專利名稱：促腫瘤細(xì)胞死亡,降低胞漿鈣離子濃度的基因copineⅤ的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)具有明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，降低胞漿鈣離子濃度作用的基因/蛋白，copine V基因及其編碼的蛋白涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新基因、新蛋白的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)癌基因的激活、抑癌基因的失活及其他相關(guān)調(diào)節(jié)基因的突變，均能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。正常細(xì)胞的增殖和分裂高度復(fù)雜和精細(xì)，為了確保細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)均有一套嚴(yán)格的精確調(diào)控細(xì)胞增殖過(guò)程的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，以維持基因組的穩(wěn)定性。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的重要組成部分。當(dāng)細(xì)胞基因組受到損傷時(shí)，細(xì)胞首先啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，一旦損傷完全修復(fù)，細(xì)胞則重新進(jìn)入正常生長(zhǎng)狀態(tài)；若修復(fù)失敗，細(xì)胞將啟動(dòng)凋亡機(jī)制，誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞進(jìn)入凋亡而被清除，從而避免基因組損傷遺傳到子代細(xì)胞，消除了腫瘤發(fā)生的潛在可能。但是，如果細(xì)胞監(jiān)測(cè)系統(tǒng)出現(xiàn)異常，本應(yīng)凋亡的細(xì)胞未被清除，而帶有不穩(wěn)定基因組的細(xì)胞容易獲得明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，造成細(xì)胞的失控性增殖，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變。在細(xì)胞癌變過(guò)程中，許多凋亡活化基因功能受阻，而凋亡抑制基因的功能得到增強(qiáng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不少腫瘤的發(fā)生就是由于凋亡受阻引起的，如淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、慢性白血病等。分子腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及與腫瘤治療中的細(xì)胞死亡有密切關(guān)系?？茖W(xué)家們希望通過(guò)探討細(xì)胞凋亡機(jī)制，了解細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞死亡的關(guān)系，在惡性腫瘤的治療中取得新的突破。因此，選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為目標(biāo)的理論和技術(shù)已經(jīng)成為治療惡性腫瘤的主要策略之一。也就是通過(guò)分子生物學(xué)的途徑在腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入誘導(dǎo)凋亡的活化基因或滅活凋亡的抑制基因。為此，發(fā)現(xiàn)新的能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因，研究其作用機(jī)制能夠?yàn)閻盒阅[瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。
發(fā)明目的通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)確定過(guò)表達(dá)人copine V基因有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡、降低胞漿鈣離子濃度的作用，闡明copine V在組織發(fā)育、再生及損傷修復(fù)和腫瘤形成中可能具有重要的作用，從而為腫瘤的治療、組織退行性病變提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步篩選治療這些疾病的藥物提供靶標(biāo)。
內(nèi)容與要求本發(fā)明利用了反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、流式細(xì)胞分析、激光共聚焦等技術(shù)分析了copine V在HEK293細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞死亡，降低胞漿鈣離子濃度作用。
該基因/蛋白達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.將copine V全長(zhǎng)連接到紅色熒光蛋白載體中，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)copine V定位于胞膜利內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。
2.通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)的HEK293細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，copine V過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。
3.通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)的HEK293細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，copine V過(guò)表達(dá)降低胞漿鈣離子濃度。
4.該基因與組織分化和腫瘤形成等許多重要的生命現(xiàn)象密切相關(guān)，可用于發(fā)育相關(guān)疾病、腫瘤的基因診斷和基因治療。


圖1.A轉(zhuǎn)染copine V的HEK293細(xì)胞；D轉(zhuǎn)染空載體的HEK293細(xì)胞；B，E內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；C A，B圖重疊；F D，E圖重疊。證明copine V融合蛋白定位于細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，而對(duì)照的空載體均勻分布于整個(gè)細(xì)胞中。
圖2.A轉(zhuǎn)染copine V的HEK293細(xì)胞；E轉(zhuǎn)染空載體的HEK293細(xì)胞；B，F(xiàn)胞漿鈣；C，G細(xì)胞核；D A，B，C圖重疊；H E，F(xiàn)，G圖重疊。證明表達(dá)copine V融合蛋白的細(xì)胞中細(xì)胞漿鈣離子濃度明顯降低。
圖3.外源表達(dá)copine V基因能夠降低細(xì)胞漿鈣離子濃度，與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組比較有顯著性差異。
圖4.轉(zhuǎn)染copine V基因24小時(shí)能誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞發(fā)生核固縮、細(xì)胞死亡，凋亡細(xì)胞達(dá)24％，與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組比較有顯著性差異。
實(shí)施例1.利用融合紅色熒光蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位將此基因編碼區(qū)融合到紅色熒光蛋白的N-端，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。將編碼區(qū)全長(zhǎng)1782bp通過(guò)BamHI和HindIII引入到pRED-N1載體中，構(gòu)建表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48小時(shí)后獲得高效的瞬時(shí)表達(dá)，利用共聚焦顯微鏡觀察在細(xì)胞內(nèi)的定位。
2.反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)用Trizol提取各個(gè)組織的總RNA，然后取2微克進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增mCcd1，以分析轉(zhuǎn)錄水平mCcd1的表達(dá)。上下游引物分別為5-GAACAGATGAGCCAGACTCT-3；5-CCTGATTCTCCTCCACACTC-3。PCR條件為95度變性10分鐘；循環(huán)條件94度變性30秒，58度退火30秒，72度延伸30秒，29個(gè)循環(huán)；延伸條件為72度10分鐘。
3、流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pRED-copine V轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48小時(shí)后獲得高效的瞬時(shí)表達(dá)，胰酶消化細(xì)胞后，75％酒精固定細(xì)胞過(guò)夜，RnaseA處理后上機(jī)測(cè)量。
4、流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞漿鈣含量利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48小時(shí)后獲得高效的瞬時(shí)表達(dá)，胰酶消化細(xì)胞后，F(xiàn)luo-3染色30分鐘后，上機(jī)測(cè)量。
權(quán)利要求
1.發(fā)明涉及一個(gè)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，降低細(xì)胞漿中鈣離子濃度作用的基因copineV，其特征在于互補(bǔ)脫氧核苷酸(cDNA)全長(zhǎng)3897p，含一個(gè)1782bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼593個(gè)氨基酸，分子量為65.7kDa的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所編碼的蛋白具有2個(gè)鈣離子依賴的磷脂結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域和VWFA結(jié)構(gòu)域(分別位于氨基酸殘基29-116，147-268，328-554)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2、所述的基因copineV，其特征在于該基因及其編碼的蛋白能促進(jìn)HEK293、Hela、HepG2、U251等人源的腫瘤細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系死亡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、所述的基因copineV，其特征在于該基因及其編碼的蛋白能降低HEK293細(xì)胞漿中鈣離子濃度的作用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了促腫瘤細(xì)胞死亡，降低細(xì)胞漿中鈣離子濃度一個(gè)基因copineV。該基因編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，利用流式細(xì)胞技術(shù)等證明該基因能促進(jìn)細(xì)胞死亡，并降低細(xì)胞漿中鈣離子濃度，提示該基因在組織發(fā)育、再生及腫瘤形成過(guò)程中可能具有重要的作用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1962867SQ200510117589
公開(kāi)日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2005年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日
發(fā)明者王曉文, 靳彥彬, 吳燕, 吳彥瑞, 范文紅, 范明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所