專(zhuān)利名稱(chēng)：對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽與分離方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽，尤其是涉及一種對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽與分離方法及其對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽在制備雜草種子萌發(fā)生抑制劑或除草劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化學(xué)除草劑的廣泛使用對(duì)于控制雜草對(duì)農(nóng)田和城市草坪的侵入和危害發(fā)揮了重要作用。公開(kāi)號(hào)為CN1181184A的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)一種非耕地用高效除草組合物，是一種含有對(duì)雜草種子、幼芽、幼草有殺滅作用的嘧黃隆以及對(duì)雜草地上綠色部分有殺滅作用的百草枯、茅草粘、環(huán)嗪酮等復(fù)配而成的系列高效除草組合物。公開(kāi)號(hào)為CN1687086A的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)一種具有殺菌除草活性的取代苯氧乙酰氧基芳雜環(huán)基烴次膦酸酯鹽及制備方法。公開(kāi)號(hào)為CN1631156的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了一種除草劑，它由N-(膦羧基甲基)甘氨酸、1，1-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶陽(yáng)離5-三嗪-2-基)-N-甲基氨碳酰]氨基磺酰]苯甲酸甲酯、3-異丙基-2，1，3-苯并噻二嗪酮-(4)-理組成。公開(kāi)號(hào)為CN1679396的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁┝藢?duì)禾谷類(lèi)作物具有選擇性的除草組合物。然而傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致雜草的抗藥性并造成環(huán)境污染，如土壤、地下水和農(nóng)產(chǎn)品中的化學(xué)除草劑殘留逐年增多，危害了人類(lèi)及動(dòng)物的安全。因此，研制出天然、無(wú)毒副作用、可降解的除草劑有著重要的生態(tài)效益和廣泛的應(yīng)用前景。20世紀(jì)90年代初，美國(guó)Iwoa州立大學(xué)的園藝學(xué)家N.E Christians(.Liu，D.L.-Y.and N.E.Christians.Isolation and identification of root-inhibiting compounds fromcorn gluten hydrolysate.J.Plant Grown Regul.，1994，13227-230)發(fā)現(xiàn)玉米蛋白粉能抑制植物種子萌發(fā)時(shí)根系的形成，并開(kāi)發(fā)出玉米蛋白粉萌前除草劑，但玉米蛋白粉為固體粉末，不溶于水，因而它不能象液體除草劑那樣能?chē)娛┖鸵子跐B入土壤發(fā)揮功效，后來(lái)N.E.Christans(.Christians，N.E.，J.T.Garbutt and D.Liu.Preemergence weed control using plant proteinhydrolysate.U.S.PatentNo.5,290,749，1994a)等人用堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制備的水解物比玉米蛋白粉有更高的除草活性，并進(jìn)而分離純化出除草活性肽單體；在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿內(nèi)的除草活性實(shí)驗(yàn)表明，除草活性肽單體比玉米蛋白粉水解粗提物對(duì)植物種子萌發(fā)生根的抑制作用更為顯著。他們從玉米蛋白粉的水解物中分離出5個(gè)具有除草活性的的2肽和一個(gè)除草活性更強(qiáng)的5肽，并分別申請(qǐng)兩項(xiàng)專(zhuān)利。這些多肽的序列分別是Gln-Gln，Ala-Asa，Ala-Gln，Gly-Ala，Ala-Ala和Leu-Ser-Pro-Ala-Gln?；钚远嚯牡某輽C(jī)制是通過(guò)阻斷種子根系分生組織的有絲分裂來(lái)抑制種子根系的形成，這種抑制作用不論是雙子葉植物雜草還是單子葉植物雜草都有效果，而對(duì)萌后的成熟根系則沒(méi)有影響，且對(duì)環(huán)境不產(chǎn)生任何的污染作用并可作為草坪植物的肥源。他們的研究還推測(cè)，玉米水解物中還可能存在其他具有除草活性的多肽單體。但此后，此研究領(lǐng)域的進(jìn)展卻十分緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽；本發(fā)明的另一目的在于提供一種對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽分離方法；本發(fā)明的另一目的在于將對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽用于制備雜草萌發(fā)生根抑制劑或除草劑。
本發(fā)明所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽其氨基酸序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser，其分子量為986.5822，理論等電點(diǎn)為5.24，為白色粉末，易溶于水，可配成不同濃度來(lái)噴施土壤來(lái)防除雜草種子萌發(fā)。
所述的玉米蛋白粉多肽均不來(lái)自于玉米醇溶蛋白，而是來(lái)自于其它的蛋白。
本發(fā)明所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽的分離方法，其步驟為1)原料玉米蛋白粉經(jīng)粉碎后，收集篩下的淡黃色粉末作為酶解底物；2)在玉米蛋白粉中加入堿性蛋白酶水解得水解液，玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶(0.03～0.05AU)，pH為7～9，水解溫度為50～70℃，水解時(shí)間為7～8h；3)水解液經(jīng)離子交換層析，分離得到活性組分；4)將分離得到的活性組分經(jīng)凝膠層析得高對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽活性組分；5)將分離得到的高對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽活性組分經(jīng)兩次反相高效液相色譜，篩選出具有高抑制活性的組分，經(jīng)過(guò)測(cè)定，其序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser。
在步驟1)中，原料玉米蛋白粉經(jīng)粉碎后最好過(guò)200目篩。
在步驟2)中，玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH為8.0，水解溫度為60℃，水解時(shí)間為6h，堿性蛋白酶選自Alacalase 2.4L。
本發(fā)明所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽具有高抑制雜草萌發(fā)生根活性或除草活性，可用于制備雜草萌發(fā)生根抑制劑或除草劑。
通過(guò)對(duì)本發(fā)明獲得的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽與已報(bào)道的玉米醇溶蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)表明，本發(fā)明得到的多肽均不來(lái)自于玉米醇溶蛋白，而是來(lái)自于其它的蛋白，而且該多肽序列目前尚未見(jiàn)到報(bào)道。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例11)以玉米蛋白為原料，其為較大的褐色片狀顆粒，為了便于酶解反應(yīng)時(shí)酶與底物能夠充分接觸，原料按如下方式進(jìn)行預(yù)處理將原料玉米蛋白粉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)200目篩，收集篩下的淡黃色粉末作為酶解底物。
2)在玉米蛋白粉中加入堿性蛋白酶水解，玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH為8.0，水解溫度為60℃，水解時(shí)間為6h，堿性蛋白酶選自Alacalase 2.4L。
3)水解液經(jīng)離子交換層析，離子交換填料為QAE-A25，工藝步驟為填料預(yù)處理→裝柱→上樣→梯度洗脫，工藝條件為(1)填料預(yù)處理稱(chēng)取7g QAE-A25陰離子交換樹(shù)脂粉末于燒杯中，加入一定體積的洗脫液A，于沸水浴中溶脹2h，冷卻后倒掉液面上漂浮的細(xì)小顆粒，用洗脫液A反復(fù)清洗幾次，配成75％的懸浮液，然后在真空箱中抽真空趕掉懸浮液中的氣泡備用。(2)裝柱將層析柱(C16/40，內(nèi)徑16mm，長(zhǎng)40cm)用去離子水清洗干凈后垂直放于鐵架臺(tái)上，加入一定量的洗脫液A，打開(kāi)出水口以趕走底部的氣泡，當(dāng)柱底部的緩沖液約有2cm高時(shí)關(guān)閉層析柱底部出水口。將溶脹好的、攪拌均勻的凝膠懸浮液一次性的倒入層析柱中，然后迅速的接上蠕動(dòng)泵，打開(kāi)出水口，以2mL/min的流速將洗脫液A泵入層析柱中使填料迅速沉降，待填料全部沉降完全后再用5mL/min的流速擠壓填料，待柱床高度不再變化后停泵，迅速將Adaptor接上并適當(dāng)壓緊，使床表面無(wú)多余空間和洗脫液，此時(shí)床體積高度約為13cm。用洗脫液A平衡2個(gè)床體積后即可使用。(3)上樣蠕動(dòng)泵上樣，上樣量為300mg，上樣速度為0.5mL/min。(4)梯度洗脫洗脫液A為30mmol/LpH8.0Tris-HCl，洗脫液B的離子強(qiáng)度為2mol/LNaCl，離子強(qiáng)度梯度(NaCl)為0.024mol/L.min、洗脫流速為0.9mL/min、。
4)由步驟3)分離得到的高對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽活性組分經(jīng)凝膠層析，填料為Superdex 30p.g.。工藝步驟為填料預(yù)處理→裝柱→上樣→洗脫。工藝條件為(1)填料預(yù)處理填料已經(jīng)在20％乙醇中預(yù)溶脹好，因此在使用時(shí)只需要先將乙醇除去即可使用。用經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)的去離子水反復(fù)清洗填料，直至將乙醇完全除去，然后放入真空干燥箱中抽真空即可裝柱。(2)裝柱將水去離子水清洗干凈的層析柱(XK16/70，內(nèi)徑16mm，長(zhǎng)70cm)垂直放置于鐵架臺(tái)上。先向柱內(nèi)加入一定量的洗脫液，將柱底端的氣泡排出，然后關(guān)閉柱出口，并在柱的頂端接上Revisior。將已經(jīng)處理好的填料用去離子水調(diào)至體積約475mL的均勻的懸濁液，然后沿玻璃棒一次性倒入層析柱中，迅速將蠕動(dòng)泵連上，用洗脫液以1mL/min的速度沖洗柱子2h，以加速填料的沉降并使填料均勻沉降。待填料沉降完全后小心取下Revisior，接上Adaptor，再以4mL/min的速度沖壓柱子，待柱高不再發(fā)生變化時(shí)即可停泵。將Adaptor向下稍微用力壓緊，使之與床表面緊密接觸不留空隙。再用緩沖液平衡兩個(gè)床體積即可使用。用該法裝柱有很好的重復(fù)性。(3)上樣蠕動(dòng)泵上樣，上樣量為床體積的2％，上樣速度為0.5mL/min。(4)洗脫洗脫液為pH6.050mol/Lm乙酸-乙酸銨緩沖溶液，洗脫流速為0.9mL/min。
5)由步驟4)所分離得到的高對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽活性組分經(jīng)兩次反相高效液相色譜，色譜柱為Everest C18反相柱(4.6mm×250mm，238TP54)，采用梯度洗脫，流動(dòng)相A為為5％乙腈+0.1％三氟乙酸，B相為純乙腈+0.1％三氟乙酸。色譜分離條件為見(jiàn)表1。篩選出具有高抑制活性的組分，經(jīng)過(guò)測(cè)定，其序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser。
表1色譜分離條件

實(shí)施例2與實(shí)施例1類(lèi)似，其區(qū)別在于玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.05AU，pH為7～9，水解溫度為50℃，水解時(shí)間為8h，堿性蛋白酶選自Alacalase2.4L。
實(shí)施例3與實(shí)施例1類(lèi)似，其區(qū)別在于玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.03AU，pH為7～9，水解溫度為70℃，水解時(shí)間為7h，堿性蛋白酶選自Alacalase2.4L。
實(shí)施例4以下給出對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽抑制雜草萌發(fā)生根或除草活性的檢測(cè)方法與結(jié)果。
取雜草野菊(Dendranthema indicum)種子用75％酒精殺菌并用蒸餾水沖洗3次后放在雙層濾紙上置于6cm的培養(yǎng)皿中，先加入1ml去離子水，蓋上上蓋培養(yǎng)5天后，對(duì)所設(shè)置實(shí)驗(yàn)處理分別加入1ml相應(yīng)濃度的多肽液后用Parafilm封口膠封口培養(yǎng)。培養(yǎng)條件每天光照16h，溫度25℃，光照強(qiáng)度1500lx。培養(yǎng)時(shí)間共7天。對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽各設(shè)4個(gè)濃度處理，分別為0.5mg/ml，1.0mg/ml，1.5mg/ml，2.0mg/l，以去離子水為對(duì)照，各處理和對(duì)照選用20粒種子，重復(fù)3次。培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量各幼苗根系中最長(zhǎng)根的長(zhǎng)度作為統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。
以下給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果及應(yīng)用。
抑制率如下式計(jì)算抑制率(％)＝(對(duì)照組根長(zhǎng)-處理組根長(zhǎng))/對(duì)照組根長(zhǎng)×100％所有定量指標(biāo)均用x±s表示。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，不同濃度的多肽溶液對(duì)野菊種子萌發(fā)生根均有明顯的抑制作用，多肽Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser濃度在2mg/ml時(shí)抑制率約為91％。此外，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)還表明該多肽還對(duì)4種單子葉植物和5種雙子葉植物雜草種子萌發(fā)時(shí)根系的形成也有明顯的抑制作用。由于多肽物對(duì)雜草萌發(fā)時(shí)根系形成有抑制作用，而且對(duì)植物的成熟根系沒(méi)有任何影響，因此它可作為一種天然萌前除草劑應(yīng)用在農(nóng)田，特別是在有機(jī)轉(zhuǎn)換型蔬菜、城市草坪的雜草防治上有著重要的應(yīng)用，這樣可以減少使用化學(xué)除草劑對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的污染，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益。
表1 不同濃度的多肽溶液對(duì)野菊種子萌發(fā)生根抑制作用

實(shí)施例5～13以下給出本發(fā)明所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽抑制單子葉植物狗牙根(Cynodon dactylon(L.)Pers)、光鱗水蜈蚣(Kyllinga brevifolia Rottb.var.leiolepis(Franch.et Savat.)Hara)、牛筋草(Eleucine indica L.Gaertn)和早熟禾(Poa annu L.)以及雙子葉植物綠莧(Amaranthus viridis L.)、一點(diǎn)紅(Emilia sonchifolia(L.)DC.)、勝紅薊(Ageratum conyzoides L)、馬蹄金(Dichondra repens Fors)和羽芒菊(Tridaxprocumbens L)等雜草種類(lèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，詳見(jiàn)表2。
表2 2mg/ml多肽對(duì)不同雜草種子生根抑制效果(％)

由此可見(jiàn)，由于對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽對(duì)成熟根系不產(chǎn)生任何副作用，而對(duì)植物不論是雙子葉植物還是單子葉植物雜草的種子萌發(fā)生根有抑制作用，因此可開(kāi)發(fā)成無(wú)公害、能降解的萌前除草劑。該產(chǎn)品為白色粉末，易溶于水，可配成不同濃度來(lái)噴施土壤來(lái)防除雜草種子萌發(fā)。
權(quán)利要求
1.對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽，其特征在于其氨基酸序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser，其分子量為986.5822，理論等電點(diǎn)為5.24，為白色粉末，易溶于水，可配成不同濃度來(lái)噴施土壤來(lái)防除雜草種子萌發(fā)。
2.對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于其步驟為1)原料玉米蛋白粉經(jīng)粉碎后，收集篩下的淡黃色粉末作為酶解底物；2)在玉米蛋白粉中加入堿性蛋白酶水解得水解液；3)水解液經(jīng)離子交換層析，分離得到活性組分；4)將分離得到的活性組分經(jīng)凝膠層析得高抑制雜草萌發(fā)生根玉米蛋白粉多肽活性組分；5)將分離得到的高抑制雜草萌發(fā)生根玉米蛋白粉多肽活性組分經(jīng)兩次反相高效液相色譜，篩選出具有高抑制活性的組分，經(jīng)過(guò)測(cè)定，其序列為Ser-Leu-Leu-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser。
3.如權(quán)利要求1所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于在步驟1)中，原料玉米蛋白粉經(jīng)粉碎后過(guò)200目篩。
4.如權(quán)利要求1所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于在步驟2)中，玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.03～0.05AU，pH為7～9。
5.如權(quán)利要求4所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于玉米蛋白粉和堿性蛋白酶的含量為玉米蛋白粉∶堿性蛋白酶＝1g∶0.042AU，pH為8.0。
6.如權(quán)利要求1所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于在步驟2)中，玉米蛋白粉中加入堿性蛋白酶水解，水解溫度為50～70℃，水解時(shí)間為7～8h。
7.如權(quán)利要求6所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于水解溫度為60℃，水解時(shí)間為6h。
8.如權(quán)利要求1所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽分離方法，其特征在于堿性蛋白酶選自Alacalase 2.4L。
9.如權(quán)利要求1所述的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽用于制備雜草萌發(fā)生根抑制劑或除草劑的應(yīng)用。
全文摘要
對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽與分離方法及其應(yīng)用，涉及一種多肽，尤其是涉及一種對(duì)雜草萌發(fā)生根具有抑制作用的對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽與分離方法及其對(duì)雜草種子萌發(fā)生根具抑制作用多肽用于制備雜草種子萌發(fā)生抑制劑或除草劑。其氨基酸序列為Ser－Leu－Leu－Pro－Pro－Tyr－Leu－Pro－Ser，分離時(shí)收集玉米蛋白粉粉碎后篩下的粉末作為酶解底物，加堿性蛋白酶水解得水解液，水解液經(jīng)離子交換層析得活性組分后經(jīng)凝膠層析得高抑制雜草萌發(fā)生根玉米蛋白粉多肽活性組分，經(jīng)兩次反相高效液相色譜篩選出具有高抑制活性組分。具有抑制雜草萌發(fā)生根活性，用于制備雜草種子萌發(fā)生抑制劑或除草劑。
文檔編號(hào)C07K1/14GK1800205SQ200510136698
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者楊劍, 張麗君, 劉冬, 李世敏, 黃國(guó)清, 于興娜 申請(qǐng)人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院