專利名稱：包含維生素b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含維生素B12作為配體的金屬配合物。本發(fā)明還涉及這些配合物在放射診斷術(shù)、放射性核素治療、化學(xué)治療中或作為催化劑的用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的抗癌藥物，例如順鉑(cisplatin)，對正常的健康細胞也是有毒的。需要給患者施用相對高的劑量，而這就會導(dǎo)致嚴重的副作用。通過靶向癌細胞增強的選擇性對患者的治療指數(shù)(therapeutic index)和生活質(zhì)量是有益的。
在放射性核素治療中，使用放射性藥物的代謝性積累來向組織傳遞治療放射劑量。放射性核素治療成功的關(guān)鍵性因素是相對于正常組織的目標(biāo)組織的積累量，目前在所有已知的方法中，該積累量在5～100的范圍內(nèi)。甲狀腺疾病的非常成功的碘代謝治療相對于此來說是一個特例。由于在目標(biāo)組織中積累相對于在正常組織中的積累的比例低，導(dǎo)致對患者正常組織的放射負荷常常相對高。因此，需要一種將放射性核素專一性地傳遞到目標(biāo)組織的方法。
一種制得注意的可以導(dǎo)致部位專一性攝取的候選化合物是維生素B12。快速增殖的癌細胞也是所謂的B12高消耗者。這種非常高的需求量使得維生素B12成為可能的用于傳遞治療劑的“特洛伊木馬”。
氰鈷胺素(維生素B12)是已知的并且已經(jīng)對其化學(xué)性質(zhì)進行了廣泛的研究。許多專利文獻和出版物描述了在鈷、咕啉環(huán)(corrin ring)或核糖部分的維生素B12的衍生化。這些維生素B12衍生物中的一些已經(jīng)被建議用于癌癥的治療或診斷，但都尚未進入市場。
例如US2004/224921涉及由與鈷胺素共價連接的熒光的(fluorescent)、磷光的(phosphorescent)、發(fā)光的(luminescent)或產(chǎn)生光的(light-producing)化合物組成的熒光鈷胺素。這些熒光鈷胺素可用作診斷或預(yù)測(prognostic)標(biāo)志物以將癌細胞和組織與健康細胞和組織區(qū)分開來，并用來確定是否個體將對于使用基于鈷胺素的治療性生物結(jié)合物(bioconjugate)的化學(xué)治療作出積極的應(yīng)答。這些熒光、磷光或產(chǎn)生光的化合物可以共價鍵連接到鈷胺素的鈷原子、咕啉環(huán)或核糖部分。對于非熒光化合物也描述了這種類型的衍生化。
在鈷上直接衍生得到一種保留90％以上維生素B12活性的化合物。因此在該位置上進行衍生化是一種顯而易見的選擇。然而這些化合物也具有缺點。例如烷基化的鈷化合物是光敏性的。
在核糖或咕啉骨架的位置上衍生存在不能被切割的缺點，因此顯著影響維生素B12的生物學(xué)行為(biological behaviour)。
因此，需要一種可用于癌癥的診斷和診療的藥物，其不會產(chǎn)生嚴重的副作用且不會導(dǎo)致高的放射負荷。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)某些金屬配合物能夠直接與維生素B12的氰基配合。這表明，此類結(jié)合尤其發(fā)生在配合物[Tc(N∩O)(OH2)(CO)3](N∩O＝雙齒(bidentate)配體)上，其中氰化物(cyanide)的氮原子直接結(jié)合到Tc金屬中心形成[Co]-CN-Tc部分。這代表了一種維生素B12作為金屬(此時為Tc)的配體的配合物的原型實例。然而，維生素B12作為配體通過氰化物連接金屬的其他金屬配合物也是本發(fā)明的一部分。在所有這些金屬配合物中，維生素B12充當(dāng)配體。
本發(fā)明首次提出了維生素B12通過其氰化物與金屬配位形成[Co]-CN-M配合物，其中[Co]表示無氰化物的維生素B12。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)這種維生素B12衍生物是化學(xué)穩(wěn)定的，且容易制備。
除CN位置以外，維生素B12的所有其他位點都已經(jīng)在文獻中被建議用于標(biāo)記。由于此前沒有預(yù)期把氰化物作為配體基團，因而此前也就未使用氰化物。
由此本發(fā)明涉及通式M(L)n的金屬配合物，其中每個L獨立選擇并為配體且至少一個L選自維生素B12(氰鈷胺素)及其通過氰基的氮原子連接M的衍生物，M為選自過渡金屬的元素，于是形成M-NC-[Co]部分，其中[Co]表示維生素B12或其無氰化物衍生物，n為1、2、3、4、5、6。
一種金屬配合物內(nèi)的不同配體L可不必相同，但每個L可以是獨立選擇的。
M可以為過渡金屬，如選自锝(technetium)、釕(ruthenium)、銠(rhodium)、錸(rhenium)、鈀(palladium)、鉑(platinum)、銥(iridium)和銅(copper)。
對于在癌癥診斷和/或治療中的應(yīng)用而言，金屬優(yōu)選為Re或Tc的放射性同位素(radioisotope)，例如99mTc、188Re、186Re、105Rh。
當(dāng)M為锝或錸時，另一個配體L適合為三個羰基(CO’s)和可選的一種雙齒配體，其可選地連接另一個金屬、生物活性分子或另一個分子，如熒光劑。還可能有兩個單齒(monodentate)配體如H2O或Cl代替一個雙齒配體。其他單齒配體是單羧化物衍生物(monocarboxylate derivative)、單硫醇鹽衍生物(mono thiolate derivative)、脂肪族/芳族胺(aliphatic/aromatic amines)等，其可選地用生物活性分子取代。
雙齒配體適合選自兩個脂肪族和/或芳族胺部分、或一個脂肪族或芳族胺部分和一個陰離子團(如羧化物、硫醇鹽或羥基化物)。實例為α-氨基酸或吡啶甲酸的衍生物。
配體L也可以是生物活性分子。
當(dāng)M為鉑時，L選自包含N、S、P、O、C作為金屬鍵合原子(metal bindingatom)的配體，或帶有一個可以與金屬配位的非成鍵電子對的任何其他供體(donor)，其可選地連接生物活性分子。
生物活性分子或其他分子選自熒光試劑、具有細胞毒素的、抑制細胞的或其他藥理學(xué)的活性的藥效基團、光學(xué)染料、NIR染料或磷光染料(如US-6,180,085和US-6,641,798所公開的)。熒光試劑為例如熒光素(fluoresceine)、芘(pyrene)、吖啶(acridine)、丹酰(dansyl)或其它。這些可用于診斷和預(yù)測的目的。細胞毒素劑或細胞生長抑制劑為例如他莫昔芬(tamoxifen)、氨甲蝶呤(methotrexate)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamid)或其他具有已知(用于治療的)藥理活性的化合物。另外，其他分子可以是用于診斷或治療目的的放射性化合物。生物活性分子還可以是核酸，如RNA或DNA，特別是反義RNA或DNA。
本發(fā)明還涉及制備這些包括維生素B12或在其衍生物作為配體的金屬配合物的方法，其包括將維生素B12與前體配合物混合以得到具有穩(wěn)定的[Co]-CN-M橋的金屬配合物，其中M為過渡金屬，n為1、2、3、4、5或6，L為配體。所述前體配合物具有通式M(L)n-1L′，其中L′是一種由維生素B12取代的配體。過渡金屬適宜選自锝、釕、銠、錸、鈀、鉑、銥和銅。
本發(fā)明還涉及具有通式M(L)n-1的前體配合物，其中M為過渡金屬，優(yōu)選自锝、釕、銠、錸、鈀、鉑、銥和銅，n為2、3、4、5或6，且L為配體。
本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的金屬配合物作為診斷劑或治療劑的用途，以及包含本發(fā)明金屬配合物的藥物組合物。
此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的金屬配合物，其中M為具有催化活性的金屬，例如釕、鈀、銥、鉑或銠。
發(fā)明的詳細說明本發(fā)明涉及含有維生素B12或其一種衍生物作為配體的金屬配合物。在一個實施方案中，金屬可以是放射性核素，例如99mTc或188Re，用于例如癌癥診斷和放射性核素治療的放射性藥物應(yīng)用。在另一個實施方案中，通過將其他金屬片段(例如Rh、Pt、Pd)通過氰化物與維生素B12偶聯(lián)所得的金屬配合物可用于化學(xué)治療或立體專一性(stereospecific)和/或?qū)τ尺x擇性(enantioselective)催化。
維生素B12與金屬配合物在d3、d6或d8電子排布的反應(yīng)導(dǎo)致形成穩(wěn)定的[Co]-CN-M橋。如果M為99mTc，這是標(biāo)記維生素B12的方便的方法。如果M為例如Rh(I)，由于維生素B12提供了立體專一性環(huán)境，因而相應(yīng)的配合物可用于催化。
如果M為99mTc或188Re，前體配合物適合為[Tc(N∩O)(OH2)(CO)3]，其中OH2被[Co]-CN取代。配體N∩O(或其他供體組合)是可變的。在缺少其他配體(單或雙齒配位的)的情況下，僅維生素B12與金屬配位。在缺少雙齒配位的N∩O配體或其他任何供體組合中的雙齒配體的情況下，一個水分子被維生素B12取代且Tc的兩個剩余位置仍由H2O或Cl占據(jù)。在溶液中，盡管對于Re作為固體分離的產(chǎn)量較低，但得到大量的含有99mTc或Re的配合物b1～b4(參閱試驗部分)。
配體N∩O(或其他)也可以是雙功能的。一種功能用于對金屬的配位，而第二種功能可以再與例如目標(biāo)載體偶聯(lián)。這使得標(biāo)記的維生素B12的受體定向(receptor targeting)、內(nèi)攝(internalization)和俘獲能夠組合。如果附加的功能性是例如細胞內(nèi)的酶分解，那么這種衍生物也被稱為“特洛伊木馬”。這就會釋放功能活性或非活性的維生素B12化合物。
雙功能配體的實例為1，4-吡啶二羧酸、1，5-吡啶二羧酸、1，2-咪唑二羧酸、1，2-哌嗪二羧酸、氨基酸，如谷氨酸、賴氨酸。
由此，可與維生素B12的氰化物連接的不同配合物的結(jié)構(gòu)和功能的可變性提供了調(diào)整(finetune)和改善[Co]-CN-M(L)n-1配合物的一般行為和生物分布的可能。
維生素B12在本發(fā)明的配合物中作為配體顯示了出乎意料的穩(wěn)定性。其作為天然維生素B12配位。如果通過用另一個配體的取代從本發(fā)明的金屬配合物將其釋放，那么它作為天然的維生素B12釋放，并因此，對身體無害而且安全。
當(dāng)維生素B12與一種毒性化合物配位時，預(yù)期其毒性會降低。從文獻中可知，某些酶如腺苷轉(zhuǎn)移酶從[Co]-CN分解維生素B12中與鈷連接的氰化物或其他基團。這意味著金屬配合物M(L)n-1也被分解并從維生素B12釋放。在吸收維生素B12配合物的癌細胞中一旦釋放毒性部分(其可以是金屬配合物或連接金屬配合物的分子)時，毒性部分可以實施其作用模式而不會在非靶向的細胞中誘發(fā)有害的副作用。
此外，還確定了通過如本發(fā)明所建議的氰化物的此類偶聯(lián)不會影響維生素B12與運鈷胺素蛋白(transcobalamin)I(TCI)、運鈷胺素蛋白II(TCII)和內(nèi)因子(intrinsic factor)(TF)的結(jié)合。其仍然可被細胞吸收(take up)并因此能成功地用作特洛伊木馬。
任何其他配體L與M的偶聯(lián)是經(jīng)由鍵合原子，其選自S、N、C、O、P或包含一個非成鍵電子對的另一種原子。因此鍵合原子為較大部分L的一部分。
本發(fā)明的金屬配合物的合成很簡單，這是因為無需B12骨架的衍生。可容易地以非常高的產(chǎn)量得到該產(chǎn)物。當(dāng)使用維生素B12的衍生物作為配體時，可以在金屬配合物合成之前進行維生素B12的衍生。


圖1和2描述的化合物為本發(fā)明的化合物。
為了得到產(chǎn)物b1～b4，將配合物[M(OH2)(L2)(CO)3](M＝185，87Re，99mTc)與維生素B12配位。在引入B12之前，通過使fac-[99mTc(OH2)3(CO)3]+配合物、[ReBr3(CO)3]2-配合物分別與雙齒配位的配體L2起反應(yīng)來合成配合物[M(OH2)(L2)(CO)3]。這是所謂的混合配體[2+1]方法。橋接(bridging)金屬被認為是維生素B12和配體L2之間的一種介質(zhì)(mediator)，而配體L2是可變的。
b1～b4的非對映異構(gòu)體(diastereomer)(a)和(b)可以彼此分離。該純非對映異構(gòu)體為動力學(xué)穩(wěn)定的且相互轉(zhuǎn)化，如果發(fā)生相互轉(zhuǎn)化的話，只是緩慢向彼此轉(zhuǎn)化。該非對映異構(gòu)體在HPLC停留時間中的明顯差異表明，可以使用維生素B12作為手性配體以在反應(yīng)中使用金屬配合物作為催化劑引入對映選擇性或非對映選擇性。
在本發(fā)明的金屬配合物中，維生素B12不被競爭配體(competing ligand)，如，例如氯化物、乙腈、水或其他天然存在的配體基團取代。
由于含Co-C(C≡烷基)鍵的輔酶B12化合物的光敏度與Co-C鍵的斷裂有關(guān)，故本發(fā)明的配合物完全不是光敏性的。這是一個重要的優(yōu)點，因為它了簡化存儲和處理。
可以通過正常的靜脈內(nèi)(intravenously)、動脈內(nèi)(intraarterially)、腹膜(peritoneally)、瘤內(nèi)(intratumorally)注射或通過將在胃中釋放金屬配合物的劑型口服對宿主，主要是哺乳動物宿主，施用本發(fā)明的化合物用于診斷或放射性核素治療。該給藥途徑取決于放射性核素要求的具體位置。通常，將注入宿主大約0.1～2mL，這取決于該宿主的體重。通常該治療方案是根據(jù)待治療的患者的體重、腫瘤類型、年齡等具體定制的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠決定所需的放射劑量。根據(jù)其目的在施用放射性核素后，通過檢測來自放射性核素特異性結(jié)合的部位的放射性發(fā)射(radioactive emission)，可采取多種方式對宿主進行診斷或治療。
當(dāng)金屬配合物為鉑配合物時，它們可以在用于化學(xué)治療的藥物組合物中使用。給藥途徑通常為靜脈內(nèi)。而且，對于每個患者單獨確定需要施用的金屬配合物的量。
化合物b1表示維生素B12的99mTc衍生物的一個代表性實例。其顯示與特定的維生素B12轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)相結(jié)合。
化合物b2由于在L2中不涉及與M(CO)3-部分配位的附加的羧基，因此親脂性較低。該自由羧基可被認為是錨點，在該錨點上可連接任何其他生物分子(例如肽)、生物活性分子或熒光標(biāo)記物。
盡管化合物b3和b4獲得的產(chǎn)量較低(～30％)，但這卻表明任何類型的人造或天然α-氨基酸可能經(jīng)由[2+1]方法與維生素B12結(jié)合。
使用小鼠黑素瘤細胞系(B16F1)進行的b4的細胞毒性試驗顯示在100μM的濃度具有17％的增殖抑制。在相同濃度，天然的鈷胺素(維生素B12)顯示完全無影響。
順鉑化合物b5～b7表明維生素B12也可以充當(dāng)不同于Tc和Re的金屬的配體的可能性。配合物b5的氯化物是不穩(wěn)定的(labile)，其可以被更穩(wěn)定的配體(例如甲基鳥嘌呤(methylguanine)b6或鳥嘌呤核苷(guanosine)b7)所取代。其提供了將維生素B12用作特洛伊木馬以便將反義RNA或DNA序列傳遞到細胞和細胞核中用于轉(zhuǎn)錄或翻譯沉默的可能性。
用小白鼠黑素瘤細胞系(B16F1)進行的細胞毒性試驗顯示b5的增殖細胞百分比為20％，而b6為30％。
本發(fā)明在實施例中通過參照化合物來進行說明，所述化合物中配體形成锝或錸三羰基，其中一個OH2部分由維生素B12取代，且在其余的OH2部分進一步衍生，或者鉑化合物，例如順鉑，其中一個氯代原子被維生素B12取代且另一個氯代原子可選為其他分子。
然而，基本的發(fā)明思想是使用維生素B12上的氰化物進行衍生?；谶@種思想，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員能夠定義本文沒有具體公開但仍使用了本發(fā)明思想的其他衍生物。這些化合物也是本發(fā)明的一部分。
其中，參照下述附圖，通過非限制性的實施例對本發(fā)明進行進一步的說明。
圖1顯示了在與維生素B12偶聯(lián)之前的前體配合物。其中的數(shù)字標(biāo)記對應(yīng)于實施例中使用的數(shù)字標(biāo)記。
圖2顯示了本發(fā)明的金屬配合物的實例。該數(shù)字標(biāo)記對應(yīng)于實施例中使用的數(shù)字標(biāo)記。
圖3顯示了99mTC(VitB12)(H2O)(CO)3的HPLC色譜。
圖4顯示了維生素B12的結(jié)構(gòu)式。
圖5顯示化合物b1、b4、b5和b6的X射線結(jié)構(gòu)。
實施例材料和方法全部化學(xué)品是從Merck、Dietikon(CH)、Aldrich或Fluka、Buchs(CH)公司購得的最高商業(yè)等級的產(chǎn)品，且除非另有說明，無需進一步純化即可使用。
所有反應(yīng)均在氮或氬氣氛中完成。通過HPLC監(jiān)控反應(yīng)。
HPLC分析是在裝備有二極管陣列UV/Vis檢測器和EG&G Berthold LB508放射度(radiometric)檢測器的Merck-Hitachi L-7000系統(tǒng)上進行的。使用Macherey Nagel Nucleosil C-18ec RP柱(5μm粒徑，100孔徑大小，250×3mm)和Merck C-18e RP Supersphere柱(100孔徑大小，250×4mm)和Waters XTerra RP8柱(5μM粒徑，3.0×100mm)進行分離。使用不同的HPLC溶劑系統(tǒng)和梯度溶劑系統(tǒng)1溶于水的0.1％AcOH和10％CH3CN，pH為3(A)和甲醇(B)。溶劑系統(tǒng)2溶于水的0.1％三乙銨乙酸酯(triethylammonium acetate)和10％CH3CN，pH為8。溶劑系統(tǒng)3溶于水的0.1％三氟乙酸(A)和甲醇(B)。梯度10～3分鐘100％A，3.1～9分鐘75％A，9.1～20分鐘66％→0％A，20～25分鐘0％A；0.5ml/分鐘，或如所述的。梯度20～40分鐘100％→0％A，30.1～40分鐘0％A，40.1～42分鐘0％→100％A，42～50分鐘100％A。梯度30～5分鐘100％A，5.1～40分鐘100％→65％A，40.1～45分鐘0％A，45.1～53分鐘100％A。梯度40～5分鐘0％→20％B，5～45分鐘20％→65％B。梯度50～10分鐘20％B，10～30分鐘20％→40％B。梯度60～30分鐘25％→65％B。梯度70～5分鐘25％B，5.1～30分鐘25％→100％B。
在裝備有兩個Prostar 215泵和Prostar 320UV/Vis檢測器的Varian Prostar系統(tǒng)上，使用Macherey Nagel Nucleosil C-18ec RP柱(7μM粒徑，100孔徑大小，250×20mm，流速10ml/分鐘，和250×40mm，流速40ml/分鐘)和Waters XTerra Prep RP8柱(5μM粒徑，100×30mm，流速30ml/分鐘)進行制備HPLC分離。
在Merck Hitachi M-8000光譜儀上記錄電噴射離子化質(zhì)譜(ESI-MS)。
在Varian Cary 50光譜儀上記錄UV/Vis光譜。
除非不同的說明，使用壓縮的KBr片中的樣品在Bio-Rad FTS-45光譜儀上記錄IR光譜。
在裝備有三個在514nm、633nm和785nm波長的激光器的RenishawRamanscope連續(xù)波儀器上記錄RAMAN光譜。
在Varian Gemini 200MHz或300MHz和Bruker DRX 500MHz光譜儀上記錄NMR光譜。使用殘余溶劑質(zhì)子作為內(nèi)標(biāo)相對于TMS報告化學(xué)位移。31PNMR光譜的化學(xué)位移是相對于0ppm的正磷酸報告的。14N NMR光譜的化學(xué)位移是相對于0ppm的硝基甲烷報告的。通過解析1H COESY、C-H相關(guān)性(correlation)、DEPT和(某些情況下)ROESY光譜來確定鈷胺素衍生物的峰值分配(peak assignment)。
MALDI-ToF質(zhì)譜是以a-氰-4-羥基肉桂酸為基質(zhì)(matrix)在Voyager-DE PRO上測定的。使用757VA Computrace Metrohm環(huán)電壓計(cyclovoltameter)在室溫采用玻璃碳(Metrohm)作為工作電極和輔助電極，Ag/AgCl為參考電極來進行CV測量。該化合物以0.1M六氟磷酸四丁銨的甲醇溶液中有1mM溶液的形式測定。
在Stoe IPDS衍射儀上，在183(2)K，使用石墨-單色的Mo Kα放射(λ＝0.71073)收集結(jié)晶數(shù)據(jù)。使用Paratone N油覆蓋合適的晶體，在玻璃纖維頂部固定并立即轉(zhuǎn)入Stoe IPDS衍射儀。在183(2)K使用石墨-單色的MoKα放射(λ＝0.71073)收集數(shù)據(jù)。通過SELECT程序選擇分布于整個上下限(limiting sphere)的八千個反射并用CELL[1]程序來進行晶胞參數(shù)精細化(refinement)。將數(shù)據(jù)對于洛倫茲(Lorentz)和偏振效果以及對于吸收(數(shù)字的)進行修正。使用SHELXS-97[2]或SIR97[3]以直接方法解得結(jié)構(gòu)，并通過F2的完全矩陣最小二乘法及SHELXL-97[4]進行精細化。
在Leco CHNS-932元素分析器上進行元素分析。
如先前報道的制備[NEt3]2[ReBr3(CO)3][5]和fac-[99mTc(OH2)3(CO)3]+[6]。
一般標(biāo)記方法用分子氮沖洗10ml帶橡皮塞的玻璃小瓶。加入50ml 10-3M含水鈷胺素衍生物或含配體的溶液和450ml 0.1M磷酸鹽緩沖的[99mTc(OH2)3(CO)3]+溶液(pH 7.4)，并在75℃下將反應(yīng)混合物保持30～45分鐘。
氰化物橋接的鈷胺素衍生物制備如下將50ml10-3M雙齒配體水溶液和450ml磷酸鹽緩沖的[99mTc(OH2)3(CO)3]+溶液(pH 7.4)加入用分子氮沖洗的小瓶(如上所述)中，在90℃將反應(yīng)混合物保持30分鐘。將100ml該溶液加入另一個含100ml 10-2M維生素B12水溶液的瓶中。在37℃下將反應(yīng)混合物保持60分鐘。
進行帶γ檢測的HPLC分析來證實99mTc核素的完全轉(zhuǎn)化。
(1)的合成將[NEt4]2[ReBr3(CO)3](488mg，0.63mmol)溶于水(5ml)并加入4-咪唑羧酸(imc)(71mg，0.63mmol)溶于水(3ml)的溶液中?；亓?小時后，產(chǎn)物在室溫(r.t.)沉淀為白色粉末。過濾，用乙醚(diethyl ether)洗滌并在高真空干燥得到186mg的1(73％)。
1H NMR(300，DMSO-D6)δ8.40(s，1H，imc)，7.68(s，1H，imc)，7.08(br s，1H，imc)IR(KBr，cm-1)2039，1936vC＝O(st)MS(ESI+，MeOH)m/z764(2M-2H2O)，382(M-H2O)+C7H5N2O6Re的分析計算值C，21.05；H，1.26；N，7.02。得到C，21.15；H，1.41；N，6.97。
(2)的合成將[NEt4]2[ReBr3(CO)3](101mg，0.13mmol)溶于水(10ml)。加入AgNO3(70mg，0.4mmol)并在室溫攪拌3小時后，通過過濾除去AgBr，向無色溶液中加入吡啶-2，4-二羧酸(2，4-dipic)(24mg，0.13mmol)，隨后在50℃下攪拌2小時。冷卻所得黃色溶液并使產(chǎn)物在4℃結(jié)晶12小時。過濾收集黃色晶體、用水洗滌并在高真空中干燥，得到產(chǎn)物產(chǎn)量為38mg(65％)。
1H NMR(300，DMSO-D6)δ8.96(d，1H，吡啶)，8.34(s，1H，吡啶)，8.15(d，1H，吡啶)，7.50(s，1H，吡啶)IR(KBr，cm-1)2036，1920vC＝O(st)MS(ESI+，MeOH)m/z438(M-H2O)+C10H6NO8Re的分析計算值C，26.45；H，1.33；N，3.07。得到C，26.15；H，1.67；N，3.07。
(3)的合成根據(jù)如“材料和方法”一節(jié)所述的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記方法制備配合物3。在室溫以10-3M的濃度下標(biāo)記絲氨酸。在90℃40分鐘后99mTc完全轉(zhuǎn)化。
(4)的合成將[Et4N]2[ReBr3(CO)3](100mg，0.13mmol)溶于甲醇/水混合物(4∶1，10ml)。加入N，N-二甲甘氨酸(70mg，0.7mmol)并在50℃攪拌混合物12小時。使溶液平衡至室溫，、濃縮并在短C18過濾器上純化。得到白色結(jié)晶固體。產(chǎn)量20mg(40％)。
1H NMR(500，DMSO-D6)δ4.18(s，2H)，3.46(s，3H)，3.15(s，3H)C21H24N3O15Re3(三聚物)的分析計算值C，22.58；H，2.17；N，3.76。得到C，23.19；H，2.78；N，3.84。
IR(KBr，cm-1)2022，1911，1890，1866MS(ESI+，MeOH)m/z1117.0([M]+)(三聚物)化合物(b1)的合成在室溫下，將溶有維生素B12(100mg，73.8mmol)和1(50mg，0.125mmol)的10ml甲醇溶液攪拌過夜。通過HPLC測量來控制該反應(yīng)(溶劑系統(tǒng)1，梯度2)。當(dāng)檢測不到維生素B12時，蒸發(fā)溶劑，并將粗產(chǎn)品再溶解于水中，通過0.2μm過濾器過濾除去過量的1。將濾液進行制備HPLC純化(溶劑系統(tǒng)1，梯度2，流速30ml/分鐘)。將兩種異構(gòu)體彼此分離。以相似量～(1∶1)得到為紅色粉末的異構(gòu)體?？偖a(chǎn)率96％。完整的表征參閱結(jié)晶數(shù)據(jù)。通過將丙酮蒸氣擴散(vapor diffusion)至b1(b)的水溶液中得到b1(b)的晶體。
31PNMR(81，CD3OD)δ0.68IR(KBr，cm-1)3400、2926、2179、2023、1900、1667、1627、1572、1401、1366、1213、1056MS(ESI+，MeOH)m/z1737(M+1)+，869(M+2)2+CVEl/2＝-652mV相對Ag+/AgCl，約90％可逆。
化合物(b2)的合成在室溫下，將溶有維生素B12(50mg，36.9mmol)和2(19.8mg，0.074mmol)的3ml甲醇溶液攪拌48小時。通過HPLC測量來控制該反應(yīng)(溶劑系統(tǒng)1，梯度2)。當(dāng)檢測不到維生素B12時，蒸發(fā)溶劑，并將粗產(chǎn)品進行制備HPLC純化(溶劑1，梯度2，流速30ml/分鐘)。分別得到相似量～(1∶1)為紅色粉末的異構(gòu)體。總產(chǎn)率76％。
1H NMR(500，D2O)δ0.43(s，3H，C20)，0.95～0.98(m，1H，C41′)，0.99(s，3H，C46)，1.08(s，3H，C54)，1.17～1.20(m，1H，C60′)，1.23(d，3H，Pr3，J＝6.3Hz)，1.42(s，3H，C36)，1.44(s，3H，C47)，1.65～1.80(m，2H，C42′，C48′)，1.83(s，3H，C25)，1.88～2.10(m，6H，C30，C37，C41，C42，C48)，2.25(s，3H，B10)，2.28(s，3H，B11)，2.37～2.38(m，2H，C26)，2.41(s，3H，C53)，2.45～2.53(m，6H，C31，C49，C55)，2.56(s，3H，C35)，2.58～2.65(m，3H，C56，C60)，2.75～2.81(m，3H，C18，C37，Pr1′)，3.15(d，1H，C13，J＝9.9Hz)，3.63(d，1H，Pr1，J＝13.7Hz)，3.70(dd，1H，R5′，J＝12.6和4.2Hz)，3.78(d，1H，C19，J＝11.4Hz)，3.86～3.90(m，2H，C8，R5)，4.00～4.02(m，1H，R4)，4.15(t，1H，R2，J＝4.2和4.1Hz)，4.26～4.33(m，1H，Pr2)，4.39(d，1H，C3，J＝8.6Hz)，4.63(dt，1H，R3，J＝8.5和4.3，4.0和3.6Hz)，6.08(s，1H，C10)，6.23(d，1H，R1，J＝3.0Hz)，6.51(s，1H，B4)，7.02(s，1H，B2)，7.24(s，1H，B7)，8.13(dd，1H，L3，J＝5.4和1.7Hz)，8.51(s，1H，L1)，8.71(d，1H，L2，J＝5.4Hz)13C NMR(125，D2O)δ15.8，16.5，17.5，18.4，19.7，19.9，20.3，20.4，20.9，21.1，27.6，27.7，29.5，32.4(3C)，33.1(2C)，33.7，35.2，36.3，40.2，42.8，43.9，46.9，48.2～52.6(2C低于溶劑信號)，52.6，55.3，55.8，58.4，60.6，62.7，70.8，73.7，75.5，76.9，83.9，86.7，88.3，96.1，105.1，108.1，112.9，117.6，128.0，129.6，131.5，134.3，136.1，138.0，143.3，152.0，154.4，166.4，167.1，168.0，174.2(3C)，175.3(2C)，176.6(3C)，177.6(2C)，178.2，180.7，182.5，193.4，196.3(2C)MS(ESI+，MeOH)m/z1793(M+1)+，1116(片段)IR(KBr，cm-1)3411、2972、2179、2027、1918、1903、1665、1611、1572、1498、1402、1214、1154、1061、571M＝99mTc的化合物(b3)的合成將500ml 10-4M的3的PBS溶液，pH 7.4與500ml 0.01M維生素B12的水溶液混合，并在40℃攪拌1.5小時。該反應(yīng)隨后經(jīng)過HPLC(溶劑系統(tǒng)1，梯度2)。60％轉(zhuǎn)化后反應(yīng)達到平衡。
化合物(b4)的合成將維生素B12(50mg，0.04mmol)溶于甲醇(10ml)。加入[Re(dmg)(CO)3]34(45mg，0.04mmol)并在室溫攪拌混合物12小時。形成兩種加合物(adduct)(通過HPLC可明顯地區(qū)分)(產(chǎn)率25％和36％)。它們通過制備HPLC(溶劑系統(tǒng)3，梯度7)進行分離純化。加合物1產(chǎn)量10mg，14％，加合物2產(chǎn)量12mg，17％。通過將丙酮蒸氣擴散至配合物的水溶液得到適合X射線分析的b4(b)晶體。完整的表征參閱結(jié)晶數(shù)據(jù)。
C70H96CoN15O19PRe的分析計算值C，48.66；H，5.60；N，12.16。得到C，48.42；H，5.01；N，12.04(b4(b))IR(KBr，cm-1)2033，1928，1904MS(ESI+，MeOH)m/z1728.7(M+1)+化合物(b5)的合成在35℃，將順二氯化二氨亞鉑(II)(5)(66.4mg，0.221mmol)和硝酸銀(37.6mg，0.221mmol)溶于水(6ml)的混合物攪拌2小時。通過離心除去沉淀并用水(4ml)洗滌。將溶液加入氰鈷胺素(300mg，0.221mmol)，并將所得溶液在50℃攪拌16小時。HPLC分析顯示鈷胺素的完全轉(zhuǎn)化。在真空中除去溶劑，并通過制備HPLC純化粗產(chǎn)品(溶劑系統(tǒng)3，梯度4)。冷凍干燥產(chǎn)物餾分(fraction)得到紅色粉末b5。產(chǎn)量259.8mg，72.6％。通過將丙酮蒸氣擴散至b5的飽和水溶液得到b5晶體。
UV/Visλ/nm(logε/mol 1-1cm-1)＝279.9(4.1)，361.9(4.4)，519.9(3.8)，550.9(3.8)IR(KBr，cm-1)vCN(st)2199195Pt NMR(107，CD3OD)δ-2340MALDI-ToF MSm/z1607[M-Cl+Na]+，1591[M-Cl-NH3+Na]+，1571[M-Cl-2NH3+Na]+CVE1/2＝-515mV相對Ag+/AgCl，約50％可逆。
化合物(b6)的合成在50℃攪拌b5(37.4mg，23.1μmol)和9-甲基鳥嘌呤(6)(4.2mg，25μmol)的水溶液(2ml)，4天后，HPLC分析顯示起始物料幾乎完全轉(zhuǎn)化。在真空中除去溶劑，通過制備HPLC純化粗產(chǎn)品(溶劑系統(tǒng)3，梯度5)。冷凍干燥產(chǎn)物餾分得到紅色粉末b6。產(chǎn)量32.0mg，79％。通過將丙酮蒸氣擴散至b6的飽和水溶液得到b6晶體。
31P NMR(202，CD3OD)δ0.73
MALDI-ToF MS1736[M-CH3]+，1715[M-NH3-CH3]+化合物(b7)的合成在30℃攪拌b5(58.5mg，36.1μmol)和2′-脫氧鳥苷(7)(11.6mg，43.3μmol)的水溶液(5ml)，4天后，HPLC分析顯示起始物料幾乎完全轉(zhuǎn)化。在真空中除去溶劑，并通過制備HPLC純化粗產(chǎn)品(溶劑系統(tǒng)3，梯度6)。冷凍干燥產(chǎn)物餾分得到紅色粉末b7。產(chǎn)量45.3mg，67.7％。
UV/Visλ/nm(logε/mol 1-1cm-1)＝278.0(4.2)，361.9(4.2)，521.0(3.7)，546.0(3.7)。
31PNMR(202，CD3OD)δ0.71(94％)，0.21(6％)195PtNMR(107，CD3OD)δ-2475(以大約1.5kHz劃線)MALDI-ToF MS1723[M-核糖-2NH3+Na]+。
99mTc(VitB12)(X)2(CO)3的制備[X＝Cl、H2O]將1ml(50mCi，但放射性濃度不是必須為50mCi/ml，其可以更低或更高)99mTc-高锝酸鹽加入到IsoLinkTM瓶中，并將所得溶液煮沸20分鐘來制備99mTc(H2O)3(CO)3+。使三羰基反應(yīng)混合物冷卻并用HCl 1N酸化至pH3。
然后，通過在5ml注射用的無氧水中溶解68.0mg維生素來制備10mM維生素B12的水溶液。在氮氣氛中，將0.1ml99mTc-三羰基溶液和0.9ml的10mM維生素B12溶液的混合物在100℃反應(yīng)30分鐘。
186Re(VitB12)(X)2(CO)3的制備[X＝Cl、H2O]將預(yù)先酸化的(pH 2.5)Re-186-高錸酸鹽溶液加入密封于氮氣氛下含NH3BH3和抗壞血酸的混合物的瓶中。在室溫10分鐘后反應(yīng)完成。這稱為預(yù)還原(pre-reduction)步驟。
通過在5ml注射用的無氧水中溶解68.0mg維生素B12來制備10mM維生素B12的水溶液。從還原的錸溶液取1ml加入IsoLinkTM瓶，并在100℃反應(yīng)15分鐘。冷卻得到的含186Re(H2O)3(CO)3+的溶液。
將0.1ml錸三羰基溶液和0.9ml的10mM維生素B12溶液的混合物在100℃保持45分鐘。
圖3是99mTc(VitB12)(H2O)2(CO)3的HPLC色譜圖的實例。
晶體數(shù)據(jù)化合物b1(b)的X射線表經(jīng)驗式C70H106CoN16O28PRe式量 1895.81溫度 183(2)K波長 0.71073晶系 正交晶系空間群P212121晶胞大小 a＝15.9578(10)α＝90°b＝21.2328(12)β＝90°c＝27.9776(13)＝90°體積 9479.6(9)3z 4密度(計算)1.328Mg/m3吸收系數(shù) 1.545mm-1F(000)3916晶粒大小 0.57×0.15×0.04mm3晶體描述 紅色片狀數(shù)據(jù)收集的θ范圍 2.16～25.00°指標(biāo)(index)范圍 -18＜＝h＜＝18，0＜＝k＜＝25，0＜＝1＜＝32收集的反射16557獨立反射 16557[R(int)＝0.0000]觀測到的反射 10604觀測標(biāo)準(zhǔn) ＞2sigma(I)相對于θ＝25.00°的完整性 98.8％吸收修正 用數(shù)字表示最大和最小透射率 0.9331和0.5508精制方法 F2的完全矩陣最小二乘法數(shù)據(jù)/約束/參數(shù)16557/40/1026F2吻合度(goodness-of-fit) 0.954
最終R指標(biāo)[I＞2sigma(I)]R1＝0.0990，wR2＝0.2370R指標(biāo)(全部數(shù)據(jù))R1＝0.1297，wR2＝0.2549絕對結(jié)構(gòu)參數(shù) -0.007(11)峰和孔的最大差異 1.975和-0.854e.-3化合物b4(b)的X射線表經(jīng)驗式 C73H112.60CoN15O27.30PRe式量 1913.28溫度 183(2)K波長 0.71073晶系 正交晶系空間群 P212121晶胞大小 a＝15.8758(7)α＝90°b＝21.8451(10)β＝90°c＝26.3673(14)γ＝90°體積 9144.4(8)3z 4密度(計算) 1.390Mg/m3吸收系數(shù) 1.601mm-1F(000) 3964晶粒大小 0.46×0.08×0.07mm3數(shù)據(jù)收集的θ范圍 1.86～26.00°指標(biāo)范圍 -19＜＝h＜＝19，-26＜＝k＜＝26，-32＜＝1＜＝32收集的反射 68628獨立反射 17853[R(int)＝0.1048]相對于θ＝26.00°的完整性 99.5％吸收修正 用數(shù)字表示最大和最小透射率 0.9257和0.7060精制方法 F2的完全矩陣最小二乘法數(shù)據(jù)/約束/參數(shù) 17853/2/1071
F2吻合度 0.900最終R指標(biāo)[I＞2sigma(I)]R1＝0.0662，wR2＝0.1588R指標(biāo)(全部數(shù)據(jù))R1＝0.1159，wR2＝0.1742絕對結(jié)構(gòu)參數(shù) -0.014(8)峰和孔的最大差異 2.044和-1.063e.-3化合物b5(b)的X射線數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)精制經(jīng)驗式 C137H184C12Co2F3N32O56P2Pt2式量 3873.04溫度 183(2)K波長 0.71073晶系 P1空間群 三斜晶系晶胞大小 a＝16.9434(17)α＝111.999(10)°b＝17.3115(15)β＝99.721(11)°c＝18.0814(17)γ＝90.580(11)°體積 4831.2(8)3z 1密度(計算) 1.331Mg/m3吸收系數(shù) 1.741mm-1F(000) 1979晶粒大小 0.34×0.14×0.10mm3數(shù)據(jù)收集的θ范圍 2.31～28.05°指標(biāo)范圍 -22＜＝h＜＝22，-22＜＝k＜＝22，-23＜＝1＜＝23收集的反射 46915獨立反射 38480[R(int)＝0.0685]相對于θ＝28.05°的完整性 92.0％最大和最小透射率 0.8545和0.7101精制方法 F2的完全矩陣最小二乘法數(shù)據(jù)/約束/參數(shù) 38480/61/1937
F2吻合度0.914最終R指標(biāo)[I＞2sigma(I)] R1＝0.0720，wR2＝0.1731R指標(biāo)(全部數(shù)據(jù)) R1＝0.1138，wR2＝0.1925絕對結(jié)構(gòu)參數(shù)-0.015(5)峰和孔的最大差異1.141和-1.967e.-3參考文獻[1]2.87ed.，STOE&Cie，GmbH，Darmstadt，Germany，1998. G.M.Sheldrick，Acta Cryst.1990，A46，467. A.Altomare，M.C.Burla，M.Camalli，G.L.Cascarano，C.Giacovazzo，A.Guagliardi，A.G.G.Moliterni，G.Polidori，R.Spagna，J.Appl.Cryst.1999，32，115. G.M.Sheldrick，University Gttingen，1997. R.Alberto，A.Egli，U.Abram，K.Hegetschweiler，P.A.Schubiger，J.Chem.Soc.Dalton Trans.1994，2815. R.Alberto，K.Ortner，N.Wheatley，R.Schibli，A.P.Schubiger，J.Am.Chem.Soc.2001，123，3135.
權(quán)利要求
1.通式為M(L)n的金屬配合物，其中每個L獨立選擇并表示配體且至少一個L是維生素B12(氰鈷胺素)或其通過氰基的氮原子與選自過渡金屬的M連接的衍生物，從而形成M-NC-[Co]部分，其中[Co]表示無氰化物的維生素B12，n為1、2、3、4、5或6。
2.如權(quán)利要求1所述的金屬配合物，其中所述過渡金屬選自锝、釕、銠、錸、鈀、鉑、銥和銅。
3.如權(quán)利要求1或2所述的金屬配合物，其中所述金屬是Re或Tc的放射性同位素，如99mTc、188Re、186Re。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項所述的金屬配合物，其中當(dāng)M為锝或錸時，其他配體包含三個羰基(CO’s)和可選地一個雙齒配位體，其可選地連接另一個金屬配合物或其他分子，如生物活性分子或熒光試劑。
5.如權(quán)利要求4所述的金屬配合物，其中所述雙齒配位體選自兩個脂肪族和/或芳族胺部分、或一個脂肪族或芳族胺部分和一個陰離子基團，如羧化物、硫醇鹽或羥基化物。
6.如權(quán)利要求5所述的金屬配合物，其中所述雙齒配位體選自α-氨基酸或吡啶甲酸的衍生物。
7.如權(quán)利要求1～3中任一項所述的金屬配合物，其中當(dāng)M為鉑時，L獨立地選自包含N、S、P、O、C作為金屬鍵合原子的配體，或帶有一個可用于與金屬配位的非成鍵電子對的任何其他供體，可其選地與另一個金屬配合物或另一個分子，如生物活性分子或熒光分子結(jié)合。
8.如權(quán)利要求4或7所述的金屬配合物，其中所述其他分子選自熒光試劑、具有細胞毒素的、抑制細胞的或其他藥理學(xué)的活性的藥效基團、光學(xué)染料、NIR染料或磷光染料。
9.如權(quán)利要求8所述的金屬配合物，其中所述熒光試劑選自熒光素、芘、吖啶、丹酰。
10.如權(quán)利要求8所述的金屬配合物，其中細胞毒素試劑為他莫昔芬、氨甲蝶呤或環(huán)磷酰胺。
11.如權(quán)利要求1～10中任一項所述的具有圖2所示結(jié)構(gòu)式的金屬配合物。12.制備如權(quán)利要求1～11中任一項所述的金屬配合物的方法，其包括將維生素B12與通式為M(L)n-1L′的前體配合物混合，其中M為過渡金屬，n為2、3、4、5或6，L′是將由維生素B12或其衍生物取代的配體，且每個L獨立選擇而且是配體，以獲得帶有穩(wěn)定的[Co]-CN-M橋的金屬配合物。
13.具有通式M(L)n-1L′、用于制備如權(quán)利要求1-11中任一項所述金屬配合物的前體配合物，其中M為過渡金屬，n為2、3、4、5或6，L′為一種將被取代的配體，且每個L獨立選擇且為配體。
14.如權(quán)利要求13所述的具有圖1所示結(jié)構(gòu)式的前體配合物。
15.如權(quán)利要求1～11中任一項所述的用于放射診斷術(shù)、化學(xué)治療或放射性核素治療的金屬配合物。
16.如權(quán)利要求1～11中任一項所述的金屬配合物，其中M是一種用于催化的催化活性金屬。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式M(L)
文檔編號C07D487/00GK1910192SQ200580002150
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者蘇珊尼·B·孔茲, 羅杰·艾伯托, 赫克托·H·奈特卡斯特羅, 斯蒂芬·芒德韋勒 申請人:蘇黎世大學(xué)