專利名稱：制備鳥苷類化合物及其中間體的方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?1110115.6，申請(qǐng)日為2001年3月27日，發(fā)明名稱為“制備鳥苷類化合物及其中間體的方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)以申請(qǐng)日為2000年3月27日的在先日本專利申請(qǐng)No.2000-087302為基礎(chǔ)，并要求其優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容在此引作參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及制備鳥苷類化合物的方法，該鳥苷類化合物被用作抗病毒劑、反義藥物的原料；和涉及鳥苷類化合物的中間體乙二醛-鳥苷類化合物的制備方法。
鳥苷或2′-脫氧鳥苷在工業(yè)上主要是通過提取/分離DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的水解產(chǎn)物來生產(chǎn)，因?yàn)榛瘜W(xué)合成鳥苷或2′-脫氧鳥苷的產(chǎn)率極低。然而，DNA水解產(chǎn)物中除了含有所需的2′-脫氧鳥苷之外，還含有2′-脫氧腺苷、2′-脫氧胞苷和胸苷。RNA的水解產(chǎn)物中除了所需的鳥苷之外，還含有腺苷、胞苷和尿苷。因而，為了只收取鳥苷或2′-脫氧鳥苷，必須實(shí)施復(fù)雜的提取/分離過程，因此不可避免地提高了產(chǎn)品的成本。
另一方面，業(yè)已報(bào)道了一種方法，在該方法中，使作為原料的核苷(或脫氧核苷)和核酸的堿基(nucleic acid base)在核苷磷酸化酶的作用下進(jìn)行堿基交換反應(yīng)，由此獲得所要的核苷(或所要的脫氧核苷)(Hori，N.，Watanabe，M.，Yamazaki，Y.，Mikami，Y.，Agric.Biol.Chem.，53，197-202(1989))。通過這種方法，可以容易地制備腺苷和2′-脫氧腺苷(日本專利申請(qǐng)說明書No.11-46790“制備嘌呤核苷化合物的方法”)。為了用這種酶合成反應(yīng)方法得到鳥苷和2′-脫氧鳥苷，至少在反應(yīng)所需的酶能發(fā)揮作用的pH范圍內(nèi)，鳥嘌呤必須是溶于水的。一般認(rèn)為，為了使得酶反應(yīng)順利進(jìn)行，最好反應(yīng)底物的溶解度至少等于酶的米氏常數(shù)(Km)或更高。但是，由于鳥嘌呤的水溶解度不超過幾個(gè)ppm，所以上述酶合成反應(yīng)方法不能實(shí)際采用。鑒于這種陷于僵局般的狀況，需要開發(fā)一種制備鳥苷或2′-脫氧鳥苷的有效方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的目的是提供一種以高產(chǎn)率有效制備鳥苷或2′-脫氧鳥苷(即鳥苷類化合物)的方法，以及以高產(chǎn)率有效制備鳥苷類化合物中間體乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷(即乙二醛-鳥苷類化合物)的方法。
本發(fā)明人為解決上述問題而進(jìn)行了刻苦的研究，結(jié)果獲得了下面的1)-6)項(xiàng)發(fā)現(xiàn)。
1)當(dāng)水溶解度不超過幾個(gè)ppm的鳥嘌呤與乙二醛反應(yīng)時(shí)，得到下式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤，而乙二醛-鳥嘌呤是溶于水的。
(乙二醛-鳥嘌呤也稱為6，7-二氫-6，7-二羥基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮)2)當(dāng)含有嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)的微生物本身或由該微生物生成的這種酶被用于乙二醛-鳥嘌呤以及核糖-1-磷酸酯和2-脫氧核糖-1-磷酸酯的一種而進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，得到式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物(即乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷)?；蛘弋?dāng)含有嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)和嘧啶核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.2)的微生物本身或由該微生物生成的這些酶被用于乙二醛-鳥嘌呤以及選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷中的任一種，在磷酸根離子的存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，得到式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物(即乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷)。換言之，乙二醛-鳥嘌呤可以作為嘌呤核苷磷酸化酶的底物。
(其中R表示氫原子或羥基)(乙二醛-鳥苷也稱為3-(β-D-赤式-戊-呋喃糖基)-6，7-二氫-6，7-二羥基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮，而乙二醛-2′-脫氧鳥苷也稱為3-(2-脫氧-β-D-赤式-戊-呋喃糖基)-6，7-二氫-6，7-二羥基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮)。
3)在上述2)制備所述的乙二醛-鳥苷的方法中，如果加入至少一種選自下面的化合物甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(以后稱為“EDTA”)、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(以后稱為“EGTA”)和這些物質(zhì)的鹽，或者一起加入至少一種上述化合物和硼酸或它的鹽，則反應(yīng)產(chǎn)率顯著提高。上述化合物是作為核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯(它們是底物或堿基交換反應(yīng)生成的中間體)的穩(wěn)定劑加入的。
4)從原理是講，由各種生物生產(chǎn)的核苷磷酸化酶在上述2)的制備方法中作為酶來使用都可能是有效的。但是，由芽胞桿菌屬(Bacillusgenus)，埃希氏桿菌屬(Escherichia genus)或克雷白氏桿菌屬(Klebsiellagenus)微生物生產(chǎn)的酶是適當(dāng)?shù)?，并且，由嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus.)JTS 859(FERM BP-6885)生產(chǎn)的耐熱型的酶是特別優(yōu)選的。
5)當(dāng)將堿用于通過上述2)的方法得到的乙二醛-鳥苷類化合物而進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，乙二醛-鳥苷類化合物的乙二醛部分很容易地釋放出來，從而可以獲得鳥苷類化合物(即鳥苷或2′-脫氧鳥苷)。
6)上述制備方法1)-5)可以通過一鍋反應(yīng)來進(jìn)行。
在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
總而言之，本發(fā)明涉及下述方法(1)-(16)。
(1)一種制備式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物的方法 其中R表示氫原子或羥基，該方法包括下面的步驟在嘌呤核苷磷酸化酶的存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤與核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯反應(yīng) 由此得到乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷。
(2)一種制備式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物的方法
其中R表示氫原子或羥基，該方法包括下面的步驟在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤 和選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷中的任一種物質(zhì)與磷酸根離子一起反應(yīng)，由此得到乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷。
(3)制備鳥苷類化合物的方法，該方法包括如下步驟在嘌呤核苷磷酸化酶的存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤與核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯反應(yīng) 由此得到式(2)表示的化合物
其中R表示氫原子或羥基；以及通過堿來分解式(2)表示的化合物，獲得鳥苷或2′-脫氧鳥苷。
(4)制備鳥苷類化合物的方法，該方法包括如下步驟在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶磷酸化酶的存在下，將式表示(1)的乙二醛-鳥嘌呤 和選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷中的任一種物質(zhì)與磷酸根離子一起反應(yīng)，由此得到式(2)表示的化合物 其中R表示氫原子或羥基；以及通過堿來分解式(2)表示的化合物，獲得鳥苷或2′-脫氧鳥苷。
(5)上述(1)所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中，作為嘌呤核苷磷酸化酶所使用的是含有這種酶的微生物本身或由該微生物產(chǎn)生的這種酶。
(6)上述(2)所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中，作為嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶所使用的是含有這些酶的微生物本身或由該微生物產(chǎn)生的這些酶。
(7)上述(3)所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中，作為嘌呤核苷磷酸化酶所使用的是含有這種酶的微生物本身或由該微生物產(chǎn)生的這種酶。
(8)上述(4)所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中，作為嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶所使用的是含有這些酶的微生物本身或由該微生物產(chǎn)生的這些酶。
(9)上述(5)或(6)所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中的微生物屬于芽胞桿菌屬(Bacillus genus)，埃希氏桿菌屬(Escherichiagenus)或克雷白氏桿菌屬(Klebsiella genus)。
(10)上述(7)或(8)所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中的微生物屬于芽胞桿菌屬(Bacillus genus)，埃希氏桿菌屬(Escherichia genus)或克雷白氏桿菌屬(Klebsiella genus)。
(11)上述(5)、(6)和(9)中任一項(xiàng)所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中的微生物是嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO3301、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO 13168或肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3321。
(12)上述(7)、(8)和(10)中任一項(xiàng)所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中的微生物是嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO 3301、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO 13168或肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)IFO 3321。
(13)上述(1)、(2)、(5)、(6)、(9)和(11)中任一項(xiàng)所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中加入至少一種選自下面的化合物甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸和它們的鹽，或者一起加入至少一種上述化合物和硼酸或它的鹽。
(14)上述(3)、(4)、(7)、(8)、(10)和(12)中任一項(xiàng)所述的制備鳥苷類化合物的方法，其中加入至少一種選自下面的化合物甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸和它們的鹽，或者一起加入至少一種上述化合物和硼酸或它的鹽。
(15)上述(1)、(2)、(5)、(6)、(9)、(11)和(13)中任一項(xiàng)所述的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，該方法是按照一鍋反應(yīng)實(shí)施的。
(16)上述(3)、(4)、(7)、(8)、(10)、(12)和(14)中任一項(xiàng)所述的制備鳥苷類化合物的方法，該方法是按照一鍋反應(yīng)實(shí)施的。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將在以下的說明書部分予以陳述，而且從說明書中有些是顯而易見的，或者通過實(shí)施本發(fā)明而知悉。本發(fā)明的這些目的和優(yōu)點(diǎn)可以通過下文具體指出的手段和組合，加以了解和實(shí)現(xiàn)。
發(fā)明詳述以下將詳細(xì)描述本發(fā)明。
<原料>
在本發(fā)明中用作原料的乙二醛-鳥嘌呤(即，6，7-二氫-6，7-二羥基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮)，可以高產(chǎn)率地制備。將嘌呤加入到乙二醛水溶液，將該混合物在高溫(優(yōu)選在50-75℃)加熱下攪拌15-20小時(shí)。乙二醛-鳥嘌呤的水溶解度隨溫度升高而增加。反應(yīng)完成后，乙二醛-鳥嘌呤通過冷卻結(jié)晶，經(jīng)過濾可以獲得白色固體。
然而，實(shí)施一鍋反應(yīng)，連續(xù)加入核苷磷酸化酶和核糖供體或2-脫氧核糖供體時(shí)，所得的乙二醛-鳥嘌呤溶液實(shí)際上可以作為原料溶液使用。
在本發(fā)明中，用作核糖供體的核糖-1-磷酸酯和尿苷，以及用作2-脫氧核糖供體的2-脫氧核糖-1-磷酸酯、2′-脫氧尿苷和胸苷均可以市購(gòu)，例如從Sigma Aldrich Japan Co.購(gòu)得。
<通過酶反應(yīng)合成乙二醛-鳥苷類化合物的條件>
將核糖供體和2-脫氧核糖供體(以下稱為“核糖基供體”)和乙二醛-鳥嘌呤加入到磷酸鹽緩沖溶液(pH 6-8，優(yōu)選pH 7)中，往上述磷酸鹽緩沖液混合物中加入生產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶(或僅生產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶)的微生物，或加入由該微生物生產(chǎn)的這些酶。所得的反應(yīng)混合物在最適宜酶的溫度下攪拌24-60小時(shí)，結(jié)果導(dǎo)致“反應(yīng)式1和反應(yīng)式2”或“反應(yīng)式3和反應(yīng)式4”所表示的反應(yīng)。乙二醛-2′-脫氧鳥苷通過“反應(yīng)式1和反應(yīng)式2”得到，乙二醛-鳥苷通過“反應(yīng)式3和反應(yīng)式4”得到。在作為前半部分的“反應(yīng)式1和反應(yīng)式3”中，嘧啶核苷磷酸化酶被用作反應(yīng)酶；在作為后半部分的“反應(yīng)式2和反應(yīng)式4”中，嘌呤核苷磷酸化酶被用作反應(yīng)酶。至于酶的最適宜溫度，對(duì)于由嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERMBP-6885)生產(chǎn)的酶的情形，溫度為大約40-70℃。
在本發(fā)明的酶反應(yīng)中，使用嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶(或單獨(dú)使用嘌呤核苷磷酸化酶)。當(dāng)嘧啶核苷(尿苷、2′-脫氧尿苷或胸苷)用作核糖基供體時(shí)，在作為前半部分反應(yīng)的“反應(yīng)式1和反應(yīng)式3”中生產(chǎn)核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯，嘧啶核苷磷酸化酶實(shí)際上是必須的。另一方面，當(dāng)核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯在反應(yīng)起始時(shí)被用作核糖基供體時(shí)，“反應(yīng)式1”或“反應(yīng)式3”表示的反應(yīng)是不需要的。但是，在這種情況下，即使存在嘧啶核苷磷酸化酶，對(duì)整個(gè)酶反應(yīng)也不會(huì)有任何反面影響。
在反應(yīng)式1-4中，“PYNP”表示嘧啶核苷磷酸化酶，“PUNP”表示嘌呤核苷磷酸化酶。
(反應(yīng)式1) (反應(yīng)式2)
(反應(yīng)式3) (反應(yīng)式4)
在本發(fā)明中，原料核糖基供體的初始濃度是5-1000mM，優(yōu)選10-100mM。乙二醛-鳥嘌呤一次的溶解量不大，但是，如果假定初始加入的乙二醛-鳥嘌呤一次全部溶解，則所表示的初始濃度為5-1000mM，優(yōu)選10-100mM。1-20mM磷酸根離子初始濃度是足夠用的。
<脫氧核糖-1-磷酸酯等的穩(wěn)定劑>
在本發(fā)明中，如上述反應(yīng)式所示，即使在核苷(尿苷、2′-脫氧尿苷、胸苷)用作原料的情況下，反應(yīng)也是通過核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯作為反應(yīng)中間體來進(jìn)行的。這些磷酸酯化合物在性質(zhì)上不穩(wěn)定，放置時(shí)，隨時(shí)間自然分解為核糖和磷酸根離子或2-脫氧核糖和磷酸根離子，當(dāng)磷酸酯酶存在于反應(yīng)體系時(shí)，會(huì)加速這種分解。如果這種分解發(fā)生，會(huì)降低乙二醛-鳥苷類化合物的產(chǎn)率，因?yàn)橹虚g體的分解產(chǎn)物核糖或2-脫氧核糖不能作為核苷磷酸化酶的底物。因而，為了增加產(chǎn)率，本發(fā)明致力于尋找一種能穩(wěn)定核糖-1-磷酸酯或2-脫氧核糖-1-磷酸酯和抑制磷酸酯酶活性的物質(zhì)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入至少一種選自以下的化合物甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、EDTA、EGTA和它們的鹽，并且在更優(yōu)選的情況下，一起加入至少一種上述化合物和硼酸或它的鹽是有效的。和硼酸或其鹽一起加入EDTA或其鹽，顯示出特別優(yōu)良的效果。加入的每個(gè)組分優(yōu)選濃度是20-200mM硼酸或其鹽、2-10mM上述的至少一種化合物或其鹽(即，甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、EDTA、EGTA)。對(duì)所用的上述化合物的鹽和硼酸鹽沒有具體的限制，可以使用任何鹽。例如，所用的鹽可以是堿金屬如鈉和鉀的鹽，以及堿土金屬如鈣和鎂的鹽。
<從乙二醛-鳥苷類化合物制備鳥苷類化合物>
乙二醛-鳥苷類化合物在堿的水溶液中，通過分解釋放出乙二醛部分，由此獲得鳥苷類化合物。作為堿的水溶液，例如，可以使用0.05-0.5N，優(yōu)選0.1-0.25N的氫氧化鈉水溶液。分解反應(yīng)隨pH和溫度的增加而加速。但是，必須選擇溫和的條件，在該條件下連接核糖基團(tuán)的鍵不斷裂。具體講，乙二醛-鳥苷類化合物在pH 4-8的范圍是相對(duì)穩(wěn)定的，但是在pH 9或更高的條件下分解并釋放出乙二醛部分。最后的結(jié)論是，優(yōu)選在60-80℃、pH 9-11范圍和1-5小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，使乙二醛-鳥苷類化合物分解得到鳥苷類化合物。
<鳥苷類化合物的分離和提純>
從反應(yīng)溶液中收集產(chǎn)物，可以通過超濾法、離子交換分離法、吸附色譜法、重結(jié)晶等進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量可以通過HPLC方法用UV探測(cè)器測(cè)定。
<微生物和酶>
原則上講，本發(fā)明使用的嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)和嘧啶核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.2)可以是任何來源的。由下述微生物生產(chǎn)的酶是優(yōu)選的。用于本發(fā)明的微生物不受限于這些具體例子，只要該微生物能生產(chǎn)有效量的上述酶即可。
然而，如上述反應(yīng)式所示，本發(fā)明采用核苷或2′-脫氧核苷作為底物，因而必然生成磷酸酯化合物作為中間體。所以，具有強(qiáng)核苷酶和/或磷酸酯酶活性的微生物是不能使用的。
滿足這些條件的微生物的例子包括屬于芽胞桿菌屬(Bacillusgenus)，埃希氏桿菌屬(Escherichia genus)或克雷白氏桿菌屬(Klebsiellagenus)的微生物。更具體講，這些微生物包括嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿(Escherichia coli)IFO 3301、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO13168和肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3321。
在本發(fā)明中，原料的溶解度和溶解速度越高，所得到的產(chǎn)率和反應(yīng)速度就越高。因此，反應(yīng)期間相對(duì)高的溫度是有利的。鑒于此，優(yōu)選使用嗜熱細(xì)菌和耐熱酶。在上述微生物的例子中，嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)是最優(yōu)選的。
“IFO”表示，這些微生物被保藏在大阪發(fā)酵研究所(Institute forFermentation，Osaka(IFO)，2-17-85，zyusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，532-0024 JAPAN.)“IFO菌株”對(duì)想要得到它們的任何人都是開放的。嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859是國(guó)際保藏菌種(其保藏編號(hào)為FERM BP-6885)，被保藏于專利微生物國(guó)際保存單位，日本國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(Patent Microorganism Depository，National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)。依照“國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約”(BUDAPESTTREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THEDEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENTPROCEDURE)，微生物JTS 859(FERM BP-6885)保藏于1987年10月20日。
這些微生物生長(zhǎng)于細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上，加入胰蛋白胨、酵母提取液、葡萄糖等，生長(zhǎng)得更好并生成大量的上述酶。此外，加入核酸化合物如肌苷于培養(yǎng)基中，可有效提高這些酶的活性。所培養(yǎng)的細(xì)菌本身可以作為粗制的酶來使用。另外，通過標(biāo)準(zhǔn)方法(如通過超聲波作用或研磨破碎，離心分離，硫酸銨—分離和膜分離)能從所培養(yǎng)的菌獲得酶，并且所得的粗制酶也可以使用。
以下是按照“Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，Volume II”(1984)，對(duì)被保藏菌株的細(xì)菌學(xué)特征的研究結(jié)果。試驗(yàn)基本上按照Takeji Hasegawa《Biseibutsu no Bunrui to Dotei(微生物的分類和鑒定)》(編輯版，Gakkai Shuppan center，1985)所述的方法進(jìn)行。
嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERMBP-6885)1.形態(tài)學(xué)特征(1)細(xì)胞的形狀和大小桿狀、5.4-6.5μm×0.7-0.9μm(2)孢子形成橢圓體狀的孢子，一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)一個(gè)孢子，該孢子位于細(xì)胞的端部。
2.培養(yǎng)特征(1)肉湯液培養(yǎng)在62℃培養(yǎng)2天。
(2)肉湯瓊脂平面培養(yǎng)白色而略帶淺黃色、平滑、不透明、無堆積。菌落呈波動(dòng)的環(huán)形。
(3)肉湯瓊脂斜面培養(yǎng)白色而略帶淺黃色、平滑、不透明、無堆積。生長(zhǎng)適度。
3.生化特性(1)格蘭氏染色陽(yáng)性(2)厭氧培養(yǎng) 不生長(zhǎng)(3)能動(dòng)性周毛運(yùn)動(dòng)(4)氧化酶陽(yáng)性(5)過氧化氫酶陽(yáng)性(6)明膠的液化能力能液化(7)石蕊乳凝固(8)O-F試驗(yàn) 發(fā)酵型(9)VP試驗(yàn)陰性(10)從D-葡萄糖產(chǎn)生氣體 未產(chǎn)生(11)從D-葡萄糖產(chǎn)生酸 產(chǎn)生(12)從L-阿糖產(chǎn)生酸 未產(chǎn)生(13)從D-甘露糖醇產(chǎn)生酸 產(chǎn)生(14)從D-木糖產(chǎn)生酸 未產(chǎn)生(15)在薩布羅氏(Sabouraud′s)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)斜面培養(yǎng)觀察到生長(zhǎng)液體培養(yǎng)觀察到生長(zhǎng)(16)0.001％溶菌酶下生長(zhǎng) 沒有生長(zhǎng)(17)0.02％疊氮化物下生長(zhǎng)沒有生長(zhǎng)(18)7％NaCl下生長(zhǎng) 沒有生長(zhǎng)(生長(zhǎng)至2％)(19)酪蛋白的水解能水解(20)淀粉的水解 能水解(21)蛋黃試驗(yàn)沒有生長(zhǎng)(22)二羥丙酮的產(chǎn)生 沒有產(chǎn)生(23)檸檬酸的利用陰性(24)吲哚的產(chǎn)生 陰性(25)脲酶的活性 陽(yáng)性(26)苯丙氨酸的脫氨基作用陰性(27)精氨酸的二水解酶活性陽(yáng)性(28)酪氨酸的分解作用陰性(29)呋喃果聚糖的產(chǎn)生陰性(30)硝酸鹽的還原陽(yáng)性(31)硝酸鈉的脫氮作用陰性(32)硫化氫的產(chǎn)生陽(yáng)性(33)對(duì)無機(jī)氮源的利用僅具有NO3的氮源 觀察到生長(zhǎng)僅具有NH4的氮源 觀察到生長(zhǎng)(34)GC含量 47.3％(35)生長(zhǎng)溫度范圍 40-71℃最佳范圍 60-68℃(36)生長(zhǎng)pH范圍 5.7-8.5最佳范圍 6.0-7.0
由上述的特征進(jìn)行判斷，本發(fā)明的菌株可以確定為嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)。
<一鍋反應(yīng)>
本發(fā)明的制備乙二醛-鳥苷化合物的方法和制備鳥苷類化合物的方法均可以通過一鍋反應(yīng)來實(shí)施。具體講，首先將鳥嘌呤與乙二醛水溶液反應(yīng)，制備出起始反應(yīng)溶液，再將反應(yīng)所必需的核糖基供體(優(yōu)選與穩(wěn)定劑一起加入)、酶溶液以及任選的磷酸根離子加入到起始反應(yīng)溶液中，進(jìn)行反應(yīng)，由此通過一鍋反應(yīng)可以制備出乙二醛-鳥苷類化合物。此外，采用堿分解上述反應(yīng)產(chǎn)物，制備鳥苷類化合物也可以通過一鍋反應(yīng)進(jìn)行。
實(shí)施例通過以下的生產(chǎn)實(shí)施例、試驗(yàn)實(shí)施例和實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步予以詳細(xì)描述。
生產(chǎn)實(shí)施例1合成乙二醛-鳥嘌呤將22.65g鳥嘌呤(由Tokyo Kasei Kogyo Co.制造)和21.75g 40％乙二醛水溶液(Tokyo Kasei Kogyo Co.制造)加入到950mL純水中，并將混合物在70℃下加熱攪拌18小時(shí)，然后將混合物冷卻至4℃并過濾，將過濾得到的白色固體干燥，得到30.7g乙二醛-鳥嘌呤。核磁共振(NMR)譜的測(cè)量結(jié)果如下。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ8.52(bs，1H)，7.70(bs，1H)，7.16(d，1H)，6.39(d，1H)，5.46(d，1H)，4.83(d，1H).
生產(chǎn)實(shí)施例2 制備含有核苷磷酸化酶的細(xì)菌懸浮液按照下述方法培養(yǎng)嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)，它生產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶(以下稱為“PUNP”)和嘧啶核苷磷酸化酶(以下稱為“PYNP”)。
在培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，使用pH 6.2的由10g細(xì)菌-胰蛋白胨、5g酵母提取液、3g葡萄糖、3g鹽、1g肌苷和1L水組成的培養(yǎng)基。將100mL上述培養(yǎng)基裝入500mL錐形燒瓶。將從斜面培養(yǎng)基用鉑環(huán)收集的細(xì)菌環(huán)接種到燒瓶中的培養(yǎng)基中。旋轉(zhuǎn)振蕩(200rpm)下，將燒瓶中的細(xì)菌在65℃培養(yǎng)16小時(shí)，得到培養(yǎng)液。將1.2L相同的培養(yǎng)基裝入2L-培養(yǎng)罐中，把60mL培養(yǎng)液接種到罐內(nèi)的培養(yǎng)基中。然后在1vvm空氣氣流速度、65℃培養(yǎng)溫度和pH 6.5-7.0范圍(靜)條件下，將罐中的細(xì)菌培養(yǎng)6小時(shí)，同時(shí)兩個(gè)攪拌葉輪(上葉輪和下葉輪，每個(gè)直徑為42mm)以650rpm旋轉(zhuǎn)。培養(yǎng)完成后，通過離心分離(10,000G，4℃，15分鐘)獲得細(xì)菌。將細(xì)菌全部懸浮于40mL的10mM磷酸鉀溶液(pH 7)，由此得到含有PUNP和PYNP的酶溶液(以下稱為“酶溶液”)。
在一分鐘內(nèi)將1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶活性定義為“1U”。在60℃按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶溶液的酶活性，1mL的酶溶液顯示出66U的PUNP活性和166U的PYNP活性。
試驗(yàn)實(shí)施例1 鳥嘌呤和乙二醛-鳥嘌呤的溶解度將每個(gè)化合物過量懸浮于水中，在每個(gè)溫度下攪拌1小時(shí)，并靜置一會(huì)兒。在下述的條件下，用帶有UV探測(cè)器的HPLC對(duì)液層進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。
HPLC分析條件探測(cè)器UV(260nm)柱Superiorex ODS(Shiseido制造)洗脫劑0.1M磷酸二氫銨溶液∶甲醇＝97∶3(v/v)流速1mL/分鐘樣品20μL
表1
實(shí)施例1 通過核苷磷酸化酶合成乙二醛-2′-脫氧鳥苷制備5mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有30mM 2′-脫氧尿苷、30mM乙二醛-鳥嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的二鈉鹽。將1ml由生產(chǎn)實(shí)施例2所獲得的酶溶液加入到99ml上述磷酸鹽緩沖液混合物，使所得反應(yīng)混合物的總量為100ml。將反應(yīng)混合物在50℃保持48小時(shí)，使反應(yīng)進(jìn)行。然后于60℃將混合物過濾并冷卻至4℃。將過濾得到的白色結(jié)晶(產(chǎn)率量為80％)進(jìn)行光譜測(cè)定，結(jié)果如下。與參考文獻(xiàn)(Chung，F(xiàn).，Hecht，S.S.，Carcinogenesis，6，1671-1673(1985))所述的值對(duì)照，結(jié)果證實(shí)產(chǎn)物是乙二醛-2′-脫氧鳥苷。
UV(pH 7)，λmax(nm)248，272(肩峰)1H-NMR(DMSO-d6+D2O，200MHZ)，δ7.95(s，1H，2-H)，6.12(t，1H，1′-H)，5.50(s，1H，7-H)，4.90(s，1H，6-H)，4.35(bs，1H，3′-H)，3.83(bs，1H，4′-H)，3.54(m，2H，5′-H)，2.52(m，1H，2′-H)，2.28(m，2H，2′-H).
實(shí)施例2 從乙二醛-2′-脫氧鳥苷合成2′-脫氧鳥苷將0.1g上述實(shí)施例1所得的乙二醛-2′-脫氧鳥苷加入到0.2N氫氧化鈉溶液，并在70℃攪拌2小時(shí)，將混合物中和以后，在實(shí)施例1的條件下，用HPLC方法進(jìn)行分析，證實(shí)定量地得到了2′-脫氧鳥苷。此外，對(duì)通過色譜和重結(jié)晶得到的白色結(jié)晶進(jìn)行光譜測(cè)定，從各種光譜證實(shí)所得結(jié)晶為2′-脫氧鳥苷。
實(shí)施例3 穩(wěn)定劑對(duì)乙二醛-2′-脫氧鳥苷生成量的影響制備5mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有20mM 2′-脫氧尿苷、20mM乙二醛-鳥嘌呤、表2所示的穩(wěn)定劑和1mL生產(chǎn)實(shí)施例2所制備的酶溶液。(表2中，“*”表示穩(wěn)定劑的濃度是4mM，而沒有“*”表示穩(wěn)定劑的濃度是100mM)。將100ml上述磷酸鹽緩沖液混合物于50℃保持38小時(shí)，令反應(yīng)進(jìn)行。通過堿將反應(yīng)溶液所含的乙二醛-2′-脫氧鳥苷分解，定量地得到2′-脫氧鳥苷。然后測(cè)定2′-脫氧鳥苷的濃度。另外，按照制備上述緩沖液混合物的相似方法制備對(duì)照溶液，只是以加入100mM鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷(“Tris”)來代替穩(wěn)定劑。該溶液以下稱為“Tris(對(duì)照)”。對(duì)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，類似于EDTA與硼酸的、形成絡(luò)合物的化合物組合對(duì)提高反應(yīng)產(chǎn)量是有效的。
表2
實(shí)施例4 通過各菌株生產(chǎn)的酶合成乙二醛-2′-脫氧鳥苷將500ml與生產(chǎn)實(shí)施例2所用的相同的培養(yǎng)基裝入3個(gè)2L的錐形燒瓶。用從原種斜面培養(yǎng)物以鉑環(huán)收集的各細(xì)菌環(huán)，將大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO 3301、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)IFO13168和肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3321分別接種到三個(gè)燒瓶的培養(yǎng)基中。上述細(xì)菌在振蕩燒瓶(200rpm)的條件下，于37℃分別培養(yǎng)16小時(shí)，獲得培養(yǎng)溶液。通過離心(10,000G，4℃，15分鐘)培養(yǎng)溶液來收集細(xì)菌。將所得細(xì)菌懸浮于10mL的10mM磷酸鉀緩沖液(pH7)，由此得到三種酶溶液。
在以下條件下，用上述三種酶溶液的任一種和生產(chǎn)實(shí)施例2所得嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859的酶溶液，從2′-脫氧尿苷和乙二醛-鳥嘌呤合成乙二醛-2′-脫氧鳥苷。具體講，首先制備5mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有30mM 2′-脫氧尿苷、30mM乙二醛-鳥嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的二鈉鹽。將上述四種酶溶液(所含細(xì)菌相當(dāng)于100ml上述培養(yǎng)溶液)的每一種(2mL)分別加入到98mL上述磷酸鹽緩沖液混合物中，得到四種反應(yīng)混合物。每種反應(yīng)混合物在各個(gè)反應(yīng)溫度下保持48小時(shí)，使反應(yīng)進(jìn)行。結(jié)果如表3所示。
表3
實(shí)施例5 使用不同的核糖基供體合成乙二醛-鳥苷類化合物首先制備5mM的磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有表4所示的每種核糖基供體、20mM乙二醛-鳥嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸二鈉鹽(每種核糖基供體的濃度是20mM，但表4中的“*”表示其濃度是10mM)。將0.25ml生產(chǎn)實(shí)施例2所得的酶溶液加入到所需量的上述磷酸鹽緩沖液混合物中，使得到的反應(yīng)混合物的總量為10mL。反應(yīng)混合物在50℃下保持48小時(shí)，使反應(yīng)進(jìn)行。結(jié)果如表4所示。
表4
實(shí)施例6 使用嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859生產(chǎn)的酶時(shí)底物濃度對(duì)制備的影響首先制備5mM的鹽酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有表5所示各濃度的底物基質(zhì)鳥嘌呤或乙二醛-鳥嘌呤、與各個(gè)底物基質(zhì)相同濃度的核糖基供體2′-脫氧尿苷、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸二鈉鹽。將1ml生產(chǎn)實(shí)施例2所得的酶溶液加入99ml上述磷酸鹽緩沖液混合物中。反應(yīng)混合物在50℃下保持48小時(shí)，使反應(yīng)進(jìn)行。結(jié)果如表5所示。當(dāng)將乙二醛-鳥嘌呤選作底物基質(zhì)時(shí)，生成的乙二醛-2′-脫氧鳥苷通過堿分解，得到2′-脫氧鳥苷。
對(duì)所得2′-脫氧鳥苷的量進(jìn)行了測(cè)定。在表5中，當(dāng)鳥嘌呤的濃度不小于50mM時(shí)，不予以分析。
表5
實(shí)施例7 一鍋反應(yīng)法合成將0.45g鳥苷和0.44g 40％乙二醛水溶液加入到10mL水中，并將混合物在70℃攪拌18小時(shí)。然后，將以下物質(zhì)和水加入到上述混合物中，得到一水溶液，其含有最終濃度為30mM的2′-脫氧尿苷、100mM的硼酸、4mM的乙二胺四乙酸二鈉鹽和5的mM磷酸鉀。
將1ml生產(chǎn)實(shí)施例2所得的酶溶液加入到99ml上述水溶液中，使得到的反應(yīng)混合物的總體積為100mL。反應(yīng)混合物在50℃下保持48小時(shí)，使反應(yīng)進(jìn)行。將包含于反應(yīng)混合物中的乙二醛-2′-脫氧鳥苷通過堿分解為2′-脫氧鳥苷。經(jīng)HPLC測(cè)定2′-脫氧鳥苷的濃度，表明產(chǎn)率為80％。
實(shí)施例8 乙二醛-鳥苷的合成首先制備5mM的磷酸鹽緩沖液(pH 7)，其中含有50mM的尿苷、50mM乙二醛-鳥嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸二鈉鹽。將1ml生產(chǎn)實(shí)施例2所得的酶溶液加入到99ml上述磷酸鹽緩沖液混合物中，使所得反應(yīng)混合物的總體積為100mL。該反應(yīng)混合物在50℃下保持48小時(shí)，使反應(yīng)進(jìn)行。加熱過濾后，將混合物冷卻至4℃。對(duì)過濾得到的白色結(jié)晶(產(chǎn)率為72％)進(jìn)行光譜測(cè)定，結(jié)果如下。與實(shí)施例1的乙二醛-2′-脫氧鳥苷光譜比較，結(jié)果證實(shí)產(chǎn)物是乙二醛-鳥苷。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)，δ8.85(5，1H，5-H)，8.00(5，1H，2-H)，7.27(d，1H，7-OH)，6.50(d，1H，6-OH)，5.71(d，1H，1′-H)，5.49(d，1H，7-H)，5.44(d，1H，3′-OH)，5.18(d，1H，2′-OH)，5.06(s，1H，5′-OH)，4.88(d，1H，6-H)，4.41(m，1H，2′-H)，4.10(d，1H，3′-H)，3.90(d，1H，4′-H)，3.57(m，2H，5′-H).
進(jìn)一步按照與實(shí)施例2相似的方法，從本實(shí)施例所得的產(chǎn)物制備出鳥苷。這事實(shí)上也表明本實(shí)施例的產(chǎn)物為乙二醛-鳥苷。
根據(jù)本發(fā)明，通過微生物產(chǎn)生的酶反應(yīng)，可以由核糖基供體和乙二醛-鳥嘌呤制備乙二醛-鳥苷類化合物，通過堿將乙二醛-鳥苷類化合物分解，可以高產(chǎn)率有效地制備鳥苷類化合物，即鳥苷和2′-脫氧鳥苷。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，其它的優(yōu)勢(shì)和改進(jìn)是很容易實(shí)現(xiàn)的。由此本發(fā)明的范圍并不限于本文所描述的具體細(xì)節(jié)和典型實(shí)施例。因此，在不背離所附權(quán)利要求和它們的等同方案所定義的本發(fā)明總的主題的精神和范圍下，可以做各種修改。
權(quán)利要求
1.一種制備式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物的方法 其中R表示氫原子或羥基，該方法包括下面的步驟在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤原 和選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷的一種物質(zhì)以及磷酸根離子一起反應(yīng)，得到乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷，其中嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶得自選自嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)和肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)的微生物。
2.一種制備式(2)表示的乙二醛-鳥苷類化合物的方法 其中R表示氫原子或羥基，該方法包括下面的步驟在含有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶微生物的存在下，將式(1)表示的乙二醛-鳥嘌呤 和選自尿苷、2′-脫氧尿苷和胸苷的一種物質(zhì)以及磷酸根離子一起反應(yīng)，得到乙二醛-鳥苷或乙二醛-2′-脫氧鳥苷，其中所述微生物選自嗜熱脂肪芽胞桿菌、大腸埃希氏桿菌和肺炎桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中所述微生物是嗜熱脂肪芽胞桿菌JTS 859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿菌IFO 3301、大腸埃希氏桿菌IFO 13168或肺炎桿菌IFO 3321。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中所述微生物是嗜熱脂肪芽胞桿菌JTS 859(FERM BP-6885)、大腸埃希氏桿菌IFO 3301、大腸埃希氏桿菌IFO 13168或肺炎桿菌IFO 3321。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中加入選自甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸及其鹽的至少一種化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)的制備乙二醛-鳥苷類化合物的方法，其中選自甘氨酸、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸及其鹽的至少一種化合物和硼酸或其鹽一起加入。
全文摘要
本發(fā)明公開的是，在嘌呤核苷磷酸化酶存在下，將乙二醛－鳥嘌呤與核糖－1－磷酸酯和2′－脫氧核糖－1－磷酸酯兩者之一進(jìn)行反應(yīng)，或者在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶存在下，將乙二醛－鳥嘌呤和選自尿苷、2′－脫氧尿苷和胸苷的一種物質(zhì)與磷酸根離子一起反應(yīng)，制備乙二醛－鳥苷類化合物；然后通過堿將乙二醛－鳥苷類化合物分解，制備由鳥苷和2′－脫氧鳥苷組成的鳥苷類化合物。
文檔編號(hào)C07H1/00GK1818074SQ20051013753
公開日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2001年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月27日
發(fā)明者三上洋一, 松本清一郎, 林良憲, 佐藤豐樹 申請(qǐng)人:有機(jī)合成藥品工業(yè)株式會(huì)社