專利名稱：具有改良的生長(zhǎng)特性的植物以及制備所述植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及一種改良植物生長(zhǎng)特性的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及通過在植物中引入和表達(dá)編碼小亞基核糖體蛋白(S3a)的核酸而改良植物生長(zhǎng)特性尤其是產(chǎn)率的方法。本發(fā)明還涉及其中引入了S3a編碼核酸的植物，該植物相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物具有改良的生長(zhǎng)特性。
不斷增長(zhǎng)的世界人口和可用于農(nóng)業(yè)的可耕地的不斷減少的供給，激起農(nóng)業(yè)研究向提高農(nóng)業(yè)的效率發(fā)展。農(nóng)作物和園藝改良的傳統(tǒng)手段利用選育技術(shù)來鑒定具有期望特性的植物。然而，這樣的選育技術(shù)具有若干缺點(diǎn)，即這些技術(shù)一般是勞動(dòng)密集型的，而且產(chǎn)生通常含有異質(zhì)遺傳組分的植物，這并非總是產(chǎn)生自親本植物傳遞過來的期望性狀。分子生物學(xué)的發(fā)展已經(jīng)允許人類修飾動(dòng)物和植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般是DNA或RNA的形式)，隨后需要把該遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到植物中。這種技術(shù)能夠提供具有多種改良的經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)或園藝性狀的作物或植物。一種具有特殊經(jīng)濟(jì)利益的性狀是產(chǎn)率。產(chǎn)率通常定義為作物產(chǎn)生的可衡量經(jīng)濟(jì)價(jià)值。這可以從數(shù)量和/或質(zhì)量方面定義。產(chǎn)率直接取決于幾個(gè)因素，例如，器官的數(shù)量和大小，植物結(jié)構(gòu)(例如，分枝的數(shù)量)，種子產(chǎn)量等等。根的發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收和應(yīng)激耐受性也是確定產(chǎn)率的重要因素?？梢酝ㄟ^優(yōu)化上述因素之一來提高作物產(chǎn)率。
20世紀(jì)70年代早期，蔗糖梯度分析浮現(xiàn)了核糖體裝配途徑的輪廓。這些研究鑒定了3種主要的前核糖體顆粒。早期的90S顆粒(‘S’是沉積速率)隨后被加工成66S和43S的前核糖體，它們分別為成熟的60S和40S亞基的前體。60S亞基經(jīng)加工后由25S、5.8S和5S的核糖體RNA組成。在成熟過程中，許多蛋白質(zhì)將相互作用而產(chǎn)生最終的結(jié)構(gòu)。40S亞基由18S核糖體RNA組成，而且在成熟復(fù)合物形成之前，同樣有許多蛋白質(zhì)相互作用。這兩種亞基裝配成大的復(fù)合物，其中40S小亞基結(jié)合mRNA和tRNAs，而大亞基催化肽鍵形成。核糖體質(zhì)量的大約2/3由RNA組成，而1/3由蛋白質(zhì)組成。蛋白質(zhì)依其所屬的核糖體亞基命名小亞基(S1至S31)和大亞基(L1至L44)。多數(shù)蛋白質(zhì)與通常來自不同結(jié)構(gòu)域的多個(gè)RNA元件相互作用，以構(gòu)成并穩(wěn)定rRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)。盡管解碼和肽移位的關(guān)鍵活性是基于RNA的過程，但蛋白質(zhì)在可能已經(jīng)進(jìn)化為蛋白質(zhì)合成過程流水線的功能方面起著積極的作用。除了它們典型的核糖體作用，許多核糖體蛋白還具有非核糖體作用，如DNA修復(fù)。
S3a(cyc07)在1991年首次克隆。它編碼40S的核糖體蛋白(小亞基)，與v-fos轉(zhuǎn)化效應(yīng)因子(由人和大鼠的fte-1基因編碼)、TNF-α誘導(dǎo)的小鼠TU-11基因同源，且類似于酵母PLC1和PLC2。哺乳動(dòng)物fte-1、植物cyc-07和酵母PLC2都已表明是細(xì)胞周期調(diào)控的，而且在核糖體水平上參與蛋白質(zhì)的合成。
改良植物的各種生長(zhǎng)特性的能力，將在諸如作物增強(qiáng)、植物育種、觀賞植物的生產(chǎn)、樹木栽培學(xué)、園藝學(xué)、林學(xué)、用于生物反應(yīng)器的藻類的生產(chǎn)(用于物質(zhì)如藥物、抗體或疫苗的生物工藝學(xué)生產(chǎn)，或是有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化)等領(lǐng)域及其它這樣的領(lǐng)域中具有許多應(yīng)用。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在植物中引入和表達(dá)編碼小亞基核糖體蛋白(S3a)的核酸，產(chǎn)生了相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物而言具有改良的生長(zhǎng)特性的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種用于改良植物的生長(zhǎng)特性的方法，包括在植物中引入和表達(dá)編碼S3a的核酸。
最好地，通過實(shí)施本發(fā)明的方法，產(chǎn)生具有多種改良的生長(zhǎng)特性的植物，尤其是增加的產(chǎn)率，特別是種子產(chǎn)率。
如文中所定義的術(shù)語(yǔ)“增加的產(chǎn)率”分別用來指相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，在如下的一個(gè)或多個(gè)方面的增加(i)植物一個(gè)或多個(gè)部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收獲)部分，增加的根生物量或增加的任何其它的可收獲部分的生物量，(ii)增加的種子產(chǎn)率，其可能源于增加的種子生物量(種子重量)，可能是每株植物種子重量的增加或個(gè)別種子基礎(chǔ)上的增加，并且所述種子重量的增加可能是因改變的種子大小所致，如種子長(zhǎng)度和/或種子寬度和/或種子面積；(iii)增加的(飽滿)種子數(shù)量；(iv)增加的種子大小，這可能也影響種子的組成；(v)增加的種子體積，這也可能影響種子的組成；(vi)增加的收獲指數(shù)，其可以表達(dá)為可收獲部分如種子的產(chǎn)率占總生物量的比率；和(vii)增加的千籽粒重(TKW)，是從計(jì)數(shù)的飽滿種子的數(shù)量和它們的總重量推斷的。增加的TKW可能源于增加的種子大小和/或種子重量。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，產(chǎn)率的增加涵蓋如上文(ii)至(vii)中任何一項(xiàng)或多項(xiàng)所定義的種子水平上的產(chǎn)率增加。
以谷物為例，產(chǎn)率增加可表現(xiàn)為下列一個(gè)或多個(gè)方面每公頃或每英畝植株數(shù)的增加，每株植物穗的增加，行數(shù)、每行種仁數(shù)、粒重、千籽粒重、穗長(zhǎng)度/直徑的增加，等等。以稻為例，產(chǎn)率增加可表現(xiàn)為下列一個(gè)或多個(gè)方面的增加每公頃或每英畝植株數(shù)，每株植物的花序數(shù)，每個(gè)花序上的小穗數(shù)，每個(gè)花序上的花數(shù)，種子飽滿率的增加、千籽粒重的增加，等等。產(chǎn)率的增加可能還導(dǎo)致改變的結(jié)構(gòu)，或可能作為改變的結(jié)構(gòu)的結(jié)果發(fā)生。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的特點(diǎn)，實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生了具有增加的產(chǎn)率的植物，其分別表現(xiàn)為相對(duì)于對(duì)照植物的如下至少一個(gè)方面增加的TKW，增加的(飽滿)種子數(shù)，增加種子重量和增加的收獲指數(shù)。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于增加植物產(chǎn)率的方法，該方法包括在植物中引入和表達(dá)編碼S3a多肽的核酸。
因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)率，相對(duì)于處于其生活周期的相應(yīng)階段的對(duì)應(yīng)野生型植物的生長(zhǎng)速率而言，這些植物很可能顯示出增加的生長(zhǎng)速率(在它們至少部分的生活周期期間)。增加的生長(zhǎng)速率可能是植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)特異性的，或可能是基本上整個(gè)植株的。具有增加的生長(zhǎng)速率的植物甚至可能顯示出早期開花。生長(zhǎng)速率的增加可能發(fā)生在植物生活周期的一個(gè)或多個(gè)階段，或基本上在整個(gè)植物生活周期期間。植物生活周期早期增加的生長(zhǎng)速率可能反映增強(qiáng)的生長(zhǎng)力。生長(zhǎng)速率的增加可能改變植物的收獲周期，使得植物能夠比可能的情形更晚播種和/或更早收獲。如果生長(zhǎng)速率充分增加，可能允許播種相同植物物種的更多種子(例如播種和收獲稻類植物，接著播種和收獲更多的稻類植物，所有這些都在一個(gè)傳統(tǒng)的生長(zhǎng)期內(nèi))。類似地，如果生長(zhǎng)速率充分增加，可能允許播種不同植物物種的更多種子(例如播種和收獲稻類植物，接著，例如，播種和任選地收獲大豆、馬鈴薯或任何其它合適的植物)。就有些植物來說，從同一根莖收獲增加的次數(shù)也是可能的。改變植物的收獲周期可能導(dǎo)致每英畝年生物量產(chǎn)量的增加(由于(比方說在一年里)任何特定植物生長(zhǎng)和收獲的次數(shù)增加)。生長(zhǎng)速率的增加還可能允許在比它們的野生型對(duì)應(yīng)物更廣的地理區(qū)栽培轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)榉N植作物的地區(qū)限制常常由種植時(shí)(早季)或收獲時(shí)(晚季)不利的環(huán)境條件所決定的。如果縮短收獲周期，可以避免這些不利條件。生長(zhǎng)速率可通過從生長(zhǎng)曲線繪圖生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)獲得各種參數(shù)來確定，這些參數(shù)可以是T-Mid(植株達(dá)到其最大大小的50％所需的時(shí)間)和T-90(植物達(dá)到其最大大小的90％所需的時(shí)間)，等等。
實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有增加的生長(zhǎng)速率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于增加植物的生長(zhǎng)速率的方法，該方法包括在植物中引入和表達(dá)編碼S3a多肽的核酸。生長(zhǎng)速率的增加這里例示為分別相對(duì)于對(duì)照植物/對(duì)應(yīng)的野生型植物而言，TKW增加、(飽滿)種子數(shù)增加的種子重量增加以及收獲指數(shù)增加。
與對(duì)照植物相比，在植物處于非應(yīng)激狀態(tài)下或植物接觸多種應(yīng)激時(shí)發(fā)生產(chǎn)率和/或生長(zhǎng)速率的增加。植物一般通過更為緩慢地生長(zhǎng)來應(yīng)答所接觸的應(yīng)激。在嚴(yán)重的應(yīng)激下，植物甚至可能完全停止生長(zhǎng)。另一方面，中度應(yīng)激在文中定義為植物接觸的任何不會(huì)導(dǎo)致植物完全停止生長(zhǎng)的應(yīng)激。由于耕作方法(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的進(jìn)步，栽培的作物植物常常不會(huì)遭遇到嚴(yán)重的應(yīng)激。因此，中度應(yīng)激誘導(dǎo)的受損生長(zhǎng)常常是農(nóng)業(yè)不期望的特點(diǎn)。中度應(yīng)激是植物可能接觸的典型應(yīng)激。這些應(yīng)激可能是植物接觸的日常生物的和/或非生物(環(huán)境)應(yīng)激。典型的非生物或環(huán)境應(yīng)激包括由反常的熱或冷/冷凍溫度引起的溫度應(yīng)激；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過量水分)。非生物應(yīng)激也可能是化學(xué)品引起的。生物應(yīng)激一般是由病原體如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的那些應(yīng)激。
最好可在任何植物中改變上述的生長(zhǎng)特性。
如文中所用的術(shù)語(yǔ)“植物”包含整個(gè)植物，植物的祖先和后代，以及植物的部分，包括種子，枝條，莖，葉，根(包括塊莖)，以及組織和器官，其中上述的每一種都包含目的基因。術(shù)語(yǔ)“植物”還包含胚，分生組織區(qū)域，配子體，孢子體，花粉與小孢子，同樣其中上述的每一種也都含有目的基因。
尤其可用于本發(fā)明方法的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，特別是單子葉和雙子葉植物，包括飼料或飼料豆科植物，觀賞植物，糧食作物，選自如下物種的喬木或灌木金合歡屬物種(Acaciaspp.)、槭樹屬物種(Acer spp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、七葉樹屬物種(Aesculus spp.)、新西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、須芒草屬物種(Andropogon spp.)、落花生屬物種(Arachis spp.)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragaluscicer、Baikiaea plurijuga、樺木屬(Betula spp.)、蕓苔屬(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫鉚(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱纓花屬物種(Calliandra spp.)、大葉茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、決明屬物種(Cassia spp.)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜屬物種(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermum mopane、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂屬物種(Crataegus spp.)、香瓜屬物種(Cucumis spp.)、柏木屬物種(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅屬物種(Cymbopogon spp.)、Cyntheadealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(bǔ)(Davallia divaricata)、山馬蟥屬物種(Desmodium spp.)、粗糙蚌貝蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、鐮扁豆屬物種(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、畫眉草屬物種(Eragrestis spp.)、刺桐屬物種(Erythrina spp.)、桉屬物種(Eucalyptus spp.)、Eucleaschimperi、Eulalia villosa、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、費(fèi)約果(Feijoasellowiana)、草莓屬物種(Fragaria spp.)、千斤拔屬物種(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycinejavanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺屬物種(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、巖黃芪屬物種(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小連翹(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭藍(lán)(Indigo incarnata)、鳶尾屬物種(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、羅頓豆(Lotonus bainesii)、百脈根屬物種(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、蘋果屬物種(Malusspp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、煙草屬物種(Nicotianumspp.)、驢食豆屬物種(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻屬物種(Oryzaspp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬物種(Pennisetum spp.)、Perseagratissima、碧冬茄屬物種(Petunia spp.)、菜豆屬物種(Phaseolus spp.)、檳榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠屬物種(Photiniaspp.)、白云杉(Picea glauca)、松屬物種(Pinus spp.)、豌豆(Pisumsativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬物種(Populus spp.)、牧豆樹(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子屬物種(Ribes spp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp.)、懸鉤子屬物種(Rubus spp.)、柳屬物種(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitysverticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendrongiganteum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶屬物種(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車軸草屬物種(Trifolium spp.)、小麥屬物種(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔屬物種(Vacciniumspp.)、野豌豆屬物種(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、錐穗沃森花(Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zeamays)、莧屬植物、朝鮮薊、蘆筍、椰菜、孢子甘藍(lán)、卷心菜、canola、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)綠葉植物、亞麻、無頭甘藍(lán)、小扁豆、油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶葉和藻類，等等。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，植物是作物如大豆，向日葵，蕓苔，紫花苜蓿，油菜籽，棉花，番茄，馬鈴薯或煙草。更進(jìn)一步優(yōu)選地，植物是單子葉植物，如甘蔗。更優(yōu)選地，植物是谷類，如稻，玉米，小麥，大麥，粟，黑麥，高粱或燕麥。
術(shù)語(yǔ)S3a是本領(lǐng)域熟知的。下表1中給出的S3a的可選擇名稱來自Naora和Naora(Immunology and Cell Biology(1999)77，197-205)。
表1S3a的同系物和命名
通過將查詢序列(優(yōu)選蛋白質(zhì)序列)與已知的S3a蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，可以很容易地鑒定S3a(例如參見圖1和2所示的序列比對(duì))。例如，可使用VNTI AlignX序列多重比對(duì)程序(InforMax，Bethesda，MD)，采用空位開放罰分為10、空位延伸罰分為0.05的缺省設(shè)置，對(duì)查詢序列(與已知的S3a序列)進(jìn)行比對(duì)。因?yàn)镾3a序列是高度保守的，通過把查詢序列的任何保守區(qū)域與已知S3a序列的那些區(qū)域進(jìn)行比較，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能很容易地鑒定其它的S3a序列。這些高度保守的區(qū)域在圖2中以3個(gè)框區(qū)圖解說明。因此，具有相應(yīng)的保守區(qū)域的查詢序列將鑒定為S3a。還已表明S3a與真核起始因子eIF-2和eIF-3結(jié)合(Westermann等(FEBSLetters Vol.97，No.1(1979年1月))。
如文中所用的術(shù)語(yǔ)“S3a”用于指蛋白質(zhì)，當(dāng)其用于序列比對(duì)時(shí)[例如圖1或2所示的比對(duì)]，是與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域。文中提及的S3a編碼核酸是指編碼這樣的蛋白質(zhì)的核酸，當(dāng)其用于序列比對(duì)時(shí)[例如圖1或2所示的比對(duì)]，是與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域。如上定義的S3a和S3a編碼核酸在本發(fā)明的方法中是有用的。
待導(dǎo)入到植物中的核酸可以是如上定義的任何S3a編碼序列。核酸優(yōu)選如SEQ ID NO1所示。待導(dǎo)入到植物中的核酸優(yōu)選與組成型啟動(dòng)子有效連接以在植物中過表達(dá)。組成型啟動(dòng)子優(yōu)選是GOS2啟動(dòng)子，更優(yōu)選來自稻的GOS2啟動(dòng)子。顯然，本發(fā)明的應(yīng)用不局限于SEQ ID NO1所示的S3a，當(dāng)由GOS2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)，本發(fā)明的應(yīng)用也不局限于S3a基因/核酸的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，考慮增強(qiáng)的或增加的S3a核酸的表達(dá)。本領(lǐng)域已經(jīng)充分報(bào)道了獲得增強(qiáng)的或增加的基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法，例如，其包括由強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過表達(dá)，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用。
編碼S3a的核酸可以來源于任何來源。編碼S3a的核酸/基因可以分離自微生物來源，如細(xì)菌、酵母或真菌，或分離自植物、藻類或動(dòng)物(包括人)來源?？赏ㄟ^深思熟慮的人為操作，對(duì)處于組合物和/或基因組環(huán)境中的核酸的天然形式進(jìn)行修飾。核酸優(yōu)選是同源核酸，即獲自植物的核酸可以是來自其將被導(dǎo)入其中的相同的植物物種，也可以是來自不同的植物物種。核酸可以分離自雙子葉種類，優(yōu)選來自十字花科，還優(yōu)選分離自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。更優(yōu)選地，分離自擬南芥的S3a如SEQ ID NO1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
SEQ ID NO1所示的序列描述了來自擬南芥的S3a，SEQ ID NO2是相應(yīng)的氨基酸序列。最好地，本發(fā)明的應(yīng)用不局限于使用如SEQ ID NO1所示的來自擬南芥的S3a。也可使用如上文定義的任何S3a或S3a編碼序列來實(shí)施本發(fā)明的方法。
用于實(shí)施本發(fā)明方法的S3a或S3a編碼核酸可以是(i)S3a編碼核酸的部分，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的部分；(ii)能與S3a編碼核酸雜交的序列，優(yōu)選能與如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸雜交的序列；(iii)S3a編碼核酸的可選擇剪接變體，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的可選擇剪接變體；(iv)S3a編碼核酸的等位變體，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的等位變體；和(v)S3a蛋白/氨基酸的同系物和衍生物，優(yōu)選如SEQ ID NO2所示的S3a蛋白的同系物和衍生物。
上述的部分、雜交序列、剪接變體和等位變體、同系物和衍生物是落入如上文所定義的S3a或S3a編碼核酸的定義范圍內(nèi)的那些，即，在蛋白質(zhì)的情況下，與已知S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域；而在核酸的情況下，編碼與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域。
對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，使用全長(zhǎng)的S3a DNA序列，對(duì)于實(shí)施本發(fā)明的方法并非是必要的。本發(fā)明的方法最好使用例如SEQ ID NO1所示的編碼S3a的DNA/核酸的部分。部分指來源于原始的(較大)DNA分子或由其制備的一段DNA。例如，可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，通過對(duì)SEQ ID NO1的核酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)缺失來制備所述部分。適合用于實(shí)施本發(fā)明方法的部分是編碼S3a蛋白的那些部分，該S3a蛋白與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域。
因此根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于改良植物的生長(zhǎng)特性的方法，包括在植物中引入和表達(dá)S3a編碼核酸的部分，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的核酸的部分。
還可用于實(shí)施發(fā)明方法的是能與S3a編碼核酸雜交的核酸，優(yōu)選能與如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸序列雜交的核酸。這樣的雜交序列是編碼S3a蛋白的那些序列，該S3a蛋白序列與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域。
如本文所定義的術(shù)語(yǔ)“雜交”是其中基本上同源的互補(bǔ)核苷酸序列彼此退火的過程。雜交過程可完全發(fā)生在溶液中，即兩互補(bǔ)的核酸都處于溶液中。依賴這種方法的分子生物學(xué)工具包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR；以及基于此的所有方法)、扣除雜交、隨機(jī)引物延伸、S1核酸酶作圖、引物延伸、反轉(zhuǎn)錄、cDNA合成、RNA差異顯示和DNA測(cè)序。雜交過程還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖凝膠珠子或任何其它樹脂上。依賴這種方法的分子生物學(xué)工具包括poly(A+)mRNA的分離。此外雜交過程可還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過例如照相平版印刷術(shù)固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸芯片)。依賴這種方法的分子生物學(xué)工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、集落雜交、噬菌斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了使得雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性受諸如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成等條件的影響。雜交優(yōu)選在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。嚴(yán)謹(jǐn)條件為(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫度進(jìn)行洗滌，例如，0.5M磷酸鈉緩沖液pH 7.2，溶于7％SDS的1mM EDTA pH 8.0，溫度為65℃或55℃，或者(2)在雜交期間使用變性劑如甲酰胺，例如，50％(體積/體積)甲酰胺加0.1％牛血清蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.05M磷酸鈉緩沖液pH 6.5加0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉，溫度為42℃。具體的實(shí)例包括使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75 NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5×Denhard’s液，超聲處理的鮭精DNA(50nm/ml)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，溫度為55℃，并于55℃在0.2×SSC和0.1％SDS中洗滌。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地確定并適當(dāng)?shù)馗淖儑?yán)謹(jǐn)條件，以獲得清楚和可檢測(cè)的雜交信號(hào)。
因此根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于改良植物的生長(zhǎng)特性的方法，包括在植物中引入和表達(dá)優(yōu)選在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與S3a編碼核酸序列[優(yōu)選與如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸]雜交的序列。
S3a編碼核酸的可選擇剪接變體，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的可選擇變體，也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。適合用于實(shí)施本發(fā)明方法的剪接變體是編碼S3a蛋白的那些剪接變體，該S3a蛋白與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“可選擇的剪接變體”涵蓋這樣的核酸序列變體，即其中選定的內(nèi)含子和/或外顯子已經(jīng)切除、置換或添加。這樣的變體是其中蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性保持未受影響的那些變體，其可以通過選擇性地保留蛋白質(zhì)的功能片段來獲得。這樣的剪接變體可以是天然發(fā)現(xiàn)的或可以是人造的。用于制備這樣的剪接變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。
因此，本發(fā)明還提供了一種用于改良植物的生長(zhǎng)特性的方法，包括在植物中引入和表達(dá)S3a編碼核酸的可選擇剪接變體，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的可選擇剪接變體。
S3a編碼核酸的等位變體，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的等位變體，也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。適合用于實(shí)施本發(fā)明方法的等位變體是編碼S3a蛋白的那些等位變體，該S3a蛋白與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域。
等位變體天然存在，且囊括在本發(fā)明的方法之內(nèi)的是這些天然等位基因的用途。等位變體包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多數(shù)生物體的天然存在的多態(tài)菌株中，SNP和INDEL構(gòu)成了最大的一類序列變體。
因此，本發(fā)明還提供了一種用于改良植物的生長(zhǎng)特性的方法，包括在植物中引入和表達(dá)S3a編碼核酸的等位變體，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的等位變體。
此外，本發(fā)明的方法最好也可以使用S3a如SEQ ID NO2所示的S3a的同系物、衍生物或活性片段。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)，可以很容易地確定編碼S3a的同系物或衍生物的核酸。
蛋白質(zhì)的“同系物”涵蓋相對(duì)于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入、且與其所衍生自的未修飾蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。為了產(chǎn)生這樣的同系物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以被具有相似性能(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打斷α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-片層結(jié)構(gòu)的趨勢(shì))的其它氨基酸所取代。保守置換表是本領(lǐng)域熟知的(例如參見Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。
可用于本發(fā)明方法的同系物與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有優(yōu)選度依次遞增的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。而且，適合用于實(shí)施本發(fā)明方法的同系物是與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域的那些同系物。
術(shù)語(yǔ)“同系物”還涵蓋兩種特殊形式的同源性，其包括直向同源(orthologous)序列和共生同源(paralogous)序列，它們涵蓋了用于描述基因遺傳關(guān)系的進(jìn)化概念。術(shù)語(yǔ)“共生同源”涉及某物種基因組內(nèi)的基因復(fù)制，產(chǎn)生共生同源基因。術(shù)語(yǔ)“直向同源”涉及不同生物體中因遺傳關(guān)系所致的同源基因。
例如，單子葉植物物種中的直向同源物可以通過實(shí)施所謂的交互blast搜索很容易地找到。這可以通過第一次blast完成，包括在任何序列數(shù)據(jù)庫(kù)如可在http//www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公眾可用的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)所討論的序列(例如，SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)進(jìn)行blast。如果尋找的是稻的直向同源物，所討論的序列將與例如來自NCBI上可用的Oryza sativa Nipponbare稻的28,469的全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)行blast。當(dāng)從核苷酸開始時(shí)可使用BLASTn，或當(dāng)從蛋白質(zhì)開始時(shí)可使用TBLASTX，并使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值(期望值10，比對(duì)值50)。blast的結(jié)果可以進(jìn)行過濾。然后再將過濾結(jié)果或未過濾結(jié)果的全長(zhǎng)序列與所討論的序列(SEQ IDNO1或2)進(jìn)行反向blast(第二次blast)。然后對(duì)第一次和第二次blast的結(jié)果進(jìn)行比較。在大家族的情況下，使用ClustalW，接著使用相鄰連接樹以幫助觀察聚類(clustering)。
同系物可以是蛋白質(zhì)“取代變體”的形式，即，其中氨基酸序列中的至少一個(gè)殘基已經(jīng)被除去，而將一個(gè)不同的殘基插入到它的位置上。氨基酸取代一般是單殘基的，但是取決于對(duì)多肽構(gòu)成的功能限制可以是成串的；插入通常是大約1到10個(gè)氨基酸殘基，缺失為大約1到20個(gè)殘基。優(yōu)選地，氨基酸取代包括保守氨基酸取代。
同系物還可以是蛋白質(zhì)的“插入變體”，即，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被引入到蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點(diǎn)。插入可包括氨基末端和/或羧基末端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的序列內(nèi)插入。通常，氨基酸序列內(nèi)的插入將小于氨基或羧基末端融合，約為1到10個(gè)殘基的數(shù)量級(jí)。氨基或羧基末端融合蛋白質(zhì)或肽的實(shí)例包括如用于酵母雙雜合系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、A蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
蛋白質(zhì)“缺失變體”形式的同系物的特征在于從蛋白質(zhì)除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作，可以很容易地制備蛋白質(zhì)的氨基酸變體。對(duì)DNA序列進(jìn)行操作以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，在DNA的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生取代突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、快速變換的定點(diǎn)誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其它定點(diǎn)誘變方案。
“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，與S3a蛋白天然存在形式的氨基酸序列相比，例如，如SEQ ID NO2所示，其可以包括天然和非天然存在氨基酸殘基的取代、缺失或添加。蛋白質(zhì)的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，與多肽天然存在形式的氨基酸序列相比，其可以包括改變的、糖基化的、酰化的天然存在的氨基酸殘基或非天然存在的氨基酸殘基。與其衍生自的氨基酸序列相比，衍生物還可包括一個(gè)或多個(gè)非氨基酸取代基，例如與氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的報(bào)告分子或其它配體，如結(jié)合以便于其檢測(cè)的報(bào)道分子，以及相對(duì)于天然存在蛋白質(zhì)的氨基酸序列而言的非天然存在的氨基酸殘基。
搜索和鑒定S3a同系物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。對(duì)用于比較的序列進(jìn)行比對(duì)的方法是本領(lǐng)域熟知的，這類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443-453，1970)的算法來實(shí)現(xiàn)兩個(gè)全序列的比對(duì)，其最大化匹配的數(shù)目，并最小化空位數(shù)目。BLAST算法計(jì)算序列同一性百分比，并對(duì)兩個(gè)序列之間相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。執(zhí)行BLAST分析的軟件通過國(guó)家生物技術(shù)信息中心(the National Centre for Biotechnology Information)可公眾獲得?？梢酝ㄟ^取全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列，使用VNTI AlignX序列多重對(duì)比程序?qū)λ鼈冞M(jìn)行序列比對(duì)(InforMax，Bethesda，MD)，并使用空位開放罰分為10和空位延伸為0.05的設(shè)置默認(rèn)值，來鑒定適合用于本發(fā)明方法的同系物，即，與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的那些同系物。例如參見圖1。
因此，本發(fā)明還提供了一種用于改良植物的生長(zhǎng)特性的方法，包括在植物中引入和表達(dá)編碼如SEQ ID NO2所示的S3a的同系物或衍生物的核酸，該同系物、衍生物或活性片段與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有優(yōu)選度依次遞增的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性，而且把該同系物或衍生物與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域。
本發(fā)明還提供了遺傳構(gòu)建體和載體，以便于引入和/或表達(dá)可用于本發(fā)明方法的核苷酸序列。
因此，本發(fā)明提供了一種基因構(gòu)建體，其包含
(i)S3a編碼核酸，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示；(ii)能驅(qū)動(dòng)(i)中核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建。基因構(gòu)建體可插入到載體中，該載體可以是商購(gòu)的，適于轉(zhuǎn)化到植物中，并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因。
植物用包含目的序列(即如上文所定義的S3a編碼核酸)的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。目的序列與一個(gè)或多個(gè)控制序列(至少與一個(gè)啟動(dòng)子)有效地連接。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”、“控制序列”和“啟動(dòng)子”在文中都可以互換使用，且應(yīng)當(dāng)取其廣義，是指能對(duì)與它們連接的序列的表達(dá)起作用的調(diào)控核酸序列。上述術(shù)語(yǔ)涵蓋來源于經(jīng)典真核生物基因組基因(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA盒，帶或不帶CCAAT盒序列)以及根據(jù)發(fā)育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的另外的調(diào)控元件(即，上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。該術(shù)語(yǔ)還包括經(jīng)典原核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在這種情況下，它可能包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”也涵蓋合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能夠、在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)，激活或增強(qiáng)這種表達(dá)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“有效連接”指啟動(dòng)子序列與目的基因之間的功能性連接，以便啟動(dòng)子序列能啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。
最好地，任何類型的啟動(dòng)子都可用于驅(qū)動(dòng)S3a編碼核酸的表達(dá)。
優(yōu)選地，編碼S3a的核酸有效地與組成型啟動(dòng)子連接。如文中所定義的術(shù)語(yǔ)“組成型”指該啟動(dòng)子在不止一種組織或器官中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，而且在植物生活周期的任何階段都優(yōu)勢(shì)表達(dá)。優(yōu)選地，組成型啟動(dòng)子在整株植物中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。優(yōu)選地，組成型啟動(dòng)子是來自稻的GOS2啟動(dòng)子。
適合用于本發(fā)明方法的其它組成型啟動(dòng)子的例子列于下表A。
表A用于實(shí)施本發(fā)明的組成型啟動(dòng)子的實(shí)例
任選地，一個(gè)或多個(gè)終止子序列也可用于被引入到植物中的構(gòu)建體中。術(shù)語(yǔ)“終止子”涵蓋控制序列，其是位于轉(zhuǎn)錄單元末端的DNA序列，傳遞3’加工和初級(jí)轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)。另外的調(diào)控元件也可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉適合用于實(shí)施本發(fā)明的終止子與增強(qiáng)子。這樣的序列是已知的，或本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地獲得。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn)序列。一個(gè)實(shí)例是需要遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中作為染色體外遺傳元件(例如，質(zhì)?；蛘沉７肿?維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制原點(diǎn)包括但不局限于f1-ori和colE1。
遺傳構(gòu)建體任選地可包含選擇標(biāo)記基因。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記基因”包括賦予表達(dá)該基因的細(xì)胞表型以便于鑒定和/或選擇用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的任何基因。合適的標(biāo)記可選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的新陳代謝性狀或允許視覺選擇。選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括能賦予抗生素抗性(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或使潮霉素磷酸化的hpt)、除草劑抗性(例如提供對(duì)Basta的抗性的bar；提供對(duì)草甘膦的抗性的aroA或gox)的基因，或提供新陳代謝性狀的基因(如允許植物利用甘露糖作為唯一碳源的manA)。視覺標(biāo)記基因?qū)е滦纬深伾?例如β-葡糖苷酸酶，GUS)、發(fā)光(如熒光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。
本發(fā)明還涵蓋可通過本發(fā)明的方法獲得的植物。本發(fā)明因此提供了可通過本發(fā)明的方法獲得的植物，該植物中引入和表達(dá)了如上文所定義的編碼S3a蛋白的核酸。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在植物中引入和表達(dá)S3a編碼核酸，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的核酸。
更具體地說，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)向植物或植物細(xì)胞中引入S3a編碼核酸，優(yōu)選如SEQ ID NO1所示的核酸；(ii)在促進(jìn)再生和使植物生長(zhǎng)成熟的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
核酸可以直接引入到植物細(xì)胞或植物本身(包括引入到植物的組織、器官或任何其它部分)之中。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的特征，核酸優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化被引入到植物中。
如本文所提及的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”涵蓋把外源多核苷酸向宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移，而不管轉(zhuǎn)移的方法如何。能夠隨后無性繁殖的植物組織，無論是通過器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生，都可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并從其再生完整植物。選擇的特定組織將視可用于且最適于轉(zhuǎn)化的特定物種的無性繁殖體系而改變。例示性的靶組織包括葉圓盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組織、已存在的分生組織(例如，頂端分生組織，腋生的芽和根分生組織)以及誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時(shí)或穩(wěn)定地被引入到宿主細(xì)胞中，并可保持非整合狀態(tài)，例如，作為質(zhì)粒。可選擇地，它可以整合到宿主基因組中。所得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞然后可用于以本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法再生為轉(zhuǎn)化植物。
植物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，任何轉(zhuǎn)化方法都可用于引入目的基因到合適的祖代細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、能增加游離DNA攝入的化學(xué)品、直接注射DNA到植物中、基因槍顆粒轟擊、使用病毒或花粉進(jìn)行轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法可選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；顯微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA涂層顆粒轟擊(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。表達(dá)S3a的轉(zhuǎn)基因稻植物優(yōu)選使用任何用于稻轉(zhuǎn)化的熟知方法，通過土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，例如在任何以下文獻(xiàn)中描述的方法公開的歐洲專利申請(qǐng)EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)271-282，1994)，其公開的內(nèi)容如同其陳述的全部?jī)?nèi)容那樣并入文中作為參考。至于谷物轉(zhuǎn)化，優(yōu)選的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)或Frame等(Plant Physiol.2002 May；129(1)13-22)中所述，其公開的內(nèi)容如同其陳述的全部?jī)?nèi)容那樣并入文中作為參考。
通常在轉(zhuǎn)化以后，選擇植物細(xì)胞或細(xì)胞群中與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因所編碼的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記，接著將轉(zhuǎn)化的材料再生成完整植株。
DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可評(píng)價(jià)推斷轉(zhuǎn)化植物中目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組結(jié)構(gòu)，例如使用Southern分析?？蛇x擇地或另外地，新引入DNA的表達(dá)水平可使用Northern和/或Western分析進(jìn)行監(jiān)控，兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可通過各種方法進(jìn)行繁殖，如通過無性繁殖或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以自花授精以產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化株，而T2植物可進(jìn)一步通過經(jīng)典的育種技術(shù)進(jìn)行繁殖。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以是各種形式的。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如，所有的細(xì)胞都被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如，在植物中，轉(zhuǎn)化的根莖被嫁接到未轉(zhuǎn)化的接穗中)。
本發(fā)明顯然延及由文中描述的任何方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本發(fā)明還延及囊括由任何上述的方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或完整植物的后代，唯一的要求是該后代顯示與由本發(fā)明的方法在親代中產(chǎn)生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本發(fā)明還包括含有分離的S3a編碼核酸的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明還延及植物的可收獲部分，如但不局限于種子、葉、果實(shí)、花、莖培養(yǎng)物、根莖、塊莖和鱗莖。
也可實(shí)施本發(fā)明的方法而不需向植物中引入編碼S3a的核酸。這可通過引入遺傳修飾來實(shí)現(xiàn)(優(yōu)選在S3a編碼基因的基因座中)。如文中所定義的基因的基因座是指基因組區(qū)域，其包括目的基因以及10KB編碼區(qū)的上游或下游。
例如，遺傳修飾可以通過以下的任何一種(或多種)方法引入TDNA激活、TILLING、定點(diǎn)誘變、同源重組、直接進(jìn)化，或如上文所述的，通過在植物(細(xì)胞)中引入和表達(dá)S3a編碼核酸。
T-DNA激活標(biāo)簽(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括T-DNA的插入，其通常在目的基因的基因組區(qū)域或基因編碼區(qū)的上游或下游10KB處中含有如此構(gòu)造的啟動(dòng)子(也可能是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子)，從而該啟動(dòng)子能指導(dǎo)靶基因的表達(dá)。一般地，破壞靶基因天然啟動(dòng)子對(duì)其的表達(dá)調(diào)控，而使該基因處于新引入的啟動(dòng)子的控制之下。啟動(dòng)子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通過土壤農(nóng)桿菌感染隨機(jī)插入到植物基因組中，并導(dǎo)致靠近該插入的T-DNA的基因過量表達(dá)。由于接近引入的啟動(dòng)子的基因過量表達(dá)，所得的轉(zhuǎn)基因植物顯示出顯性表型。待引入的啟動(dòng)子可以是能指導(dǎo)基因在所需的生物體[在本案為植物]中表達(dá)的任何啟動(dòng)子。例如，組成型、組織偏好的、細(xì)胞類型偏好的以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子都適合用于T-DNA激活。
也可以使用TILLING技術(shù)(靶向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù))，把遺傳修飾引入到編碼S3a的核酸/基因的基因座中。這是一種誘變技術(shù)，可用于產(chǎn)生和/或鑒定、并最終分離能顯示S3a生物學(xué)活性的S3a編碼核酸的誘變變體。TILLING還能夠選擇攜帶這類突變變體的植物。這些突變變體甚至可表現(xiàn)出比該基因的天然形式所表現(xiàn)的更高的S3a活性。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結(jié)合起來。TILLING一般遵循的步驟是(a)EMS誘變(Redei和Koncz，1992；Feldmann等，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制備和個(gè)體合并；(c)目的區(qū)域的PCR擴(kuò)增；(d)變性和退火以允許形成異源雙鏈；(e)DHPLC，其中庫(kù)中異源雙鏈的存在檢測(cè)為色譜圖中額外的峰值；(f)鑒定突變個(gè)體；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測(cè)序。TILLING的方法是本領(lǐng)域熟知的(McCallum Nat Biotechnol.2000 Apr；18(4)455-7，由Stemple 2004(TILLING-a high-throughput harvest for functionalgenomics.Nat Rev Genet.2004年2月；5(2)145-50.)綜述)。
可利用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生S3a編碼核酸的變體或其部分。若干方法可用來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變，最常見的是基于PCR的方法(current protocols inmolecular biology.Wiley編http//www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
直接進(jìn)化也可用于產(chǎn)生S3a編碼核酸的變體。這包括重復(fù)的DNA改組，接著進(jìn)行合適的篩選和/或選擇以產(chǎn)生S3a編碼核酸的變體(Castle等，(2004)Science 304(5674)1151-4；美國(guó)專利5,811,238和6,395,547)。
T-DNA激活、TILLING、定點(diǎn)誘變和直接進(jìn)化是能產(chǎn)生新的等位基因和SYT變體的技術(shù)的實(shí)例。
同源重組能夠在基因組的規(guī)定選擇位置處引入選定的核酸。同源重組是生物學(xué)中通常使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于較低等的生物體如酵母或苔蘚physcomitrella。用于在植物中進(jìn)行同源重組的方法不僅已在模式植物中描述(Offringa等Extrachromosomal homologous recombination and genetargeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990年10月；9(10)3077-84)，而且在禾谷類作物例如稻中描述(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Efficient gene targetingby homologous recombination in rice.Nat Biotechnol.2002.Iida和TeradaA tale of two integrations，transgene and T-DNAgene targeting byhomologous recombination in rice.Curr Opin Biotechnol.2004年4月；15(2)132-8)。例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定義的S3a編碼核酸)不需靶向到S3a編碼基因的基因座中，但是可以被引入到高表達(dá)的區(qū)域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替換內(nèi)源基因，或附加地引入到內(nèi)源基因中。
本發(fā)明還包括編碼S3a的核酸的用途和S3a多肽的用途。
一種這樣的用途當(dāng)然涉及如上文所定義的S3a在改良植物的生長(zhǎng)特性，特別是用于提高產(chǎn)率，尤其是種子產(chǎn)率的用途。種子產(chǎn)率可包括下列一個(gè)或多個(gè)方面增加的(飽滿)種子數(shù)、增加的種子重量、增加的收獲指數(shù)和增加的TKW等等。S3a編碼核酸可以如SEQ ID NO1所示，S3a蛋白可以是如SEQ ID NO2所示的氨基酸。
如上文所定義的編碼S3a的核酸以及S3a多肽在育種方案中也大有用途。S3a編碼核酸可以如SEQ ID NO1所示，或S3a可以是如SEQ ID NO2所示的氨基酸。例如，S3a編碼核酸或其部分可以位于染色體(或其部分)上，優(yōu)選與一種或多種相關(guān)的家族成員連接在一起。在這種育種方案的一個(gè)實(shí)例中，鑒定可能與能夠調(diào)節(jié)植物中編碼S3a蛋白的核酸表達(dá)的基因遺傳連鎖的DNA標(biāo)記，該基因可以是編碼S3a蛋白本身的基因，或者是可直接或間接地影響編碼S3a蛋白的基因的表達(dá)和/或S3a蛋白本身的活性的任何其它基因。然后這種DNA標(biāo)記可用于育種方案，以選擇具有改良的生長(zhǎng)特性的植物。
S3a的等位變體也可用于常規(guī)的育種方案，如在標(biāo)記輔助的育種中。這樣的育種方案有時(shí)需要通過植物的誘變處理，在植物中引入等位基因變異。一種合適的誘變方法是EMS誘變。然后通過例如PCR進(jìn)行等位變體的鑒定。接著是篩選步驟，用于選擇所討論序列的優(yōu)良等位變體，其在植物中產(chǎn)生改良的生長(zhǎng)特性。一般通過監(jiān)控含有所討論序列的不同等位變體(例如，SEQ ID NO1的不同等位變體)的植物的生長(zhǎng)特性來進(jìn)行篩選。監(jiān)控生長(zhǎng)特性可以在溫室或野外進(jìn)行。此外任選的步驟包括使植物與另一種植物雜交，其中鑒定優(yōu)良的等位變體。例如，這可用于產(chǎn)生組合的目的表型特征。
S3a編碼核酸還可用作探針，以對(duì)基因進(jìn)行遺傳和物理作圖，這些基因是與之連鎖的性狀的一部分和標(biāo)志。這些信息可用于植物育種，以開發(fā)具有所需表型的種系。S3a編碼核酸的這種應(yīng)用，僅僅需要長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸的核酸序列。S3a編碼核酸可用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Maniatis)可使用S3a編碼核酸進(jìn)行探測(cè)。然后可以使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1174-181)對(duì)所得的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖譜。此外，該核酸可用于探測(cè)Southern印跡，該Southern印跡含有代表親本和明確的遺傳雜交后代的一組個(gè)體的限制性核酸內(nèi)切酶處理的基因組DNA。記錄到DNA多態(tài)性的分離，并用于計(jì)算S3a編碼核酸在前面使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
植物基因來源的探針的制備和在遺傳作圖中的用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中。眾多出版物描述過使用上面所述的方法或其變通形式對(duì)特定的cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，F(xiàn)2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近親同基因系及其它的個(gè)體組可用于作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
核酸探針也可用于物理作圖(即，把序列置于物理圖上；參見Hoheisel等Non-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346頁(yè)，以及其中引用的參考文獻(xiàn))。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)。雖然目前的FISH作圖方法偏向于使用大的克隆(幾個(gè)到幾百KB；參見Laan等(1995)Genome Res.513-20)，但是靈敏度的提高允許使用較短的探針進(jìn)行FISH作圖。
許多用于遺傳和物理作圖的各種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸實(shí)施。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med1195-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等(1988)Science 2411077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射雜交作圖(Walter等(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核酸序列設(shè)計(jì)和制備引物對(duì)，以用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)。這類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在采用基于PCR遺傳作圖的方法中，可能有必要鑒定跨越相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列區(qū)域作圖的親代之間DNA序列的差異。然而，這對(duì)作圖方法通常不是必要的。
編碼S3a的核酸和S3a多肽也可用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。S3a編碼核酸可以是如SEQ ID NO1所示的核酸，而S3a蛋白/多肽可以是如SEQ ID NO2所示的氨基酸。由于這些S3a可用于改良植物的生長(zhǎng)特性，S3a也是有用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如除草劑或生長(zhǎng)刺激物。本發(fā)明因此提供了一種組合物，其包含S3a或編碼S3a的核酸，連同合適的載體、稀釋劑或賦形劑，用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有改良的生長(zhǎng)特性的植物，如以上所述。這些改良的生長(zhǎng)特性也可與其它經(jīng)濟(jì)學(xué)上有利的性狀結(jié)合，如其它增產(chǎn)性狀、對(duì)各種應(yīng)激的耐受性、修飾各種結(jié)構(gòu)特征和/或生化和/或生理學(xué)特征的性狀。


本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下附圖進(jìn)行描述，其中圖1顯示了使用VNTI AlignX序列多重比對(duì)程序(InforMax，Bethesda，MD)進(jìn)行的S3a蛋白序列的比對(duì)，其中使用空位開放罰分為10和空位延伸為0.05的缺省設(shè)置。黑色背景上以白色表示的殘基是相同的；灰色背景上以白色表示的殘基是保守的或類似殘基區(qū)，如VNTI選項(xiàng)所定義的那樣。
圖2顯示了來自Lyamouri(Gene 294(2002)147-156)等的序列比對(duì)，其顯示了來自不同物種的S3a蛋白中的高度保守智人(H.sapiens)(Hs)，褐家鼠(M.musculus)(Mm)，紅鰭東方鲀(T.rubripes)(Tr)，非洲爪蟾(X.laevis)(Xl)，黑腹果蠅(D.melanogaster)(Dm)，黑果蠅(D.virilis)(Dv)，秀麗隱桿線蟲(C.elegans)(Ce)，釀酒酵母(S.cerevisiae)(Sc)，擬南芥(A.thaliana)(At)，稻(O.sativa)(Os)和H.holobium(Hh)。黑色陰影表示相同的氨基酸，而淺灰表示保守的氨基酸置換。空位由破折號(hào)表示。最高度保守的區(qū)域是方框內(nèi)的。
圖3顯示了二元載體，用于在稻中表達(dá)處于稻GOS2啟動(dòng)子控制下(內(nèi)參PRO0129)的擬南芥cyc07推定的S-期特異性40S S3a核糖體蛋白基因(內(nèi)參CDS0730)。
圖4詳述了用于進(jìn)行本發(fā)明方法的序列。
實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下實(shí)施例進(jìn)行描述，其僅僅是為了例證說明。
DNA操作除非另有說明，重組DNA技術(shù)根據(jù)(Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，3rd Edition Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等第1卷和第2卷(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
實(shí)施例1基因克隆使用擬南芥幼苗cDNA文庫(kù)(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板，PCR擴(kuò)增擬南芥S3a(S-期特異性40S cyc07)。對(duì)從幼苗提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以后，把cDNA克隆到pCMV Sport 6.0中?；驇?kù)的平均插入大小為1.5kb，而且克隆的原始數(shù)為1.59×107cfu。原始滴度確定為9.6×105cfu/ml，而且在第一輪擴(kuò)增以后變成6×1011cfu/ml。質(zhì)粒提取以后，200ng的模板用于50μl PCR混合物。如下引物用于PCR擴(kuò)增引物prm02255(正義，起始密碼子為黑體，AttB1位點(diǎn)為斜體5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTGTCGGGAAGAA 3’)和prm02256(反向，互補(bǔ)，終止密碼子為黑體，AttB2位點(diǎn)為斜體5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAGCTCCGATGATTTCT 3’)，其包括用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR。擴(kuò)增到789bp的PCR片段，而且同樣使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化。然后進(jìn)行Gateway方法的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間，PCR片段在體內(nèi)與pDONR201質(zhì)粒重組，根據(jù)Gateway術(shù)語(yǔ)，以產(chǎn)生“entry克隆”p2782。質(zhì)粒pDONR201購(gòu)自Invitrogen，作為Gatewaytechnology的一部分。
實(shí)施例2載體構(gòu)建entry克隆p2782接著與p0640進(jìn)行LR反應(yīng)，p0640是用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體。該載體包含位于T-DNA邊界內(nèi)的以下部分作為功能性元件植物選擇標(biāo)記；植物篩選標(biāo)記；旨在與已克隆到entry克隆中的目的序列進(jìn)行體內(nèi)重組的LR的Gateway表達(dá)盒。用于組成型表達(dá)的稻GOS2啟動(dòng)子(PRO0129)位于該Gateway表達(dá)盒的上游。LR重組步驟之后，得到的如圖3所示的表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌中，其隨后被轉(zhuǎn)化到稻植株中。使轉(zhuǎn)化的稻植株生長(zhǎng)，然后檢驗(yàn)實(shí)施例3中所述的參數(shù)。
實(shí)施例3評(píng)估和結(jié)果產(chǎn)生了大約15到20個(gè)獨(dú)立的T0稻轉(zhuǎn)化株。一代轉(zhuǎn)化株從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室中生長(zhǎng)，并收獲T1種子。6個(gè)事件得以保留，其中T1后代發(fā)生轉(zhuǎn)基因存在/缺乏的3∶1分離。對(duì)于這些事件中的每一個(gè)，通過監(jiān)控視覺標(biāo)記的表達(dá)，選擇了大約10個(gè)包含轉(zhuǎn)基因的T1幼苗(異型和同型接合子)，和大約10個(gè)缺乏轉(zhuǎn)基因的T1幼苗(無效接合子)。有些T1事件在T2代中使用與T1代相同的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行進(jìn)一步予以評(píng)估。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析F-測(cè)驗(yàn)兩因子的ANOVA(可變性分析)用作統(tǒng)計(jì)模型，用于植物表型特征的綜合評(píng)價(jià)。對(duì)用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植株的所有測(cè)量參數(shù)進(jìn)行F測(cè)驗(yàn)。進(jìn)行F測(cè)驗(yàn)以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的作用，并檢驗(yàn)基因的總效應(yīng)，亦稱之為整體基因效應(yīng)。真實(shí)整體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F測(cè)驗(yàn)的5％概率水平。顯著的F測(cè)驗(yàn)值顯示基因效應(yīng)，意味著不僅僅是基因的存在或位置引起表型的差異。
3.1種子相關(guān)的參數(shù)測(cè)量收獲成熟的初級(jí)穗，裝袋，進(jìn)行條型碼標(biāo)記，然后在烘箱于37℃干燥3天。然后對(duì)穗脫粒，收集所有的種子并計(jì)數(shù)。使用鼓氣裝置，把飽滿的谷殼從空谷殼中分離開。丟棄空谷殼，并對(duì)保留的部份再次計(jì)數(shù)。飽滿的谷殼在分析天平上稱重。該方法產(chǎn)生如下所述的種子相關(guān)參數(shù)組。
下面的結(jié)果表顯示了用于T1評(píng)估、T2評(píng)估的F測(cè)驗(yàn)的p值，以及用于聯(lián)合的T1和T2評(píng)估的F測(cè)驗(yàn)的p值。當(dāng)對(duì)相同的事件已經(jīng)進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以考慮聯(lián)合分析。這可用于檢查對(duì)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的作用的一致性，并增加結(jié)論的可信度。所用的方法是混合模型法，其考慮數(shù)據(jù)的多級(jí)結(jié)構(gòu)(也即實(shí)驗(yàn)-事件-分離子)。P值通過比較似然比檢驗(yàn)與卡方分布獲得。每一個(gè)表都提供了每代的轉(zhuǎn)基因與對(duì)應(yīng)的無效接合子之間的％差異。
3.1.1飽滿的種子數(shù)通過計(jì)數(shù)分離步驟之后保留的飽滿谷殼的數(shù)目確定飽滿的種子數(shù)。如下表1所示，用于聯(lián)合的T1和T2評(píng)估的F測(cè)驗(yàn)的p值是顯著的(p值為0.0071)，這表明植物中構(gòu)建體的存在對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的飽滿種子數(shù)具有顯著影響。
表1

3.1.2每個(gè)植株的種子總產(chǎn)率通過對(duì)從植株收獲的全部飽滿的谷殼進(jìn)行稱重，來測(cè)定種子總產(chǎn)率。如下表2所示，用于聯(lián)合的T1和T2評(píng)價(jià)的F測(cè)驗(yàn)的p值是顯著的(p值為0.0016)，這表明植物中構(gòu)建體的存在對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的種子總重量具有顯著影響。
表2

3.1.3植物的收獲指數(shù)本發(fā)明中的收獲指數(shù)定義為種子總產(chǎn)率與地上面積(mm2)之間的比率，再乘以系數(shù)106。如下表3所示，用于聯(lián)合的(以及分別的)T1和T2評(píng)價(jià)的F測(cè)驗(yàn)的p值是顯著的(p值為0.0005)，這表明植物中構(gòu)建體的存在對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的收獲指數(shù)具有顯著影響。
表3

3.1.4千籽粒重(TKW)從計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)以及它們的總重量來推斷該參數(shù)。如下表4所示，用于聯(lián)合的T1和T2評(píng)估的F測(cè)驗(yàn)的p值是顯著的(p值為0.0405)，這表明植物中構(gòu)建體的存在對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的TKW具有顯著影響。
表4

序列表<110>克羅普迪塞恩股份有限公司<120>具有改良的生長(zhǎng)特性的植物以及制備所述植物的方法<130>CD-112-PCT<150>EP 04101179.2<151>2004-03-22<150>US 60/556,847<151>2004-03-28<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>830<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atggctgtcg ggaagaacaa gaggatttca aagggtagga aaggaggaaa gaagaaggct 60gttgatccct tctccaagaa ggattggtat gacgtgaagg ctcctggttc tttcacgaac120aggaatgttg ggaagactct tgtttccagg actcagggta ccaagattgc ctctgaggga180ctgaaacaca gggtgtttga ggtttctctt gctgatctac aaaatgatga ggataatgcc240tacaggaaga tccgtcttag agctgaagat gttcagggaa ggaatgtgtt gacccagttc300tggggtatgg atttcacaac cgacaagcta aggtcattgg tgaagaagtg gcagactttg360attgaagccc atgtcgatgt gaaaaccaca gacggctaca ccttgaggat gttctgcatc420gccttcacaa agagacgtgc taaccaagtg aagcgtacct gttacgctca atccagccaa480atccgtcaga tccgcagaaa gatgagtgag attatggtga aggaggcttc atcttgtgac540ctcaaggagc tagtggccaa gttcatccca gaggccattg gaagagagat tgagaaggca600acacagggca tctacccgtt gcagaatgtg ttcatccgta aagtgaagat cctaaaggct660cccaagtttg accttggaaa gctcatggag gtgcatggag attacacagc agaggatgtt720
ggtgtgaagg tagacaggcc agctgatgag acaatggttg aggagccaac agaaatcatc780ggagcttagg ggattataga tttgtttgtt ttttcgctgg caaaaaaaaa 830<210>2<211>261<212>PRT<213>擬南芥<400>2Met Ala Val Gly Lys Asn Lys Arg Ile Ser Lys Gly Arg Lys Gly Gly1 5 10 15Lys Lys Lys Ala Val Asp Pro Phe Ser Lys Lys Asp Trp Tyr Asp Val20 25 30Lys Ala Pro Gly Ser Phe Thr Asn Arg Asn Val Gly Lys Thr Leu Val35 40 45Ser Arg Thr Gln Gly Thr Lys Ile Ala Ser Glu Gly Leu Lys His Arg50 55 60Val Phe Glu Val Ser Leu Ala Asp Leu Gln Asn Asp Glu Asp Asn Ala65 70 75 80Tyr Arg Lys Ile Arg Leu Arg Ala Glu Asp Val Gln Gly Arg Asn Val85 90 95Leu Thr Gln Phe Trp Gly Met Asp Phe Thr Thr Asp Lys Leu Arg Ser100 105 110Leu Val Lys Lys Trp Gln Thr Leu Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys115 120 125Thr Thr Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Met Phe Cys Ile Ala Phe Thr Lys130 135 140
Arg Arg Ala Asn Gln Val Lys Arg Thr Cys Tyr Ala Gln Ser Ser Gln145 150 155 160Ile Arg Gln Ile Arg Arg Lys Met Ser Glu Ile Met Val Lys Glu Ala165 170 175Ser Ser Cys Asp Leu Lys Glu Leu Val Ala Lys Phe Ile Pro Glu Ala180 185 190Ile Gly Arg Glu Ile Glu Lys Ala Thr Gln Gly Ile Tyr Pro Leu Gln195 200 205Asn Val Phe Ile Arg Lys Val Lys Ile Leu Lys Ala Pro Lys Phe Asp210 215 220Leu Gly Lys Leu Met Glu Val His Gly Asp Tyr Thr Ala Glu Asp Val225 230 235 240Gly Val Lys Val Asp Arg Pro Ala Asp Glu Thr Met Val Glu Glu Pro245 250 255Thr Glu Ile Ile Gly260<210>3<211>1169<212>DNA<213>甘蔗(Saccharum officinarum)<400>3aagatgaagc ctttgtcatg gtgcatgcta aagatgctga ggctgagaag ttgagggatg 60aaccatgaca aaggcttcat ctttctcgac ctgaatcctg tccacattcc ccttcagcat120cttcaattca gcctcgatca ttttcttctt aagcaccccg ccgtcgttct cttcctgcat180ccccgcccca ttccctagcg tcgcccccct cgccgccgca cggacgcagc gacgagctct240
cgcagcagca atggcggttg gcaagaataa gcgtatctcc aagggcaaga agggaggcaa300gaagaagacc gtggatccgt tcagcaaaaa ggattggtat gatatcaagg ctccgtcggt360cttcagcgtg cgcaacatcg gcaagaccct ggtctccagg acacagggca ccaagattgc420ctctgagggt ttaaagcaca gagtatttga ggtctccttg gctgatcttc agagtgatga480agaccaggcg tacaggaaga tcagacttcg tgcagaggat gtacaaggga gaaatgttct540cacaaacttc tggggtatga gcttcaccac cgacaagctc cgttcacttg tgaagaagtg600gcagacgctt attgaggctc atgttgatgt caagaccacc gataactata tgctgcggct660gttctgcatt gggttcacca agaggcggcc caatcaagtg aagcgcactt gctatgctca720agcaagccaa atcagacaga ttcgtcggaa gatgactgaa atcatgagca accaagcttc780aacttgtgat ctgaaagagc tcgtgtccaa gttcatccct gaggtcattg gaaaggaaat840cgagaaagcc acctctagca tattcccctt gcaaaatgtc ttcatccgca aggtgaagat900cctgaaagca ccaaagttcg acattggaaa gctcatggag gtccatggtg actatgccaa960ggaggatgtt ggtgtcaaga tggacaggcc tgctgaaggc gacgaggcca tgggaggaca 1020ggaggttgct gcagctgagt gattagtctc actgtttacg tccgagttag agctgccata 1080tttccttgaa acacttagga acactttttt tgagagtctg acatgtggtg gcttcgattc 1140tccttgaaaa tttgcagcat gggaaatgt 1169<210>4<211>263<212>PRT<213>甘蔗<400>4Met Ala Val Gly Lys Asn Lys Arg Ile Ser Lys Gly Lys Lys Gly Gly1 5 10 15Lys Lys Lys Thr Val Asp Pro Phe Ser Lys Lys Asp Trp Tyr Asp Ile20 25 30
Lys Ala Pro Ser Val Phe Ser Val Arg Asn Ile Gly Lys Thr Leu Val35 40 45Ser Arg Thr Gln Gly Thr Lys Ile Ala Ser Glu Gly Leu Lys His Arg50 55 60Val Phe Glu Val Ser Leu Ala Asp Leu Gln Ser Asp Glu Asp Gln Ala65 70 75 80Tyr Arg Lys Ile Arg Leu Arg Ala Glu Asp Val Gln Gly Arg Asn Val85 90 95Leu Thr Asn Phe Trp Gly Met Ser Phe Thr Thr Asp Lys Leu Arg Ser100 105 110Leu Val Lys Lys Trp Gln Thr Leu Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys115 120 125Thr Thr Asp Asn Tyr Met Leu Arg Leu Phe Cys Ile Gly Phe Thr Lys130 135 140Arg Arg Pro Asn Gln Val Lys Arg Thr Cys Tyr Ala Gln Ala Ser Gln145 150 155 160Ile Arg Gln Ile Arg Arg Lys Met Thr Glu Ile Met Ser Asn Gln Ala165 170 175Ser Thr Cys Asp Leu Lys Glu Leu Val Ser Lys Phe Ile Pro Glu Val180 185 190Ile Gly Lys Glu Ile Glu Lys Ala Thr Ser Ser Ile Phe Pro Leu Gln195 200 205Asn Val Phe Ile Arg Lys Val Lys Ile Leu Lys Ala Pro Lys Phe Asp
210 215 220Ile Gly Lys Leu Met Glu Val His Gly Asp Tyr Ala Lys Glu Asp Val225 230 235 240Gly Val Lys Met Asp Arg Pro Ala Glu Gly Asp Glu Ala Met Gly Gly245 250 255Gln Glu Val Ala Ala Ala Glu260<210>5<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物prm02255<400>5ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct gtcgggaaga a 51<210>6<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物prm02256<400>6ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctaagctccg atgatttct 49
權(quán)利要求
1.一種改良植物生長(zhǎng)特性的方法，包括在植物中引入和表達(dá)編碼小亞基核糖體蛋白S3a多肽的核酸。
2.權(quán)利要求1的方法，包括在植物中引入和表達(dá)(i)S3a編碼核酸的一部分；(ii)能與S3a編碼核酸雜交的序列；(iii)S3a編碼核酸的可選擇剪接變體；(iv)S3a編碼核酸的等位變體；和(v)編碼S3a氨基酸序列的同系物或衍生物的核酸，其中，(i)至(v)所編碼的蛋白質(zhì)與已知的S3a蛋白序列比對(duì)且包含與圖2序列比對(duì)中所示的框區(qū)相應(yīng)的保守區(qū)域。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述改良的植物生長(zhǎng)特性是相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物而言增加的產(chǎn)率。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述增加的產(chǎn)率是增加的種子產(chǎn)率。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述增加的產(chǎn)率選自(i)增加的種子生物量；(ii)增加的(飽滿)種子數(shù)；(iii)增加的種子大?。?iv)增加的種子體積；(v)增加的收獲指數(shù)；和(vi)增加的千籽粒重(TKW)。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述改良的植物生長(zhǎng)特性是增加的生長(zhǎng)速率。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼S3a的核酸來源于植物，優(yōu)選來源于雙子葉植物，還優(yōu)選來源于十字花科，更優(yōu)選該核酸來自于擬南芥。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼S3a的核酸序列在植物中過表達(dá)。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼S3a的核酸的表達(dá)由組成型啟動(dòng)子尤其是GOS2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
10.用于改良植物生長(zhǎng)特性尤其是產(chǎn)率特別是種子產(chǎn)率的方法，包括在植物中引入編碼S3a多肽或其變體的基因的基因座的遺傳修飾。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述遺傳修飾通過下列之一實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變、同源重組、TILLING、直接進(jìn)化和T-DNA激活。
12.可通過權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法獲得的植物。
13.構(gòu)建體，其包含(i)S3a編碼核酸；(ii)能驅(qū)動(dòng)(i)中核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
14.權(quán)利要求13的構(gòu)建體，其中所述控制序列包括至少一個(gè)組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選GOS2啟動(dòng)子。
15.用權(quán)利要求13或14的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。
16.用于生產(chǎn)具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)把S3a編碼核酸引入到植物或植物細(xì)胞中；(ii)在促進(jìn)再生和使植物生長(zhǎng)成熟的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
17.具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物，特征在于在所述植物中引入和表達(dá)編碼S3a蛋白的核酸序列。
18.權(quán)利要求12、15或權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗，或選自稻、玉米、小麥、大麥、大豆、高粱、向日葵、蕓苔、甘蔗、苜蓿、粟、大麥、油菜籽和棉花的禾谷類。
19.權(quán)利要求12、15、17或18中任一項(xiàng)的植物的可收獲部分。
20.權(quán)利要求19的植物的可收獲部分，其中所述的可收獲部分是種子。
21.S3a或S3a編碼核酸在改良植物的生長(zhǎng)特性尤其是提高產(chǎn)率特別是種子產(chǎn)率中的用途。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述種子產(chǎn)率包括如下一項(xiàng)或多項(xiàng)增加的(飽滿)種子數(shù)、增加的種子重量、增加的收獲指數(shù)和增加的TKW。
23.權(quán)利要求21或22的用途，其中所述S3a編碼核酸如SEQ ID NO1所示，而其中所述S3a是如SEQ ID NO2所示的氨基酸。
24.S3a或S3a編碼核酸作為分子標(biāo)志的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過在植物中引入和表達(dá)編碼S3a蛋白的核酸而改良植物的生長(zhǎng)特性的方法。本發(fā)明還涉及其中引入了編碼S3a蛋白的核酸的轉(zhuǎn)基因植物，該植物相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物具有改良的生長(zhǎng)特性。本發(fā)明還涉及可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1934259SQ200580009205
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月22日
發(fā)明者V·弗蘭卡德, D·杜迪斯, A·費(fèi)赫爾 申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司