專利名稱：用于在糖蛋白產(chǎn)生中減少或消除a－甘露糖苷酶抗性聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低等真核生物中蛋白質(zhì)糖基化工程領(lǐng)域。本發(fā)明進一步涉及用于治療性糖蛋白產(chǎn)生的酵母和絲狀真菌宿主細胞的工程改造。尤其，本發(fā)明涉及糖蛋白上a-甘露糖苷酶抗性聚糖的減少或消除，以及用于減少或除去酵母細胞中參與聚糖上a-甘露糖苷酶抗性的產(chǎn)生的基因。
背景技術(shù)：
產(chǎn)生重組人蛋白質(zhì)的能力引起人類健康護理的很大進步并且維持了活躍的藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域。許多治療性的蛋白質(zhì)需要聚糖翻譯后添加至蛋白質(zhì)特定的天冬酰胺殘基(N-糖基化)以確保適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)-功能活性以及在人血清中隨后的穩(wěn)定性。對于人中治療性的用途，糖蛋白需要人-樣N-糖基化?？赡M人-樣糖蛋白加工的哺乳動物細胞系(例如，CHO細胞、人視網(wǎng)膜細胞)具有一些缺點，包括低的蛋白質(zhì)效價、長的發(fā)酵時間、不同種類的產(chǎn)物以及連續(xù)的病毒抑制。因此希望使用不僅在短的發(fā)酵時間內(nèi)產(chǎn)生高蛋白質(zhì)，還可以產(chǎn)生人-樣糖蛋白的表達系統(tǒng)。
真菌宿主如親甲基醇酵母巴斯德畢赤氏酵母具有用于治療性蛋白質(zhì)表達的顯著優(yōu)點-例如其不分泌大量的內(nèi)源蛋白質(zhì)，其具有強的誘導(dǎo)型啟動子，它可在確定的化學(xué)培養(yǎng)基中生長，以及其可產(chǎn)生高效價的重組蛋白質(zhì)(Cregg等.，2000)。然而，P.pastoris中表達的糖基化蛋白質(zhì)包含產(chǎn)生“高甘露糖”聚糖的另外的甘露糖，以及在糖蛋白上提供負電荷的磷酸甘露糖基團。具有高甘露糖聚糖或帶電甘露聚糖的糖蛋白為禁止人中免疫應(yīng)答的高風(fēng)險(Takeuchi，1997；Rosenfeld和Ballou，1974)。因此，希望在真菌宿主系統(tǒng)中產(chǎn)生治療性的糖蛋白使得糖基化模式與人中的相同或至少類似。
有些真菌宿主包含糖蛋白的聚糖上免疫原性的b-甘露糖基化。為了避免抗原性，希望在人-樣糖蛋白產(chǎn)生中消除b-甘露糖基化。具有b-1，2-鍵的寡甘露糖苷首先由Shibata等.，(1985)描述，其通過磷酸二酯橋與白色念珠菌細胞壁磷肽甘露聚糖相連。隨后，已在念珠菌屬細胞壁甘露聚糖的側(cè)鏈中鑒定了三種類型的b-1，2鍵。第一種為位于磷酸二酯化低聚糖部分的b-1，2-連接的甘露-寡聚物，其為一些念珠菌屬種類的甘露聚糖中共同的表位(Shibata等.1993a)。第二種類型為附著于白色念珠菌、tropicalis和薄荷的甘露聚糖中a-1，2寡甘露糖基側(cè)鏈未還原末端的b-1，2-連接的甘露糖單元(Kobayashi等.，1989，1992和1994)。第三種類型的b-1，2鍵在季也蒙假絲酵母中發(fā)現(xiàn)并且包含附著于a-1，3連接的甘露糖單元的b-1，2連接的甘露糖單元(Shibata等.，1993b)。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，對b-1，2鍵的研究受到對鑒定b-1，2甘露糖基-轉(zhuǎn)移酶基因的失敗嘗試的限制。Suzuki等.，(1997)描述了季也蒙假絲酵母中b-1，2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的存在，然而該酶的基因還有待克隆。
在C.albicans酵母中，組成磷酸甘露聚糖復(fù)合物酸-不穩(wěn)定區(qū)的b-寡甘露糖苷和組成該復(fù)合物酸-穩(wěn)定區(qū)的a-寡甘露糖苷用作這些致病酵母細胞附著至宿主脾臟和淋巴結(jié)巨噬細胞的粘合素(Cutler，2001)。令人感興趣的是，保護免受各種形式念珠菌病的抗體識別b-連接的甘露三糖，而不是更大甘露糖鏈長的寡甘露糖苷(Han等.，1997)。據(jù)報導(dǎo)發(fā)展由C.albicans深度組織侵襲的患者不具有對于b-連接的寡甘露糖苷特異的可檢測抗體效價，而所述抗體存在于健康個體中(Jouault等.，1997)。
幾乎沒有來自P.pastoris的糖蛋白上b-連接的甘露糖殘基的例子。在1986年，Kobayashi等描述了用于主要由b-1，2連接的甘露糖殘基組成的甘露-低聚糖分離的具有溫和條件的改進的乙酰解方法。在2003年，Trimble等報道了P.pastoris中表達的重組人膽鹽-刺激的脂肪酶(hBSSL)中b-1，2-連接的甘露糖殘基的存在。如由未感染的個體中保護性抗體存在所證實的，b-連接的甘露聚糖很可能為免疫原性的。另外，治療性蛋白質(zhì)上暴露的甘露糖基團由巨噬細胞上的甘露糖受體快速清除，導(dǎo)致低的藥效。因此，考慮到其免疫原性潛力和其結(jié)合清除因子的能力，并不希望在真菌宿主例如，P.pastoris中表達的異種治療性蛋白質(zhì)N-或O-連接的聚糖上存在b-連接的甘露糖殘基。
因此需要的是用于除去糖蛋白上不想要的甘露糖殘基而用于治療性糖蛋白產(chǎn)生的方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供用于在酵母或絲狀真菌宿主細胞中產(chǎn)生糖蛋白組合物的方法，所述糖蛋白組合物具有高甘露糖聚糖減少的量，所述方法包含減少或消除所述糖蛋白上a-甘露糖苷酶抗性聚糖的存在。某些實施方案，減少或消除糖蛋白上a-甘露糖苷酶抗性聚糖由通過參與N-聚糖甘露糖基化基因的破壞、刪除或突變而修飾宿主細胞來實現(xiàn)。所述基因可包括例如，此處作為SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7或其變體而描述的基因序列。
某些實施方案中，a-甘露糖苷酶抗性的聚糖可包括b-甘露糖、分枝的高甘露糖或a-1，4甘露糖殘基。
本發(fā)明的宿主細胞優(yōu)選酵母和/或絲狀真菌來源的。本發(fā)明中有用的宿主細胞可包括下列科、屬和種巴斯德畢赤氏酵母、Pichiafinlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭畢赤氏酵母、Pichia methanolica、Pichia minuta(Ogataea minuta，Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、耐熱畢赤氏酵母、Pichi salictaria、Pichia guercum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia sp.、Saccharomyces castellii、釀酒酵母、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces sp.、多形漢遜酵母、克盧費氏酵母屬、乳酸克盧費氏酵母、白假絲酵母、假絲酵母屬、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、Trichoderma reesei、Chrysosporiumlucknowense、鐮刀菌屬、Fusarium gramineum、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens和粗糙鏈孢霉。
某些實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞可包括編碼α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的功能基因，如OCH1的缺失體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞可進一步包括編碼甘露糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的基因，如PNO1和MNN4B。
本發(fā)明還提供具有對a-甘露糖苷酶抗性的高甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)減少量的糖蛋白組合物，其可通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生。所述糖蛋白組合物可包括N-連接的聚糖和/或O-連接的聚糖。
本發(fā)明進一步提供分離的核酸序列，其參與a-甘露糖苷酶抗性聚糖的產(chǎn)生。這些分離的核酸序列包括此處作為SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7或其變體而描述的序列。本發(fā)明還包括與上述序列呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)相似性的另外的核酸序列。這些可包括例如，SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7的簡并變體以及與上述序列具有高水平核苷酸序列同一性的核酸序列。包括在本發(fā)明中的核酸序列因此將包括具有與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7的序列至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、99％、99.9％同一性的那些核酸序列，以及編碼具有通過SEQ ID NO1、SEQIDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7所產(chǎn)生氨基酸序列的多肽的核酸序列；編碼具有與通過SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8產(chǎn)生的氨基酸序列至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、98％、99％、99.9％同一性的多肽的核酸序列；以及在嚴謹條件下與如SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7所述的一種或多種核酸序列雜交的核酸序列。本發(fā)明還包括包含至少60個連續(xù)核苷酸長度的任何上述核酸序列的片段的核酸序列。
仍然在另一個實施方案中，本發(fā)明提供修飾的酵母或絲狀真菌宿主細胞。本發(fā)明的宿主細胞可表征為經(jīng)修飾而降低選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7的一種或多種核酸序列的功能基因產(chǎn)物的表達。某些實施方案中，修飾的宿主細胞包括選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7的一種或多種核酸序列的破壞、缺失或突變。另一個實施方案中，修飾的宿主細胞包括選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7或其變體的核酸的功能基因產(chǎn)物表達的細胞抑制劑?？捎糜诒景l(fā)明表達的細胞抑制劑包括例如，反義DNA和短的干擾RNA。
另一個實施方案中，本發(fā)明可包括修飾的酵母或絲狀真菌宿主細胞，其能表達具有高甘露糖聚糖減少量的糖蛋白組合物，所述糖蛋白組合物包括a-甘露糖苷酶抗性的聚糖，例如-甘露糖基殘基存在的減少。
附圖簡述

圖1描述了P.pastoris AMR2基因的核酸和氨基酸序列。
圖2 A.顯示P.pastoris YAS137(Doch1、Dpno1、Dmnn4b)N-聚糖的MALDI-TOF MS。B.顯示P.pastoris YAS137的N-聚糖用a-1，2甘露糖苷酶消化后的MALDI-TOF MS。C.顯示P.pastoris PBP130(Doch1、Dpno1、Dmnn4b、Damr2)N-聚糖的MALDI-TOF MS。D.顯示P.pastoris PBP130(Doch1、Dpno1、Dmnn4b、Damr2)的N-聚糖用a-1，2甘露糖苷酶消化后的MALDI-TOF MS。
圖3 P.pastoris YAS137的N-聚糖用a-1，2甘露糖苷酶和刀豆甘露糖苷酶消化后的MALDI-TOF MS譜。
圖4說明了利用抗藥性標記，卡那霉素的P.pastoris AMR2的融合PCR敲除策略。
圖5 P.pastoris AMR2基因推導(dǎo)的氨基酸序列與來自白假絲酵母的AMR2同源物相比對而顯示。
發(fā)明詳述除非此處另外定義，所用與本發(fā)明有關(guān)的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常了解的含義。此外，除非上下文另外要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)情況并且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)情況。通常，此處所述的生物化學(xué)、酶學(xué)、分子和細胞生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)和雜交的技術(shù)以及所用與此相關(guān)的命名為本領(lǐng)域所熟知并且通常在本領(lǐng)域中使用。本發(fā)明的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法以及在各種常規(guī)和更具體的參考文獻中所述的而進行，除非另有陳述，其在整個說明書中引用并且討論。參見例如.，Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel等.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates(1992，and Supplements to 2002)；Harlow andLane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)；Taylor andDrickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，F(xiàn)reehold，NJ；Handbook of BiochemistrySection A Proteins，Vol I，CRC Press(1976)；Handbook of BiochemistrySection A Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1999)。
此處提及的所有出版物、專利和其他的參考文獻在此通過引用整體引入。
除非另有陳述，下列術(shù)語應(yīng)該理解為具有下列含義術(shù)語“多核苷酸”或“核酸分子”指至少10個堿基長度的核苷酸的聚合形式。該術(shù)語包括DNA分子(例如，cDNA或基因組或合成的DNA)和RNA分子(例如，mRNA或合成的RNA)，以及包含非天然核苷酸類似物、非天然核苷酸間鍵或兩者的DNA或RNA類似物。核酸可以是任何拓撲構(gòu)象。例如，核酸可以是單鏈的、雙鏈的、三鏈的、四體的、部分雙鏈的、分枝的、發(fā)夾的、環(huán)狀的或掛鎖構(gòu)象的。
除非另有陳述，“包括SEQ ID NOX的核酸”指其至少一部分具有(i)SEQ ID NOX的序列，或(ii)SEQ ID NOX互補序列的核酸。兩者間的選擇通過上下文規(guī)定。例如，如果該核酸用作探針，兩者間的選擇通過探針與所希望的靶標互補的要求而限定。
“分離的”或“基本上純的”核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合聚合物)為基本上與其天然宿主細胞中天然伴隨該天然(native)多核苷酸的其他細胞組分相分離的核酸或多核苷酸，例如其天然結(jié)合的核糖體、聚合酶和基因組序列。該術(shù)語包含這樣的核酸或多核苷酸，其(1)已從其天然存在的環(huán)境移出，(2)與自然界中該“分離的多核苷酸”發(fā)現(xiàn)于其中的多核苷酸的所有或一部分不相結(jié)合，(3)與自然狀態(tài)下其不與之連接的多核苷酸可操作連接或(4)自然界不存在。術(shù)語“分離的”或“基本上純的”還可用于指重組或克隆的DNA分離物、化學(xué)合成的多核苷酸類似物或通過異種系統(tǒng)生物學(xué)合成的多核苷酸類似物。
然而，“分離的”不一定要求如此所述的核酸或多核苷酸本身從其自然環(huán)境中物理地移出。例如，如果異源序列置于內(nèi)源核酸序列的附近，使得該內(nèi)源核酸序列的表達改變，則生物體基因組中的該內(nèi)源核酸序列在此認為是“分離的”。在這里，異源序列為不天然接近該內(nèi)源核酸序列的序列，而不管該異源序列本身是否是內(nèi)源的(源于相同的宿主細胞或其子代)或外源的(源于不同的宿主細胞或其子代)。舉例來說，啟動子序列可用于代替(例如，通過同源重組)宿主細胞基因組中天然的基因啟動子，使得該基因具有改變的表達模式。該基因目前將成為“分離的”，因為其與天然位于其側(cè)翼的至少一些序列分離開。
如果核酸包含基因組中相應(yīng)核酸并不天然存在的任何修飾，則其也認為是“分離的”。例如，如果內(nèi)源的編碼序列包含人工，例如通過人為干預(yù)引入的插入、缺失或點突變，則其認為是“分離的”?！胺蛛x的核酸”還包括在異種(heterologous)部位整合入宿主細胞染色體的核酸以及作為游離基因存在的核酸構(gòu)建體。此外，“分離的核酸”可基本上無其他的細胞材料，或當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時基本上無培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時基本上無化學(xué)前體或其他化學(xué)試劑。
如此處所用的，短語對照核酸序列的“簡并變體”包括可根據(jù)標準遺傳密碼翻譯而提供與翻譯自對照核酸序列的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。術(shù)語“簡并寡核苷酸”或“簡并引物”用于表示能與靶核酸序列雜交的寡核苷酸，其不一定在序列上相同但在一個或多個特定的片段內(nèi)相互是同源的。
在核酸序列的上下文中，術(shù)語“序列同一性的百分比”或“同一的”指兩個序列中的殘基當(dāng)用于最大對應(yīng)比對時是相同的。序列同一性比較的長度可超過至少約九個核苷酸，通常至少約20個核苷酸，更通常至少約24個核苷酸，典型地至少約28個核苷酸，更典型地至少約32個核苷酸，并且優(yōu)選至少約36或更多核苷酸的范圍。本領(lǐng)域有許多已知可用于測量核苷酸序列同一性的不同算法。例如，多核苷酸序列可利用FASTA、Gap或Bestfit比較，其為Wisconsin PackageVersion 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序。FASTA提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對以及序列同一性百分比。Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)(在此通過引用整體引入)。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可利用FASTA以缺省參數(shù)(字長為6以及計分矩陣的NOPAM因數(shù))或利用Gap以GCG Version 6.1提供的缺省參數(shù)確定，在此通過引用引入?；蛘?，序列可利用計算機程序，BLAST(Altschul等.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3266-272(1993)；Madden等.，Meth.Enzymol.266131-141(1996)；Altschul等.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)；Zhang andMadden，Genome Res.7649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))比較。
如上所述，當(dāng)指核酸或其片段時，術(shù)語“顯著的同源性”或“顯著的相似性”表明，當(dāng)與另一個核酸(或其互補鏈)以適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔Ф罴驯葘r，如通過任何熟知的序列同一性算法測量的，如FASTA、BLAST或Gap，存在核苷酸堿基的至少約50％、更優(yōu)選核苷酸堿基的60％、通常至少約70％、更通常至少約80％、優(yōu)選至少約90％以及更優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性。
或者，當(dāng)核酸或其片段在嚴謹雜交條件下雜交至另一核酸、至另一核酸的鏈，或至其互補鏈時，存在顯著的同源性或相似性。核酸雜交實驗上下文中的“嚴謹雜交條件”和“嚴謹洗滌條件”取決于許多不同的物理參數(shù)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的，核酸雜交將受以下條件如鹽濃度、溫度、溶劑、雜交種類的堿基組成、互補區(qū)域的長度以及雜交核酸之間錯配核苷酸堿基的數(shù)目的影響。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道如何變化這些參數(shù)以實現(xiàn)特定的雜交嚴謹度。
通常，“嚴謹雜交”在特定的條件設(shè)置下，在低于具體DNA雜交物的熱熔點(Tm)約25℃時進行?！皣乐斚礈臁痹谔囟ǖ臈l件設(shè)置下，在比具體DNA雜交物Tm低約5℃的溫度進行。Tm為50％的靶序列雜交至完全匹配的探針時的溫度。參見Sambrook等.，Molecular CloningALaboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，page 9.51，在此通過引用引入。對于此處的目的，液相雜交的“嚴謹條件”定義為在6X SSC(其中20X SSC包含3.0 M NaCl和0.3 M檸檬酸鈉)，1％SDS中，在65℃ 8-12小時的水相雜交(即無甲酰胺)，隨后為0.2XSSC，0.1％SDS中65℃ 20分鐘兩次洗滌。技術(shù)工作者將理解取決于許多因數(shù)包括雜交序列的長度和同一性百分比，在65℃將存在不同速率的雜交。
本發(fā)明的核酸(也稱為多核苷酸)可包括RNA、cDNA、基因組DNA和上述的合成形式和混合聚合物的正義和反義鏈。如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的，其可經(jīng)化學(xué)或生化修飾或可包含非天然的或衍生的核苷酸堿基。所述修飾包括，例如，標記、甲基化、一種或多種天然存在的核苷酸用類似物的取代、核苷酸間修飾如不帶電的連接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等等)、帶電的連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)、懸掛的部分(pendentmoieties)(例如，多肽)、嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等等)、螯合劑、烷化劑和經(jīng)修飾的連接(例如，α異頭核酸等等)。此外包括的為合成的分子，其模擬多核苷酸通過氫鍵作用和其他化學(xué)相互作用結(jié)合指定序列的能力。所述分子在本領(lǐng)域中已知并且包括例如，其中肽鍵代替該分子主鏈中磷酸酯鍵的那些。其他的修飾可包括例如類似物，其中核糖環(huán)包含橋部分或其他結(jié)構(gòu)如“掛鎖”(locked)核酸中發(fā)現(xiàn)的修飾。
術(shù)語“突變的”當(dāng)應(yīng)用于核酸序列時指相比對照核酸序列，可插入、缺失或改變核酸序列中的核苷酸。在一個位點可產(chǎn)生單個改變(點突變)或在單個位點可插入、缺失或改變多個核苷酸。此外，可在核酸序列內(nèi)的任何數(shù)目的位點產(chǎn)生一個或多個改變。核酸序列可通過本領(lǐng)域已知的任何方法突變，包括但不限于誘變技術(shù)如“易錯PCR”(用于在其中DNA聚合酶的復(fù)制保真度較低，使得順著PCR產(chǎn)物的全長獲得高比率的點突變的條件下進行PCR的方法；參見例如.，Leung等l.，Technique，111-15(1989)和Caldwell and Joyce，PCR MethodsApplic.228-33(1992))；以及“寡核苷酸指導(dǎo)的誘變”(能在任何克隆的目的DNA片段中產(chǎn)生位點特異性突變的方法；參見例如，Reidhaar-Olson and Sauer，Science 24153-57(1988))。
如此處所用的術(shù)語“載體”用來指能轉(zhuǎn)運與之連接的另一個核酸的核酸分子。載體的一種類型為“質(zhì)粒”，指另外的DNA片段可以連接進入其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。其他的載體包括粘粒、細菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)。載體的另一種類型為病毒載體，其中另外的DNA片段可連接進入該病毒基因組(底下更詳細地論述)。某些載體能在它所導(dǎo)入的宿主細胞中自主復(fù)制(例如，具有在宿主細胞中起作用的復(fù)制起點的載體)。其他的載體可在導(dǎo)入宿主細胞后整合入宿主細胞的基因組中，并且由此隨著宿主基因組一起重復(fù)。此外，某些優(yōu)選的載體能指導(dǎo)與之可操作連接的基因的表達。所述載體此處稱為“重組表達載體”(或簡單地稱為“表達載體”)。
如此處所用的，術(shù)語“目的序列”或“目的基因”指核酸序列，一般編碼通常不在宿主細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。此處公開的方法允許一個或多個目的序列或目的基因整合入宿主細胞基因組中。優(yōu)選的整合位點為AMR2基因座。目的序列的非-限制性例子包括編碼具有酶活性的一種或多種多肽的序列，例如影響N-聚糖在宿主中合成的酶如甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙?；咸前忿D(zhuǎn)移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運蛋白、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶以及唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
如此處所用的，術(shù)語“治療性糖蛋白”包括促紅細胞生成素、細胞因子如干擾素-a、干擾素-b、干擾素-g、干擾素-w和粒細胞-CSF、GM-CSF、凝血因子如凝血因子III、凝血因子IX以及人蛋白質(zhì)C、抗凝血酶III、凝血酶、可溶的IgE受體a-鏈、IgG、IgG片段、IgG融合蛋白、IgM、白介素、尿激酶、Chymase、和尿素胰蛋白酶抑制劑、IGF-結(jié)合蛋白、表皮生長因子、生長激素釋放因子、annexin V融合蛋白、血管抑素、血管內(nèi)皮生長因子-2、骨髓祖抑制因子-1、骨保護素(osteoprotegerin)、a-1-抗胰蛋白酶、a-胚胎蛋白、DNase II、人纖溶酶原的kringle 3、葡糖腦苷脂酶、TNF結(jié)合蛋白1、促卵泡激素、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4-Ig、跨膜活化劑和鈣調(diào)節(jié)劑以及親環(huán)素配體、可溶的TNF受體Fc融合蛋白、高血糖素-樣蛋白1、IL-2受體激動劑。
“可操作連接的”表達調(diào)控序列指其中表達調(diào)控序列與目的基因相鄰近以控制目的基因的連接，以及以反式或在一定的距離內(nèi)作用而控制目的基因的表達調(diào)控序列。
如此處所用的術(shù)語“表達調(diào)控序列”指影響與之可操作連接的編碼序列的表達所必需的多核苷酸序列。表達調(diào)控序列為控制核酸序列轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后事件以及翻譯的序列。表達調(diào)控序列包括合適的轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效的RNA加工信號如剪接和聚腺苷酸化信號；穩(wěn)定胞質(zhì)mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(例如，核糖體結(jié)合位點)；增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；以及當(dāng)需要時，增強蛋白質(zhì)分泌的序列。所述調(diào)控序列的性質(zhì)因宿主生物體而不同；原核生物中，所述調(diào)控序列通常包括啟動子、核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語“調(diào)控序列”用來包括，至少其存在是用于表達必不可少的所有組分，并且還可以包括其存在是有利的另外的組分，例如前導(dǎo)序列和融合配偶體序列。
如此處所用的，術(shù)語“重組宿主細胞”(或簡單地稱“宿主細胞”)用來指其中已導(dǎo)入重組載體的細胞。應(yīng)該理解的是所述術(shù)語不僅用來指特定的主題細胞(subject cell)而且指所述細胞的子代。因為由于突變或者環(huán)境影響而造成某些修飾可能在繼代中存在，實際上所述子代可能不同于親本細胞，但仍然包括在如此處所用的術(shù)語“宿主細胞”的范圍內(nèi)。重組宿主細胞可以是分離的細胞或培養(yǎng)基中生長的細胞系或可以是存在于活組織或生物體中的細胞。
如此處所用的術(shù)語“肽”指短的多肽，例如通常小于約50個氨基酸長并且更通常小于約30個氨基酸長的多肽。如此處所用的術(shù)語包括模擬結(jié)構(gòu)并且因此具有生物學(xué)功能的類似物和模擬物。
術(shù)語“多肽”包括天然-存在的和非-天然-存在的蛋白質(zhì)，以及其片段、突變體、衍生物和類似物。多肽可以是單體的或多聚體的。此外，多肽可包括許多不同的結(jié)構(gòu)域，每個具有一種或多種不同的活性。
術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”或“分離的多肽”為根據(jù)其來源或衍生來源的蛋白質(zhì)或多肽，其(1)與在天然狀態(tài)下伴隨其的天然締合的組分不相締合，(2)以自然界未發(fā)現(xiàn)的純度存在，其中可根據(jù)其他細胞材料的存在判定純度(例如，無來自相同種的其他蛋白質(zhì))(3)通過來自不同種的細胞表達，或(4)自然界不存在(例如，其為自然界中發(fā)現(xiàn)的多肽的片段或其包括自然界中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸類似物或衍生物或不是標準肽鍵的連接)。因此，化學(xué)合成的或在不同于多肽天然來源的細胞的細胞系統(tǒng)中合成的多肽將是與其天然締合組分相“分離的”。利用本領(lǐng)域熟知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，還可通過分離使多肽或蛋白質(zhì)基本上無天然締合組分(naturally associated components)。如由此定義的，“分離的”不一定要求如此描述的該蛋白質(zhì)、多肽、肽或寡肽已從其天然環(huán)境中物理移出。
如此處所用的術(shù)語“多肽片段”指具有缺失，例如相比全長多肽具有氨基-端和/或羧基-端缺失的多肽。在一優(yōu)選的實施方案中，該多肽片段為其中該片段的氨基酸序列與天然存在序列的相應(yīng)位點相同的連續(xù)序列。片段通常至少5、6、7、8、9或10個氨基酸長，優(yōu)選至少12、14、16或18個氨基酸長，更優(yōu)選至少20個氨基酸長，更優(yōu)選至少25、30、35、40或45個氨基酸，甚至更優(yōu)選至少50或60個氨基酸長，并且甚至更優(yōu)選至少70個氨基酸長。
“修飾的衍生物”指多肽或其片段，其初級結(jié)構(gòu)序列基本上同源但其包括例如，體內(nèi)或體外的化學(xué)和生化修飾或其摻入天然多肽中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的，所述修飾包括例如，乙酰化、羧基化、磷酸化、糖基化、泛素化、標記，例如用放射性核素標記，以及各種酶促修飾。用于標記多肽的各種方法以及可用于所述目的的取代基或標記物為本領(lǐng)域所熟知，并且包括放射性同位素如125I、32P、35S和3H、結(jié)合被標記抗配體的配體(例如，抗體)、熒光團、化學(xué)發(fā)光劑、酶以及可用作被標記配體的特異性結(jié)合對成員的抗配體。標記物的選擇取決于所需要的靈敏度、與引物結(jié)合的容易度、穩(wěn)定性要求和可得到的設(shè)備。用于標記多肽的方法為本領(lǐng)域所熟知。參見，例如.，Ausubel 等.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，and Supplements to 2002)(在此通過引用引入)。
術(shù)語“融合蛋白”指包括偶聯(lián)至異種氨基酸序列的多肽或片段的多肽。融合蛋白由于其可被構(gòu)建而包含來自兩種或更多不同的蛋白質(zhì)的兩種或更多所需的功能元件而是有用的。融合蛋白包括來自目的多肽的至少10個連續(xù)的氨基酸，更優(yōu)選至少20或30個氨基酸，甚至更優(yōu)選至少40、50或60個氨基酸，而更優(yōu)選至少75、100或125個氨基酸。包括本發(fā)明蛋白質(zhì)整體的融合蛋白具有特定的功用。包括在本發(fā)明融合蛋白內(nèi)的異種多肽為至少6個氨基酸長度，常常至少8個氨基酸長度，并且有用地至少15、20和25個氨基酸長度。包括更大多肽如IgG Fc區(qū)域，以及甚至整個蛋白質(zhì)的融合蛋白，如包含綠色熒光蛋白(“GFP”)生色團的蛋白質(zhì)具有特定的功用。融合蛋白可通過將編碼多肽或其片段的核酸序列與編碼不同蛋白質(zhì)或肽的核酸序列構(gòu)建在讀框內(nèi)并且隨后表達該融合蛋白而重組產(chǎn)生?；蛘撸诤系鞍卓赏ㄟ^將多肽或其片段交聯(lián)至另一種蛋白質(zhì)而以化學(xué)方法產(chǎn)生。
如此處所用的，術(shù)語“抗體”指其至少一部分由至少一種免疫球蛋白基因編碼的多肽，或其片段，并且其可特異性結(jié)合所想要的靶分子。該術(shù)語包括天然-存在的形式，以及片段和衍生物。
在該術(shù)語“抗體”范圍內(nèi)的片段包括通過用各種蛋白酶消化產(chǎn)生的、通過化學(xué)裂解和/或化學(xué)解離產(chǎn)生的以及重組產(chǎn)生的，只要該片段保持能特異性結(jié)合靶分子即可。所述片段為Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2和單鏈Fv(scFv)片段。
在該術(shù)語范圍內(nèi)的衍生物包括在序列上已被修飾，但仍然能特異性結(jié)合靶分子的抗體(或其片段)，包括種間嵌合的和人源化的抗體；抗體融合物；異抗體復(fù)合物和抗體融合物，如雙抗體(雙特異性抗體)、單鏈雙抗體和內(nèi)體(參見，例如.，Intracellular AntibodiesResearch and Disease Applications，(Marasco，ed.，Springer-VerlagNew York，Inc.，1998)，其公開內(nèi)容在此通過引用整體引入)。
如此處所用的，抗體可通過任何已知的技術(shù)產(chǎn)生，包括收集自天然B淋巴細胞的細胞培養(yǎng)物，收集自雜交瘤、重組表達系統(tǒng)和噬菌體展示的培養(yǎng)物。
術(shù)語“非-肽模擬物”指具有類似于對照多肽性質(zhì)的化合物。非-肽化合物還可稱為“肽模擬物”或“模擬肽”。參見，例如，Jones，Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford University Press(1992)；Jung，Combinatorial Peptide and Nonpeptide LibrariesAHandbook，John Wiley(1997)；Bodanszky等.，Peptide Chemistry--A PracticalTextbook，Springer Verlag(1993)；Synthetic PeptidesA Users Guide，(Grant，ed.，W.H.Freeman and Co.，1992)；Evans等.，J.Med.Chem.301229(1987)；Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber and Freidinger，Trends Neurosci.，8392-396(1985)；以及以上引用的每篇參考文獻，其在此通過引用引入。所述化合物常常借助于計算機分子建模開發(fā)。結(jié)構(gòu)類似于本發(fā)明有用的肽的肽模擬物可用于產(chǎn)生同等的作用并且因此設(shè)想屬于本發(fā)明。
“多肽突變體”或“突變蛋白”指相比天然的或野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其序列包含一個或多個氨基酸的插入、重復(fù)、缺失、重排或取代的多肽。突變蛋白可具有一個或多個氨基酸點取代，其中該位點的單個氨基酸已改變至另一種氨基酸，一個或多個插入和/或缺失，其中一個或多個氨基酸分別在天然-存在的蛋白質(zhì)序列中插入或缺失，和/或該氨基酸序列氨基或羧基末端或兩者的截短物。相比天然-存在的蛋白質(zhì)，突變蛋白可具有相同的但優(yōu)選具有不同的生物學(xué)活性。
突變蛋白具有與其野生型對應(yīng)物至少65％總的序列同源性。甚至更優(yōu)選的為具有與野生型蛋白質(zhì)至少70％、75％、80％、85％或90％總的序列同源性的突變蛋白。在更優(yōu)選的實施方案中，突變蛋白呈現(xiàn)至少95％的序列同一性，甚至更優(yōu)選98％，甚至更優(yōu)選99％并且甚至更優(yōu)選99.9％總的序列同一性。序列同源性可通過任何常用的序列分析算法，如Gap或Bestfit測量。
氨基酸取代可包括那些，其(1)降低對蛋白質(zhì)水解的敏感性，(2)降低對氧化作用的敏感性，(3)改變結(jié)合親和力而用于形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，(4)改變結(jié)合親和力或酶活性，以及(5)給予或改進所述類似物的其他物理化學(xué)的或功能性的性質(zhì)。
如此處所用的，二十種常規(guī)氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)用法。參見Immunology-A Synthesis(Golub and Gren eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.，2nded.1991)，其在此通過引用引入。二十種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸如α-、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸以及其他的非常規(guī)氨基酸也可以為本發(fā)明多肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸的例子包括4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基精氨酸以及其他的類似氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥脯氨酸)。在此處所用的多肽注釋中，根據(jù)標準用法和慣例，左-側(cè)末端對應(yīng)氨基-末端而右-側(cè)末端對應(yīng)羧基-末端。
如果編碼蛋白質(zhì)的核酸序列具有與編碼第二種蛋白質(zhì)的核酸序列類似的序列，則該蛋白質(zhì)與第二種蛋白質(zhì)具有“同源性”或與之“同源的”?；蛘?，如果兩種蛋白質(zhì)具有“類似的”氨基酸序列，則一種蛋白質(zhì)與第二種蛋白質(zhì)具有同源性。(因此，術(shù)語“同源蛋白質(zhì)”定義指兩種蛋白質(zhì)具有類似的氨基酸序列。)在一優(yōu)選的實施方案中，同源蛋白質(zhì)對野生型蛋白質(zhì)呈現(xiàn)至少72％的序列同源性，更優(yōu)選至少75％的序列同源性。甚至更優(yōu)選的為具有與野生型蛋白質(zhì)至少80％、85％、90％或95％序列同源性的同源蛋白質(zhì)。在又一個更優(yōu)選的實施方案中，同源蛋白質(zhì)呈現(xiàn)至少96％、98％、99％或99.9％的序列同一性。如此處所用的，兩個氨基酸序列區(qū)域之間的同源性(尤其關(guān)于預(yù)測的結(jié)構(gòu)相似性)解釋為暗示功能的相似性。
當(dāng)“同源的”用于指蛋白質(zhì)或肽時，公認的是不相同的殘基位點常常以保守的氨基酸取代而不同?！氨Ｊ氐陌被崛〈睘槠渲邪被釟埢删哂蓄愃苹瘜W(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)側(cè)鏈(R基團)的另一種氨基酸殘基取代的取代。通常，保守的氨基酸取代基本上不會改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。如果兩個或更多氨基酸序列彼此通過保守取代而不同，可調(diào)高序列同一性的百分比或同源性程度以修正保守的取代性質(zhì)。用于進行該調(diào)節(jié)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。參見，例如.，Pearson，1994，Methods Mol.Biol.24307-31 and 25365-89(此處通過引用引入)。
下列六組每組包含彼此為保守取代的氨基酸1)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)，和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
多肽的序列同源性，也稱為序列同一性百分比，通常利用序列分析軟件測量。參見，例如.，Genetics Computer Group(GCG)的序列分析軟件包，University of Wisconsin Biotechnology Center，910University Avenue，Madison，Wisconsin 53705。蛋白質(zhì)分析軟件利用指定至各種取代、缺失和其他修飾，包括保守氨基酸取代的同源性測量而匹配相似的序列。例如，GCG包含如“Gap”和“Bestfit”的程序，其以缺省參數(shù)使用以確定緊密相關(guān)的多肽之間，如來自不同生物體種類的同源多肽或野生型蛋白質(zhì)和其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參見，例如.，GCG Version 6.1。
當(dāng)將特定的多肽序列與包含來自不同生物體的大量序列的數(shù)據(jù)庫比較時優(yōu)選的算法為計算機程序BLAST(Altschul等.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3266-272(1993)；Madden等.，Meth.Enzymol.266131-141(1996)；Altschul 等.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)；Zhang andMadden，Genome Res.7649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))。
用于BLASTp的優(yōu)選的參數(shù)為期望值10(缺省)；過濾器seg(缺省)；開放間隙的成本11(缺省)；延長間隙的成本1(缺省)；最大對比100(缺省)；字長11(缺省)；描述的編號100(缺省)；罰分矩陣BLOWSUM62。
比較同源性的多肽序列長度通常為至少約16個氨基酸殘基，通常至少約20個殘基，更通常至少約24個殘基，一般至少約28個殘基，并且優(yōu)選超過約35個殘基。當(dāng)搜索包含來自大量不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫時，優(yōu)選比較氨基酸序列。利用氨基酸序列搜索數(shù)據(jù)庫可通過本領(lǐng)域已知的blastp以外的算法測量。例如，多肽序列可利用FASTA比較，GCG Version 6.1中的程序。FASTA提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分比。Pearson，MethodsEnzymol.18363-98(1990)(此處通過引用引入).例如，氨基酸序列之間的序列同一性百分比可利用如GCG Version 6.1提供的FASTA以缺省參數(shù)(字長為2以及PAM250計分矩陣)確定，在此通過引用引入。
“特異性結(jié)合”指兩種分子先于結(jié)合環(huán)境中其他的分子而相互結(jié)合的能力。一般，“特異性結(jié)合”區(qū)別超過反應(yīng)中偶發(fā)的結(jié)合至少兩倍，更通常至少10倍，常常至少100倍。通常，如通過解離常數(shù)定量的，特異性結(jié)合反應(yīng)的親和力或親合力為約10-7M或更強(例如，約10-8M，10-9M或甚至更強)。
如此處所用的術(shù)語“區(qū)域”指生物分子一級結(jié)構(gòu)的物理上連續(xù)的部分。在蛋白質(zhì)的情況下，區(qū)域定義為蛋白質(zhì)氨基酸序列的連續(xù)部分。
如此處所用的術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”指對生物分子已知或懷疑的功能有貢獻的生物分子的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域可以是與區(qū)域或其部分具有共同邊界(coextensive)；也可包括生物分子不同的、非-連續(xù)的區(qū)域。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的例子包括但不限于，Ig結(jié)構(gòu)域、胞外域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
如此處所用的，術(shù)語“分子”指任何化合物，包括但不限于，小分子、肽、蛋白質(zhì)、糖、核苷酸、核酸、脂類等等，并且所述化合物可以為天然的或合成的。
如此處所用的術(shù)語“高甘露糖”指糖蛋白上的聚糖結(jié)構(gòu)，其通過酵母和/或絲狀真菌種類天然產(chǎn)生，并且通常具有八個或更多的甘露糖殘基。
如此處所用的，術(shù)語“分子”指任何化合物，包括但不限于，小分子、肽、蛋白質(zhì)、糖、核苷酸、核酸、脂類等等，并且所述化合物可以為天然的或合成的。
術(shù)語“a-甘露糖苷酶抗性的聚糖”和“抗性的a-甘露糖聚糖”在此可互換使用并且指糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)，其對α-甘露糖苷酶，如a-1，2；a-1，3；和/或a-1，6-甘露糖苷酶裂解為全部或部分抗性的。抗性的a-甘露糖聚糖可包括b-甘露糖、分枝的高甘露糖、a-1，4甘露糖或未表征的甘露糖。這些聚糖結(jié)構(gòu)因此提供提高的高甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)的存在。
除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所涉及技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的意思。典型的方法和材料描述如下，雖然與所述的那些相似的或等效的方法和材料也可用于本發(fā)明的實踐并且其對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。此處提及的所有出版物、專利和其他的參考文獻在此通過引用整體引入。如有沖突，以包括定義的本說明書為準。材料、方法和實施例僅是解釋性的而并不試圖作為限制。
貫穿本說明書和權(quán)利要求書，單詞“包括”或變體如“包括”或“包括”將理解為暗示包含所述的整數(shù)或整數(shù)組而不是排除任何其他的整數(shù)或整數(shù)組。
a-甘露糖苷酶抗性基因的鑒定在致力于在真菌系統(tǒng)中表達人-樣糖蛋白的努力中，需要消除非-人糖基化。真菌糖基化以高甘露糖/非-人聚糖為特征。確定甘露糖基化的類型通常為消除不想要的糖基化事件的第一步。P.pastoris中OCH1的缺失引起高甘露糖基化的降低(Choi等.，2003)。通過負性MALDI-TOF MS的分析揭示負電荷的存在與這些甘露糖基團有關(guān)。推定的甘露糖基磷酸鹽轉(zhuǎn)移酶基因，PNO1和MNN4B隨后的缺失產(chǎn)生甘露糖基磷酸鹽缺乏的菌株(圖2A)(美國申請系列No.11/020，808)。殘留的甘露糖基團通過a-1，2甘露糖苷酶和刀豆甘露糖苷酶的消化進一步降低甘露聚糖的大小(圖2B，圖3)(實施例1)。盡管這些基因用a-甘露糖苷酶破壞和消化，多至20％的N-聚糖仍然維持抗性。根據(jù)糖成分分析，以及這些甘露糖基團對a-1，2甘露糖苷酶和刀豆甘露糖苷酶(a-1，2/a-1，3/a-1，6)的抗性，推斷這些甘露糖結(jié)構(gòu)為分枝的b-甘露糖、高甘露糖、a-1，4甘露糖或未表征的甘露糖。
最初假定這些抗性甘露聚糖產(chǎn)生于甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并且因此推測負責(zé)這些抗性甘露聚糖的該基因(或多個基因)與其他的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因有一些同源性。來自釀酒酵母MNN4基因的C末端序列用于探測P.pastoris的基因組(實施例2)。通過選擇編碼推定的II型膜蛋白的基因(并且因此，可在高爾基體膜上發(fā)現(xiàn))，鑒定了一個基因，當(dāng)其被破壞時，在用a-1，2甘露糖苷酶消化后，消除抗性的甘露聚糖(圖2D)。我們命名該基因為AMR2(α-甘露糖苷酶抗性的)。因此，如圖1中所述，本發(fā)明公開了參與糖蛋白甘露糖基化的P.pastoris基因。
核酸序列本發(fā)明的一個方面中，鑒定并且測序了P.pastoris中參與N-聚糖(其對已知的a-甘露糖苷酶具有抗性)甘露糖基化的基因(圖1，實施例2)。在一實施方案中，提供編碼P.pastoris AMR2基因及其變體的核酸序列。P.pastoris AMR2基因的破壞尤其利于酵母菌株中糖蛋白上a-甘露糖苷酶-抗性聚糖的減少或消除。在另一實施方案中，本發(fā)明提供包括或由序列組成的核酸分子，該序列為與SEQ ID NO1具有至少72％同一性的P.pastoris AMR2基因的變體。核酸序列優(yōu)選具有與野生型基因的至少75％、80％或85％的同一性。更優(yōu)選，核酸序列具有對SEQ ID NO1的90％、95％、99％、99.9％或甚至更高的同一性。
根據(jù)本發(fā)明其他的實施方案，本發(fā)明的核酸分子編碼具有圖1中顯示的氨基酸序列的多肽。還提供編碼對SEQ ID NO2至少72％同一性的多肽序列的核酸分子。通常，本發(fā)明核酸分子編碼對SEQ IDNO2至少75％、80％或85％同一性的多肽序列。更優(yōu)選，編碼的多肽具有對SEQ ID NO2的90％、95％、98％、99％、99.9％或甚至更高的同一性。
本發(fā)明的另一個方面中，參與N-聚糖的a-甘露糖苷酶-抗性甘露糖基化的AMR2基因與P.pastoris中的三個另外的基因同源-AMR1、AMR3、AMR4(圖5)，并且具有對下列種類中基因的同源區(qū)域白假絲酵母中的11個基因，(圖5中顯示八個)；Saccharomyces castellii株系NRRL Y-12630中的八個基因；Saccharomyces kluyveri株系NRRL Y-12651中的兩個基因，以及煙曲霉中的三個基因(實施例3)。對于減少或消除其他物種中抗性的a-甘露糖聚糖，本領(lǐng)域技術(shù)人員可鑒定來自給定物種基因組的AMR2同源物，并且破壞該同源基因或多個基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解破壞任何給定的物種中發(fā)現(xiàn)的所有同源基因，或同源基因的組合可能是必要的。更具體地，熟練技術(shù)人員認識到為了減少或消除其他物種中a-甘露糖苷酶抗性的N-聚糖，可根據(jù)保守序列設(shè)計用于AMR2同源物PCR克隆的簡并引物。或者還可構(gòu)建用于AMR2同源物雜交的探針。
宿主細胞本發(fā)明的另一方面中，產(chǎn)生糖蛋白的宿主細胞，其通常具有a-甘露糖苷酶-抗性的聚糖，已經(jīng)過工程改造而產(chǎn)生糖蛋白但無a-甘露糖苷酶-抗性的N-聚糖。在一實施方案中，產(chǎn)生治療性糖蛋白的宿主細胞，其通常具有a-甘露糖苷酶-抗性的聚糖，已經(jīng)過工程改造而產(chǎn)生治療性糖蛋白但無甘露糖苷酶-抗性的聚糖。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞已通過與本發(fā)明分離核酸的破壞、缺失或突變的重組而突變以使宿主細胞中聚糖上的α-甘露糖基化相比缺乏該突變的宿主細胞減少。更優(yōu)選，消除N-聚糖上的a-甘露糖苷酶-抗性。本發(fā)明的宿主細胞優(yōu)選為巴斯德畢赤氏酵母或Pichia methanolica，但其他的宿主細胞，尤其酵母細胞也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
一些實施方案中，酵母宿主細胞中的AMR2基因通過實施例3中論述的并且在圖4中顯示的PCR敲除策略破壞。本發(fā)明的另一些實施方案中，α-甘露糖苷酶抗性活性缺陷型宿主細胞被用于利用本發(fā)明的核酸分子和/或方法將一個或多個目的序列或基因整合入宿主細胞基因組中。在一優(yōu)選的實施方案中，整合目的序列或基因以便破壞宿主細胞的內(nèi)源基因。例如，AMR2基因被目的序列破壞。包含所述整合的宿主細胞很容易通過選擇標記物鑒定，其在酵母中通常為營養(yǎng)缺陷型的基因，其允許轉(zhuǎn)化的細胞在缺乏特定氨基酸或核苷酸的培養(yǎng)基上生長，或抗生素抗性基因，其允許在包含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長。
本發(fā)明的另一個方面中，提供用本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞以及其子代。本發(fā)明的一些實施方案中，這些細胞攜帶載體上的本發(fā)明的核酸序列，其可以是但不需要是自主復(fù)制載體。本發(fā)明的另一些實施方案中，核酸已經(jīng)整合入所述宿主細胞的基因組中。
編碼參與糖蛋白的聚糖上的a-甘露糖抗性活性的破壞的AMR2基因優(yōu)選為來自畢赤氏酵母屬的酵母菌株。屬于本發(fā)明畢赤氏酵母屬的酵母包括，但不限于例如，巴斯德畢赤氏酵母、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭畢赤氏酵母、Pichiamethanolica、Pichia minuta(Ogataea minuta，Pichia lindneri)、Pichiaopuntiae、Pichia thermotolerans、Pichi salictaria、Pichia guercum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia sp.，以及其他的酵母。又一個實施方案中，攜帶AMR2活性和/或同源性的基因可在下列宿主的一種中破壞Saccharomyces castellii、釀酒酵母、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces sp.，多形漢遜酵母、克盧費氏酵母屬、乳酸克盧費氏酵母、白假絲酵母、假絲酵母屬、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、鐮刀菌屬、Fusarium gramineum、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens以及粗糙鏈孢霉。
編碼b-甘露糖基化活性的AMR2基因觀察到具有該AMR2基因同源物的一些酵母種類也具有b-甘露糖基化活性。因此，本發(fā)明的另一個方面中，所述AMR2基因編碼b-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性。在一實施方案中，編碼b-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的AMR2單獨和/或與P.pastoris或其他的真菌物種中任何其同源物一起破壞，導(dǎo)致糖蛋白上a-甘露糖基化抗性聚糖的減少或消除。
O-聚糖上b-甘露糖基化的存在在Trimble等.，2003的報告中論述。因此，另外的實施方案中，P.pastoris以及其他種類中的a-甘露糖苷酶抗性O(shè)-聚糖用AMR2基因及其同源物的破壞而減少或消除。
下列為舉例說明本發(fā)明組合物和方法的實施例。這些實施例不應(yīng)認為是限制-所述實施例僅包括用于例證性的目的。
實施例1N-聚糖的刀豆和a-1，2甘露糖苷酶消化標準的N-連接的低聚糖(20mg)重構(gòu)于100ml HPLC級水中。10ml的等分試樣添加至0.6ml的硅化管。蒸干樣品。10ml 50 mM乙酸銨與刀豆甘露糖苷酶(0.03U)或來自Trichoderma reseei的a-1，2甘露糖苷酶(0.03mU，Dr Contreras R贈送，Unit of Fundamental andApplied Molecular Biology，Department of Molecular Biology，GhentUniversity，Ghent，Belgium)一起添加至樣品。樣品在37℃與酶一起溫育16至24h。隨后蒸干樣品。樣品重構(gòu)于10ml水中。樣品隨后通過MALDI-TOF MS分析。
基質(zhì)輔助的激光解吸飛行電離時間質(zhì)譜法利用Voyager DE PRO linear MALDI-TOF(AppliedBiosciences)質(zhì)譜儀利用延緩的提取確定所述聚糖的分子量。每孔的干燥的聚糖溶于15μL水并且0.5μL點樣于不銹鋼樣品平板上且與0.5μL S-DHB基質(zhì)(1∶1水/乙腈0.1％TFA中的9mg/mL雙羥基苯甲酸，1mg/mL 5-甲氧水楊酸)混合并且干燥。
通過用脈沖氮激光器(337nm)以4ns脈沖時間的照射產(chǎn)生離子。所述儀器以125ns延緩和20kV加速電壓的延緩提取的方式操作。柵極電壓為93.00％，導(dǎo)線電壓為0.10％，內(nèi)壓小于5 X 10-7托，并且低質(zhì)量的閘為875Da。從100-200個激光脈沖的總和產(chǎn)生譜并且用2GHz的數(shù)字轉(zhuǎn)換器獲得。Man5GlcNAc2低聚糖用作外部分子量標準。所有光譜用所述儀器以正離子方式產(chǎn)生。評估的所述光譜的質(zhì)量準確度為0.5％。
實施例2來自巴斯德畢赤氏酵母AMR2基因的鑒定和序列分析包含富集賴氨酸和谷氨酸的重復(fù)序列的釀酒酵母MNN4基因(Genbank登錄號#P36044)的C末端部分用作探針而對P.pastoris基因組序列(Integrated Genomics，Chicago，IL)進行blast。鑒定具有ORF的數(shù)個DNA片段，該ORF編碼具有類似的賴氨酸和谷氨酸富集重復(fù)體的蛋白質(zhì)。其中發(fā)現(xiàn)一個ORF編碼具有推定的結(jié)構(gòu)類似于釀酒酵母Mnn4p的N末端跨膜結(jié)構(gòu)域和富集賴氨酸和谷氨酸的C末端尾的644個氨基酸的蛋白質(zhì)?；跀y帶突變等位基因的菌株的表型分析，該基因命名為AMR2(α-甘露糖苷酶抗性的)。隨后P.pastoris基因組序列的blast搜索揭示存在與AMR2緊密有關(guān)的另外三個基因。
實施例3YAS137菌株中AMR2基因的缺失P.pastoris菌株YAS137(Doch1、Dpno1、Dmnn4b)(美國申請系列No.11/020,808)用作AMR2基因敲除實驗的宿主。YAS137產(chǎn)生無外部鏈的無電荷N-聚糖(圖2A)。當(dāng)用a-1，2-甘露糖苷酶(圖2B)和刀豆(具有a-1，2/a-1，3/a-1，6活性)甘露糖苷酶消化時，純化自菌株YAS137的N-聚糖的顯著百分比可轉(zhuǎn)換成Man5GlcNAc2。然而，上至20％的總N-聚糖對這些a-甘露糖苷酶具有抗性(圖3)。通過PCR重疊方法產(chǎn)生amr2缺失等位基因(amr2::KanR)(圖4)。與PBS2-KO2(SEQ ID NO10)(5′-GTGCTACCTAAAT-CGTATGTGTCGTTGAAGCTTCCCAATGATAGC-3′)成對的引物PBS1-2-C3(SEQ ID NO9)(5’-TAATAGTGGAGAAA-CTTGCAAAGG-3’)，以及與PBS1-2-KO4(SEQ ID NO12)(5′-CTTGG-TTCAACGCAGCACTTTG-AC-3′)成對的PBS1-2-KO3(SEQ ID NO11)(5’-CTCCCTATAGTGAGTCGTATTCATATGAT-GGGTGTTTGCTCACTC-3’)用于擴增來自基因組DNA(分離自菌株NRRL-Y11430的基因組DNA)的AMR2基因的5’和3’側(cè)翼區(qū)。與PR32(SEQ ID NO14)(5’-AATACGACTCACTATAGG-GAG-3’)成對的引物PR29(SEQ ID NO13)(5’-CACATACGATTTAG-GTGACAC-3’)用于擴增來自載體pUG6(Goldstein and McCusker，1999)的Kan(G418)抗性標記物。隨后，引物PBS1-2-C3和PBS1-2-KO4用于用來自第一輪PCR反應(yīng)的所有三種產(chǎn)物的第二個反應(yīng)以產(chǎn)生重疊產(chǎn)物。得到的融合PCR產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化菌株YAS137。通過添加乙酸鈉至終濃度0.3M而制備用于轉(zhuǎn)化的DNA。隨后向DNA樣品添加百分之百冰冷的乙醇至終濃度70％。DNA通過離心沉淀(12000g×10min)并且用70％冰冷的乙醇洗滌兩次。干燥DNA并且隨后重懸于50ml的10mM Tris中，pH 8.0。通過在BMGY中(緩沖最小量的甘油100mM磷酸鉀，pH 6.0；1.34％酵母氮基質(zhì)；4×10-5％生物素；1％甘油)擴大酵母培養(yǎng)至～2-6的O.D.而制備YAS137。酵母通過在1M山梨糖醇中洗滌3次并且重懸于～1-2mls 1M山梨糖醇中而制備為電感受態(tài)。DNA(1-2mg)與50ml感受態(tài)酵母混合并且冰上孵育1分鐘。酵母隨后用BTX Electrocell Manipulator 600利用下列參數(shù)電穿孔1.5kV，129ohms以及25mF。一毫升YPDS(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％右旋糖，1M山梨糖醇)添加至電穿孔的細胞。轉(zhuǎn)化的酵母隨后在選擇性瓊脂平板上鋪板。在含有200mg/ml G418硫酸鹽，GIBCOTM的YPD培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。通過PCR證實缺失等位基因amr2::KanR的正確整合。通過敲除構(gòu)建體的5’和3’部分的PCR擴增進行敲除的篩選。PBS1-C5(SEQ ID NO15)(5’-TTTTCCTCA-AGCCTTCAAA-GACAG 3’)和PTEF(SEQ ID NO16)(5’-AGCTGCGCA-CGTCAAGACTGTCAA-GG-3’)引物用于篩選敲除構(gòu)建體的5’部分而PBS1-2-C2(SEQ ID NO17)(5’-TACCGATACATAC-GTAGCCAACAC-3’)和KAN10(SEQ ID NO18)(5’-TCGCTATACTGCTG-TCGATTCGATAC-3’)引物用于篩選敲除構(gòu)建體的3’部分。在兩個篩選中觀察到PCR產(chǎn)物為AMR2基因成功敲除的指示，因為引物PTEF和KAN10分別在抗藥性標記物序列的5’和3’端退火；并且PBS1-C5和PBS1-2-C2與位于用于敲除構(gòu)建體中的DNA的5’和3’區(qū)域側(cè)翼的基因組中的序列互補。新的(Doch1、Dpno1、Dmnn4b、Damr2)菌株命名為PBP130。
PCR擴增Eppendorf Mastercycler用于所有的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)包含模板DNA，125mM dNTP，0.2mM每種正向和反向引物，Ex Taq聚合酶緩沖液(Takara Bio Inc.)，以及Ex Taq聚合酶(Takara BioInc.)。擴增預(yù)測的AMR2基因5’，預(yù)測的AMR2基因的3’的DNA片段以及抗藥性標記物，以30個循環(huán)的98℃10秒，52℃ 10秒和72℃2min，94℃ 2min的初始變性步驟以及72℃ 10min的最終延伸步驟。通過瓊脂糖凝膠電泳分開PCR樣品且用Qiagen的Gel Extraction Kit抽提和純化DNA條帶。所有DNA純化物在10mM Tris，pH8.0中洗脫。
搜索和比對如本發(fā)明詳述中論述的，進行BLAST搜索以獲得來自NCBI的完全和不完全的真菌基因組的序列，導(dǎo)致AMR2同源物的鑒定。利用Megalign程序(DNAStar)和ClustalW算法構(gòu)建圖5中顯示的比對。
實施例4P.pastoris中a-甘露糖苷酶抗性N-聚糖的確定YAS137和PBP130中N-連接的聚糖通過分泌在甲醇誘導(dǎo)型AOX1啟動子調(diào)控下表達的His-標記的報告蛋白而分析。報告蛋白K3，包含單個N-糖基化位點。簡要地，含有BMGY的搖瓶用YAS-130的新鮮培養(yǎng)物接種并且生長至～20的O.D.。離心培養(yǎng)物并且用BMMY(緩沖的最小量甲醇除了0.5％甲醇代替1％甘油外，與BMGY相同)洗滌細胞沉淀。細胞沉淀重懸于BMMY至原始BMGY培養(yǎng)物的1/5體積并且置于振蕩器中24h。通過離心沉淀生物物質(zhì)并且轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基至新的管而收集分泌蛋白。His-標記的K3蛋白隨后在Ni-親和柱上純化并且用PNGase消化(Choi等.，2003)。
實施例5Man10和Man11/12的分析對α-甘露糖苷酶消化抗性的聚糖的結(jié)構(gòu)分析揭示了連接至核心甘露糖低聚糖的至少一個b1，2-甘露糖基殘基。結(jié)構(gòu)I顯示在分枝5呈現(xiàn)的建議的b-甘露糖基殘基13，其可明確連接至該鏈，并且很可能為高-甘露糖結(jié)構(gòu)的不可分割的部分。下列聚糖結(jié)構(gòu)上(結(jié)構(gòu)I)的殘基基于Ziegler等的論文編號(Ziegler，F(xiàn).D.，J.Cavanagh，C.Lubowski，R.B.Trimble，1999，Glycobiology 9497-505)，任意添加另外的編號(13、14、15)。
結(jié)構(gòu)I9......[Man a(1-2)]Man a(1-6)6\Man a(1-6)4/\........Man a(1-3)7\32115 Man bβ(1-4)GlcNAcβ1-4)GlcNAc[Man a]-[Man a(1-6)]12//Man a(1-3)514 13 11 8/...[Man a(1-2)]Man b(1-2)Manα a(1-2)Man a(1-2)對b-甘露糖基殘基的存在分析來自三個樣品的數(shù)據(jù)。
樣品1‘man10’-此為作為man9/10混合物描述的原始樣品樣品2‘man11’-此為作為來自P4餾分63-66的man11/man12混合物而描述的第二種制備物，估計50％的man11，15％的man12。
樣品3‘man10_消化物’-此為其中原始的man11/man12混合物用1，2-甘露糖苷酶處理而調(diào)整回man9或man10的第三種制備物。
還檢驗了包含核心man8/man9混合物的第四種樣品。
從D2O凍干樣品，并且再溶入200μL或500μL的D2O。
在25C收集Varian Inova 600MHz和800MHz分光計上的NMR數(shù)據(jù)。
來自Varian library(梯度COSY、TOCSY、NOESY、梯度HSQC和HMBC)的標準實驗用于表征。
b-甘露糖基殘基的證據(jù)所有三種樣品具有與b-端基異構(gòu)體一致的NMR信號。三種光譜特征支持該論據(jù)化學(xué)位移、H1-H2標量耦合和分子內(nèi)NOE測量。
質(zhì)子化學(xué)位移。
a-甘露糖基殘基異頭質(zhì)子的化學(xué)位移值通常大于5.0ppm，而b-甘露糖基殘基的通常小于5.0ppm。也有例外，如a-甘露糖基殘基3、4和12，因此僅此不能證實異頭構(gòu)型。
顯示四種樣品質(zhì)子1D光譜異頭區(qū)域的分析揭示兩個峰13和13t，其對應(yīng)于1-2連接至11的b-甘露糖基殘基，13t為末端殘基，并且13似乎用a-甘露糖基殘基14另外取代?？蓪⑦@些光譜與來自Ziegler等中發(fā)現(xiàn)的高-甘露糖結(jié)構(gòu)的NMR數(shù)據(jù)比較，其僅在低于5ppm的化學(xué)位移區(qū)域中顯示核心殘基3和4，以及殘基12。
從2D TOCSY數(shù)據(jù)提取另外的化學(xué)位移，其顯示來自殘基13的不同的H1、H2、H3、H4和H5信號，其與Trinel等.，JBC 1999和Nitz等.，JBC 2002中報道的數(shù)據(jù)緊密對應(yīng)。來自末端殘基13t的信號并不同樣分開的但具有類似的位移(參見表1)。
2D TOCSY(質(zhì)子-質(zhì)子關(guān)聯(lián)圖)顯示屬于b-Man 13殘基的交叉峰(數(shù)據(jù)沒有顯示)。b-甘露糖基殘基的化學(xué)位移和文獻值列于表1中。
表1
a-甘露糖基殘基的化學(xué)位移通常具有相同的等級，但H2的值通常為低～0.1ppm，H3為高～0.1ppm并且H5為高～0.2 ppm。
(Trinel，P.-A.，Y.Plancke，P.Gerold，T.Jouault，F(xiàn).Delplace，R.T.Schwarz，G.Strecker，和D.Poulain，1999，J.Biol.Chem.27430520-30526)(Nitze.M，C.-C.Ling，A.Otter，J.E.Cutler，D.R.Bundle，2002，J.Biol.Chem.，2773440-3446)NOE交叉峰。
b-異頭質(zhì)子位于吡喃糖環(huán)的與H3和H5相同的面并且約2.4埃間距，而a-異頭質(zhì)子位于背面，并且離H3或H5接近4埃。因此，預(yù)期b-異頭物中的H1和H3以及H5之間有強的NOE信號。這在NOESY數(shù)據(jù)中清楚地顯示(未呈現(xiàn))，其中光譜顯示NOE交叉峰，其通過空間相互作用而產(chǎn)生并且為高度距離依賴性的。4.895ppm的水平線與b-man 13殘基的H1對應(yīng)(數(shù)據(jù)沒有顯示)。如通過頂部板塊中的TOCSY試驗確定的，垂直線證實這些峰賦予特定的共振。強的峰H3和H5應(yīng)歸于H1和H3或H5之間的殘基內(nèi)的NOE，證實b-異頭賦值(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
H1至H2的標量耦合(峰的‘分裂’)產(chǎn)生共振‘分裂’和多重結(jié)構(gòu)的質(zhì)子標量耦合(scalar coupling)的數(shù)值與所涉及質(zhì)子的相對方位有關(guān)。其因此能成為異頭構(gòu)型的指示。
a-甘露糖基殘基中的H1-H2標量耦合為約1.5Hz，而b-異頭物的為＜1Hz。在具有非常窄線的光譜中可看到a-異頭物的分裂，而b-異頭物太小并且信號看起來像單峰。這些數(shù)據(jù)中，行距不是最佳的，因此兩組峰看起來像單峰。然而，2D TOCSY中峰的模式和強度(數(shù)據(jù)沒有顯示)還取決于偶合的數(shù)值。TOCSY光譜的區(qū)域顯示其中水平線與H1信號對應(yīng)，并且交叉峰來自各自殘基中的其他質(zhì)子。與b-Man殘基(3、13、13t)有關(guān)的H2區(qū)域的第一個峰比a-Man峰(例如4)的強度更低。強度為信號轉(zhuǎn)移效率以及因此耦合常數(shù)量值的大致指示。
a-異頭物還呈現(xiàn)H1至H3以及有時H4的另外的交叉峰-此表示H1和H2之間的標量耦合足夠大以允許信號轉(zhuǎn)移超過H2。相反，b-異頭物僅呈現(xiàn)H1至H2交叉峰；因為偶合如此小而信號轉(zhuǎn)移非常低效并且未延續(xù)至環(huán)中的其他質(zhì)子。13、13t和3的模式相同，但明顯不同于另一種甘露糖基殘基。
b-甘露糖基13(t)鍵合位點的證據(jù)H1和H2化學(xué)位移的變化。
對于已知的高-甘露糖結(jié)構(gòu)，通常足以將H1和H2質(zhì)子化學(xué)位移與標準的文獻值比較而得到一種結(jié)構(gòu)。在這種情況下，不規(guī)則的信號需要更多的工作來建立鍵合。然而，存在一些峰，其可分配給核心組織，如呈現(xiàn)用于Man8/9光譜。比較Man8/9和Man9/10光譜(數(shù)據(jù)沒有顯示)，有許多差異，包括新信號13和13t，其已在上面如b-甘露糖基殘基所述。
比較樣品Man9/10和Man11/12的光譜，類似于9的末端a-甘露糖基殘基返回。此提示Man9/10光譜中標記為6、12的峰很可能為末端6，因為其在用另一個a-甘露糖取代后預(yù)計會移位。其回到甘露糖苷酶消化樣品，Man10-消化物的起始位置。來自man11和Man10-消化物樣品的碳-質(zhì)子相關(guān)數(shù)據(jù)(HSQC，HMBC光譜，未顯示)證實該殘基以1-6鍵連接。
如在典型的Man9結(jié)構(gòu)中看到的，標記為14的信號提示為連接至13的a-甘露糖基殘基，而不是取代的甘露糖基殘基7。此以底下論述的NOE數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。然而，為了解釋異頭質(zhì)子的化學(xué)位移，其可能為另外取代的。
NOE數(shù)據(jù)分析。
用于確定鍵合位點的初始數(shù)據(jù)來自NOE光譜，其顯示空間上接近的質(zhì)子。因此，除了殘基內(nèi)的NOE交叉峰，還可觀察到殘基間的交叉峰，其通常顯示鍵合位點。在Man(1-2)鍵合的情況下，觀察到相同的殘基中H1和H2之間，糖苷連接的殘基的H1和H2之間并且常常糖苷連接的殘基的H1和H1之間的交叉峰。
分析來自man10樣品NOESY和TOCSY光譜的區(qū)域(數(shù)據(jù)沒有顯示)。上平板中，峰代表鑒定的甘露糖基殘基H1和H2之間的相互關(guān)系。中間平板中，與其賦值一致，標記為11的信號顯示甘露糖基殘基8的H1和H2之間的NOE相互關(guān)系(box)。如果檢驗來自殘基13和13t的異頭質(zhì)子的NOE交叉峰，其與甘露糖基殘基11的H2有相互關(guān)系。此將b-甘露糖基殘基連接至核心寡糖的1-3支鏈。底下平板顯示13t的H1和11的H1之間另外的強NOE相互關(guān)系，也與b(1-2)鍵合一致。
對該結(jié)構(gòu)片段的另外的支持來自甘露糖基殘基11的H2的異?；瘜W(xué)位移；其值與來自Trimble等(Trimble，R.B.，C.Lubowski，C.HauerIII，R.Stack，L.McNaughton，T.Gemmill，和S.Anand Kumar，2004，Glycobiology 14265-274))的數(shù)據(jù)一致，其顯示b-man取代的a-甘露糖基殘基2的4.26ppm的化學(xué)位移。此外，質(zhì)子-碳相關(guān)數(shù)據(jù)(HSQC和HMBC光譜，未顯示)表明甘露糖基11(以及例如8和5)的C2的碳化學(xué)位移為糖苷鍵中碳的高值(～82-84ppm)特性。
推斷至少一種b-甘露糖基殘基可顯示1-2連接至核心甘露糖低聚糖?？赡苡衎-甘露糖基殘基的多個鍵合位點，并且其本身可被取代。
參考文獻Choi，B-K.等.2003.Use of combinatorial genetic libraries tohumanize N-linked glycosylation in yeast Pichiapastoris.Proc.Natl.Acad.Sci.100；5022-5027.
Cregg，J.M.等.2000.Recombinant protein expression in Pichiapastoris.Mol.Biotechnol.16；23-52.
Cutler，J.E.2001 N-glycosylation of yeast，with emphasis onCandida albicans.Med.Mycology.39；S75-S86.
Han，Y.，Kanbe，T.，Cherniak，R.and Cutler，J.E.1997.Biochemicalcharacterization of Candida albicans epitopes that can elicit protectiveand nonprotective antibodies.Infect.Immun.65；4100-4107.
Joualt，T.，Delaunoy，C.Sendid，B.，Ajana，R.and Poulain，D.1997.Differential humoral response against a-and b-linked mannoseresidues associated with tissue invasion by Candidaalbicans.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4；328-333.
Kobayashi，H.，Shibata，N.and Suzuki，S.1986.Acetolysis of Pichiapastoris IFO 0948 Strain Mannan Containing a-1，2 and b-1，2 LinkagesUsing Acetolysis medium of Low Sulfuric AcidConcentration.Arch.Biochem.Biophys.245；494-508.
Kobayashi，H 等.1989.Structural study of phosphomannan ofyeast-form cells of Candida albicans J-1012 strain with specialreference to application of mild acetolysis.Arch.Biochem.Biophys.272；364-375.
Kobayashi，H.等.1992.Structural study of a cell wall mannan-protein complex of the pathogenic yeast Candida glabrata IFO 0622strain.Arch.Biochem.Biophys.294；662-669.
Kobayashi，H.等.1994.Structural modification of cell wallmannans of Candida albicans serotype A strains grown in yeastextract-Sabouraud liquid medium under acidicconditions.Infect.Immun.62；968-973.
Rosenfeld，L.and Ballou，C.1974.Genetic Control of Yeast MannanStructure.J.Biol.Chem.249；2319-2321.
Shibata，N.，Ichikawa，T.，Tojo，M.等.1985.Immunochemical studyon the mannans of Candida albicans NIH A-207，NIH B-792 and J-1012strains prepared by fractional precipitation withcetyltrimethylammonium bromide.Arch.Biochem.Biophys.243；338-348.
Shibata，N.，Hisamichi，K.，Kobayashi，H.，and Suzuki，S.1993a.Complete assignment of 1H and 13C nuclear magneticresonance chemical shifts of beta-1，2-linked mannooligosaccharidesisolated from the phosphomannan of the pathogenic yeast Candidaalbicans NIH B-792 strain.Arch Biochem Biophys.302；113-117.
Shibata，N.，Hisamichi，K.，Kobayashi，H.，and Suzuki，S.1993b.Structural study of a cell-wall mannan of Saccharomyceskluyveri IFO 1685 strain.Presence of a branched side chain and beta-1，2-linkage.Eur J Biochem.217；1-12.
Suzuki，A.等.1997.Charcterization of b-1，2 Mannosyltrahsferasein Candida guilliermondii and Its Utilization in the Synthesis of NovelOligosaccharides.J.Biol.Chem.272；16822-16828.
Takeuchi，Makato.1997.Trial for Molecular Breeding of Yeast forthe Production of Glycoprotein Therapeutics.Trends in Glycoscienceand Glycotechnology.9；S29-S35.
Trimble，R.B.等.2004.Characterization of N-and O-linkedglycosylation of recombinant human bile salt-stimulated lipasesecreted by Pichia pastoris.Glycobiology.14；265-274.
<110>GlycoFi，Inc.
Bobrowicz，Piotr<120>用于在糖蛋白產(chǎn)生中減少或消除a-甘露糖苷酶抗性聚糖的方法<130>GFI-14<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工<220>
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權(quán)利要求
1.用于在酵母或絲狀真菌宿主細胞中產(chǎn)生糖蛋白組合物的方法，所述糖蛋白組合物具有減少的高甘露糖聚糖的量，所述方法包含減少或消除所述糖蛋白上a-甘露糖苷酶抗性聚糖的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中減少或消除糖蛋白上a-甘露糖苷酶抗性聚糖的步驟包括通過參與N-聚糖的β-甘露糖基化的基因的破壞、缺失或突變而修飾宿主細胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該基因編碼SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7或其變體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中a-甘露糖苷酶抗性的聚糖包括b-甘露糖、支鏈的高甘露糖或a-1，4甘露糖殘基。
5.權(quán)利要求1-4的任何一項的方法，其中宿主細胞選自由以下構(gòu)成的組巴斯德畢赤氏酵母、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭畢赤氏酵母、Pichia methanolica、Pichia minuta(Ogataea minuta，Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、耐熱畢赤氏酵母、Pichi salictaria、Pichia guercum、Pichia pijperi、Pichia sttptis、Pichia sp.、Saccharomyces castellii、釀酒酵母、Saccharomyceskluyveri、Saccharomyces sp.、多形漢遜酵母、克盧費氏酵母屬、乳酸克盧費氏酵母、白假絲酵母、假絲酵母屬、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、鐮刀菌屬、Fusarium gramineum、Fusarium venenatum、Physcomitrellapatens和粗糙鏈孢霉。
6.權(quán)利要求2的方法，其中該宿主細胞進一步包括編碼α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的功能性基因產(chǎn)物的缺失。
7.權(quán)利要求2的方法，其中該宿主細胞進一步包括編碼甘露糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的功能性基因產(chǎn)物的缺失。
8.通過權(quán)利要求1-7的任何一項的方法產(chǎn)生的宿主細胞。
9.通過權(quán)利要求8的方法產(chǎn)生的糖蛋白組合物。
10.權(quán)利要求9的糖蛋白組合物，其中該糖蛋白包括N-連接的聚糖或O-連接的聚糖。
11.分離的核酸序列，包括或由下列組成(a)SEQ ID NO1；(b)是SEQ ID NO1簡并變體的核酸分子；(c)具有對SEQ ID NO1至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、98％、99％、99.9％同一性的核酸序列；(d)編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的核酸序列(e)編碼具有對SEQ ID NO2至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、98％、99％、99.9％同一性的多肽的核酸序列；(f)在嚴謹條件下與SEQ ID NO1雜交的核酸序列；以及(g)包括(a)-(f)任何一項的片段的核酸序列，其為至少60個連續(xù)的核苷酸長度。
12.分離的核酸序列，包括或由下列組成(a)SEQ ID NO3；(b)是SEQ ID NO3簡并變體的核酸分子；(c)具有對SEQ ID NO3至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、98％、99％、99.9％同一性的核酸序列；(d)編碼具有SEQ ID NO4氨基酸序列的多肽的核酸序列(e)編碼具有對SEQ ID NO4至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、98％、99％、99.9％同一性的多肽的核酸序列；(f)在嚴謹條件下與SEQ ID NO2雜交的核酸序列；以及(g)包括(a)-(f)任何一項的片段的核酸序列，其為至少60個連續(xù)的核苷酸長度。
13.分離的核酸序列，包括或由下列組成(a)SEQ ID NO5；(b)是SEQ ID NO5簡并變體的核酸分子；(c)具有對SEQ ID NO5至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、98％、99％、99.9％同一性的核酸序列；(d)編碼具有SEQ ID NO6氨基酸序列的多肽的核酸序列(e)編碼具有對SEQ ID NO6至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、98％、99％、99.9％同一性的多肽的核酸序列；(f)在嚴謹條件下與SEQ ID NO5雜交的核酸序列；以及(g)包括(a)-(f)任何一項的片段的核酸序列，其為至少60個連續(xù)的核苷酸長度。
14.分離的核酸序列，包括或由下列組成(a)SEQ ID NO7；(b)是SEQ ID NO7簡并變體的核酸分子；(c)具有對SEQ ID NO7至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、98％、99％、99.9％同一性的核酸序列；(d)編碼具有SEQ ID NO8氨基酸序列的多肽的核酸序列(e)編碼具有對SEQ ID NO8至少72％、75％、80％或85％、90％、95％、98％、99％、99.9％同一性的多肽的核酸序列；(f)在嚴謹條件下與SEQ ID NO7雜交的核酸序列；以及(g)包括(a)-(f)任何一項的片段的核酸序列，其為至少60個連續(xù)的核苷酸長度。
15.包含權(quán)利要求11-14任何一項的核酸序列的載體。
16.權(quán)利要求15的載體，其中該核酸序列表達具有β-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
17.修飾的酵母或絲狀真菌宿主細胞，特征在于該宿主細胞已經(jīng)過修飾而減少選自SEQ ID NO1、EQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7或其變體的核酸序列的功能性基因產(chǎn)物的表達。
18.權(quán)利要求17的修飾的宿主細胞，其中所述修飾的宿主細胞包含選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7或其變體的一個或多個核酸序列中的破壞、缺失或突變。
19.分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段或其衍生物，其選擇性結(jié)合權(quán)利要求11、12、13或14的分離的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供減少或消除酵母中糖蛋白上a－甘露糖苷酶抗性聚糖的方法。糖蛋白上a－甘露糖苷酶抗性聚糖的減少或消除產(chǎn)生自新分離的編碼β1，2－甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的P.pastoris AMR2基因的破壞。本發(fā)明還公開了與聚糖的a－甘露糖苷酶抗性相關(guān)的新的基因、多肽、抗體、載體和宿主細胞。
文檔編號C07K16/00GK101084233SQ200580013792
公開日2007年12月5日 申請日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者P·波布羅維茨 申請人:格利科菲公司