專利名稱：評估出現(xiàn)與抗epcr自身抗體的存在相關的病理的危險度和素因的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過檢測和體外定量在樣品中檢測高水平針對內皮蛋白C/活化蛋白C受體(EPCR)的自身抗體的方法。
背景技術：
自身免疫疾病自身免疫疾病的特征在于有免疫反應的存在，其中某些因素誘導針對宿主組織的免疫反應，并且有攻擊這些組織的異?？贵w(自身抗體)的產生。這些自身免疫疾病包括諸如抗磷脂綜合征(APLS)、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、全身性自身免疫血管炎等等的疾病。
APLS是以與抗磷脂抗體的存在有關的血管血栓形成(靜脈、動脈或微血管)和孕期并發(fā)癥(胎死、早產或多發(fā)性自發(fā)流產)為特征。這些抗體是異質的，并且識別多種磷脂組合、磷脂結合蛋白或二者。最常檢測到的抗磷脂抗體亞型包括所謂的抗凝血狼瘡抗體(ACL)、抗心磷脂抗體和抗糖蛋白Iβ2抗體。當前研究了不包括在經典實驗室標準中的其它抗磷脂抗體。這類抗體靶向不同于心磷脂的如磷脂酰乙醇胺的磷脂或靶向諸如膜聯(lián)蛋白V和蛋白S的磷脂結合蛋白。但是，人們卻幾乎不知抗磷脂抗體的存在與血管血栓形成及流產間相關的機制。
血管疾病根據(jù)涉及的血管類型(動脈、靜脈或微循環(huán)的小內徑血管)，血管病存在三種主要類型。對于動脈血管疾病，管壁硬化會降低通過血管腔的血流，因而長期減少由受損血管供血區(qū)域的血供給。這種動脈粥樣硬化損傷可遭受并發(fā)癥，導致在動脈內形成血栓，完全堵塞動脈，因而完全阻塞血流。在這種情況下，導致組織梗死。這種現(xiàn)象最常見的實例為當血栓形成影響到冠狀動脈時的心肌梗塞，或者，當受影響的血管為腦部動脈時的中風。對于靜脈血管疾病，血栓形成使回心血流變得錯綜復雜。當血栓的靜脈壁中的血栓碎片脫落時，碎片將會在血流中遷移，一直到達肺靜脈循環(huán)回路中才滯留下來-產生急性肺衰竭(稱為肺栓塞的情況)。微循環(huán)疾病繼炎癥和/或不同器官中微循環(huán)血管的血栓形成而出現(xiàn)，且表現(xiàn)為微循環(huán)損傷的器官衰竭。血管疾病在西方國家是發(fā)病率和死亡率的重要原因。特別是，來自于InstitutoNacional de Estadistica(INE)(西班牙國家統(tǒng)計研究所)的數(shù)據(jù)表明，2000年心血管疾病是西班牙的第一死亡原因(約占總死亡率的35.0％)。在最常見的心血管系統(tǒng)疾病中，心臟血管或動脈血栓疾病(主要是急性心肌梗塞)構成第一死亡原因。目前，許多分子危險因素已得到鑒定，它們是一些患者中出現(xiàn)血栓形成的原因。其中一個這樣的危險因素為存在所謂的抗磷脂抗體。最初認為這些自身抗體靶向陰離子磷脂；但是，后來表明許多這些自身抗體靶向諸如糖蛋白Iβ2或凝血酶原的蛋白質和磷脂之間形成的復合物。最近，發(fā)現(xiàn)其它具有抗凝結功能的蛋白質也有參與，如蛋白C(PC)、蛋白S、血栓調節(jié)蛋白或膜聯(lián)蛋白V-這樣就解釋了為什么自身抗體的存在傾向于血栓形成。
產科并發(fā)癥產科并發(fā)癥基本上包括妊娠第10周后胎死、嬰兒早產、妊娠第10周前自發(fā)性流產、宮內生長遲緩、子癇和先兆子癇。
EPCR活化的蛋白C(APC)是主要的凝血級聯(lián)調控蛋白之一。APC的酶原PC被與內皮細胞表面的血栓調節(jié)蛋白結合的凝血酶活化。與蛋白S(它的非酶輔因子)組合的APC通過蛋白水解活化的因子V和VIII發(fā)揮它的抗凝結作用。在靜脈和/或動脈血栓形成的患者體內檢測到血栓調節(jié)蛋白、PC和蛋白S的基因性缺陷和獲得性缺陷。內皮PC/活化PC受體(EPCR)是在內皮細胞膜上表達的，具有特異性和高親和性結合PC和APC的糖蛋白。為使EPCR具有功能，它必須與穩(wěn)定其三維結構的磷脂分子結合。PC與EPCR的結合顯著增強了內皮細胞表面的凝血酶-血栓調節(jié)蛋白復合體對它的活化。EPCR的任務是將PC聚集到內皮表面，并將其呈遞給凝血酶-血栓調節(jié)蛋白復合體-從而利于PC的有效活化。在體內，EPCR誘導了內皮細胞表面PC活化指標近乎9倍的增加-結果造成90％循環(huán)水平的APC。此外，只有當APC結合到EPCR上時，它才可活化蛋白酶活化的受體-1，這產生“保護細胞”的細胞信號，并阻止調亡。
EPCR主要由靜脈和動脈內皮表達，尤其是由那些大和中內徑的靜脈和動脈內皮表達。另外，合胞體滋養(yǎng)層也大量表達EPCR。在這些地方，EPCR阻止血栓形成和促進內皮和合胞體滋養(yǎng)層良好的細胞功能。愈來愈多的有力證據(jù)表明EPCR參與妊娠維持，因為，在基因敲除小鼠中，EPCR基因缺失引起這些小鼠的胎盤血栓和早期胚胎死亡。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及在來自個體的樣品中測定抗EPCR自身抗體(IgG，IgA和IgM)的方法。另一方面，已證實這些自身抗體存在于經診斷為自身免疫疾病(APLS和播散性紅斑狼瘡)的患者、存在于血管疾病(靜脈和動脈血栓形成)的患者和產科并發(fā)癥女性患者體內。除了其它方面之外，伴隨本說明書的實施例還闡明了以下事實在自身免疫疾病的患者(在APLS或播散性紅斑狼瘡患者中確定)中，在患有諸如動脈血栓形成，如心肌梗塞(在APLS和非APLS患者中確定)的血管疾病、或局部缺血性中風(在APLS患者中確定)或靜脈血栓形成(在APLS患者中確定)的患者中，以及患有諸如胎死(在患有APLS和未患有APLS的女性中確定)或多次流產(在APLS患者中確定)的產科并發(fā)癥的患者中，在血清或血漿中抗EPCR自身抗體的水平會增加。
本發(fā)明的創(chuàng)作者發(fā)現(xiàn)，自身免疫疾病患者、和/或血管疾病患者和/或產科并發(fā)癥患者的血清或血漿中抗EPCR自身抗體的水平，與不受這些疾病的影響的健康個體的樣品相比有增加。這些證據(jù)使得所述抗EPCR自身抗體成為有用的標記物，用于在體外評估個體出現(xiàn)與存在增加水平的針對EPCR的自身抗體相關疾病的危險度和素因，這些疾病例如為自身免疫疾病、血管疾病或產科并發(fā)癥。
對APLS患者體內抗EPCR自身抗體的存在及其與胎死的關系作了研究。也評估了這些自身抗體對內皮表面APC生成的影響。然后，在配對病例-對照研究中研究了抗EPCR自身抗體與胎死的關聯(lián)性。得到的結果支持了抗EPCR自身抗體構成胎死了的危險因素這一觀點。阻止PC在表達EPCR的細胞表面的活化可能是這些自身抗體發(fā)揮它們的病理作用的一種機制。
附圖簡述

圖1顯示rhsEPCR在Pichia pastoris中的表達。rhsEPCR從穩(wěn)定轉化的P.pastoris細胞上清中純化出，如材料與方法部分所述(見實施例)。將含有rhsEPCR的3組分每種10μl進行SDS-PAGE分離，使用GELCODE Blue檢測蛋白(A)或采用單克隆的抗myc抗體(Invitrogen)進行Western印跡檢測蛋白(B)。
圖2比較在診斷為APLS的患者及對照者體內的抗EPCR自身抗體水平。顯示了抗EPCR自身抗體的水平。IgM同種型抗體對照(中值＝45AU，任意單位)，患者(中值＝57AU)；IgA同種型抗體對照(中值＝31AU)，患者(中值＝39AU)；和IgG同種型抗體對照(中值＝72AU)，患者(中值＝75AU)。
圖3顯示抗EPCR自身抗體對內皮細胞生成APC的影響，其中在患者C中可觀察到在同種型M抗EPCR自身抗體存在時的APC的生成，并與抗體不存在時和非抑制性抗體存在時APC的生成比較。每種情況都進行了2-4次獨立的實驗。
發(fā)明詳述定義為方便理解本發(fā)明申請，下面對本發(fā)明上下文中使用的一些術語和表述的含義進行解釋。
術語“個體”指哺乳動物物種的成員，并且包括但不限于家養(yǎng)寵物、靈長類和人類；個體優(yōu)選是任何年齡或種族的人(男性或女性)。
表述“自身免疫疾病”指那些免疫系統(tǒng)針對宿主組織進行反應、產生廣泛機體紊亂的病癥。出于說明目的，這樣的疾病包括(除其它狀況外)APLS、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、自身免疫血管炎，等等。
表述“血管疾病”指那些影響血管的病癥。當涉及動脈時，由該血管所供血的附屬區(qū)域就缺乏灌注；這種情況通常繼發(fā)于歸屬于管壁的動脈粥樣硬化損傷或血栓形成或二者同時存在的動脈阻塞。而靜脈受累由來源于受影響的外周區(qū)域的回心血液的復雜化定義，并且通常是靜脈血栓形成導致血管阻塞的結果。當影響到微循環(huán)時，它是以器官損傷為特征，該器官的微循環(huán)在行使其功能方面受到影響。作為實例，這樣的疾病包括(除其它病癥外)諸如心肌梗塞、中風、暫時性腦血管意外、四肢局部缺血、動脈粥樣硬化、動脈瘤等動脈血管障礙，以及諸如淺表靜脈和深層靜脈血栓形成、肺栓塞等的靜脈血管疾病和在感染期或自身免疫疾病情況下觀察到的器官衰竭形式的微循環(huán)病理(血栓形成)。
表述“產科并發(fā)癥”是指那些影響妊娠進行的病癥，如涉及妊娠母體及胚胎或胎兒。其實例包括流產、胎死、早產、宮內生長遲緩、子癇和先兆子癇。
術語“自身抗體”是指由個體產生并靶向(或特異于)宿主結構和自產生機體的組織的抗體，如抗血小板自身抗體、抗甲狀腺自身抗體、針對紅血球的自身抗體，等等。在此意義上，術語“抗EPCR自身抗體”是指由個體產生并且特異性靶向他或她自身組織的EPCR的免疫球蛋白或抗體。
本發(fā)明中所用的術語“抗原表位”，是指蛋白的抗原決定簇，例如能被所述抗體所識別的其氨基酸序列。
術語“肽”和“多肽”是指代表蛋白質片段的氨基酸分子鏈。術語“蛋白質”和“多肽”用起來無明顯區(qū)別。
本發(fā)明是基于以下觀察結果自身免疫疾病患者，和/或血管疾病患者，和/或產科并發(fā)癥患者與來源于無此類疾病的健康個體的樣品相比，抗EPCR自身抗體的產生增加了。此證據(jù)將抗EPCR自身抗體可作為有用的標記物，用于在體外評估給定的個體出現(xiàn)與針對EPCR的自身抗體的高水平存在相關的病理的危險度和易感性。
此說明書中用到的表述“高水平抗EPCR自身抗體”是指AU(任意單位)水平等于或超過正態(tài)總體的百分位50，例如包括AU水平等于或超過正態(tài)總體的百分位60、等于或超過正態(tài)總體的百分位70、等于或超過正態(tài)總體的百分位80、等于或超過正態(tài)總體的百分位90、等于或超過正態(tài)總體的百分位95。由于個體間差異(如種族相關方面等)，很難(如果不是完全不可能)建立適用于所有個體的指示高水平抗EPCR自身抗體的絕對值。通過涉及測試一組正常個體(即，在測試時未診斷出自身免疫疾病，或未有血管疾病或產科并發(fā)癥病史的人)的抗EPCR自身抗體水平的常規(guī)程序，很容易就可計算得出這樣的百分位。
抗EPCR自身抗體的測定可以采用任何常規(guī)方法完成，如“材料與方法”中描述的ELISA(實施例1)。邏輯上，每個個體都會呈現(xiàn)出一定的抗EPCR自身抗體水平(AU)，并且會確定這樣的具體的抗EPCR自身抗體水平，在此水平以上發(fā)現(xiàn)被分析總體的50％。這個值為百分位50。顯然，這樣的值(AU)也存在，即在其之上可發(fā)現(xiàn)40％的正常被檢個體-該值對應于百分位60。依次地，也可以定義其它值，在它們之上可發(fā)現(xiàn)30％、20％、20％、10％和5％的正常被檢個體-分別對應于百分位70、80、90、95。
本發(fā)明提供了在樣品中檢測存在高水平的針對內皮蛋白C/活化蛋白C受體(EPCR)的自身抗體的方法，特征在于包括在體外定量來自個體的所述樣品中的針對EPCR的自身抗體。這些高水平的自身抗體與選自自身免疫疾病(如，APLS、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、自身免疫血管炎等)、血管疾病(如，動脈血管疾病，如心肌梗塞、中風、暫時性腦血管意外、四肢局部缺血、動脈粥樣硬化、動脈瘤、血栓形成等；或靜脈血管疾病，如淺表或深層靜脈血栓形成、肺栓塞；或微循環(huán)血管疾病)和產科并發(fā)癥(如，流產、胎死、早產、宮內生長遲緩、子癇、先兆子癇等)的病理相關。因而，本發(fā)明的主題方法適用于在給定時間間隔檢測抗EPCR自身抗體水平的變化。本發(fā)明的檢測目的可通過它們與抗EPCR自身抗體的正常水平比較來完成。
所述方法包括從個體采集樣品的步驟，如血清或血漿樣品，它們可用諸如血液采集的任何常規(guī)方法獲得。
樣品可從先前診斷為或未診斷為患有自身免疫疾病或血管病癥或產科并發(fā)癥的個體中取得。樣品也可從正在進行治療的個體或以前治療過此類疾病或并發(fā)癥的個體中獲得。
考慮到本發(fā)明方法的性質，對這些抗EPCR自身抗體的檢測和定量通過與標記物連接的免疫測試方法進行，此標記物使得能檢測和定量特異性抗原-抗體復合物的形成，該測試方法例如免疫層析法檢測(乳膠、膠體金等)、以熒光、同位素、重金屬、酶、發(fā)光標記物、化學發(fā)光標記物和生色團標記物為標記物的免疫檢測，等等。
廣泛的眾所周知的測試法都可使用于本發(fā)明，包括使用未標記抗體(第一抗體)和標記抗體(第二抗體)。這些技術包括Western-印跡或Western轉移、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)、RIA(放射性免疫分析)等。
在具體實施方案中，本發(fā)明方法中能夠檢測和/或定量這些抗EPCR自身抗體的優(yōu)選免疫檢測是ELISA測試，其包括a)將包括EPCR氨基酸序列或其片段的多肽固定于固體載體，所述片段含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位；b)將所述被固定的多肽和來自于所述個體的懷疑含有抗EPCR自身抗體的樣品孵育足夠的時間，以使抗體結合到被固定的多肽，并形成多肽-抗EPCR自身抗體復合物；c)除去多余的未與被固定的多肽結合的樣品；d)將所述多肽-抗EPCR自身抗體復合物與酶連接的第二抗體孵育，其中所述第二抗體能與所述抗EPCR自身抗體結合。
該包含EPCR氨基酸序列或其含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位的片段的多肽可為包括全長EPCR的氨基酸序列的多肽，或包括EPCR片段的氨基酸序列并且含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位的多肽。在具體實施例中，所提及的多肽是融合蛋白，它包括i)區(qū)域A，其由含有EPCR氨基酸序列或其片段的多肽組成，所述片段含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位；以及ii)區(qū)域B，其由含有用于分離或純化所提及的融合蛋白的氨基酸序列和/或用于將所提及的融合蛋白錨定到固體載體的氨基酸序列的多肽組成。
此區(qū)域B可與區(qū)域A的氨基末端或區(qū)域A的羧基末端結合。
在具體實施方案中，區(qū)域A包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列。
區(qū)域B包括用于分離或純化先前定義的融合蛋白的氨基酸序列，和/或用于將提及的融合蛋白固定于固體載體的氨基酸序列。實際上能用于分離或純化融合蛋白的任何氨基酸序列(一般指“標簽”肽)，和/或能用于將融合蛋白固定于固體載體的任何氨基酸序列都可出現(xiàn)在區(qū)域B中。有時，用于分離或純化融合蛋白的氨基酸也可用作用于將所提及的融合蛋白固定到固體載體的氨基酸序列，反之亦然。在具體實施方案中，區(qū)域B包括用于分離或純化融合蛋白的氨基酸序列和用于將融合蛋白固定到固體載體的氨基酸序列。
作為例子，這種用在分離或純化融合蛋白中的氨基酸序列和/或用在將融合蛋白固定到固體載體的氨基酸序列可為Arg-標簽、His-標簽、FLAG-標簽、Strep-標簽、能被抗體識別的抗原表位，該抗原表位例如為c-myc-標簽、SBP-標簽、S-標簽、鈣調節(jié)蛋白結合肽、纖維素結合域、甲殼質結合域、谷胱甘肽S-轉移酶-標簽、麥芽糖結合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-標簽等。(Terpe K.，Appl.Microbiol.Biotechnol.(2003)，60523-525)，如Ala-His-Gly-His-Arg-Pro(SEQ ID NO4)(2、4和8拷貝)、Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser(SEQ ID NO5)、Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys(SEQ ID NO6)(6次重復)、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白(YTDIEMNRLGK)等的氨基酸序列。
在具體實施方案中，所述區(qū)域B由包括能被抗體識別的抗原表位的多肽(如c-myc抗原表位，被抗c-myc抗體所識別)和組氨酸尾(His-標簽)所組成。
在伴隨本說明書的的實施例中，公開了名為rhsEPCR的多肽的產生，該多肽由包含人EPCR(hsEPCR)可溶性部分的氨基酸序列、對應于c-myc抗原表位的氨基酸序列和組氨酸尾的融合蛋白組成-氨基酸序列示于SEQ ID NO3中。
本發(fā)明方法中所用的多肽可由常規(guī)方法獲得，如通過適宜的表達系統(tǒng)表達。
用在前述ELISA實驗中的第二抗體是免疫球蛋白同種特異性抗體，它來源于不同于本研究個體的種屬，因而能夠表征抗EPCR自身抗體的同種型。舉例而言，特異于給定免疫球蛋白同種型的該第二抗體選自抗人IgG抗體、抗人IgM抗體、抗人IgA抗體，及它們的混合物。在具體實施方案中，第二抗體與使得能檢測復合物的諸如酶(例如，過氧化物酶、堿性磷酸酶等)的標記物結合。
另一方面，本發(fā)明提供了評估個體出現(xiàn)與所述個體內抗EPCR自身抗體的高水平存在相關的病理的危險度和易感性的方法，包括在體外定量來自所述個體的樣品中針對EPCR的自身抗體。
在具體實施方案中，與針對EPCR的自身抗體的高水平存在相關的病理選自自身免疫疾病，例如APLS、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、自身免疫血管炎等；血管疾病，例如動脈血管疾病，如心肌梗塞、中風、暫時性腦血管意外、四肢局部缺血、動脈粥樣硬化、動脈瘤、血栓形成等，或靜脈血管病，如淺表或深層靜脈血栓形成、肺栓塞，或微循環(huán)血管病，如微循環(huán)血栓形成、在感染或自體免疫疾病期間發(fā)生的器官衰竭等；以及產科并發(fā)癥，如流產、胎死、早產、宮內生長遲緩、子癇、先兆子癇等。
本發(fā)明所提供的方法是基于以下事實診斷患有自身免疫疾病或患有血管疾病或患有產科并發(fā)癥的個體與無此類疾病或產科并發(fā)癥臨床史的個體內的相應水平相比，前者具有水平高抗EPCR自身抗體。
本發(fā)明所提供的用于評估(評定)個體出現(xiàn)與自身抗體的高水平存在相關的疾病的危險度和易感性的方法是通過將本研究個體樣品中的自身抗體水平與正常水平(定義為那些在正常個體群體中發(fā)現(xiàn)的水平，如上述表述“高水平”的定義中所提及的)比較而完成。所述方法是基于此部分先前所描述的免疫分析。
另一方面，本發(fā)明涉及在體外監(jiān)測對表現(xiàn)出與抗EPCR自身抗體的高水平存在相關的病理的個體的治療效果，該方法包括在體外定量所提及個體樣品中的抗EPCR自身抗體。該方法以如上所述的方式進行，盡管此時樣品源自以前診斷有某些自身免疫疾病或血管疾病，或表現(xiàn)出某些產科并發(fā)癥，接受治療的個體。此方法可以評估應用于正在接受治療的個體的治療效果，即指，治療的有效性和作用，目的(例如)在于維持治療或修正治療。
另一方面，本發(fā)明涉及抗EPCR自身抗體在評估來自個體的樣品中存在高水平針對EPCR的自身抗體的方法中的用途。在具體的實施方案中，所述抗EPCR自身抗體的高水平存在與選自自身免疫疾病、血管疾病和產科并發(fā)癥的病理學相關。個體中增加水平的抗EPCR自身抗體和出現(xiàn)與抗EPCR自身抗體的高水平存在相關的病理的增加的危險度或易感性相關，該病理例如為自身免疫疾病、血管疾病和/或產科并發(fā)癥。
另一方面，本發(fā)明涉及一種多肽在評估樣品中存在針對內皮受體EPCR的自身抗體的方法中的用途，其中該多肽包括EPCR氨基酸序列或其含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位的片段。所述方法包括監(jiān)測和在體外定量所述樣品中的抗EPCR自身抗體。在具體實施方案中，這種與抗EPCR自身抗體的高水平存在有關的病理選自自身免疫疾病、血管疾病和產科并發(fā)癥。
在具體實施方案中，所提及包括EPCR氨基酸序列或其片段(該片段含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位)的多肽如先前在描述用以監(jiān)測和/或定量抗EPCR自身抗體的ELISA試驗中所定義的多肽。在具體實施方案中，此多肽是所謂的rhsEPCR(見實施例)，它由包含人EPCR(hsEPCR)可溶性部分的氨基酸序列、對應于c-myc抗原表位的氨基酸序列和組氨酸尾的融合蛋白所組成-氨基酸序列示于SEQ ID NO3中。
另一方面，本發(fā)明涉及用于在體外評估高水平抗EPCR自身抗體的試劑盒，其包括具有EPCR氨基酸序列或其片段(該片段含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位)的多肽。在具體的實施方案中，該包括EPCR氨基酸序列或其片段(該片段含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位)的多肽如先前在描述用以監(jiān)測和/或定量抗EPCR自身抗體的ELISA試驗中所定義的多肽。在具體的實施方案中，此多肽是所謂的rhsEPCR(見實施例)，它由包含人EPCR(hsEPCR)可溶性部分的氨基酸序列、對應于c-myc抗原表位的氨基酸序列和組氨酸尾的融合蛋白所組成-氨基酸序列示于SEQ ID NO3中。
在另一方面，所述試劑盒被用于在體外評估個體出現(xiàn)與抗EPCR自身抗體的高水平存在相關的病理的危險度和易感性，所述病理選自自身免疫疾病、血管疾病和產科并發(fā)癥。
以下實施例解釋本發(fā)明。
實施例1應用抗EPCR自身抗體作為個體出現(xiàn)與自身抗體的高水平存在相關的病理的危險度和易感性的標記物I.材料和方法患者1.APLS患者及對照本研究包括了共43名患者[年齡44±11歲(平均年齡±標準偏差(SD))，39名女性和4名男性]，依據(jù)1998年2月至2002年3月間國際診斷標準[Wilson WA，Gharavi AE，Koike T，Lockshin MD，BranchDW，Piette JC，Brey R，Derksen R，Harris EN，Hughes GR，Triplett DA，Khamashta MA.International consensus statement on preliminaryclassification criteria for definite antiphospholipid syndromereport of aninternational workshop(對用于定義抗磷脂綜合征的初步分類標準的國際統(tǒng)一陳述國際研討會報道).Arthritis Rheum.1999；421309-11；Brandt JT，Barna LK，Triplett DA.Laboratory identification of lupusanticoagulantsresults of the Second International Workshop forIdentification of Lupus Anticoagulants.On behalf of the Subcommittee onLupus Anticoagulants/Antiphospholipid Antibodies of the ISTH(狼瘡抗凝劑的實驗室鑒別第二次國際狼瘡抗凝劑鑒別研討會結果。代表ISTH的狼瘡抗凝劑/抗磷脂抗體小組委員會).Thromb Haemost.1995；741597-603]他(她)們診斷為患有抗磷脂綜合征(APLS)。所有的患者特征在于存在抗凝血狼瘡抗體(ACL)以及靜脈血栓形成(n＝17)、動脈血栓形成(n＝13，其中4人涉及急性心肌梗塞(AMI)，7人存在腦血管血栓疾病(CVTD)，2人在其它區(qū)域表現(xiàn)出疾病)或二者[n＝13，都存在深部靜脈血栓形成和CVTD(n＝8)、AMI(n＝1)、CVTD和AMI(n＝3)或腸系膜區(qū)的動脈血栓形成(n＝1)]的個人史。其中27名患者診斷患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。在ACL陽性期和至少在最后一次血栓事件的3個月后收集血清樣品。直到抗EPCR自身抗體檢測進行前，樣品一直儲存于-80℃。
對照組由43名無血栓形成或ACL病史的健康志愿者組成。所有的患者和對照都作出參加此研究的知情同意。
2.具胎死的女性及對照對胎死進行了配對病例-對照研究。由于在無月經的第10周內且發(fā)生于她們的末次妊娠的首次胎死事件，共87名年齡在19至31歲之間(平均年齡27歲)的女性被納入1996年9月至2002年9月的研究中。該研究排除了具有血栓先例、慢性傳染病或某種已知的系統(tǒng)性疾病、糖尿病史或具有其它類型的妊娠病理(自發(fā)性流產、子癇、限制性子宮內胎兒發(fā)育)先例的女性，以及排除了由于染色體異常影響到染色體組型的，或由于胎兒形態(tài)畸形的胎死病例。有58名女性在首次妊娠中發(fā)生胎死，21名女性在第二次妊娠中發(fā)生胎死，剩余8名女性在第三次妊娠中發(fā)生胎死；在75名女性中胎死發(fā)生在10周和22周之間，而剩余12名女性中胎死發(fā)生在22周至36周之間(平均值17周)。
建立了有87名健康母親的對照組，按年齡、妊娠次數(shù)和末次妊娠經歷的時間分組；她們都符合應用于具胎死的女性組的排除標準。為了系統(tǒng)的醫(yī)學檢驗，從同一家醫(yī)院的婦科的門診病人中同期吸收對照者。
本研究經過了發(fā)明者協(xié)會倫理委員會的批準和取得所有個體的知情同意?；颊吆蛯φ照叩闹橥夂脱獦拥牟杉l(fā)生在胎死后至少6個月(范圍6-12個月)。依據(jù)常規(guī)程序采集、處理血樣并儲存于-80℃。取樣方法在所有的病例及對照中是一致的。
重組人可溶性EPCR的表達為了以可溶性形式表達人重組EPCR(rhsEPCR)，以來源于內皮細胞的cDNA作模板，采用在5’和3’末端分別增加了ClaI限制性酶切位點和另一NotI位點的引物對SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增了人可溶性EPCR(hsEPCR)序列，包括無信號肽的胞外結構域或跨膜和胞內結構域(Entrez-Protein 21730830，1-193殘基，編號對應于信號肽處理后的蛋白質的成熟形式)。這些修飾使rhsEPCR序列可連接到質粒pPICZαC(Stratagene，La Jolla，CA)的Saccharomyces cerevisiae(釀酒酵母)因子α的分泌信號下游的ClaI和NotI位點，該分泌信號使許多蛋白從酵母細胞內部有效分泌進入到胞外培養(yǎng)基。
插入物被克隆至載體pPICZαC的閱讀相中，此閱讀相具有c-myc抗原表位和6-組氨酸標簽。由于在克隆過程中rhsEPCR氨基端添加了絲氨酸殘基和異亮氨酸殘基，該rhsEPCR氨基端表達為融合到其羧基末端，形成含有c-myc抗原表位和6-組氨酸的尾巴或標簽，以利于純化和經抗c-myc單克隆抗體將rhsEPCR錨定到微板孔的底部。通過直接測序，證實插入物和載體序列是正確的。SEQ ID NO3顯示由此獲得的從DNA序列推斷的rhsEPCR序列，它包括由所用的克隆技術添加的殘基、人rhsEPCR胞外區(qū)域殘基、c-myc抗原表位和6-組氨酸標簽。
采用先前制備的表達載體并利用限制性酶PmeI將后者線性化后，通過化學方法(Easy Comp，Invitrogen)轉化Pichia pastoris細胞，經由同源重組產生rhsEPCR編碼序列整合進甲醇反應性內源啟動子中。轉化產物在zeocine存在下培養(yǎng)，以篩選用含有rhsEPCR編碼序列的載體轉化的P.pastoris菌落，而該載體含有編碼zeocine抗性的基因。簡而言之，轉化的酵母培養(yǎng)在補加了1％(v/v)甘油的4ml BMY培養(yǎng)基[1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、100mM(pH6.0)磷酸鉀、1.34％(w/v)具有硫酸銨的酵母氮源、4×10-5％(w/v)的生物素](BMGY)中，28-30℃攪拌孵育約18小時。室溫下2000g離心5min收集細胞。棄上清，用1％甲醇誘導rhsEPCR的表達18h。具體地，細胞重懸于3ml補加了0.5％(w/v)甲醇的BMY中，接著是劇烈攪拌下約28-30℃孵育18h。誘導之后，將取自條件培養(yǎng)基的樣品加載至12％NuPAGEBis-Tris凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)，使用抗myc單克隆抗體通過Western印跡(Invitrogen)檢測rhsEPCR。對于大規(guī)模生產，篩選最高濃度分泌rhsEPCR的菌落?；诰涞膔hsEPCR的高產量所篩選的菌落，進行了菌落甲醇代謝(代謝快或代謝慢)的研究，這樣可以判定適于大多數(shù)可用菌落的最佳表達條件。優(yōu)化培養(yǎng)條件和甲醇誘導之后，對于產生大量的rhsEPCR來說，增加了規(guī)模。
重組sEPCR的純化由于P.pastoris幾乎不分泌蛋白質到培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)有高比例對應于rhsEPCR的蛋白質-實際上大大簡化了其純化。簡而言之，通過3步純化的方法從酵母培養(yǎng)物上清中純化rhsEPCR，該方法包括金屬親和層析、陰離子交換和膠過濾層析。具體地，濃縮培養(yǎng)物上清，并對100mM磷酸鈉，10mM NaCl，pH7.6的溶液透析，然后是載有銅的5-ml Hitrap柱(Amersham Biosciences，Little Chalfont，英國)中的金屬親和層析。與柱結合的部分用含乙二胺四乙酸(EDTA)的緩沖液洗脫，然后對不含NaCl的Tris-HCl 20mM(pH7.6)透析。再在Resource Q柱(Amersham Biosciences)中進行陰離子交換層析，使用20倍柱體積0.0-300mM梯度的NaCl洗脫。收集被洗脫下來的包含rhsEPCR的部分并且采用離心超濾法濃縮，然后將樣品加載到Superdex 75-HR10/30柱(Amersham Biosciences)進行凝膠過濾。使用BCA總蛋白試驗(Pierre，Rockford，IL)及標準牛血清白蛋白(BSA)檢測純化蛋白的濃度。為了檢測純化的rhsEPCR，將樣品加載到12％NuPAGE Bis-Tris凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，在還原條件下電泳，然后進行考馬斯藍染色。將一份膠用于電印跡，使用抗myc單克隆抗體(Invitrogen)檢測rhsEPCR。在每次電泳膠中使用分子量標準物用以估算rhsEPCR的分子量。
檢測血清或血漿中抗EPCR自身抗體的ELISA分別測定對應于同種型IgG、IgA或IgM的抗EPCR自身抗體的水平，因為這些是自身免疫改變患者中最常見的形式，在這些患者中檢測到靶向一些宿主結構的抗體(自身抗體)。
在所有三種情況下，96孔微孔板(Costar，Acton，MA，USA)都用pH9.6的Na2CO3溶液(100mmol/l)中濃度為1.5μg/ml的抗c-myc單克隆抗體(Invitrogen，USA)100μl/孔包被，4℃過夜。這種抗體作為俘獲抗體，靶向添加在rhsEPCR中的c-myc標簽。這樣，rhsEPCR就被錨定于孔中，且保留了胞外抗原表位。TB(Tris 20mM，NaCl 150mM，0.05％ of Tween-20，pH7.4)洗滌后，在室溫(RT)下4.5h內用TB中3％(w/v)BSA封閉非特異性結合位點。隨后，將在補加了1％BSA的TB(TB1)中含有3μg/ml rhsEPCR的溶液以100μl/孔加入，接著在輕微搖晃下室溫孵育2h。平行地，空白孔用不合rhsEPCR的TB1孵育。用TB洗滌后，每孔加入100μl 1∶100(血漿或血清)稀釋于TB1中的樣品，然后4℃孵育過夜。再用TB洗滌孔，采用連接了過氧化物酶的鼠抗人IgA多克隆抗體(Biotrend)、連接了過氧化物酶的鼠抗人IgM多克隆抗體(Zymed)或連接了堿性磷酸酶的鼠抗人IgG多克隆抗體(Zymed)檢測保留下來的吸附于孔底的抗EPCR自身抗體。在輕微搖晃下室溫孵育2h后，洗滌。
為檢測IgA或IgM同種型的抗EPCR自身抗體水平，加入100μl的鄰苯二胺溶液(Kodak)(0.4mg/ml)，此溶液含有Na2HPO40.07M，檸檬酸鈉0.04M和0.02％(v/v)的H2O2，pH5.0。對于IgA和IgM分別在背光處反應5分鐘和8分鐘，然后加入100μl H2SO4終止反應，5分鐘后在微孔板讀數(shù)器(iEMS REader，Labsystems，F(xiàn)inland)在492nm處讀出結果。
在用于檢測IgG同種型的抗EPCR自身抗體的板上，加入100μl0.1M二乙醇胺中的4-硝基苯基磷酸酶(Sigma)(1ng/ml)溶液，pH10.3。15分鐘后，加入100μl 1M NaOH終止反應，待顏色穩(wěn)定后在微孔板讀數(shù)器(iEMS REader)中在405nm處記錄吸收值。所有樣品在不同實驗中至少測試2次。
為確保每個板上所有測量的吸收值都對應于線性范圍，對每種同種型都采用連續(xù)稀釋記錄到最高吸收值的樣品來構建曲線。為允許板間比較，在每個板中選擇進行檢測的樣品(標準樣品)-這樣可以引入校正系數(shù)。任意單位(AU)定義如下通過減去空白孔的吸收值，再乘以1000，并乘以對應于標準樣品在給定板(參照板)和研究樣品測試板中檢測的比吸光度之間的比例的校正系數(shù)，對每個患者樣品(研究樣品)計算比吸光度。對于評估板間與板內變異系數(shù)(CV)，采用5個樣品測試5次用于板間變異系數(shù)(不超過5％)，采用3個不同時間用于板間變異系數(shù)(不超過10％)。
培養(yǎng)的內皮細胞中APC的生成采用EA.hy926細胞系，此細胞系是保留血栓調節(jié)蛋白和EPCR表達能力的轉化的人內皮細胞(Stearns-Kurosawa DJ，Kurosawa S，Mollica JS，F(xiàn)errell GL，Esmon CT.The endothelial cell protein C receptoraugments protein C activation by the thrombin-thrombomodulincomplex(內皮細胞蛋白C受體通過凝血酶-血栓調節(jié)蛋白復合物增強蛋白C的活性).Proc Natl Acad Sci USA.1996；9310212-6)。在96孔板上孵育此細胞，5x104細胞/孔，其中含有0.02U/ml凝血酶(0.17nM)(ERL，Swansea，United Kingdom)和在pH7.4的20mM Tris緩沖液中濃度在50-1000nM不斷增加的PC(Baxter，Deerfield，IL，USA)，該緩沖液中補加了NaCl 150mM、CaCl25mM、MgCl20.6mM、1％BSA、0.001％ Tween-20和0.02％ NaN3。室溫下45分鐘后，添加來匹盧定至終濃度為0.2μmol/L，以抑制凝血酶；3-4分鐘后，加入生色底物S-2366(Chromogenix，Milan，Italy)至終濃度為0.4mM，用以監(jiān)測其酶被APC蛋白水解。用微孔板讀數(shù)器(iEMS REader，Labsystems，F(xiàn)inland)動態(tài)記錄405nm處吸收值的增加。使用Enzfitter程序(Biosoft，Cambridge，United Kingdom)進行曲線數(shù)據(jù)至Michaelis-Menten方程式的擬合，其計算在那些條件下PC活性的Km值。需要時，在加入凝血酶和PC的同時添加45μg/ml從患者純化的抗EPCR自身抗體(見下)。這樣，就可以分析抗EPCR自身抗體對PC活性的影響。
抗EPCR抗體的純化1.IgM抗體的純化1ml含抗EPCR自身抗體的血清樣品稀釋于磷酸鹽緩沖液(PBS)(磷酸鈉100mM，NaCl 0.15M，pH＝7.4)，用0.45μm孔徑的濾器過濾。濾出液加至被NHS HP(Amersham Biosciences)活化的HitTrap柱，此柱先前已固定了鼠抗人IgM多克隆抗體(Maruyama S，KubagawaH，Cooper MD.Activation of human B cells and inhibition of theirterminal differentiation by monoclonal anti-murine antibodies(人B細胞的活化和抗鼠單克隆抗體對它們的終端分化的抑制).J Immunol.1985；135192-9)。用5ml 0.1M，pH2.5的甘氨酸洗脫人IgM，收集在100μl 1M，pH9.0的Tris中。濃縮含有人IgM的部分，并對補加了CaCl25mM和MgCl20.6mM，pH7.4的TB透析。
2.IgA抗體的純化1ml的血清樣品稀釋于PBS中，并手動加至jacaline柱(Pierce)。被吸附的部分用2ml 0.1M溶于PBS的mellibiose洗脫，然后對PBS透析。由于后面純化步驟所需，樣品加至HiTrap蛋白G HP親和柱(Amersham Biosciences)中以除去污染的IgG。含有IgA的未結合產物對50mM，pH7.0的KH2PO4透析，最后應用HiTrap Blue HP親和柱(Amersham Pharmacia Biotech)去白蛋白。收集含純化IgA的未結合物質，并對補加了CaCl25mM和MgCl20.6mM，pH7.4的TB緩沖液透析。
3.IgG抗體的純化取1ml含抗EPCR自身抗體的血清樣品稀釋于磷酸鹽緩沖液(PBS)(磷酸鈉100mM，NaCl 0.15M，pH＝7.4)，用0.45μm孔徑的濾器過濾。濾出液加至HitTrap蛋白G HP柱(Amersham Biosciences)中進行處理，用5ml 0.1M，pH2.5的甘氨酸稀釋人IgG，收集在100μl 1M，pH9.0的Tris中。收集含有人IgG的部分，并以添加CaCl25mM和MgCl20.6mM，pH7.4的TB溶液透析。
rhsEPCR親和柱的制備依據(jù)廠家說明書將rhsEPCR(在3ml 100 mM，pH8.5的NaHCO3中含的2mg)結合至HitTrap NHS-活化HP親和柱(AmershamBiosciences)。一旦加入0.1M甘氨酸終止反應，用2M NaCl徹底沖洗rhsEPCR柱。這樣rhsEPCR柱能結合補加了CaCl220mM和MgCl20.6mM，pH7.4的TBS中的PC。使用補加了EDTA的TBS可將PC從柱上洗脫下來(數(shù)據(jù)未示出)。由于結合到柱上的rhsEPCR保留了它的吸附PC的能力，故它必定能保留它的天然構象及能被自身抗體識別的抗原表位。因而，如此制備的柱子足以用于除去血清或血漿樣品中的抗EPCR自身抗體。
統(tǒng)計學方法在APLS病例和對照的研究中，患者(病例)與對照的抗EPCRIgM、IgA和IgG抗體高水平的機率的比較采用卡方檢驗進行。計算優(yōu)勢比(OR)(Martinez-González MA，of Irala-Estevez J&Guillén GrimaF，(1999)， Qué es una odds ratio？，Medicina Clínica，112，11416-422)和95％的置信區(qū)間(95％CI)作為APLS和抗EPCR自身抗體間關聯(lián)的計量。
在胎死的配對病例-對照研究中，病例與對照連續(xù)變量的比較和分類分析分別采用配對樣品的t-檢驗以及McNemar檢驗進行?；谶B續(xù)變量和分類變量曼-懷二氏檢驗的相關系數(shù)評估對應于同種型IgG和IgM的抗EPCR自身抗體與ACL以及與IgM同種型的抗心磷脂抗體水平間的關系。
為評估與高水平IgG和IgM同種型的抗EPCR自身抗體相關的胎死危險度，用病例-對照對中進行了多重回歸分析。依據(jù)這些免疫球蛋白在對照中的分布，主獨立變量就是相應于分類數(shù)據(jù)同種型IgG和IgM的抗EPCR自身抗體水平。不同的邊界點用于確定與更高危險度相關的水平。進行單一變量和多變量分析，擬合已知的胎死危險因子。在完全模型中不可能包括Leiden(FVL)和ACL；因而，考慮使用兩個模型檢測抗EPCR自身抗體的作用(1)同時引入相應于同種型IgM和IgG的抗EPCR自身抗體水平、IgM同種型的抗心磷脂抗體、ACL和凝血酶原G20210A；以及(2)與模型1一致的，但調整為FVL的存在/不存在，代替ACL。
模型(1)用于評估抗心磷脂抗體和ACL作為標記物，而不是病因學因子的假說，此假說表明血栓前狀態(tài)由抗EPCR自身抗體引起。所有的計算均使用SPSS，10.0版統(tǒng)計學軟件包(SPSS Inc.)完成。
II.結果以調查血漿和血清中的抗EPCR自身抗體的存在為目的，首先采用酵母P.pastoris表達系統(tǒng)產生rhsEPCR。基于描述的方法，從P.pastoris培養(yǎng)物中可以純化出超過5mg的rhsEPCR。采用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳和利用抗myc單克隆抗體的Western印跡分析，rhsEPCR以單一和輕微異質的條帶出現(xiàn)，反映出有不同程度的糖基化，如以前的文獻所報道(Fukudome K，Kurosawa S，Stearns-Kurosawa DJ，He X，Rezaie AR，Esmon CT.The endothelial cellprotein C receptor.Cell surface expression and direct ligand binding bythe soluble receptor(內皮細胞蛋白C受體。細胞表面表達和可溶性受體的直接配體結合).J Biol Chem.1996；27117491-8)[見圖1]。
在凝血試驗中，rhsEPCR可抑制APC的抗凝血活性，如先前所描述的(Regan LM，Stearns-Kurosawa DJ，Kurosawa S，Mollica J，F(xiàn)ukudome K， Esmon CT. The endothelial cell protein C receptor.Inhibition of activated protein C anticoagulant function withoutmodulation of reaction with proteinase inhibitors(內皮細胞蛋白C受體。不用蛋白酶抑制劑調節(jié)反應時活化蛋白C的抗凝血功能的抑制).JBiol Chem.1996；27117499-503)(數(shù)據(jù)未顯示)。除了以所預期的親和性結合PC(見下)以外，在內皮細胞表面凝血酶對PC的活化以51±10nM的Km為特征。在2μM rhsEPCR存在下，其活化作用大大降低(Km約等于1000nM)，這意味著Ki約為70nM，且表明rhsEPCR結合PC與天然EPCR與PC的結合有著相似的效果，這在以前已有報道(Fukudome K，Kurosawa S，Stearns-Kurosawa DJ，He X，Rezaie AR，Esmon CT. The endothelial cell protein C receptor. Cell surfaceexpression and direct ligand binding by the soluble receptor(內皮細胞蛋白C受體。細胞表面表達和可溶性受體的直接配體結合).J Biol Chem.1996；27117491-8；Regan LM，Stearns-Kurosawa DJ，Kurosawa S，Mollica J，F(xiàn)ukudome K，Esmon CT.The endothelial cell protein Creceptor.Inhibition of activated protein C anticoagulant function withoutmodulation of reaction with proteinase inhibitors(內皮細胞蛋白C受體。不用蛋白酶抑制劑調節(jié)反應時活化蛋白C的抗凝血功能的抑制).JBiol Chem.1996；27117499-503)。這些證據(jù)強有力地表明了rhsEPCR活性與構象的正確性-這樣可以用于針對人EPCR的抗體的檢測中。
APLS患者中的抗EPCR自身抗體取高水平代表每一對照組高于百分位97的那些，對應于同種型IgM、IgA或IgG的高水平的抗EPCR自身抗體與APLS相關聯(lián)[OR＝4.47；95％CI1.15-17.40](見表1)。只在診斷為APLS的個體中檢測到極高水平的抗EPCR自身抗體(見圖2)3名患者表現(xiàn)出很高水平的IgM同種型抗EPCR自身抗體(患者A＝407AU，患者B＝301AU，患者C＝293AU)，2名患者表現(xiàn)出很高水平的IgA同種型抗EPCR自身抗體(患者D＝795AU，患者B＝475AU，他也表現(xiàn)出高水平的IgM同種型抗EPCR自身抗體)，以及2名患者表現(xiàn)出高水平的IgG同種型抗EPCR自身抗體(患者E＝230AU和患者F＝220AU)。這6名患者是有過血栓形成病史(這是選擇標準之一)的女性(患者A、C、D和F有中風；患者E有心血管疾病；患者A、B、D和F有靜脈血栓形成)。最令人關注的發(fā)現(xiàn)是呈現(xiàn)同種型IgM和IgA抗EPCR自身抗體的所有女性(除患者B外，該患者證明不可評估)都曾有過多次胎死事件。
考慮到此發(fā)現(xiàn)，分析結果直接導向抗EPCR自身抗體與胎死之間可能的相關性。
表1APLS與抗EPCR自身抗體相關的OR

抗EPCR自身抗體的生化特性從1ml血清中純化來源于具有極高水平的患者的同種型IgM、IgA和IgG的抗EPCR自身抗體組分?；颊逤的IgM同種型抗EPCR自身抗體組分在凝血酶的存在下能減少培養(yǎng)的內皮細胞的產生APC(20％的殘留PC活化能力，p＝0.02)。抑制效果是劑量依賴性的。為證明APLS患者的IgM同種型抗EPCR自身抗體組分的此效果歸因于針對EPCR的特異性抗體，將樣品加載到已固定rhsEPCR的親和柱上，完全除去樣品中特異性抗EPCR自身抗體。如此獲得的組分喪失了它抑制APC產生的作用(87.6％的PC生成)，這意味著造成該現(xiàn)象的試劑必定是特異性抗EPCR自身抗體。從APLS患者中純化的其它組分都不能改變內皮細胞產生APC的能力(圖3)。
有胎死的女性中的抗EPCR自身抗體患者組和對照組中以前涉及胎死的危險因素的幾率和抗EPCR自身抗體的幾率顯示于表2中。
表2胎死與研究的不同變量間關系的單變量OR及它們的置信區(qū)間

對照組百分位95％的IgM同種型抗EPCR自身抗體水平為99AU。87名患者中，16名(18％)表現(xiàn)出超過此邊界值，與之相比，對照組中有3名(n＝87)。與那些表現(xiàn)出較低值的相比IgM同種型抗EPCR自身抗體水平超過百分位95的患者中未對胎死進行調整的OR為14(95％置信區(qū)間(CI)1.8-106.4)。當將邊界點設在90％的百分位(83AU)時，OR是5.2(95％CI1.8-15.3).
對照組百分位95的IgG同種型抗EPCR自身抗體水平是94AU。87名患者中，13名(15％)表現(xiàn)出值超過此邊界點，與之相比，對照組有4名。IgG同種型抗EPCR自身抗體水平超過95％百分位的患者中未對胎死進行調整的OR是4.3(95％CI1.2-15.2)。當將邊界點設在90％的百分數(shù)(88.4AU)時，OR是2.3(95％CI0.9-5.6)。
另外，進行多變量分析用于調整潛在的混雜因素。如上所述，在同一多變量模型中，不可能包括FVL和ACL-因此要考慮兩個模型模型(1)經過對抗磷脂抗體(也就是ACL和抗心磷脂抗體)和凝血素G20210A的調整；和模型(2)包括FVL，但不包括ACL。模型(1)中與超過百分位95的IgM同種型抗EPCR自身抗體相關的OR是23.1(95％CI2-266.3)，但在模型(2)中，該值是31.0(95％CI2-384.3)。模型(1)中與超過百分位95的IgG同種型抗EPCR自身抗體相關的OR是6.8(95％CI1.2-38.4)。依據(jù)包括Leiden的因子V，而不是ACL的模型(2)，超過百分位95的IgG同種型抗EPCR自身抗體相關的OR是11.0(95％CI1.6-73.5)。結果見表3。
表3胎死與高水平的抗EPCR自身抗體間關系的多變量ORs及95％置信區(qū)間

這些結果表明IgM和IgG同種型抗EPCR自身抗體對于胎死是獨立的危險性因素。但是，在這一女性組中，高水平的IgA與胎死的相關性并不顯著。
III.討論實現(xiàn)了可以檢測針對人EPCR的自身抗體的存在的方法(尤其是ELISA測試)。運用此系統(tǒng)，對以血栓形成和ACL為特征的APLS患者組進行研究，證實了(第一次在人的病理學上)同種型IgM、IgG和IgA特異性抗EPCR自身抗體的存在。該研究集中于APLS和ACL患者亞群，因為他們與增加的血栓形成危險度相關；因而，這些個體很可能表現(xiàn)出直接與臨床癥狀相關的自身抗體。事實上，許多患者被發(fā)現(xiàn)具有很高水平的抗EPCR自身抗體。
這些自身抗體可為APLS患者上所見的血栓形成和流產提供解釋。首先，EPCR是一種在大型血管的內皮和滋養(yǎng)層表達的分子。IgM和IgG免疫球蛋白可結合并活化補體；如果這些抗體靶向EPCR，它們可能活化內皮上的補體并且損傷后者-這樣就促進了這個水平上的血栓形成；第二，已表明具有高水平IgM同種型抗EPCR自身抗體患者的IgM組分在凝血酶的存在下能大大減少由上皮細胞產生的APC。在通過使IGM組分共同經過EPCR親和柱，特異性消除靶向EPCR的IgM之后，這種抑制效果就消失了-這意味著這種抑制效果歸因于IgM同種型抗EPCR自身抗體。這種抗體可能在體內導致APC的低水平-自身構成血栓形成的強危險性因素的情況。
依據(jù)靜脈和/或動脈血栓形成的標準篩選患者時，不可能評估與抗EPCR自身抗體相關的血栓形成的危險度。相反，相對于無先例的女性，在有胎死病史的女性中可檢測到抗EPCR自身抗體的水平增加，尤其是IgM同種型。考慮到初步研究中的這些結果，決定進行配對病例-對照研究，以評估在與抗EPCR自身抗體的存在相關的女性的一般群體中，無法解釋的第一次胎死事件的危險度。發(fā)現(xiàn)對于第一次胎死事件，IgM同種型抗EPCR自身抗體的高水平(定義為超過對照個體值分布的百分位95的值)構成一個強危險性因素，與低水平相比，相對危險性為23或31。IgG同種型抗EPCR自身抗體的高水平也構成強危險性因素，盡管低于IgM同種型的情況，依據(jù)所使用的數(shù)學模型相對危險度是7或11。在單變量分析中，IgM同種型的ACL和抗心磷脂抗體與增加的胎死危險度相關聯(lián)，盡管這種關聯(lián)在多變量模型中有所減弱-可能是因為由經典的抗磷脂抗體提供的信息可歸于相關的抗EPCR自身抗體，這可能代表了胎死的病原學因素，而不是簡單的危險性標記物。同樣地，對FVL和凝血素G20210A進行了研究，最近它們與增加的晚期胎死危險度相聯(lián)系-在單變量和多變量分析中鑒定出的與這種多態(tài)性相關聯(lián)的增加的危險度。這種危險度在統(tǒng)計學上是不顯著的，但是，可能是由于本研究中所涉及的患者數(shù)目的原因。
總之，本研究首次揭示了APLS和血栓形成患者中抗EPCR自身抗體的存在。IgM和IgG同種型抗EPCR自身抗體的存在增加了首次胎死事件的危險度。這些自身抗體可能內在地有助于APLS患者和一般群體的血栓形成和胎死。
實施例2心肌梗塞女性中抗EPCR自身抗體的檢測研究組142名患有心肌梗塞的女性(年齡39±5歲，平均值±標準偏差)和142健康女性(年齡39±5歲)，按年齡和地理來源配對。研究了經典的心肌梗塞危險性因素(高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、吸煙和口服避孕藥)。對血漿樣品中的抗EPCR自身抗體IgG、IgM和IgA進行分析，按照“材料和方法”(實施例1)描述ELISA測試方法進行。
結果抗EPCR自身抗體的高水平與增加的心肌梗塞危險度相關，此高水平定義為超過對照組抗EPCR抗體水平分布的百分位93的值。在多變量分析中，對于IgA來說抗EPCR抗體的高水平與調整的優(yōu)勢率(OR)3.5相關，置信區(qū)間(95％CI)為1.4-8.9，而對于IgM，數(shù)值為OR＝3.0；95％CI1.2-7.5。
結論抗EPCR自身抗體的高水平構成女性心肌梗塞獨立的危險因素。
序列表<110>西瑪生物醫(yī)學信息公司<120>評估出現(xiàn)與抗EPCR自身抗體的存在相關的病理的危險度和素因的方法<160>6<170>PatentIn version 2.0<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>寡核苷酸引物<400>1agcttggcat atcgattagc caagacgcct cagatg36<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>寡核苷酸引物<400>2tattctatgc ggccgccgaa gtgtaggagc ggcttg36<210>3<211>222<212>PRT<400>3Ser Ile Ser Gln Asp Ala Ser Asp Gly Leu Gln Arg Leu His Met Leu1 5 10 15
Gln Ile Ser Tyr Phe Arg Asp Pro Tyr His Val Trp Tyr Gln Gly Asn20 25 30Ala Ser Leu Gly Gly His Leu Thr His Val Leu Glu Gly Pro Asp Thr35 40 45Asn Thr Thr Ile Ile Gln Leu Gln Pro Leu Gln Glu Pro Glu Ser Trp50 55 60Ala Arg Thr Gln Ser Gly Leu Gln Ser Tyr Leu Leu Gln Phe His Gly65 70 75 80Leu Val Arg Leu Val His Gln Glu Arg Thr Leu Ala Phe Pro Leu Thr85 90 95Ile Arg Cys Phe Leu Gly Cys Glu Leu Pro Pro Glu Gly Ser Arg Ala100 105 110His Val Phe Phe Glu Val Ala Val Asn Gly Ser Ser Phe Val Ser Phe115 120 125Arg Pro Glu Arg Ala Leu Trp Gln Ala Asp Thr Gln Val Thr Ser Gly130 135 140Val Val Thr Phe Thr Leu Gln Gln Leu Asn Ala Tyr Asn Arg Thr Arg145 150 155 160Tyr Glu Leu Arg Glu Phe Leu Glu Asp Thr Cys Val Gln Tyr Val Gln165 170 175Lys His Ile Ser Ala Glu Asn Thr Lys Gly Ser Gln Thr Ser Arg Ser180 185 190Tyr Thr Ser Ala Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu195 200 205
Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His210 215 220<210>4<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>錨定蛋白1<400>4Ala His Gly His Arg pro1 5<210>5<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>錨定蛋白2<400>5Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser1 5 10<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>錨定蛋白3<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(6)<223>必需的氨基酸<400>6Gly Met Thr Cys Xaa Xaa Cys1 權利要求
1.評估樣品中的針對內皮PC/活化PC受體(EPCR)的自身抗體的高水平存在的方法，其特征在于包括在體外定量來自個體的所述樣品中的針對EPCR的自身抗體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述針對EPCR的自身抗體的高水平存在與選自自身免疫疾病、血管疾病和產科并發(fā)癥的病理學相關。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述自體免疫病選自抗磷脂綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎和自身免疫血管炎。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述血管疾病選自動脈血管疾病、靜脈血管疾病和微循環(huán)血栓形成。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述血管疾病選自心肌梗塞、腦中風、暫時性腦血管意外、肢體局部缺血、動脈粥樣硬化、動脈瘤、血栓形成、淺表靜脈血栓形成、深層靜脈血栓形成和肺栓塞。
6.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述產科并發(fā)癥選自流產、胎死、早產、宮內生長遲緩、子癇和先兆子癇。
7.如權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于所提及的樣品是血清或血漿樣品。
8.如權利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于所提及的個體是人。
9.如權利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于這些抗EPCR自身抗體的定量通過偶聯(lián)了標記物的免疫分析手段進行的。
10.如權利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于這些抗EPCR自身抗體的定量是通過ELISA檢測手段進行的，所述手段包括a)包括EPCR氨基酸序列或其片段的多肽的固體載體固定，所述片段至少含有一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位；b)將被固定的多肽和來自于所述個體的懷疑含有抗EPCR自身抗體的樣品孵育足夠的時間，以使所述抗體與所述被固定的多肽結合，并形成多肽-抗EPCR自身抗體復合物；c)除去多余的未與被固定的多肽結合的樣品；d)將所述多肽-抗EPCR自身抗體復合物和與酶連接的第二抗體孵育，其中所述第二抗體能與這些抗EPCR自身抗體結合。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于所提及的多肽選自以下兩種a)包括全長EPCR氨基酸序列的多肽；以及b)包括EPCR片段的氨基酸序列的多肽，所述片段含有至少一個能被抗EPCR抗體識別的抗原表位；
12.如權利要求1-11任一項所述的方法，其特征在于所述多肽是融合蛋白，包括a)區(qū)域A，其由含有EPCR氨基酸序列或其片段的多肽組成，所述片段含有至少一個能被抗EPCR抗體識別的抗原表位；以及b)區(qū)域B，其由包含用于分離或純化所提及的融合蛋白的氨基酸序列和/或用于將所提及的融合蛋白錨定到固體載體的氨基酸序列的多肽組成。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于所述區(qū)域B與區(qū)域A的氨基末端結合。
14.如權利要求12所述的方法，其特征在于所述區(qū)域B與區(qū)域A的羧基末端結合。
15.如權利要求12-14任一項所述的方法，其特征在于所述區(qū)域A包含人EPCR可溶性部分的氨基酸序列。
16.如權利要求12-14任一項所述的方法，其中區(qū)域B中用于分離或純化所提及的融合蛋白的氨基酸序列和/或用于將所述融合蛋白錨定到固體載體的氨基酸序列，包括選自Arg-標簽、His-標簽、FLAG-標簽、Strep-標簽、能被抗體識別的抗原表位、SBP-標簽、S-標簽、鈣調蛋白結合肽、纖維素結合域、甲殼質結合域、谷胱甘肽S-轉移酶-標簽、麥芽糖結合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-標簽、Ala-His-Gly-His-Arg-Pro(SEQ ID NO4)(2、4和8拷貝)、Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser(SEQ IDNO5)、Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys(SEQ ID NO6)(6次重復)、β-半乳糖苷酶和VSV-糖蛋白的氨基酸序列。
17.如權利要求12-16任一項所述的方法，其特征在于區(qū)域B由包含能被抗c-myc抗體識別的c-myc抗原表位和組氨酸尾(His-標簽)的多肽組成。
18.如權利要求12-17任一項所述的方法，其特征在于所述多肽為包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列、對應于c-myc抗原表位的氨基酸序列和組氨酸尾(His-標簽)的融合蛋白。
19.如權利要求12-18任一項所述的方法，其特征在于所述多肽為氨基酸序列顯示在SEQ ID NO3中的融合蛋白。
20.如權利要求10所述的方法，其特征在于所述第二抗體是來源于不同于被檢樣品個體的物種的免疫球蛋白同種型特異性抗體。
21.如權利要求10或20所述的方法，其特征在于所述第二免疫球蛋白同種型特異性抗體選自抗人IgG抗體、抗人IgM抗體、抗人IgA抗體，以及它們的混合物。
22.如權利要求20或21所述的方法，其特征在于所述第二抗體與選自過氧化物酶和堿性磷酸酶的酶連接。
23.如權利要求1-22所述的方法，其特征在于它還包括將源自所述個體的樣品中檢測的抗EPCR自身抗體水平與正常水平比較。
24.如權利要求1所述的方法，其特征在于檢測抗EPCR自身抗體水平在給定時間段的變化。
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于所述樣品源自先前診斷患有自身免疫或血管疾病的個體，或患有產科并發(fā)癥的個體并接受治療處理的。
26.針對EPCR的自身抗體在評估樣品中針對EPCR的自身抗體高水平存在的方法中的用途。
27.如權利要求26所述的用途，其特征在于所提及的樣品中針對EPCR的自身抗體的高水平存在與選自自身免疫疾病、血管疾病和產科并發(fā)癥的病理相關聯(lián)。
28.包含EPCR氨基酸序列或其片段的多肽在樣品中針對EPCR的自身抗體的高水平存在的方法中的用途，所述片段含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位，其特征在于包括在體外在所述樣品中定量針對EPCR的自身抗體。
29.如權利要求28所述的用途，其特征在于所述與針對EPCR的自身抗體高水平存在相關的病理學選自自身免疫疾病、血管疾病和產科并發(fā)癥。
30.如權利要求28所述的用途，其特征在于所述多肽是融合蛋白，包括a)區(qū)域A，由含有EPCR氨基酸序列的多肽或其片段的多肽組成，所述片段含有至少一個能被抗EPCR抗體識別的抗原表位；以及b)區(qū)域B，由包含用于分離或純化所述融合蛋白的氨基酸序列和/或用于將所述融合蛋白錨定到固體載體的氨基酸序列組成。
31.如權利要求30所述的多肽的用途，其中所述區(qū)域A包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列。
32.如權利要求30或31任一項所述的用途，其特征在于所述多肽為包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列、對應于c-myc抗原表位的氨基酸序列和組氨酸尾(His-標簽)的融合蛋白。
33.如權利要求30-32任一項所述的多肽的用途，其特征在于所述多肽為具有顯示在SEQ ID NO3中的氨基酸序列的融合蛋白。
34.在體外評估樣品中針對EPCR的自身抗體高水平存在的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括含有EPCR氨基酸序列或其片段的多肽，所述片段含有至少一個能被抗EPCR自身抗體識別的抗原表位。
35.如權利要求34所述的試劑盒，其特征在于所述多肽是融合蛋白，包括i)區(qū)域A，由含有EPCR氨基酸序列的多肽或其片段的多肽組成，所述片段含有至少一個能被抗EPCR抗體識別的抗原表位；以及ii)區(qū)域B，由包含用于分離或純化所提及的融合蛋白的氨基酸序列和/或用于將所述融合蛋白錨定到固體載體的氨基酸序列組成。
36.如權利要求35所述的試劑盒，其中所述區(qū)域A特征在于包含人EPCR可溶性部分的氨基酸序列。
37.如權利要求35或36任一項所述的試劑盒，其特征在于所述多肽為包括人EPCR可溶性部分的氨基酸序列、對應于c-myc抗原表位的氨基酸序列和組氨酸尾(His-標簽)的融合蛋白。
38.如權利要求35-37任一項所述的試劑盒，其特征在于所述多肽為具有顯示在SEQ ID NO3中的氨基酸序列的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測針對蛋白C/活化蛋白C內皮受體(EPCR)的自身抗體的高水平存在的方法。本發(fā)明的特征在于它包括在體外檢測和定量樣品中的抗EPCR自身抗體。
文檔編號C07K14/705GK1954216SQ200580006853
公開日2007年4月25日 申請日期2005年2月3日 優(yōu)先權日2004年2月6日
發(fā)明者何塞·埃米達桑托斯, 拉蒙·蒙特斯迪亞斯, 韋羅妮卡·烏爾塔多利納雷斯 申請人:西瑪生物醫(yī)學信息公司