmol)化合物115的18mL環(huán)己烷與36mL無水乙醇溶液中通入N2氣進(jìn)行脫氧。向溶液中加入1.80g 10％ Pd/C，將混合物加熱回流3小時(shí)。冷卻后，使混合物通過Celite過濾，用MeOH清洗。濃縮濾液，將濃縮液從CH2Cl2中濃縮，得到4.20g(87％)化合物116，為不完全白色固體。
化合物117的合成向5.39g(21.8mmol)化合物105的10mL無水乙腈溶液中加入3.02g(23.9mmol)CDI(羰基二咪唑)，將混合物在氮?dú)夥障聰嚢?.5小時(shí)。將所得溶液加入到4.20g(10.7mmol)化合物116的15mL無水DMF溶液中，將混合物攪拌2小時(shí)，倒入500mL冰水中。將所得混合物用四份100mL CH2Cl2萃取。將合并后的CH2Cl2層用100mL H2O洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮。所得半固體殘余物從10％異丙醇/EtOAc中結(jié)晶，得到4.0g(44％)117，為白色固體1H NMRCDCl3(δ)1.35(m，4H)，1.42(m，4H)，1.49(s，18H)，1.63(m，16H)，2.01(brd s，1H)，2.20(t，4H)，3.23(m，4H)，3.34(m，4H)，3.85(t，4H)，6.34(t，2H)，6.70(t，2H)，7.98(brd s，1H).
化合物119向3.65g(14.11mmol)9-芴甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl)的15mL二噁烷溶液中加入3.00g(15.5mmol)化合物118(Bondunov等《有機(jī)化學(xué)雜志》(J.Org.Chem.)1995，Vol.60，pp.60976102)的15mL二噁烷溶液，再加入1.95g(14.11mmol)碳酸鉀的30mL H2O溶液。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，濃縮。使所得的油在50mL 1NNaOH溶液與三份150mL CH2Cl2之間分配。將合并后的CH2Cl2層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度；90/10 EtOAc/AcOH至90/10/1 EtOAc/AcOH/MeOH)，得到3.85g(66％)119，為粘性的油1H NMR CDCl3(δ)3.26(m，4H)，3.39(m，2H)，3.49(m，2H)，3.59(m，2H)，3.65(m，4H)，3.69(m，2H)，4.25(t，1H)，4.60(d，2H)，7.35(t，2H)，7.41(t，2H)，7.59(d，2H)，7.78(d，2H).
化合物120在0℃下，向3.77g(9.08mmol)化合物119與7.32g(36.3mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的50mL CH2Cl2溶液中加入5.88mL(5.75g，72.6mmol)吡啶。將混合物在室溫氮?dú)夥障聰嚢?2小時(shí)，使混合物在200mL CH2Cl2與四份100mL 10％碳酸氫鈉水溶液之間分配。將CH2Cl2層連續(xù)用100mL H2O、100mL 1N HCl和100mL鹽水洗滌。將溶液干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到橙色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(15/50/35/1 EtOAc/CH2Cl2/己烷/AcOH)，得到2.67g(39％)化合物120，為黃色的膠1H NMR(CDCl3)δ3.32(m，4H)，3.52(m，2H).3.60(m，4H)，3.74(m，2H)，4.23(t，1H)，4.38(m，2H)，4.41(m，2H)，4.57(d，2H)，7.37(m，8H)，7.59(d，2H)，7.78(d，2H)，8.26(重疊的d，4H)；質(zhì)譜(ESI)(M+H) 計(jì)算C37H36N3O14746.實(shí)測746.
化合物121向482mg(0.612mmol)化合物117的5mL CH2Cl2溶液中加入182mg(0.245mmol)化合物120，再加入171μL(124mg，1.22mmol)Et3N和26mg(.490mmol)HOBt。將混合物在室溫下攪拌，直至用TLC(1/9 MeOH/CH2Cl2)判斷反應(yīng)完全。使混合物在300mL CH2Cl2與三份50mL 1N HCl之間分配。將CH2Cl2層用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(多級梯度；5/1/94至10/1/89至15/1/84至20/1/79 MeOH/HOAc/CH2Cl2)，得到317mg(63％)化合物121，為粘性白色固體1H NMR(CD3OD)δ1.34(m，16H)，1.43(m，8H)，1.48(s，36H)，1.64(m，24H)，2.20(m，16H)，3.19(m，12H)，3.25-3.52(m，18H)，3.55(m，2H)，3.79(t，8H)，4.16(m，4H)，4.28(t，1H)，4.59(d，2H)，7.33(t，2H)，7.41(t，2H)，7.60(d，2H)，7.84(d，2H)；13C NMR(CD3OD)δ14.6，23.8，26.7，26.7，26.9，27.7，28.8，28.9，30.3，37.1，38.8，39.1，40.3，65.8，66.0，68.1，70.2，70.3，77.3，82.0，121.2，126.0，128.4，129.0，142.9，145.6，157.9，158.2，159.2，176.1，176.3；質(zhì)譜(ESI)(M+2Na)/2計(jì)算C101H171Na2N15O281044.實(shí)測1044.
化合物122向163mg(79.8mmol)化合物121的2.4mL DMF溶液中加入600μL二乙胺。將混合物攪拌3小時(shí)，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化(多級梯度；10/1/89至至15/1/84 MeOH/濃NH4OH/CH2Cl2)，得到127mg(81％)化合物122，為玻璃狀膠1H NMR(CD3OD)δ1.38(m，16H)，1.48(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，2.83(t，4H)，3.17(t，8H)，3.38(m，16H)，3.63(t，4H)，3.69(t，4H)，3.78(t，4H)，4.21(m，4H)；13C NMR(CD3OD)δ26.7，27.0，27.8，28.8，28.9，30.3，37.1，38.8，39.1，40.3，49.9，66.0，70.4，70.9，77.3，82.0，158.2，159.2，176.1，176.3；質(zhì)譜(ESI)(M+H)計(jì)算C86H162N15O261821.實(shí)測1821.
化合物124b向20mg(11.0μmol)化合物122的5mL DMF溶液中加入103mg(8.8μmol)分子量為11,690g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG12K-BTC，化合物123b，Shearwater Polymers)，再加入5μL(3.6mg，35.9mmol)Et3N。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(多級梯度；5/95至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到109mg化合物124b，為蠟狀不完全白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m.4H)，3.68(m，約1056H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H).
化合物124a利用本質(zhì)上與化合物124b制備所用相同的操作制備該化合物；不過，使用分子量為5,215g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG5K-BTC，化合物123a，Shearwater Polymers)1H NMR(4∶1CDCl3/CD3OD)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，約468H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H).
化合物124c利用本質(zhì)上與化合物124b制備所用相同的操作制備該化合物；不過，使用分子量為22,334g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG20K-BTC，化合物123c，Shearwater Polymers)1H NMR(5∶1CDCl3/CD3OD)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，約2024H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H).
化合物125b按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物124a-c的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到化合物125a-c。
反應(yīng)流程如圖28所示。
實(shí)施例21-化合物129的合成化合物126向14mg(18.6μmol)化合物120與29mg(186.3μmol)HOBT的5mL無水DMF溶液中加入56μL(38mg，373μmol)Et3N。將混合物攪拌1小時(shí)，加入85mg(46.6μmol)化合物122的1mL DMF溶液。將混合物在室溫下攪拌5小時(shí)，在150mL CH2Cl2與50mL 1N HCl之間分配。將CH2Cl2層用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化，得到34mg(44％)化合物126，為蠟狀白色固體1H NMR(CD3OD)δ1.37(m，32H)，1.49(m與s重疊在1.48，88H)1.62(m，48H)，2.20(t，32H)，3.18(t，16H)，3.36(m，32H)，3.50(m，12H)，3.64(m，24H)，3.79(t，16H)4.17(m，12H)，4.29(t，1H)，4.60(d，2H)，7.37(t，2H)，7.43(t，2H)，7.65(d，2H)，7.84(d，2H)；質(zhì)譜(ESI)(M+3Na)/3 計(jì)算C197H347Na3N31O601393.實(shí)測1393.
化合物127向34mg(8.27μmol)化合物126的1.6mL DMF溶液中加入400μL二乙胺。將混合物在室溫下攪拌4小時(shí)，濃縮。濃縮液經(jīng)過硅膠色譜純化(1/10/89濃NH4OH/MeOH/CH2Cl2)，得到13mg(40％)化合物1271H NMR(CD3OD)δ1.35(m，32H)，1.49(與s重疊在1.48，88H)，1.63(m，48H)，2.19(t，32H)，3.08(brd t，4H)3.17(t，16H)，3.38(m，36H)，3.52(m，8H)，3.63(t，8H)，3.70(m，12H)，3.78(t，16H)，4.21(m，12H)；質(zhì)譜(ESI)(M+3Na)/3計(jì)算C182H337Na3N31O581319.實(shí)測1319.
化合物128向13mg(3.34μmol)化合物127的5mL吡啶溶液中加入60mg(2.68μmol)分子量為22，334g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG20K-BTC，Shearwater Polymers)，再加入5μL(3.6mg，35.9μmol)Et3N。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(多級梯度；10/90至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到45mg化合物128，為蠟狀固體1H NMR(CDCl3)δ1.30(m，32H)，1.50(mc(m與s重疊在1.48，88H)，1.67(m，48H)，2.24(t，32H)，3.23(m，16H)，3.41(m，32H)，3.65(m，約2024H)，3.70(t，24H)，3.89(m，16H)，4.21(m，12H).
化合物129按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物128的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到129，如圖29所示。
實(shí)施例22-化合物132的合成化合物131向22mg(27.3μmol)化合物117的5mL吡啶溶液中加入236mg(10.9μmol)分子量為21,529g/mol的聚乙二醇雙-苯并三唑基碳酸酯(PEG20K-bis-BTC，化合物130，Shearwater Polymers)，再加入8μL(5.8mg，57.4mmol)Et3N。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(多級梯度；5/95至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到242mg(96％)化合物131，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.35(m，16H)，1.48(m，44H)，1.61(m，24H)，2.20(m，16H)，3.22(m，8H)，3.52-3.96(m，約2000H)，4.23(m，4H).
化合物132按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物131的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到132。
反應(yīng)流程如圖30所示。
實(shí)施例23-化合物136的合成化合物134向3.87mg(4.85μmol)季戊四醇四-(4-硝基苯基碳酸酯)(通過季戊四醇與對-硝基苯基氯甲酸酯的反應(yīng)制備，得到四對-硝基苯基碳酸酯化合物)的5mL吡啶溶液中加入124mg(24.2μmol)分子量為5094g/mol的單-Boc-保護(hù)的二氨基聚乙二醇(化合物133，BocNH-PEG(5K)-NH2)和5μL(3.63mg，35.9μmol)Et3N。將混合物攪拌18小時(shí)，濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度；5/95至15/85MeOH/CH2Cl2)，得到77mg(77％)化合物134，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.48(s，36H)，3.32(m，16H)，3.52-3.96(m，約1818H)，4.10(m，8H).
化合物135將化合物134(77mg，3.73μmol)溶于5mL三氟乙酸，將混合物放置三小時(shí)。在N2氣流下除去TFA，將殘余物溶于5mL CH2Cl2。向所得溶液中加入7.72mg(22.4μmol)化合物106的5mL CH2Cl2溶液，再加入35μL(25.4mg，251μmol)Et3N(注應(yīng)當(dāng)檢查混合物的pH，并相應(yīng)地用Et3N進(jìn)行調(diào)整，以確保其為堿性)。將混合物在氮下攪拌18小時(shí)。使混合物在50mL CH2Cl2與三份25mL 1N HCl之間分配。將CH2Cl2層用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度；5/95至10/90 MeOH/CH2Cl2)，得到42mg(53％)化合物135，為蠟狀固體1H NMR(CDCl3)δ1.40(m，8H)，1.48(s，36H)，1.66(m，16H)，2.18(t，8H)，3.32(m.16H)，3.38-3.89(m，約1818H)，4.10(m，8H)，4.97(t，4H)，6.43(t，4H)，7.47(s，4H).
化合物136按照本質(zhì)上類似于制備化合物16所述方式，除去化合物135的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到化合物136，如圖31所示。
實(shí)施例24-化合物143的合成化合物137在氮?dú)夥障拢?℃的200mg(1.11mmol)3，5-二氨基苯甲酸乙酯的5mL CH2Cl2溶液中加入928μL(674mg，6.66mmol)Et3N。向混合物中滴加510μl(710mg，3.33mmol)6-溴己酰氯的5mLCH2Cl2溶液。將混合物在室溫下攪拌1.5小時(shí)，在50mL 1N HCl與兩份50mL CH2Cl2之間分配。將CH2Cl2層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜純化(6/4己烷/EtOAc)，得到554mg(93％)化合物137，為一種油
1H NMR(CDCl3)δ1.39(t，3H)，1.52(m，4H)，1.75(m，4H)，1.90(m，4H)，2.40(t，4H)，3.42(t，4H)，4.36(q，2H)，7.60(s，2H)，7.88(s，2H)，8.17(s，1H).
化合物138將DBU(612μL，623mg，4.01mmol)加入到547mg(1.02mmol)化合物137與272mg(2.05mmol)N-(叔丁氧羰基)羥胺(Aldrich Chemical Co.)的溶液中。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，在50mL 1N HCl與三份50mL CH2Cl2之間分配。將合并后的CH2Cl2層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜純化(1/1己烷/EtOAc)，得到216mg(33％)化合物138，為白色固體mp55-60℃；1H NMR(CDCl3)δ1.38(t，3H)，1.48(s，18H；buried m，4H)，1.60(m，4H)，1.73(m，4H)，2.40(m，4H)，3.86(t，4H)，4.36(q，2H)，7.41(s，2H)，7.90(s，2H)，8.06(s，2H)，8.11(s，1H)；質(zhì)譜(ESI)(M+Na) 計(jì)算C31H50NaN4O10661.實(shí)測661.
化合物139向205mg(0.32mmol)化合物138的1/1丙酮/EtOH溶液中加入256μL(2.56mmol)10N NaOH，將混合物加熱至60℃達(dá)4小時(shí)。冷卻后，使混合物在50mL 1N HCl與四份50mL 4/1 CH2Cl2/MeOH之間分配。將合并后的有機(jī)層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜純化(3/97/1 MeOH/CH2Cl2/HOAc)，得到184mg(94％)化合物139，為粘性的油1H NMR(CDCl3)δ1.38(m，4H)，1.42(s，18H)，1.60(m，4H)，1.70(m，4H)，2.38(m，4H)，3.80(t，4H)，7.77(s，2H)，8.00(s，2H)，8.11(s，1H)，8.91(s，2H)；質(zhì)譜(ESI)(M+Na) 計(jì)算C29H46NaN4O10633.實(shí)測633.
化合物140向0℃的164mg(0.268mmol)化合物139的2.0mL無水THF溶液中加入31mg(0.268mmol)N-羥基琥珀酰亞胺，再加入83mg(0.403mmol)DCC。使混合物達(dá)到室溫，在氮?dú)夥障聰嚢?8小時(shí)，加入200μL HOAc。另將混合物攪拌一小時(shí)，用約5mL EtOAc稀釋，放置一小時(shí)。過濾除去所得沉淀，濃縮濾液。經(jīng)過硅膠色譜純化(3/97MeOH/CH2Cl2)，得到129mg(68％)化合物140，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.40(m，4H)，1.43(s，18H)，1.65(m，4H)，1.80(m，4H)，2.34(m，4H)，2.93(s，4H)，3.85(t，4H)，7.68(s，2H)，7.87(s，2H)，8.36(s，1H)，8.61(s，2H).
化合物142向60mg(0.85mmol)化合物140的0.5mL CH2Cl2溶液中加入14μL(13.3mg，0.168mmol)吡啶。將混合物冷卻至0℃，加入71mg(0.021mmol)二氨基-PEG、即化合物141的0.5mL CH2Cl2溶液。將混合物在室溫氮?dú)夥障聰嚢?8小時(shí)，在10mL 1N HCl與三份10mL CH2Cl2之間分配。將合并后的CH2Cl2層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化(分級梯度；5/95 MeOH/CH2Cl2至10/90MeOH/CH2Cl2)，得到66mg(69％)化合物142，為粘性的油1HNMR(CDCl3)δ1.45(s，36H)，1.60-1.80(m，24H)，2.39(t，8H)，3.39(m，8H)，3.50-3.80(brd s，約318H)，3.87(t，8H)，4.22(t，4H)，7.50(brd s，2H)，7.63(s，4H)，7.77(s，2H)，8.08(s，2H)，8.60(s，2H)；質(zhì)譜(MALDI)(M+H)計(jì)算C207H389N12O934535.實(shí)測以約4324為中心分布.
化合物143按照本質(zhì)上類似于化合物16制備所述方式，除去化合物142的Boc-保護(hù)基團(tuán)，得到143，如圖32所示。
化合物25-軛合物的制備方法如下制備軛合物200、201、202、203、204和205(圖33)。
化合物200向68.8mg(9.74μmol，6當(dāng)量)TA/D1在10mL氦噴射的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的溶液中加入36.8mg(1.62μmol)化合物125c在6.15mL 1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸鹽緩沖液中的溶液。小心地使混合物保持在氮?dú)夥障?，同時(shí)在室溫下攪拌18小時(shí)。反應(yīng)完全后，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，使用由PolyLC Inc.生產(chǎn)的PolyCat A WCX柱(梯度10％ B至25％B，A＝10mM磷酸鈉pH7的1/9乙腈/H2O溶液)，得到57mg(40％)化合物200。
化合物201按照本質(zhì)上類似于化合物200的方式制備化合物201。因而，向6當(dāng)量TA/D1在氦噴射的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物125a在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮?dú)夥障?，同時(shí)在室溫下攪拌18小時(shí)。反應(yīng)完全后，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物201。
化合物202按照本質(zhì)上類似于化合物200的方式制備化合物201。因而，向6當(dāng)量TA/D1在氦噴射的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物132在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮?dú)夥障拢瑫r(shí)在室溫下攪拌18小時(shí)。反應(yīng)完全后，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物202。
化合物203按照本質(zhì)上類似于化合物200的方式制備化合物201。因而，向6當(dāng)量TA/D1在氦噴射的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物136在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮?dú)夥障?，同時(shí)在室溫下攪拌18小時(shí)。反應(yīng)完全后，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物203。
化合物204按照本質(zhì)上類似于化合物200的方式制備化合物201。因而，向6當(dāng)量TA/D1在氦噴射的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物143在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮?dú)夥障?，同時(shí)在室溫下攪拌18小時(shí)。反應(yīng)完全后，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物204。
化合物205按照本質(zhì)上類似于化合物200的方式制備化合物201。因而，向6當(dāng)量TA/D1在氦噴射的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物125b在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮?dú)夥障?，同時(shí)在室溫下攪拌18小時(shí)。反應(yīng)完全后，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物205。
實(shí)施例26耐受原效率和血清半衰期的評價(jià)制備第1結(jié)構(gòu)域-鑰孔血藍(lán)蛋白軛合物(D1-KLH)，用于動物免疫法。利用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有第五個(gè)半胱氨酸的重組第1結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c谷胱甘肽混合的二硫化物。結(jié)構(gòu)組成為天然人β2-糖蛋白I中存在的前66個(gè)氨基末端氨基酸，然后是C-末端leu-(his)5表達(dá)標(biāo)記。C-末端的多組氨酸表達(dá)標(biāo)記是鎳親和色譜純化操作的基礎(chǔ)。Iverson等(1998)《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Nat’l.Acad.Sci.)9515542-15546。
所得具有游離巰基的第1結(jié)構(gòu)域(D1-SH)被馬來酰亞胺基-KLH烷基化。根據(jù)廠商的指導(dǎo)，將馬來酰亞胺基-活化的KLH(Pierce ChemicalCo.；Rockford，IL)按10mg/mL溶于水。立即將KLH加入到D1-SH中，比例為1.27mg/mg D1-SH。將含有KLH與D1的試管在RT下旋轉(zhuǎn)混合2h。恒溫結(jié)束時(shí)，利用＞25,000MW截留膜將內(nèi)容物透析到4℃的PBS中，以除去未共軛化合的D1。對透析后的樣本取樣，用ELISA試驗(yàn)與來自患者的親和性純化的抗磷脂抗體(aPL)的免疫反應(yīng)性D1的存在。
使用致免疫的大鼠模型，測量耐受原功效。將含有10μg D1-KLH的明礬以及百日咳佐劑i.p.給藥，使Lewis大鼠(Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN)致免疫。初次給藥三周后，將耐受原或PBS對照i.v.給藥，每組四只動物。治療五天后，將10μg D1-KLHi.p.給藥，加強(qiáng)給藥七天后采集血清樣本。
使用ELISA檢測大鼠血清中的抗-第1結(jié)構(gòu)域抗體。在4℃下，將Nunc Maxisorp Immunoplates(Nalge Nunc International，Rochester，NY)涂以50μl 5μg/ml重組人β2-GPI在碳酸鹽緩沖液(Sigma，St.Louis，MO)pH9.6中的溶液過夜。隨后的步驟在室溫下進(jìn)行。將平皿用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，然后用250μl 2％脫脂干乳(Carnation，Solon，OH)的PBS溶液封阻1h。洗滌后，將小孔用50μl血清樣本的PBS連續(xù)稀釋液恒溫1h，每種樣本一式三份。使用未致免疫的血清作為對照，使用從致免疫動物收集的血清繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。洗滌后，將小孔用50μl與堿性磷酸酶共軛的山羊抗-大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)在PBS/0.1％ BSA中的1∶2000稀釋液恒溫1h。將小孔用dIH2O洗滌3次，用PPMP溶液(10gm酚酞單-磷酸鹽(Sigma，St.Louis MO)、97.4ml 2-氨基-2-甲基-1-丙醇(Sigma)、9.62ml dIH2O、21ml HCl)顯色20分鐘。用50μl 0.2MNa2HPO4停止顯色，在Bio-Tek Instruments PowerWave 340Microplate分光光度計(jì)(Winooski，VT)上讀取OD550。把正?？贵w單位指定為標(biāo)準(zhǔn)池，從標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)供試血清中抗-第1結(jié)構(gòu)域抗體的濃度(單位/ml)。使用軛合物200、201、202和203，通過與PBS-治療的對照進(jìn)行對比，計(jì)算多價(jià)平臺軛合物對抗-第1結(jié)構(gòu)域抗體的抑制作用百分率。結(jié)果如下表1所示。
表1致免疫大鼠抗-第1結(jié)構(gòu)域抗體的抑制作用百分率

還測定了化合物在大鼠血漿中的半衰期。利用一氯化碘法，將化合物用125I標(biāo)記。Contreras等，1983，《酶學(xué)方法》(Methods inEnzymology)92277-292。i.v.注射標(biāo)記后的化合物，在24h內(nèi)定期采集血漿樣本。利用Packard Instruments Cobra型γ計(jì)數(shù)器(Downers Grove，IL)檢測血漿中的藥物含量。利用WinNonLin軟件(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)，利用公式t1/2＝0.693(MRT)測定血漿半衰期。結(jié)果如下表2所示。
表2化合物在大鼠血漿中的半衰期(小時(shí))

權(quán)利要求
1.具有下式結(jié)構(gòu)的化合價(jià)平臺分子，選自下組Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y；Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y；Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y；Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y；Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y；和Rc[S-G2(ONH2)n]y；其中y是1至16；n是1至32；R1是H、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基或G2-(ONH2)n；Rc和每個(gè)G2獨(dú)立地是有機(jī)部分，包含選自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子，和其中化合價(jià)平臺分子包含至少4個(gè)末端氨氧基。
2.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中Rc和每個(gè)G2獨(dú)立地包含直鏈、支鏈或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并選自下組烴基，僅由H和C原子組成，并且具有1至5000個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧和氫原子組成，并且具有1至5000個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧、氮和氫原子組成，并且具有1至5000個(gè)碳原子；有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧、硫和氫原子組成，并且具有1至5000個(gè)碳原子；和有機(jī)基團(tuán)，僅由碳、氧、硫、氮和氫原子組成，并且具有1至5000個(gè)碳原子。
3.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中Rc選自由C1-200烴部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基團(tuán)的C1-200烴部分組成的組。
4.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中Rc包含氧化烯部分。
5.權(quán)利要求4的化合價(jià)平臺分子，其中Rc包含氧乙烯部分。
6.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中Rc包含氧乙烯單元-(CH2CH2O)n-；其中n是1-5000。
7.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中G2包含官能團(tuán)，選自由烷基、雜烷基、芳基和雜芳基組成的組。
8.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中G2包含官能團(tuán)，選自由C1-200烴部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基團(tuán)的C1-200烴部分組成的組。
9.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中G2包含氧化烯部分。
10.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中G2包含氧乙烯部分。
11.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中G2包含氧乙烯單元-(CH2CH2O)n-；其中n是1-5000。
12.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中每個(gè)G2獨(dú)立地包含選自下組的官能團(tuán)胺；酰胺；酯；醚；酮；醛；氨基甲酸酯；硫醚；哌嗪基；哌啶基；醇；聚胺；聚醚；酰肼；肼；羧酸；酸酐；鹵素；磺酰基；磺酸酯；砜；亞氨酸酯；氰酸酯；異氰酸酯；異硫氰酸酯；甲酸酯；碳二亞胺；硫醇；肟；亞胺；氨基氧基；和馬來酰亞胺。
13.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式結(jié)構(gòu)Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y。
14.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式結(jié)構(gòu)Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y。
15.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式結(jié)構(gòu)Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y。
16.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式結(jié)構(gòu)Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y。
17.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式結(jié)構(gòu)Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y。
18.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式結(jié)構(gòu)Rc[S-G2(ONH2)n]y。
19.包含權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的兩個(gè)或多個(gè)化合價(jià)平臺分子的組合物，其中該化合價(jià)平臺分子的多分散性小于1.2。
20.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中每個(gè)G2-ONH2獨(dú)立地選自下組 和
21.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有選自下式的結(jié)構(gòu) 和 其中n是1至100。
22.權(quán)利要求21的化合價(jià)平臺分子，其中G2包含氧乙烯基。
23.具有下列結(jié)構(gòu)的化合價(jià)平臺分子 其中n是503；或 其中n是481。
24.具有下式結(jié)構(gòu)的化合價(jià)平臺分子 其中n是112。
25.權(quán)利要求1的分子與一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
26.權(quán)利要求21的分子與一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
27.權(quán)利要求23的分子與一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
28.權(quán)利要求24的分子與一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
29.權(quán)利要求25或26的軛合物，其中生物活性分子選自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、藥物、核酸、脂質(zhì)、脂肪酸和它們的混合物。
30.權(quán)利要求29的軛合物，其中生物活性分子包括第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽。
31.權(quán)利要求30的軛合物，其中多肽缺乏T細(xì)胞表位。
32.權(quán)利要求30的軛合物，其中軛合物包含將第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽連接到化合價(jià)平臺分子上的連接劑。
33.權(quán)利要求29的軛合物，其中生物活性分子包括一種與抗αGal抗體特異性結(jié)合的αGal表位或其類似物。
34.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式的結(jié)構(gòu) 其中(CH2CH2O)n部分具有20Kg/mol的分子量。
35.權(quán)利要求34的分子與一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
36.權(quán)利要求35的軛合物，其中生物活性分子選自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、藥物、核酸、脂質(zhì)、脂肪酸和它們的混合物。
37.權(quán)利要求36的軛合物，其中生物活性分子包括第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽。
38.權(quán)利要求37的軛合物，其中多肽缺乏T細(xì)胞表位。
39.權(quán)利要求37的軛合物，其中軛合物包含將第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽連接到化合價(jià)平臺分子上的連接劑。
40.權(quán)利要求36的軛合物，其中生物活性分子包括一種與抗αGal抗體特異性結(jié)合的αGal表位或其類似物。
41.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式的結(jié)構(gòu) 其中(CH2CH2O)n部分具有20Kg/mol的分子量。
42.權(quán)利要求41的分子與一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
43.權(quán)利要求42的軛合物，其中生物活性分子選自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、藥物、核酸、脂質(zhì)、脂肪酸和它們的混合物。
44.權(quán)利要求43的軛合物，其中生物活性分子包括第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽。
45.權(quán)利要求44的軛合物，其中多肽缺乏T細(xì)胞表位。
46.權(quán)利要求44的軛合物，其中軛合物包含將第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽連接到化合價(jià)平臺分子上的連接劑。
47.權(quán)利要求43的軛合物，其中生物活性分子包括一種與抗αGal抗體特異性結(jié)合的αGal表位或其類似物。
48.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式的結(jié)構(gòu) 其中(CH2CH2O)n部分具有5Kg/mol的分子量。
49.權(quán)利要求48的分子與一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
50.權(quán)利要求49的軛合物，其中生物活性分子選自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、藥物、核酸、脂質(zhì)、脂肪酸和它們的混合物。
51.權(quán)利要求50的軛合物，其中生物活性分子包括第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽。
52.權(quán)利要求51的軛合物，其中多肽缺乏T細(xì)胞表位。
53.權(quán)利要求51的軛合物，其中軛合物包含將第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽連接到化合價(jià)平臺分子上的連接劑。
54.權(quán)利要求50的軛合物，其中生物活性分子包括一種與抗αGal抗體特異性結(jié)合的αGal表位或其類似物。
55.權(quán)利要求13的化合價(jià)平臺分子，其中Rc是C(CH2-)4；R1是H；n是1；y是4；其中G2包含-(CH2CH2O)p-，其中p是2-500；和其中G2進(jìn)一步包含酰胺部分和末端氨氧基部分。
56.權(quán)利要求13的化合價(jià)平臺分子，其中Rc是C(CH2-)4；R1是H；n是1；y是4；其中G2包含-(CH2CH2O)p-，其中p是200-500；和其中G2進(jìn)一步包含酰胺部分和末端氨氧基部分。
57.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式的結(jié)構(gòu) 其中n是200-500。
58.包含權(quán)利要求55、56或57任一項(xiàng)的化合價(jià)平臺分子與一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
59.權(quán)利要求58的軛合物，其中生物活性分子選自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、藥物、核酸、脂質(zhì)、脂肪酸和它們的混合物。
60.權(quán)利要求59的軛合物，其中生物活性分子包括第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽。
61.權(quán)利要求60的軛合物，其中多肽缺乏T細(xì)胞表位。
62.權(quán)利要求60的軛合物，其中軛合物包含將第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽連接到化合價(jià)平臺分子上的連接劑。
63.權(quán)利要求59的軛合物，其中生物活性分子包括一種與抗αGal抗體特異性結(jié)合的αGal表位或其類似物。
64.權(quán)利要求25的軛合物的制備方法，包括將生物活性分子共價(jià)結(jié)合到化合價(jià)平臺分子上，這樣形成肟鍵或其修飾形式。
65.權(quán)利要求64的方法，其中修飾的肟鍵是還原的或烷基化的肟鍵。
66.權(quán)利要求64的方法，其中化合價(jià)平臺分子包含氨氧基，和生物活性分子包含反應(yīng)性官能團(tuán)，這樣通過將生物活性分子結(jié)合到化合價(jià)平臺分子上形成肟鍵。
67.權(quán)利要求66的方法，其中反應(yīng)性官能團(tuán)是醛或酮部分的羰基。
68.權(quán)利要求67的方法，其中生物活性分子包括多肽，并且其中該方法包括在化合價(jià)平臺分子上結(jié)合氨基氧基之前修飾多肽，這樣使得多肽包含末端的醛基。
69.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，具有下式的結(jié)構(gòu) 其中每個(gè)(CH2CH2O)n部分具有小于10Kg的分子量。
70.權(quán)利要求6的化合價(jià)平臺分子，其中n是1-500。
71.包含權(quán)利要求6的分子和一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
72.權(quán)利要求71的軛合物，其中生物活性分子選自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、藥物、核酸、脂質(zhì)、脂肪酸和它們的混合物。
73.權(quán)利要求72的軛合物，其中生物活性分子包括第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽。
74.權(quán)利要求73的軛合物，其中多肽缺乏T細(xì)胞表位。
75.權(quán)利要求73的軛合物，其中軛合物包含將第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽連接到化合價(jià)平臺分子上的連接劑。
76.權(quán)利要求72的軛合物，其中生物活性分子包括一種與抗αGal抗體特異性結(jié)合的αGal表位或其類似物。
77.權(quán)利要求6的化合價(jià)平臺分子，其中n是200-500。
78.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中G2包含一個(gè)由碳、氧和氫原子組成的并具有1-5000個(gè)碳原子的有機(jī)基團(tuán)。
79.權(quán)利要求78的化合價(jià)平臺分子，其中G2包含氧乙烯基單元-(CH2CH2O)-；其中n是1-200。
80.權(quán)利要求78的化合價(jià)平臺分子，其中G2包含氧乙烯基單元-(CH2CH2O)-；其中n是200-500。
81.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中該化合價(jià)平臺分子是對稱的。
82.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中該化合價(jià)平臺分子的化合價(jià)是4。
83.權(quán)利要求1、6、11或21的化合價(jià)平臺分子，其中該化合價(jià)平臺分子包含一種或多種二價(jià)連接劑分子，所述連接劑分子用于將生物活性分子連接到化合價(jià)平臺分子上，其中連接劑分子包含氨基氧基，該氨基氧基未被保護(hù)或被氨基氧基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，并且其中所述二價(jià)連接劑分子結(jié)合到化合價(jià)平臺分子上，這樣使得在二價(jià)連接劑分子和化合價(jià)平臺分子之間形成連接鍵。
84.權(quán)利要求83的化合價(jià)平臺分子，其中形成的連接鍵選自酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、硫醚鍵和肟鍵。
85.權(quán)利要求84的化合價(jià)平臺分子，其中通過使化合價(jià)平臺分子與二價(jià)連接劑分子反應(yīng)形成連接鍵，其中二價(jià)連接劑分子包含選自氨、碳酸酯、硫醇、氨基氧基和羧酸的官能團(tuán)部分。
86.權(quán)利要求1的化合價(jià)平臺分子，其中該化合價(jià)平臺分子是樹狀的。
87.權(quán)利要求2的化合價(jià)平臺分子，其中Rc和每個(gè)G2獨(dú)立地包含一個(gè)直鏈、支鏈或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且獨(dú)立地選自只由H和C組成的并且具有1-500個(gè)碳原子的烴基；只由C、O和H原子組成的并且具有1-500個(gè)碳原子的有機(jī)基團(tuán)；只由C、O、N和H原子組成的并且具有1-500個(gè)碳原子的有機(jī)基團(tuán)；只由C、O、S和H原子組成的并且具有1-500個(gè)碳原子的有機(jī)基團(tuán)；和只由C、O、S、N和H原子組成的并且具有1-500個(gè)碳原子的有機(jī)基團(tuán)。
88.包含權(quán)利要求15的化合價(jià)平臺分子和一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
89.權(quán)利要求88的軛合物，其中生物活性分子選自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、藥物、核酸、脂質(zhì)、脂肪酸和它們的混合物。
90.權(quán)利要求89的軛合物，其中生物活性分子包括第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽。
91.權(quán)利要求90的軛合物，其中多肽缺乏T細(xì)胞表位。
92.權(quán)利要求90的軛合物，其中軛合物包含將第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽連接到化合價(jià)平臺分子上的連接劑。
93.權(quán)利要求89的軛合物，其中生物活性分子包括一種與抗αGal抗體特異性結(jié)合的αGal表位或其類似物。
94.藥物組合物，包含權(quán)利要求25-28、29-33和35-40任一項(xiàng)的軛合物和藥學(xué)上可接受的載體。
95.包含權(quán)利要求14的化合價(jià)平臺分子和一個(gè)或多個(gè)生物活性分子的軛合物。
96.權(quán)利要求95的軛合物，其中生物活性分子選自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、藥物、核酸、脂質(zhì)、脂肪酸和它們的混合物。
97.權(quán)利要求96的軛合物，其中生物活性分子包括一種與抗αGal抗體特異性結(jié)合的αGal表位或其類似物。
98.權(quán)利要求96的軛合物，其中生物活性分子包括第1結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽。
99.包含兩種或多種權(quán)利要求20-24、34、41、48、55-57、69、70和77-87中任一項(xiàng)的化合價(jià)平臺分子的組合物，其中該化合價(jià)平臺分子的多分散性小于1.2。
100.權(quán)利要求1-18、20-24、34、41、48、55-57、69、70和77-87中任一項(xiàng)的化合價(jià)平臺分子，其中該化合價(jià)平臺分子的化合價(jià)是4。
101.權(quán)利要求25-28、29、36、43、50、59、72、89和96中任一項(xiàng)的軛合物，其中生物活性分子包括多肽。
102.權(quán)利要求25-28、29、36、43、50、59、72、89和96中任一項(xiàng)的軛合物，其中生物活性分子包括核酸。
103.權(quán)利要求25-28、29、36、43、50、59、72、89和96中任一項(xiàng)的軛合物，其中生物活性分子包括寡核苷酸。
104.權(quán)利要求101的軛合物，其中多肽缺乏T細(xì)胞表位。
105.權(quán)利要求36的化合價(jià)平臺分子，其中n是1-500。
全文摘要
提供了包含氨基氧基的分子，其中該氨基氧基提供了用于與其他分子共價(jià)結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。在一種實(shí)施方式中，提供了包含氨基氧基的聚氧乙烯分子，它們能夠與包括多(氨基酸)在內(nèi)的多種生物活性分子共軛化合。在另一種實(shí)施方式中，提供了包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子。氨基氧基可以用來與生物分子、例如多(氨基酸)形成共價(jià)鍵。氨基氧基例如可以與經(jīng)過修飾含有羰基、例如乙醛基的多(氨基酸)反應(yīng)，生成化合價(jià)平臺分子與生物活性分子經(jīng)由肟鍵結(jié)合的軛合物。包含氨基氧基的化合價(jià)平臺分子在軛合物形成中有利地是反應(yīng)性的，它們還可以是易于合成的，形成多分散性非常低的組合物。
文檔編號C07D295/16GK1762990SQ20051011611
公開日2006年4月26日 申請日期2000年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月8日
發(fā)明者D·S·瓊斯, H－T·湯－努, 謝方, 陶安平, 徐彤, J·R·哈馬克 申請人:拉卓拉藥物公司