專利名稱：制備鳥苷類化合物及其中間體的方法
本申請是申請?zhí)枮?1110115.6，申請日為2001年3月27日，發(fā)明名稱為“制備鳥苷類化合物及其中間體的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
相關申請的交叉引用本申請以申請日為2000年3月27日的在先日本專利申請No.2000-087302為基礎，并要求其優(yōu)先權，其全部內容在此引作參考。
背景技術：
本發(fā)明涉及制備鳥苷類化合物的方法，該鳥苷類化合物被用作抗病毒劑、反義藥物的原料；和涉及鳥苷類化合物的中間體乙二醛-鳥苷類化合物的制備方法。
鳥苷或2′-脫氧鳥苷在工業(yè)上主要是通過提取/分離DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的水解產物來生產，因為化學合成鳥苷或2′-脫氧鳥苷的產率極低。然而，DNA水解產物中除了含有所需的2′-脫氧鳥苷之外，還含有2′-脫氧腺苷、2′-脫氧胞苷和胸苷。RNA的水解產物中除了所需的鳥苷之外，還含有腺苷、胞苷和尿苷。因而，為了只收取鳥苷或2′-脫氧鳥苷，必須實施復雜的提取/分離過程，因此不可避免地提高了產品的成本。
另一方面，業(yè)已報道了一種方法，在該方法中，使作為原料的核苷(或脫氧核苷)和核酸的堿基(nucleic acid base)在核苷磷酸化酶的作用下進行堿基交換反應，由此獲得所要的核苷(或所要的脫氧核苷)(Hori，N.，Watanabe，M.，Yamazaki，Y.，Mikami，Y.，Agric.Biol.Chem.，53，197-202(1989))。通過這種方法，可以容易地制備腺苷和2′-脫氧腺苷(日本專利申請說明書No.11-46790“制備嘌呤核苷化合物的方法”)。為了用這種酶合成反應方法得到鳥苷和2′-脫氧鳥苷，至少在反應所需的酶能發(fā)揮作用的pH范圍內，鳥嘌呤必須是溶于水的。一般認為，為了使得酶反應順利進行，最好反應底物的溶解度至少等于酶的米氏常數(shù)(Km)或更高。但是，由于鳥嘌呤的水溶解度不超過幾個ppm，所以上述酶合成反應方法不能實際采用。鑒于這種陷于僵局般的狀況，需要開發(fā)一種制備鳥苷或2′-脫氧鳥苷的有效方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供一種以高產率有效制備鳥苷或2′-脫氧鳥苷(即鳥苷類化合物)的方法，以及以高產率有效制備鳥苷類化合物中間體乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷(即乙二醛-鳥苷類化合物)的方法。
本發(fā)明人為解決上述問題而進行了刻苦的研究，結果獲得了下面的1)-6)項發(fā)現(xiàn)。
1)當水溶解度不超過幾個ppm的鳥嘌呤與乙二醛反應時，得到下式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤，而乙二醛-鳥嘌呤是溶于水的。
(乙二醛-鳥嘌呤也稱為6，7-二氫-6，7-二羥基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮)2)當含有嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)的微生物本身或由該微生物生成的這種酶被用于乙二醛-鳥嘌呤以及核糖-1-磷酸酯和2-脫氧核糖-1-磷酸酯的一種而進行反應時，得到式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物(即乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷)?；蛘弋敽朽堰屎塑樟姿峄?EC 2.4.2.1)和嘧啶核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.2)的微生物本身或由該微生物生成的這些酶被用于乙二醛-鳥嘌呤以及選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷中的任一種，在磷酸根離子的存在下進行反應時，得到式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物(即乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷)。換言之，乙二醛-鳥嘌呤可以作為嘌呤核苷磷酸化酶的底物。
(其中R表示氫原子或羥基)(乙二醛-鳥苷也稱為3-(β-D-赤式-戊-呋喃糖基)-6，7-二氫-6，7-二羥基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮，而乙二醛-2′-脫氧鳥苷也稱為3-(2-脫氧-β-D-赤式-戊-呋喃糖基)-6，7-二氫-6，7-二羥基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮)。
3)在上述2)制備所述的乙二醛-鳥苷的方法中，如果加入至少一種選自下面的化合物甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(以后稱為“EDTA”)、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(以后稱為“EGTA”)和這些物質的鹽，或者一起加入至少一種上述化合物和硼酸或它的鹽，則反應產率顯著提高。上述化合物是作為核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯(它們是底物或堿基交換反應生成的中間體)的穩(wěn)定劑加入的。
4)從原理是講，由各種生物生產的核苷磷酸化酶在上述2)的制備方法中作為酶來使用都可能是有效的。但是，由芽胞桿菌屬(Bacillusgenus)，埃希氏桿菌屬(Escherichia genus)或克雷白氏桿菌屬(Klebsiellagenus)微生物生產的酶是適當?shù)?，并且，由嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus.)JTS 859(FERM BP-6885)生產的耐熱型的酶是特別優(yōu)選的。
5)當將堿用于通過上述2)的方法得到的乙二醛-鳥苷類化合物而進行反應時，乙二醛-鳥苷類化合物的乙二醛部分很容易地釋放出來，從而可以獲得鳥苷類化合物(即鳥苷或2′-脫氧鳥苷)。
6)上述制備方法1)-5)可以通過一鍋反應來進行。
在上述發(fā)現(xiàn)的基礎上完成了本發(fā)明。
總而言之，本發(fā)明涉及下述方法(1)-(16)。
(1)一種制備式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物的方法 其中R表示氫原子或羥基，該方法包括下面的步驟在嘌呤核苷磷酸化酶的存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤與該糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯反應 由此得到乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷。
(2)一種制備式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物的方法
其中R表示氫原子或羥基，該方法包括下面的步驟在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤 和選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷中的任一種物質與磷酸根離子一起反應，由此得到乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷。
(3)制備鳥苷類化合物的方法，該方法包括如下步驟在嘌呤核苷磷酸化酶的存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤與核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯反應 由此得到式(2)表示的化合物
其中R表示氫原子或羥基；以及通過堿來分解式(2)表示的化合物，獲得鳥苷或2′-脫氧鳥苷。
(4)制備鳥苷類化合物的方法，該方法包括如下步驟在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶磷酸化酶的存在下，將式表示(1)的乙二醛-鳥嘌呤 和選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷中的任一種物質與磷酸根離子一起反應，由此得到式(2)表示的化合物 其中R表示氫原子或羥基；以及通過堿來分解式(2)表示的化合物，獲得鳥苷或2′-脫氧鳥苷。
(5)上述(1)所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中，作為嘌呤核苷磷酸化酶所使用的是含有這種酶的微生物本身或由該微生物產生的這種酶。
(6)上述(2)所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中，作為嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶所使用的是含有這些酶的微生物本身或由該微生物產生的這些酶。
(7)上述(3)所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中，作為嘌呤核苷磷酸化酶所使用的是含有這種酶的微生物本身或由該微生物產生的這種酶。
(8)上述(4)所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中，作為嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶所使用的是含有這些酶的微生物本身或由該微生物產生的這些酶。
(9)上述(5)或(6)所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中的微生物屬于芽胞桿菌屬(Bacillus genus)，埃希氏桿菌屬(Escherichiagenus)或克雷白氏桿菌屬(Klebsiella genus)。
(10)上述(7)或(8)所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中的微生物屬于芽胞桿菌屬(Bacillus genus)，埃希氏桿菌屬(Escherichia genus)或克雷白氏桿菌屬(Klebsiella genus)。
(11)上述(5)、(6)和(9)中任一項所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中的微生物是嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO3301、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO 13168或肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3321。
(12)上述(7)、(8)和(10)中任一項所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中的微生物是嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO 3301、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO 13168或肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)IFO 3321。
(13)上述(1)、(2)、(5)、(6)、(9)和(11)中任一項所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中加入至少一種選自下面的化合物甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸和它們的鹽，或者一起加入至少一種上述化合物和硼酸或它的鹽。
(14)上述(3)、(4)、(7)、(8)、(10)和(12)中任一項所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中加入至少一種選自下面的化合物甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸和它們的鹽，或者一起加入至少一種上述化合物和硼酸或它的鹽。
(15)上述(1)、(2)、(5)、(6)、(9)、(11)和(13)中任一項所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，該方法是按照一鍋反應實施的。
(16)上述(3)、(4)、(7)、(8)、(10)、(12)和(14)中任一項所述的制備鳥苷類化合物的方法，該方法是按照一鍋反應實施的。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將在以下的說明書部分予以陳述，而且從說明書中有些是顯而易見的，或者通過實施本發(fā)明而知悉。本發(fā)明的這些目的和優(yōu)點可以通過下文具體指出的手段和組合，加以了解和實現(xiàn)。
發(fā)明詳述以下將詳細描述本發(fā)明。
<原料>
在本發(fā)明中用作原料的乙二醛-鳥嘌呤(即，6，7-二氫-6，7-二羥基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮)，可以高產率地制備。將嘌呤加入到乙二醛水溶液，將該混合物在高溫(優(yōu)選在50-75℃)加熱下攪拌15-20小時。乙二醛-鳥嘌呤的水溶解度隨溫度升高而增加。反應完成后，乙二醛-鳥嘌呤通過冷卻結晶，經(jīng)過濾可以獲得白色固體。
然而，實施一鍋反應，連續(xù)加入核苷磷酸化酶和核糖供體或2-脫氧核糖供體時，所得的乙二醛-鳥嘌呤溶液實際上可以作為原料溶液使用。
在本發(fā)明中，用作核糖供體的核糖-1-磷酸酯和尿苷，以及用作2-脫氧核糖供體的2-脫氧核糖-1-磷酸酯、2′-脫氧尿苷和胸苷均可以市購，例如從Sigma Aldrich Japan Co.購得。
<通過酶反應合成乙二醛-鳥苷類化合物的條件>
將核糖供體和2-脫氧核糖供體(以下稱為“核糖基供體”)和乙二醛-鳥嘌呤加入到磷酸鹽緩沖溶液(pH 6-8，優(yōu)選pH 7)中，往上述磷酸鹽緩沖液混合物中加入生產嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶(或僅生產嘌呤核苷磷酸化酶)的微生物，或加入由該微生物生產的這些酶。所得的反應混合物在最適宜酶的溫度下攪拌24-60小時，結果導致“反應式1和反應式2”或“反應式3和反應式4”所表示的反應。乙二醛-2′-脫氧鳥苷通過“反應式1和反應式2”得到，乙二醛-鳥苷通過“反應式3和反應式4”得到。在作為前半部分的“反應式1和反應式3”中，嘧啶核苷磷酸化酶被用作反應酶；在作為后半部分的“反應式2和反應式4”中，嘌呤核苷磷酸化酶被用作反應酶。至于酶的最適宜溫度，對于由嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859(FERM BP-6885)生產的酶的情形，溫度為大約40-70℃。
在本發(fā)明的酶反應中，使用嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶(或單獨使用嘌呤核苷磷酸化酶)。當嘧啶核苷(尿苷、2′-脫氧尿苷或胸苷)用作核糖基供體時，在作為前半部分反應的“反應式1和反應式3”中生產核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯，嘧啶核苷磷酸化酶實際上是必須的。另一方面，當核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯在反應起始時被用作核糖基供體時，“反應式1”或“反應式3”表示的反應是不需要的。但是，在這種情況下，即使存在嘧啶核苷磷酸化酶，對整個酶反應也不會有任何反面影響。
在反應式1-4中，“PYNP”表示嘧啶核苷磷酸化酶，“PUNP”表示嘌呤核苷磷酸化酶。
(反應式1) (反應式2)
(反應式3) (反應式4)
在本發(fā)明中，原料核糖基供體的初始濃度是5-1000mM，優(yōu)選10-100mM。乙二醛-鳥嘌呤一次的溶解量不大，但是，如果假定初始加入的乙二醛-鳥嘌呤一次全部溶解，則所表示的初始濃度為5-1000mM，優(yōu)選10-100mM。1-20mM磷酸根離子初始濃度是足夠用的。
<脫氧核糖-1-磷酸酯等的穩(wěn)定劑>
在本發(fā)明中，如上述反應式所示，即使在核苷(尿苷、2′-脫氧尿苷、胸苷)用作原料的情況下，反應也是通過核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯作為反應中間體來進行的。這些磷酸酯化合物在性質上不穩(wěn)定，放置時，隨時間自然分解為核糖和磷酸根離子或2-脫氧核糖和磷酸根離子，當磷酸酯酶存在于反應體系時，會加速這種分解。如果這種分解發(fā)生，會降低乙二醛-鳥苷類化合物的產率，因為中間體的分解產物核糖或2-脫氧核糖不能作為核苷磷酸化酶的底物。因而，為了增加產率，本發(fā)明致力于尋找一種能穩(wěn)定核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯和抑制磷酸酯酶活性的物質。
結果發(fā)現(xiàn)，加入至少一種選自以下的化合物甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、EDTA、EGTA和它們的鹽，并且在更優(yōu)選的情況下，一起加入至少一種上述化合物和硼酸或它的鹽是有效的。和硼酸或其鹽一起加入EDTA或其鹽，顯示出特別優(yōu)良的效果。加入的每個組分優(yōu)選濃度是20-200mM硼酸或其鹽、2-10mM上述的至少一種化合物或其鹽(即，甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、EDTA、EGTA)。對所用的上述化合物的鹽和硼酸鹽沒有具體的限制，可以使用任何鹽。例如，所用的鹽可以是堿金屬如鈉和鉀的鹽，以及堿土金屬如鈣和鎂的鹽。
<從乙二醛-鳥苷類化合物制備鳥苷類化合物>
乙二醛-鳥苷類化合物在堿的水溶液中，通過分解釋放出乙二醛部分，由此獲得鳥苷類化合物。作為堿的水溶液，例如，可以使用0.05-0.5N，優(yōu)選0.1-0.25N的氫氧化鈉水溶液。分解反應隨pH和溫度的增加而加速。但是，必須選擇溫和的條件，在該條件下連接核糖基團的鍵不斷裂。具體講，乙二醛-鳥苷類化合物在pH 4-8的范圍是相對穩(wěn)定的，但是在pH 9或更高的條件下分解并釋放出乙二醛部分。最后的結論是，優(yōu)選在60-80℃、pH 9-11范圍和1-5小時的時間內，使乙二醛-鳥苷類化合物分解得到鳥苷類化合物。
<鳥苷類化合物的分離和提純>
從反應溶液中收集產物，可以通過超濾法、離子交換分離法、吸附色譜法、重結晶等進行，反應產物的產量可以通過HPLC方法用UV探測器測定。
<微生物和酶>
原則上講，本發(fā)明使用的嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)和嘧啶核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.2)可以是任何來源的。由下述微生物生產的酶是優(yōu)選的。用于本發(fā)明的微生物不受限于這些具體例子，只要該微生物能生產有效量的上述酶即可。
然而，如上述反應式所示，本發(fā)明采用核苷或2′-脫氧核苷作為底物，因而必然生成磷酸酯化合物作為中間體。所以，具有強核苷酶和/或磷酸酯酶活性的微生物是不能使用的。
滿足這些條件的微生物的例子包括屬于芽胞桿菌屬(Bacillusgenus)，埃希氏桿菌屬(Escherichia genus)或克雷白氏桿菌屬(Klebsiellagenus)的微生物。更具體講，這些微生物包括嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿(Escherichia coli)IFO 3301、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO13168和肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3321。
在本發(fā)明中，原料的溶解度和溶解速度越高，所得到的產率和反應速度就越高。因此，反應期間相對高的溫度是有利的。鑒于此，優(yōu)選使用嗜熱細菌和耐熱酶。在上述微生物的例子中，嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)是最優(yōu)選的。
“IFO”表示，這些微生物被保藏在大阪發(fā)酵研究所(Institute forFermentation，Osaka(IFO)，2-17-85，zyusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，532-0024 JAPAN.)“IFO菌株”對想要得到它們的任何人都是開放的。嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859是國際保藏菌種(其保藏編號為FERM BP-6885)，被保藏于專利微生物國際保存單位，日本國立生命科學和人體技術研究所(Patent Microorganism Depository，National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)。依照“國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約”(BUDAPESTTREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THEDEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENTPROCEDURE)，微生物JTS 859(FERM BP-6885)保藏于1987年10月20日。
這些微生物生長于細菌的標準培養(yǎng)基上，加入胰蛋白胨、酵母提取液、葡萄糖等，生長得更好并生成大量的上述酶。此外，加入核酸化合物如肌苷于培養(yǎng)基中，可有效提高這些酶的活性。所培養(yǎng)的細菌本身可以作為粗制的酶來使用。另外，通過標準方法(如通過超聲波作用或研磨破碎，離心分離，硫酸銨-分離和膜分離)能從所培養(yǎng)的菌獲得酶，并且所得的粗制酶也可以使用。
以下是按照“Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，Volume II”(1984)，對被保藏菌株的細菌學特征的研究結果。試驗基本上按照Takeji Hasegawa《Biseibutsu no Bunrui to Dotei(微生物的分類和鑒定)》(編輯版，Gakkai Shuppan center，1985)所述的方法進行。
嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERMBP-6885)1.形態(tài)學特征(1)細胞的形狀和大小桿狀、5.4-6.5μm×0.7-0.9μm(2)孢子形成橢圓體狀的孢子，一個細胞生長一個孢子，該孢子位于細胞的端部。
2.培養(yǎng)特征(1)肉湯液培養(yǎng)在62℃培養(yǎng)2天。
(2)肉湯瓊脂平面培養(yǎng)白色而略帶淺黃色、平滑、不透明、無堆積。菌落呈波動的環(huán)形。
(3)肉湯瓊脂斜面培養(yǎng)白色而略帶淺黃色、平滑、不透明、無堆積。生長適度。
3.生化特性(1)格蘭氏染色 陽性(2)厭氧培養(yǎng) 不生長(3)能動性 周毛運動(4)氧化酶 陽性(5)過氧化氫酶 陽性(6)明膠的液化能力 能液化(7)石蕊乳 凝固(8)O-F試驗發(fā)酵型(9)VP試驗 陰性(10)從D-葡萄糖產生氣體未產生(11)從D-葡萄糖產生酸 產生(12)從L-阿糖產生酸未產生(13)從D-甘露糖醇產生酸產生(14)從D-木糖產生酸未產生
(15)在薩布羅氏(Sabouraud′s)培養(yǎng)基中生長斜面培養(yǎng)觀察到生長液體培養(yǎng)觀察到生長(16)0.001％溶菌酶下生長 沒有生長(17)0.02％疊氮化物下生長沒有生長(18)7％NaCl下生長 沒有生長(生長至2％)(19)酪蛋白的水解能水解(20)淀粉的水解 能水解(21)蛋黃試驗沒有生長(22)二羥丙酮的產生 沒有產生(23)檸檬酸的利用陰性(24)吲哚的產生 陰性(25)脲酶的活性 陽性(26)苯丙氨酸的脫氨基作用陰性(27)精氨酸的二水解酶活性陽性(28)酪氨酸的分解作用陰性(29)呋喃果聚糖的產生陰性(30)硝酸鹽的還原陽性(31)硝酸鈉的脫氮作用陰性(32)硫化氫的產生陽性(33)對無機氮源的利用僅具有NO3的氮源 觀察到生長僅具有NH4的氮源 觀察到生長(34)GC含量 47.3％(35)生長溫度范圍40-71℃最佳范圍60-68℃(36)生長pH范圍5.7-8.5
最佳范圍 6.0-7.0由上述的特征進行判斷，本發(fā)明的菌株可以確定為嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)。
<一鍋反應>
本發(fā)明的制備乙二醛-鳥苷化合物的方法和制備鳥苷類化合物的方法均可以通過一鍋反應來實施。具體講，首先將鳥嘌呤與乙二醛水溶液反應，制備出起始反應溶液，再將反應所必需的核糖基供體(優(yōu)選與穩(wěn)定劑一起加入)、酶溶液以及任選的磷酸根離子加入到起始反應溶液中，進行反應，由此通過一鍋反應可以制備出乙二醛-鳥苷類化合物。此外，采用堿分解上述反應產物，制備鳥苷類化合物也可以通過一鍋反應進行。
實施例通過以下的生產實施例、試驗實施例和實施例將對本發(fā)明進一步予以詳細描述。
生產實施例1合成乙二醛-鳥嘌呤將22.65g鳥嘌呤(由Tokyo Kasei Kogyo Co.制造)和21.75g 40％乙二醛水溶液(Tokyo Kasei Kogyo Co.制造)加入到950mL純水中，并將混合物在70℃下加熱攪拌18小時，然后將混合物冷卻至4℃并過濾，將過濾得到的白色固體干燥，得到30.7g乙二醛-鳥嘌呤。核磁共振(NMR)譜的測量結果如下。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ8.52(bs，1H)，7.70(bs，1H)，7.16(d，1H)，6.39(d，1H)，5.46(d，1H)，4.83(d，1H).
生產實施例2制備含有核苷磷酸化酶的細菌懸浮液按照下述方法培養(yǎng)嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)，它生產嘌呤核苷磷酸化酶(以下稱為“PUNP”)和嘧啶核苷磷酸化酶(以下稱為“PYNP”)。
在培養(yǎng)細菌時，使用pH6.2的由10g細菌-胰蛋白胨、5g酵母提取液、3g葡萄糖、3g鹽、1g肌苷和1L水組成的培養(yǎng)基。將100mL上述培養(yǎng)基裝入500mL錐形燒瓶。將從斜面培養(yǎng)基用鉑環(huán)收集的細菌環(huán)接種到燒瓶中的培養(yǎng)基中。旋轉振蕩(200rpm)下，將燒瓶中的細菌在65℃培養(yǎng)16小時，得到培養(yǎng)液。將1.2L相同的培養(yǎng)基裝入2L-培養(yǎng)罐中，把60mL培養(yǎng)液接種到罐內的培養(yǎng)基中。然后在1vvm空氣氣流速度、65℃培養(yǎng)溫度和pH 6.5-7.0范圍(靜)條件下，將罐中的細菌培養(yǎng)6小時，同時兩個攪拌葉輪(上葉輪和下葉輪，每個直徑為42mm)以650rpm旋轉。培養(yǎng)完成后，通過離心分離(10,000G，4℃，15分鐘)獲得細菌。將細菌全部懸浮于40mL的10mM磷酸鉀溶液(pH 7)，由此得到含有PUNP和PYNP的酶溶液(以下稱為“酶溶液”)。
在一分鐘內將1μmol的底物轉化為產物所需的酶活性定義為“1U”。在60℃按照標準方法測定酶溶液的酶活性，1mL的酶溶液顯示出66U的PUNP活性和166U的PYNP活性。
試驗實施例1鳥嘌呤和乙二醛-鳥嘌呤的溶解度將每個化合物過量懸浮于水中，在每個溫度下攪拌1小時，并靜置一會兒。在下述的條件下，用帶有UV探測器的HPLC對液層進行分析，結果如表1所示。
HPLC分析條件探測器UV(260nm)柱Superiorex ODS(Shiseido制造)洗脫劑0.1M磷酸二氫銨溶液∶甲醇＝97∶3(v/v)流速1mL/分鐘樣品20μL表1
實施例1通過核苷磷酸化酶合成乙二醛-2′-脫氧鳥苷制備5mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有30mM 2′-脫氧尿苷、30mM乙二醛-鳥嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的二鈉鹽。將1ml由生產實施例2所獲得的酶溶液加入到99ml上述磷酸鹽緩沖液混合物，使所得反應混合物的總量為100ml。將反應混合物在50℃保持48小時，使反應進行。然后于60℃將混合物過濾并冷卻至4℃。將過濾得到的白色結晶(產率量為80％)進行光譜測定，結果如下。與參考文獻(Chung，F(xiàn).，Hecht，S.S.，Carcinogenesis，6，1671-1673(1985))所述的值對照，結果證實產物是乙二醛-2′-脫氧鳥苷。
UV(pH 7)，λmax(nm)248，272(肩峰)1H-NMR(DMSO-d6+D2O，200MHZ)，δ7.95(s，1H，2-H)，6.12(t，1H，1′-H)，5.50(s，1H，7-H)，4.90(s，1H，6-H)，4.35(bs，1H，3′-H)，3.83(bs，1H，4′-H)，3.54(m，2H，5′-H)，2.52(m，1H，2′-H)，2.28(m，2H，2′-H).
實施例2從乙二醛-2′-脫氧鳥苷合成2′-脫氧鳥苷將0.1g上述實施例1所得的乙二醛-2′-脫氧鳥苷加入到0.2N氫氧化鈉溶液，并在70℃攪拌2小時，將混合物中和以后，在實施例1的條件下，用HPLC方法進行分析，證實定量地得到了2′-脫氧鳥苷。此外，對通過色譜和重結晶得到的白色結晶進行光譜測定，從各種光譜證實所得結晶為2′-脫氧鳥苷。
實施例3穩(wěn)定劑對乙二醛-2′-脫氧鳥苷生成量的影響制備5mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有20mM 2′-脫氧尿苷、20mM乙二醛-鳥嘌呤、表2所示的穩(wěn)定劑和1mL生產實施例2所制備的酶溶液。(表2中，“*”表示穩(wěn)定劑的濃度是4mM，而沒有“*”表示穩(wěn)定劑的濃度是100mM)。將100ml上述磷酸鹽緩沖液混合物于50℃保持38小時，令反應進行。通過堿將反應溶液所含的乙二醛-2′-脫氧鳥苷分解，定量地得到2′-脫氧鳥苷。然后測定2′-脫氧鳥苷的濃度。另外，按照制備上述緩沖液混合物的相似方法制備對照溶液，只是以加入100mM鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷(“Tris”)來代替穩(wěn)定劑。該溶液以下稱為“Tris(對照)”。對結果的分析發(fā)現(xiàn)，類似于EDTA與硼酸的、形成絡合物的化合物組合對提高反應產量是有效的。
表2
實施例4通過各菌株生產的酶合成乙二醛-2′-脫氧鳥苷將500ml與生產實施例2所用的相同的培養(yǎng)基裝入3個2L的錐形燒瓶。用從原種斜面培養(yǎng)物以鉑環(huán)收集的各細菌環(huán)，將大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO 3301、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO13168和肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3321分別接種到三個燒瓶的培養(yǎng)基中。上述細菌在振蕩燒瓶(200rpm)的條件下，于37℃分別培養(yǎng)16小時，獲得培養(yǎng)溶液。通過離心(10,000G，4℃，15分鐘)培養(yǎng)溶液來收集細菌。將所得細菌懸浮于10mL的10mM磷酸鉀緩沖液(pH 7)，由此得到三種酶溶液。
在以下條件下，用上述三種酶溶液的任一種和生產實施例2所得嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859的酶溶液，從2′-脫氧尿苷和乙二醛-鳥嘌呤合成乙二醛-2′-脫氧鳥苷。具體講，首先制備5mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有30mM 2′-脫氧尿苷、30mM乙二醛-鳥嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的二鈉鹽。將上述四種酶溶液(所含細菌相當于100ml上述培養(yǎng)溶液)的每一種(2mL)分別加入到98mL上述磷酸鹽緩沖液混合物中，得到四種反應混合物。每種反應混合物在各個反應溫度下保持48小時，使反應進行。結果如表3所示。
表3
實施例5使用不同的核糖基供體合成乙二醛-鳥苷類化合物首先制備5mM的磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有表4所示的每種核糖基供體、20mM乙二醛-鳥嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸二鈉鹽(每種核糖基供體的濃度是20mM，但表4中的“*”表示其濃度是10mM)。將0.25ml生產實施例2所得的酶溶液加入到所需量的上述磷酸鹽緩沖液混合物中，使得到的反應混合物的總量為10mL。反應混合物在50℃下保持48小時，使反應進行。結果如表4所示。
表4
實施例6使用嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859生產的酶時底物濃度對制備的影響首先制備5mM的鹽酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有表5所示各濃度的底物基質鳥嘌呤或乙二醛-鳥嘌呤、與各個底物基質相同濃度的核糖基供體2′-脫氧尿苷、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸二鈉鹽。將1ml生產實施例2所得的酶溶液加入99ml上述磷酸鹽緩沖液混合物中。反應混合物在50℃下保持48小時，使反應進行。結果如表5所示。當將乙二醛-鳥嘌呤選作底物基質時，生成的乙二醛-2′-脫氧鳥苷通過堿分解，得到2′-脫氧鳥苷。
對所得2′-脫氧鳥苷的量進行了測定。在表5中，當鳥嘌呤的濃度不小于50mM時，不予以分析。
表5
實施例7一鍋反應法合成將0.45g鳥苷和0.44g 40％乙二醛水溶液加入到10mL水中，并將混合物在70℃攪拌18小時。然后，將以下物質和水加入到上述混合物中，得到一水溶液，其含有最終濃度為30mM的2′-脫氧尿苷、100mM的硼酸、4mM的乙二胺四乙酸二鈉鹽和5的mM磷酸鉀。將1ml生產實施例2所得的酶溶液加入到99ml上述水溶液中，使得到的反應混合物的總體積為100mL。反應混合物在50℃下保持48小時，使反應進行。將包含于反應混合物中的乙二醛-2′-脫氧鳥苷通過堿分解為2′-脫氧鳥苷。經(jīng)HPLC測定2′-脫氧鳥苷的濃度，表明產率為80％。
實施例8乙二醛-鳥苷的合成首先制備5mM的磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有50mM的尿苷、50mM乙二醛-鳥嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸二鈉鹽。將1ml生產實施例2所得的酶溶液加入到99ml上述磷酸鹽緩沖液混合物中，使所得反應混合物的總體積為100mL。該反應混合物在50℃下保持48小時，使反應進行。加熱過濾后，將混合物冷卻至4℃。對過濾得到的白色結晶(產率為72％)進行光譜測定，結果如下。與實施例1的乙二醛-2′-脫氧鳥苷光譜比較，結果證實產物是乙二醛-鳥苷。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)，δ8.85(5，1H，5-H)，8.00(5，1H，2-H)，7.27(d，1H，7-OH)，6.50(d，1H，6-OH)，5.71(d，1H，1′-H)，5.49(d，1H，7-H)，5.44(d，1H，3′-OH)，5.18(d，1H，2′-OH)，5.06(s，1H，5′-OH)，4.88(d，1H，6-H)，4.41(m，1H，2′-H)，4.10(d，1H，3′-H)，3.90(d，1H，4′-H)，3.57(m，2H，5′-H).
進一步按照與實施例2相似的方法，從本實施例所得的產物制備出鳥苷。這事實上也表明本實施例的產物為乙二醛-鳥苷。
根據(jù)本發(fā)明，通過微生物產生的酶反應，可以由核糖基供體和乙二醛-鳥嘌呤制備乙二醛-鳥苷類化合物，通過堿將乙二醛-鳥苷類化合物分解，可以高產率有效地制備鳥苷類化合物，即鳥苷和2′-脫氧鳥苷。
對于本領域技術人員而言，其它的優(yōu)勢和改進是很容易實現(xiàn)的。由此本發(fā)明的范圍并不限于本文所描述的具體細節(jié)和典型實施例。因此，在不背離所附權利要求和它們的等同方案所定義的本發(fā)明總的主題的精神和范圍下，可以做各種修改。
權利要求
1.一種制備鳥苷類化合物的方法，該方法包括以下步驟在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤 和選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷的一種物質以及磷酸根離子一起反應，得到式(2)表示的化合物 其中R表示氫原子或羥基，其中嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶得自選自嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)和肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)的微生物；以及通過堿來分解式(2)表示的化合物，得到鳥苷或2′-脫氧鳥苷。
2.一種制備鳥苷類化合物的方法，該方法包括以下步驟在含有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的微生物存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤 和選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷的一種物質以及磷酸根離子一起反應，得到式(2)表示的化合物 其中R表示氫原子或羥基，其中所述微生物選自嗜熱脂肪芽胞桿菌、大腸埃希氏桿菌和肺炎桿菌；以及通過堿來分解式(2)表示的化合物，獲得鳥苷或2′-脫氧鳥苷。
3根據(jù)權利要求1的制備鳥苷類化合物的方法，其中所述微生物是嗜熱脂肪芽胞桿菌JTS 859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿菌IFO3301、大腸埃希氏桿菌IFO 13168或肺炎桿菌IFO 3321。
4.根據(jù)權利要求2的制備鳥苷類化合物的方法，其中所述微生物是嗜熱脂肪芽胞桿菌JTS 859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿菌IFO3301、大腸埃希氏桿菌IFO 13168或肺炎桿菌IFO 3321。
5.根據(jù)權利要求1～4任一項的制備鳥苷類化合物的方法，其中加入選自甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸及其鹽的至少一種化合物。
6.根據(jù)權利要求1～4任一項的制備鳥苷類化合物的方法，其中選自甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸及其鹽的至少一種化合物和硼酸或其鹽一起加入。
全文摘要
本發(fā)明公開的是，在嘌呤核苷磷酸化酶存在下，將乙二醛－鳥嘌呤與核糖－1－磷酸酯和2′－脫氧核糖－1－磷酸酯兩者之一進行反應，或者在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶存在下，將乙二醛－鳥嘌呤和選自尿苷、2′－脫氧尿苷和胸苷的一種物質與磷酸根離子一起反應，制備乙二醛－鳥苷類化合物；然后通過堿將乙二醛－鳥苷類化合物分解，制備由鳥苷和2′－脫氧鳥苷組成的鳥苷類化合物。
文檔編號C07H1/00GK1821420SQ20051013753
公開日2006年8月23日 申請日期2001年3月27日 優(yōu)先權日2000年3月27日
發(fā)明者三上洋一, 松本清一郎, 林良憲, 佐藤豐樹 申請人:有機合成藥品工業(yè)株式會社