專利名稱：抗炎劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及3-氨基己內(nèi)酰胺衍生物的用途，用于制備預(yù)防或治療炎癥的藥品。
發(fā)炎是生理性宿主防御的重要組分。不過日益明顯的是，在時(shí)間或空間上不適當(dāng)?shù)难仔詰?yīng)答在廣泛的疾病中扮演角色，包括具有明顯的白細(xì)胞組分的那些(例如自身免疫疾病、哮喘或動(dòng)脈粥樣硬化)，以及在傳統(tǒng)上不被認(rèn)為牽涉白細(xì)胞的疾病(例如骨質(zhì)疏松或阿爾茨海默氏病)。
趨化因子是一大家族具有白介素-8同源性的信號(hào)傳導(dǎo)分子，它們在調(diào)節(jié)生理和病理?xiàng)l件下的白細(xì)胞運(yùn)輸中都有牽連。鑒于五十多種配體和二十種受體參與趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)，該系統(tǒng)具有必需的信息密度，以通過復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)過程為白細(xì)胞尋址，從骨髓到外周，然后通過次級(jí)淋巴樣器官返回。不過，趨化因子系統(tǒng)的這種復(fù)雜性首先妨礙通過阻滯趨化因子受體來調(diào)控炎性應(yīng)答的藥理手段。已經(jīng)證實(shí)難以確定在既定炎性疾病中應(yīng)當(dāng)抑制何種趨化因子受體以產(chǎn)生治療益處。
最近，已經(jīng)描述了同時(shí)阻滯多種趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)的成分家族Reckless et al.，Biochem J.(1999)340803-811。第一種這樣的成分是一種被稱為“肽3”的肽，被發(fā)現(xiàn)抑制由5種不同趨化因子誘導(dǎo)的白細(xì)胞移行，而響應(yīng)于其他化學(xué)引誘劑(例如fMLP或TGF-β)的移行沒有改變。這種肽及其類似物、例如NR58-3.14.3(也就是序列ID No.1 c(DCys-DGln-DIle-DTrp-DLys-DGln-DLys-DPro-DAsp-DLeu-DCys)-NH2)，統(tǒng)稱為“廣譜趨化因子抑制劑”(BSCI)。Grainger et al.，Biochem.Pharm.65(2003)1027-1034隨后指出BSCI在廣泛的動(dòng)物疾病模型中具有潛在有用的抗炎活性。有趣地，同時(shí)阻滯多種趨化因子在表面上與急性或慢性毒性無關(guān)，提示了這種手段可能是可用于開發(fā)新的抗炎藥物的策略，它們具有與甾類相似的益處，但是減少了副作用。
不過，肽類和類肽衍生物、例如NR58-3.14.3可能不是體內(nèi)使用的優(yōu)選。合成它們相當(dāng)昂貴，并且具有相對(duì)不可取的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)。例如，NR58-3.14.3不是口服可生物利用的，在靜脈內(nèi)注射后從血漿中廓清的半衰期小于30分鐘。
為鑒定保留肽3和NR58-3.14.3的抗炎性質(zhì)、但是改進(jìn)作為藥物使用的特征的新穎制劑已經(jīng)采取兩種平行策略。首先開發(fā)一系列肽類似物，有些具有比NR58-3.14.3更長的血漿半衰期，有些合成起來相當(dāng)便宜。其次進(jìn)行詳細(xì)的肽結(jié)構(gòu)活性分析，以鑒定關(guān)鍵的藥效基因，并設(shè)計(jì)保留原始肽的有益性質(zhì)的小型非肽結(jié)構(gòu)。
這種第二種手段產(chǎn)出若干結(jié)構(gòu)不同的保留肽類抗炎性質(zhì)的化合物系列，包括生物堿育亨賓的16-氨基和16-氨基烷基衍生物，以及一些N-取代的3-氨基戊二酰亞胺(參考文獻(xiàn)Fox et al.，J Med Chem45(2002)360-370WO 99/12968和WO 00/42071)。所有這些化合物都是保留非趨化因子類化學(xué)引誘劑之外選擇性的廣譜趨化因子抑制劑，它們當(dāng)中有些已經(jīng)顯示體內(nèi)阻滯急性炎癥。
這些化合物中最有效力和選擇性的是(S)-3-(十一碳-10-烯?；?-氨基戊二酰亞胺(NR58，4)，它體外抑制趨化因子-誘導(dǎo)移行的ED50為5nM。不過，進(jìn)一步的研究揭示氨基戊二酰亞胺環(huán)易感于血清中的酶促開環(huán)作用。所以，就有些應(yīng)用而言(例如其中所治療的炎癥是慢性的，例如在自身免疫疾病中)，這些化合物可能不具有最優(yōu)的性質(zhì)，并且具有相似抗炎性質(zhì)的更穩(wěn)定的化合物可能是更優(yōu)的。
作為鑒定這類穩(wěn)定類似物的手段，已經(jīng)測試了(S)-3-(十一碳-10-烯?；?-氨基戊二酰亞胺的各種衍生物在血清中的穩(wěn)定性。一種這類衍生物、即6-脫氧類似物(S)-3-(十一碳-10-烯?；?-四氫吡啶-2-酮，在37℃人血清中完全穩(wěn)定達(dá)至少7天，但是與母體分子相比，效力也有相當(dāng)?shù)臏p少。
本領(lǐng)域已經(jīng)公開了3-氨基己內(nèi)酰胺的酰胺衍生物。例如-日本專利申請No.09087331描述了3-氨基己內(nèi)酰胺酰胺衍生物，其中酰胺烷基側(cè)鏈可以含有2至30個(gè)碳原子。這些化合物已經(jīng)作為油-膠化劑存在。
-美國專利No.6,395,282描述了致免疫性綴合物，包含與革蘭氏陰性細(xì)菌自誘導(dǎo)劑偶聯(lián)的載體分子，其中所述自誘導(dǎo)劑可以是3-氨基己內(nèi)酰胺酰胺衍生物，其中酰胺烷基側(cè)鏈可以含有至多34個(gè)碳原子。不過，僅公開了綴合物而非所分離的酰胺衍生物的治療用途。
-Weiss等的文章(Research Communications in Psychology，Psychiatry and Behavior(1992)，17(3-4)，153-159)公開了一系列3-氨基己內(nèi)酰胺酰胺衍生物，其中有3-己酰氨基-DL-e-己內(nèi)酰胺和3-十二烷酰氨基-DL-ε-己內(nèi)酰胺。這些化合物僅有體外活性，沒有顯著的體內(nèi)效果。
換句話說，盡管本領(lǐng)域確實(shí)已經(jīng)知曉3-氨基己內(nèi)酰胺的一些烷基酰胺衍生物，不過沒有描述過3-氨基己內(nèi)酰胺酰胺衍生物的實(shí)際藥學(xué)用途。
本發(fā)明提供通式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備治療炎性障礙的藥物 其中X是-CO-Y-(R1)n或SO2-Y-(R1)n；Y是環(huán)烷基或多環(huán)烷基(例如金剛烷基、金剛烷甲基、雙環(huán)辛基、環(huán)己基、環(huán)丙基)；或者是環(huán)烯基或多環(huán)烯基；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫或者烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、鏈烯基、炔基或烷基氨基原子團(tuán)，具有1至20個(gè)碳原子(例如5至20個(gè)碳原子、8至20個(gè)碳原子、9至20個(gè)碳原子、10至18個(gè)碳原子、12至18個(gè)碳原子、13至18個(gè)碳原子、14至18個(gè)碳原子、13至17個(gè)碳原子)；或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自氟、氯、溴、碘、羥基、氧基烷基、氨基、氨基烷基或氨基二烷基原子團(tuán)；n是1至m的任意整數(shù)，其中m是環(huán)狀基團(tuán)Y上可允許的最大取代數(shù)。
作為替代選擇，R1可以選自肽基原子團(tuán)，例如具有1至4個(gè)肽片段(peptidicmoieties)，通過肽鍵連接在一起(例如1至4個(gè)氨基酸殘基的肽基原子團(tuán))。
己內(nèi)酰胺環(huán)3位碳原子是不對(duì)稱的，所以，根據(jù)本發(fā)明的化合物具有兩種可能的對(duì)映體形式，也就是“R”和“S”構(gòu)型。本發(fā)明涵蓋這兩種對(duì)映體形式和這些形式的所有組合，包括外消旋的“RS”混合物。為了簡便起見，當(dāng)沒有在結(jié)構(gòu)式中指出具體構(gòu)型時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解這代表兩種對(duì)映體形式和它們的混合物。
優(yōu)選地，按照這方面發(fā)明所使用的通式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽將是通式(I’)化合物 其中x具有上述相同含義。
優(yōu)選地，通式(I)或(I’)化合物或它們藥學(xué)上可接受的鹽將是這樣的，Y的一個(gè)或多個(gè)環(huán)限制α-碳的鍵角為本質(zhì)上四面體的(也就是sp3雜化鍵)?！唉?碳”位于2-位(相對(duì)于酰胺羰基而言)或者1-位(相對(duì)于磺酰胺磺酰基而言)。
任何取代基R1都可以是環(huán)狀基團(tuán)Y的一個(gè)或多個(gè)環(huán)上任意可允許位置上的取代基。特別要注意的是，本發(fā)明包括其中“α-碳”是環(huán)狀基團(tuán)一部分和本身被取代的化合物。(R1)n的定義涵蓋沒有取代(也就是R1＝氫)的本發(fā)明化合物、具有單取代(也就是R1不是氫，并且n＝1)和多取代(也就是至少兩個(gè)R1基團(tuán)不是氫，并且n＝2或以上)的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明也提供藥物組合物，包含作為活性成分的通式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體 其中X是-CO-Y-(R1)n或SO2-Y-(R1)n；Y是環(huán)烷基或多環(huán)烷基(例如金剛烷基、金剛烷甲基、雙環(huán)辛基、環(huán)己基、環(huán)丙基)；或者是環(huán)烯基或多環(huán)烯基；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫或者烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、鏈烯基、炔基或烷基氨基原子團(tuán)，具有1至20個(gè)碳原子(例如5至20個(gè)碳原子、8至20個(gè)碳原子、9至20個(gè)碳原子、10至18個(gè)碳原子、12至18個(gè)碳原子、13至18個(gè)碳原子、14至18個(gè)碳原子、13至17個(gè)碳原子)；或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自氟、氯、溴、碘、羥基、氧基烷基、氨基、氨基烷基或氨基二烷基原子團(tuán)；并且n是1至m的任意整數(shù)，其中m是環(huán)狀基團(tuán)Y上可允許的最大取代數(shù)。
作為替代選擇，R1可以選自肽基原子團(tuán)，例如具有1至4個(gè)肽片段，通過肽鍵連接在一起(例如1至4個(gè)氨基酸殘基的肽基原子團(tuán))。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明這方面所使用的通式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽將是通式(I’)化合物 其中x具有上述相同含義。
藥學(xué)上可接受的鹽確切地表示無機(jī)酸或有機(jī)酸的加成鹽，前者例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽和硝酸鹽，后者例如乙酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對(duì)-甲苯磺酸鹽、棕櫚酸鹽和硬脂酸鹽。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，當(dāng)它們可以使用時(shí)，還有從堿生成的鹽，例如鈉或鉀的氫氧化物。關(guān)于藥學(xué)上可接受的鹽的其他實(shí)例，可以參見″Saltselection for basic drugs″，Int.J.Pharm.(1986)，33，201-217。
藥物組合物可以是固體形式，例如粉劑、顆粒劑、片劑、明膠膠囊、脂質(zhì)體或栓劑。適當(dāng)?shù)墓腆w載體例如可以是磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖類、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷和蠟。其他適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的賦形劑和/或載體將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物也可以以液體形式呈遞，例如溶液、乳液、懸浮液或糖漿。適當(dāng)?shù)囊后w載體例如可以是水、有機(jī)溶劑(例如甘油或二醇)以及它們在水中的可變比例混合物。
本發(fā)明也提供通式(I)化合物及其鹽 其中X是-CO-Y-(R1)n或SO2-Y-(R1)n；Y是環(huán)烷基或多環(huán)烷基(例如金剛烷基、金剛烷甲基、雙環(huán)辛基、環(huán)己基、環(huán)丙基)；或者是環(huán)烯基或多環(huán)烯基；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫或者烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、鏈烯基、炔基或烷基氨基原子團(tuán)，具有1至20個(gè)碳原子(例如5至20個(gè)碳原子、8至20個(gè)碳原子、9至20個(gè)碳原子、10至18個(gè)碳原子、12至18個(gè)碳原子、13至18個(gè)碳原子、14至18個(gè)碳原子、13至17個(gè)碳原子)；或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自氟、氯、溴、碘、羥基、氧基烷基、氨基、氨基烷基或氨基二烷基原子團(tuán)；n是1至m的任意整數(shù)，其中m是環(huán)狀基團(tuán)Y上可允許的最大取代數(shù)。
作為替代選擇，R1可以選自肽基原子團(tuán)，例如具有1至4個(gè)肽片段，通過肽鍵連接在一起(例如1至4個(gè)氨基酸殘基的肽基原子團(tuán))。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明這方面所使用的通式(I)化合物或其鹽將是通式(I’)化合物 其中x具有上述相同含義。
優(yōu)選地，當(dāng)用在本發(fā)明中時(shí)，通式(I)或(I’)化合物或它們的鹽將是這樣的，Y的一個(gè)或多個(gè)環(huán)限制α-碳的鍵角為本質(zhì)上四面體的(也就是sp3雜化鍵)。
確切而言，按照本發(fā)明任意方面所優(yōu)選的通式(I)或(I’)化合物和它們的鹽選自下組-(S)-3-(環(huán)己烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(1’-甲基環(huán)己烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(環(huán)己-1’-烯羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(反式-4’-戊基環(huán)己烷-1-羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(4’-戊基[2，2，2]雙環(huán)-辛烷-1-羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；.
-(S)-3-(1’-金剛烷基甲烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(3’-氯-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(3’，5’-二甲基-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(3’，5’，7’-三甲基-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；
及其鹽。
最優(yōu)選的化合物是(S)-3-(1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺及其鹽。
本發(fā)明也提供所例證的化合物的磺酰胺類似物也就是所述化合物的磺?；?氨基-己內(nèi)酰胺等價(jià)物。
正如上文在先技術(shù)討論所提到的，3-氨基己內(nèi)酰胺的某些烷基酰胺衍生物作為化合物本身可能是已知的(不過目前未知任何已在抗炎方面被描述為藥物組合物或醫(yī)藥用途者)。
本發(fā)明包括所定義的化合物、組合物及其用途，其中該化合物是水合或溶劑化形式。
這里所述3-氨基己內(nèi)酰胺的酰胺衍生物是功能性BSCI。采用本文提供的靈巧合成途徑，它們合成起來相對(duì)便宜；它們在人血清中是穩(wěn)定的，所以具有優(yōu)異的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)；它們是口服可生物利用的；它們是非常有力的體外廣譜趨化因子抑制劑，具有優(yōu)異的非趨化因子類化學(xué)引誘劑之外選擇性；它們在嚙齒動(dòng)物炎癥模型中是非常有力和有效的體內(nèi)抗炎劑；它們的給藥在達(dá)到最大治療效果所需的劑量下不與任何顯著的急性毒性有關(guān)?？傊?，這些性質(zhì)提示了3-氨基己內(nèi)酰胺的酰胺衍生物代表了優(yōu)于前述化合物的抗炎藥物。
與在先技術(shù)相比，本發(fā)明的改進(jìn)在于帶側(cè)鏈3-氨基己內(nèi)酰胺片段的提供，該側(cè)鏈具有一個(gè)或多個(gè)烷基/烯基環(huán)，限制了該側(cè)鏈α-碳的鍵角。本發(fā)明化合物顯著優(yōu)于帶線性烯丙基鏈的化合物(無論烷基酰胺還是烷基磺酰胺)。
在先技術(shù)的肽類(例如NR58-3.14.3)具有如下缺點(diǎn)(a)它們是昂貴的，并需要固相合成(至少對(duì)于更長者而言)，并且(b)它們經(jīng)由腎臟非常快速地廓清，和(c)它們一般是不太有效的。
在先技術(shù)的氨基戊二酰亞胺是便宜的，不經(jīng)由腎臟快速廓清，也更加有效，但是它們不顯示代謝穩(wěn)定性。
這里所述的改進(jìn)、即氨基己內(nèi)酰胺，是便宜的，不被腎臟廓清，甚至更加有效，也是代謝穩(wěn)定的。
按照本發(fā)明，旨在用通式(I)或(I’)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或者含有它們作為活性成分的藥物組合物或藥物預(yù)防或治療的炎癥尤其包括-自身免疫疾病，例如多發(fā)性硬化；-血管障礙，包括中風(fēng)、冠狀動(dòng)脈疾病、心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、動(dòng)脈粥樣硬化或脈管炎，例如貝切特氏綜合征、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、風(fēng)濕性多肌痛、韋格內(nèi)氏肉芽腫病、Churg-Strauss綜合征結(jié)節(jié)性脈管炎、Henoch-Schnlein紫癜和川崎??；-病毒感染或復(fù)制，例如由病毒引起的感染或者病毒的復(fù)制，所述病毒包括痘病毒、皰疹病毒(例如Herpesvirus samiri)、巨細(xì)胞病毒(CMV)或lentivirus；-哮喘；-骨質(zhì)疏松(低骨礦質(zhì)密度)；-腫瘤生長；-類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；-器官移植排斥和/或移植物或器官功能遲緩，例如在腎移植患者中；-以TNF-α水平升高為特征的障礙；-牛皮癬；-皮膚傷口；-由細(xì)胞內(nèi)寄生蟲導(dǎo)致的障礙，例如瘧疾或結(jié)核；-變態(tài)反應(yīng)；或者-阿爾茨海默氏病。
按照本發(fā)明，進(jìn)一步的炎性障礙包括-ALS；-纖維化(特別是肺纖維化，但是不限于肺中的纖維化)；-粘連的形成(特別是在腹膜和骨盆區(qū)域中)；-抗原誘發(fā)的回憶應(yīng)答；-免疫應(yīng)答抑制。
這些臨床適應(yīng)癥滿足炎癥或以TNFα水平升高為特征的障礙的一般定義。
只要法律允許，本發(fā)明也提供治療、改善或預(yù)防炎性疾病癥狀(包括對(duì)于任何藥物的不良炎性反應(yīng))的方法，該方法對(duì)患者給予抗炎量的如本文所要求保護(hù)的化合物、組合物或藥物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物的給藥可以借助局部、口服、腸胃外途徑、通過肌內(nèi)注射等進(jìn)行。
適用于根據(jù)本發(fā)明的藥物的給藥劑量在0.1mg與10g之間，這依賴于所用活性化合物的類型。
按照本發(fā)明，通式(I)或(I’)化合物可以利用下文所述過程制備。
通式(I)或(I’)化合物的制備所有通式(I)或(I’)化合物都可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一般方法容易地制備。
盡管如此，建議下列優(yōu)選的合成途徑 簡

圖1簡圖1所示反應(yīng)可以在例如氯仿或二氯甲烷中進(jìn)行。最優(yōu)選的反應(yīng)溶劑是二氯甲烷。
上述反應(yīng)優(yōu)選地是在堿存在下進(jìn)行的，例如Na2CO3。
上述反應(yīng)可以在環(huán)境溫度(約25℃)下進(jìn)行，或者更一般為20與50℃之間的溫度。
定義術(shù)語“約”表示在所考慮的數(shù)值左右的區(qū)間。正如本專利申請所使用的，“約X”表示從X減去X的10％到X加上X的10％的區(qū)間，優(yōu)選從X減去X的5％到X加上X的5％的區(qū)間。
數(shù)字范圍在本說明書中的使用旨在在本發(fā)明范圍內(nèi)明確包括在該范圍內(nèi)的所有個(gè)別整數(shù)和在既定范圍最寬范圍內(nèi)的上下限數(shù)字的所有組合。因此例如，(尤其)關(guān)于式I所指定的1至20個(gè)碳原子的范圍旨在包括4與20之間的所有整數(shù)和上下限數(shù)字的每種組合的所有子范圍，無論明示與否。
本文所用的術(shù)語“包含”被理解為表示包含和由......組成。所以，若本發(fā)明涉及“包含作為活性成分的化合物的藥物組合物”，這種術(shù)語旨在涵蓋其中可能存在其他活性成分的組合物以及僅由一種所定義的活性成分組成的組合物。
本文所用的術(shù)語“肽片段”旨在包括下列20種天然存在的蛋白質(zhì)生成性氨基酸殘基
改性和非尋常氨基酸殘基以及擬肽類也打算涵蓋在“肽片段”的定義內(nèi)。
除非另有定義，這里使用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語都具有通常為本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通專業(yè)人員所理解的相同含義。與之相似，所有出版物、專利申請、所有專利和所有其他這里提到的參考文獻(xiàn)都引用在此作為參考(只要法律允許)。
下列實(shí)施例供闡述上述工藝，絕不應(yīng)被解釋為限制發(fā)明的范圍。
附1顯示根據(jù)本發(fā)明的化合物實(shí)例的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例起始化合物的一般合成工藝按照文獻(xiàn)合成(R)與(S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺的鹽酸鹽和(R，R)與(S，S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺的氫-吡咯烷-5-甲酸鹽(cf.Boyle et al.，J.Org.Chem，(1979)，44，4841-4847；Rezler et al.，J.Med.Chem.(1997)，40，3508-3515)。
實(shí)施例1(S)-3-(環(huán)己烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S，S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺氫-吡咯烷-5-甲酸鹽2(5mmol)與Na2CO3(15mmol)的水(25ml)溶液加入到環(huán)己烷碳酰氯(5mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌12小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×25ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2CO3干燥，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過EtOAc/己烷重結(jié)晶純化，得到內(nèi)酰胺(540mg，45％)；m.p.(EtOAc/己烷)180-181℃；[α]D25(c＝1，CHCl3)+42.0；vmax/cm-13294(NH)，1668，1614(CO)，1537(NH)；δH(500MHz，CDCl3)6.89(1H，d，J 5.5，CHNH)，6.51(1H，brs，CH2NH)，4.48(1H，dd，J 11，6，CHNH)，3.30-3.17(2H，m，CH2NH)，2.11(1H，tt，J 11.5，3.5，(CH2)CHCO)，2.01(1H，brd，J 13，內(nèi)酰胺環(huán)CH)，1.98-1.92(1H，m，內(nèi)酰胺環(huán)CH)，1.87-1.70(6H，m，內(nèi)酰胺環(huán)CH×2+己環(huán)CH×4)，1.66-1.59(1H，m，己環(huán)CH)，1.47-1.30(4H，brm，內(nèi)酰胺環(huán)CH×2+己環(huán)CH×2)和1.23-1.15(3H，m，己環(huán)CH×3)；δC(125MHz，CDCl3)175.9，175.3(CO)，51.8(NHCHCO)，45.2(CH)，42.1，31.7，29.6，29.4，28.9，27.9，25.7(×2)，25.6(CH2)；m/z(M+C13H22N2O2需要238.16813)238.16768.
實(shí)施例2(S)-3-(1’-甲基環(huán)己烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S，S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺氫-吡咯烷-5-甲酸鹽2(5mmol)與Na2CO3(15mmol)的水(25ml)溶液加入到1-甲基環(huán)己烷碳酰氯(5mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌12小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×25ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2CO3干燥，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過EtOAc/己烷重結(jié)晶純化，得到內(nèi)酰胺(540mg，43％)；m.p.(EtOAc/己烷)168-169℃；[α]D25(c＝1，CHCl3)+33.0；vmax/cm-13380，3241(NH)，1674，1638(CO)，1501(NH)；δH(500MHz，CDCl3)7.12(1H，d，J 5，CHNH)，6.52(1H，brs，CH2NH)，4.48(1H，ddd，J 11，5.5，1.5 CHNH)，3.30-3.16(2H，m，CH2NH)，2.01(1H，br d，J 13，內(nèi)酰胺環(huán)CH)，1.98-1.86(3H，m，內(nèi)酰胺環(huán)CH+己環(huán)CH×2)，1.85-1.73(2H，m，內(nèi)酰胺環(huán)CH×2)，1.56-1.47(2H，m，己環(huán)CH×2)，1.47-1.33(5H，br m，內(nèi)酰胺環(huán)CH×2+己環(huán)CH×3)和1.33-1.25(3H，m，己環(huán)CH×3)；δC(125MHz，CDCl3)176.9，167.0(CO)，52.0(NHCHCO)，42.5(C quat)，42.1，35.5(×2)，31.6，28.9，27.9(CH2)，26.4(CH3)，25.8，22.9(×2)(CH2)；m/z(M+C14H24N2O2需要252.18378)252.18323.
實(shí)施例3(S)-3-(環(huán)己-1’-烯羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S，S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺氫-吡咯烷-5-甲酸鹽2(5mmol)與Na2CO3(15mmol)的水(25ml)溶液加入到環(huán)己-1-烯-1-碳酰氯(5mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌12小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×25ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2CO3干燥，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過EtOAc/己烷重結(jié)晶純化，得到內(nèi)酰胺(431mg，36％)；m.p.(EtOAc/己烷)151-152℃；[α]D25(c＝1，CHCl3)+57.5；vmax/cm-13219(NH)，1652，1628(C＝O，C＝C)，1515(NH)；δH(500MHz，CDCl3)7.12(1H，d，J5，CHNH)，6.67(1H，qn，J 1.5，CH＝C)，6.52(1H，br s，CH2NH)，4.54(1H，ddd，J 11，5.5，1.5CHNH)，3.32-3.18(2H，m，CH2NH)，2.30-2.17(2H，m，CH2CH＝C)，2.16-2.10(2H，m，CH＝CCH2)，2.07(1H，br d，J 15，內(nèi)酰胺環(huán)CH)，2.00-1.92(1H，m，內(nèi)酰胺環(huán)CH)，1.87-1.76(2H，m，內(nèi)酰胺環(huán)CH×2)，1.68-1.60(2H，m，己環(huán)CH×2)，1.60-1.52(2H，m，己環(huán)CH×2)和1.50-1.31(2H，br m，內(nèi)酰胺環(huán)CH×2)；δC(125MHz，CDCl3)175.9，167.4(CO)，134.0(CH＝C)，132.8(CH＝C)，52.1(NHCHCO)，42.1，31.6，28.9，27.9，25.3，24.0，22.1，21.5(CH2)；m/z(M+C13H20N2O2需要236.15248)236.15208.
實(shí)施例4(S)-3-(反式-4-’-戊基環(huán)己烷-1-羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S，S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺氫-吡咯烷-5-甲酸鹽2(7mmol)與Na2CO3(21mmol)的水(25ml)溶液加入到反式-4-戊基環(huán)己烷-1-碳酰氯(6mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌12小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×25ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2CO3干燥，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過EtOAc/己烷重結(jié)晶純化，得到內(nèi)酰胺(977mg，53％)；m.p.182-184℃；[α]D25(c＝1，CHCl3)+32.2；vmax/cm-13326(NH)，1670，1636(CO)，1511(NH)；δ(500MHz，CDCl3)6.91(1H，d，J 5.5，CHNH)，6.87-6.70(1H，brm，CH2NH)，4.44(1H，ddd，J 11，6.0，1.5，CHNH)，3.28-3.15(2H，m，CH2NH)，2.08-1.90(3H，br m，環(huán)CH×2+(CH2)2CHCO)，1.88-1.72(6H，m，環(huán)CH+鏈CH2×4)，1.45-1.28(4H，br m，環(huán)CH+鏈CH2×2+鏈CH(CH2)3)，1.27-1.07(9H，br m，環(huán)CH+鏈CH2×8)t0.90-0.79(5H，m，鏈CH2+CH3)；δC(125MHz，CDCl3)176.0，175.3(CO)，51.8(NHCHCO)，45.4(CH)，41.0(CH2)，37.1(CH2)，36.9(CH)，32.5，32.4，32.1，31.7，29.6，29.4，28.9，27.9，26.5，22.6(CH2)and 14.0(CH3)；m/z(M+C18H32N2O2需要308.24638)308.24566.
實(shí)施例5(S)-3-(4’-戊基[2，2，2]雙環(huán)-辛烷-1-羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S，S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺氫-吡咯烷-5-甲酸鹽2(5.5mmol)與Na2CO3(16.5mmol)的水(25ml)溶液加入到反式-4-戊基環(huán)己烷-1-碳酰氯(4.4mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌12小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×25ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2CO3干燥，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過EtOAc/己烷重結(jié)晶純化，得到內(nèi)酰胺(868mg，57％)；m.p.195-196℃；[α]D25(c＝1，CHCl3)+28.7；vmax/cm-13395，3254(NH)，1677，1626(CO)，1501(NH)；δH(500MHz，CDCl3)6.98(1H，d，J 5.5，CHNH)，6.77-6.63(1H，br m，CH2NH)，4.41(1H，dd，J 11，5.5，CHNH)，3.27-3.15(2H，m，CH2NH)，2.00-1.88(2H，br m，環(huán)CH×2)，1.81-1.73(2H，brm，環(huán)CH×2)，1.69(6H，br t，J 7.5，鏈CCH2CH2C×6)，1.43-1.30(8H，br m，環(huán)CH×2+鏈CCH2CH2C×6)，1.24(2H，sext，J 7，CH2CH3)，1.19-1.07(4H，m，CH2CH2CH2CH3)1.05-0.98(2H，m，CH2Bu)和0.82(3H，t，J 7，CH3)；δC(125MHz，CDCl3)177.4，176.1(CO)，51.9(NHCHCO)，42.0，41.2(CH2)，39.0(C quat)，32.7，31.6，30.6(×3)(CH2)，30.4(C quat)，28.9，28.8(×3)，27.9，23.3，22.6(CH2)and 14.0(CH3)；m/z(M+C20H34N2O2需要334.26203)334.26352.
實(shí)施例6(S)-3-(1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺鹽酸鹽2(1mmol)與Na2CO3(3mmol)的水(15ml)溶液加入到1-金剛烷碳酰氯(1mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌2小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×25ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2CO3干燥，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過CH2Cl2/己烷重結(jié)晶純化，得到(S)-3-(1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺(171mg，59％)；m.p.256-258℃；[α]D25(c＝1，CHCl3)+29.5；vmax/cm-13411，3259(NH)，1678，1626(CO)，1505(NH)；δH(500MHz，CDCl3)7.08(1H，d，J 5.5，CHNH)，6.67(1H，br s，CH2NH)，4.47(1H，ddd，.J 11，5.5，1.5，CHNH)，3.32-3.17(2H，m，CH2NH)，2.06-1.94(5H，m，2×環(huán)CH+3×金剛烷CH)，1.90-1.75(8H，m，2×環(huán)CH+3×金剛烷CH2)，1.72(3H，brd，J 14.5，3×金剛烷CHH)，1.68(3H，br d，J 14.5，3×金剛烷CHH)和1.47-1.32(2H，m，2×環(huán)CH)；δC(125MHz，CDCl3)177.2，175.9(CO)，51.9(NHCHCO)，42.2(CH2N)，40.5(CCO)，39.0(3×CH2金剛烷)，36.5(3×CH2金剛烷)，31.7，28.9，28.0(CH2內(nèi)酰胺)，28.1(3×CH金剛烷)；m/z(MH+C17H27N2O2需要291.2073)291.1994.
實(shí)施例7(S)-3-(1’-金剛烷基甲烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺鹽酸鹽2(4mmol)與Na2CO3(12mmol)的水(50ml)溶液加入到1-金剛烷甲烷碳酰氯(4mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌2小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×50ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2SO4干燥，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過EtOAc/己烷重結(jié)晶純化，得到(S)-3-(1’-金剛烷基甲烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺，從EtOAc中重結(jié)晶，得到白色晶體(688mg，56％)；m.p.258-260℃；[α]D25(c＝1，CHCl3)+30.7；vmax/cm-13409，3255(NH)，1682，1611(CO)，1539(NH)；δH(500MHz，CDCl3)6.82(1H，d，J 5.5，CHNH)，6.77(1H，br t，J 5.5，CH2NH)，4.48(1H，ddd，J 11，6，1.5，CHNH)，3.28-3.14(2H，m，CH2NH)，2.04(1H，br d，J 13.5，C-4H)，1.97-1.86(6H，m，C-5H+3×金剛烷CH+CH2CO)，1.84-1.72(2H，m，C-5H+C-6H)，1.63(3H，br d，J 12，金剛烷3×CH2)，1.60-1.54(9H，m，9×金剛烷CH2)和1.47-1.27(2H，m，C-4H+C-6H)；δC(125MHz，CDCl3)175.9(內(nèi)酰胺CO)，170.1(酰胺CO)，52.0(NHCHCO)，51.4(CH2CO)，42.6(3×金剛烷CH2)，42.0(NCH2)，36.7(3×CH2金剛烷)，32.7(Cquat金剛烷)，31.7(C-4)，28.8(C-6)，28.6(3×CH金剛烷)，28.5(C-5)；m/z(M+C18H28N2O2需要304.2151)304.21430.
實(shí)施例8(S)-3-(3’-氯-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺鹽酸鹽2(3mmol)與Na2CO3(9mmol)的水(15ml)溶液加入到3-氯-1-金剛烷碳酰氯(3mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌12小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×25ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2CO3干燥，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過EtOAc/己烷重結(jié)晶純化，得到(S)-3-(3’-氯-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺(621mg，64％)；m.p.204-206℃；[α]D25(c＝0.5，CHCl3)+26.2；vmax/cm-13411，3267(NH)，1679，1630(CO)，1508(NH)；δH(500MHz，CDCl3)7.07(1H，d，J 5.5，CHNH)，6.65-6.44(1H，br m，CH2NH)，4.43(1H，dd，J 11，5.5，CHNH)，3.24-3.17(2H，m，CH2NH)，2.24(2H，br s，金剛烷CH)，2.20(2H，br s，金剛烷CH)，2.12-2.03(4H，m，金剛烷CH)，2.02-1.91(2H，m，2×內(nèi)酰胺環(huán)CH)，1.85-1.72(6H，m，2×環(huán)CH+4×金剛烷CH)，1.66-1.55(2H，m，2×金剛烷CH)and 1.45-1.31(2H，m，2×環(huán)CH)；δC(125MHz，CDCl3)175.9，174.9(CO)，67.4(CCl)，51.9(NHCHCO)，48.6，46.2(×2)(3×CH2金剛烷)，44.5(CCO)，42.1(CH2N)，37.4，37.3，34.5(3×CH2金剛烷)，31.5(CH2內(nèi)酰胺)，31.1(2×CH金剛烷)，28.8，27.9(CH2內(nèi)酰胺)；m/z(MH+C17H26N2O2Cl需要325.1683)325.1696.
實(shí)施例9(S)-3-(3’，5’-二甲基-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺鹽酸鹽2(1mmol)與Na2CO3(3mmol)的水(15ml)溶液加入到3，5-二甲基-1-金剛烷碳酰氯(1mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌12小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×25ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2CO3干燥，在真空中濃縮。殘余物從己烷中重結(jié)晶，得到(S)-3-(3’，5’-二甲基-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺(200mg，63％)；m.p.157-158℃；[α]D25(c＝0.5，CHCl3)+26.8；vmax/cm-13206(NH)，1647(CO)，1548(NH)；δH(500MHz，CDCl3)7.05(1H，d，J 5.0，CHNH)，6.49-6.24(1H，br m，CH2NH)，4.45(1H，ddd，J 11，5.5，1.5，CHNH)，3.30-3.16(2H，m，CH2NH)，2.12-2.07(1H，m，金剛烷CH)，2.04-1.90(2H，m，2×內(nèi)酰胺環(huán)CH)，1.86-1.73(2H，m，2×內(nèi)酰胺環(huán)CH)，1.67(2H，br s，2×金剛烷CH)，1.51-1.26(10H，br m，8×金剛烷CH+2×內(nèi)酰胺環(huán)CH)1.17-1.09(2H，m，金剛烷CH)和0.81(6H，s，2×CH3)；δC(125MHz，CDCl3)176.9，176.0(CO)，51.9(NHCHCO)，50.6，45.2(×2)，42.7(×2)(CH2金剛烷)，42.4(CCO)，42.1(CH2N)，37.7(CH2金剛烷)，31.6(CH2內(nèi)酰胺)，31.0(2×CCH3)，30.4，29.3(CH3)，28.9 and 27.9(CH2內(nèi)酰胺)；m/z(MH+C19H31N2O2需要319.2386)319.2372.
實(shí)施例10(S)-3-(3’，5’，7’-三甲基-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺在環(huán)境溫度下，將(S)-3-氨基-己內(nèi)酰胺鹽酸鹽2(1mmol)與Na2CO3(3mmol)的水(15ml)溶液加入到3，5，7-三甲基-1-金剛烷碳酰氯(1mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中，將反應(yīng)攪拌12小時(shí)。然后分離有機(jī)層，水相用另外的二氯甲烷萃取(2×25ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)Na2CO3干燥，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過EtOAc/己烷重結(jié)晶純化，得到(S)-3-(3’，5’，7’-三甲基-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺(188mg，56％)；m.p.177-178℃；[α]D25(c＝0.5，CHCl3)+25.6；vmax/cm-13377，3220(NH)，1677，1623(CO)，1514(NH)；δH(500MHz，CDCl3)7.06(1H，d，J 5.0，CHNH)，6.40-6.15(1H，br m，CH2NH)，4.46(1H，ddd，J 11，5.5，1.5，CHNH)，3.32-3.17(2H，m，CH2NH)，2.03-1.92(2H，m，2×內(nèi)酰胺環(huán)CH)，1.86-1.74(2H，m，2×內(nèi)酰胺環(huán)CH)1.47-1.32(8H，m，2×環(huán)CH+6×金剛烷CH)1.06(3H，br d，J 12，3×金剛烷CHH)，1.04(3H，br d，J 12，3×金剛烷CHH)和0.83(9H，s，3×CH3)；δC(125MHz，CDCl3)176.8，176.0(CO)，51.9(NHCHCO)，50.0(3×CH2金剛烷)，44.6(3×CH2金剛烷)，43.4(CCO)，42.1(CH2N)，31.8(3×CCH3)，31.7(CH2內(nèi)酰胺)，30.0(3×CH3)，28.9，27.9(CH2內(nèi)酰胺)；m/z(MH+C20H33N2O2需要333.2542)333.2528.
本發(fā)明產(chǎn)物的藥理研究抑制MCP-1誘導(dǎo)的白細(xì)胞移行測定原理本發(fā)明化合物的生物活性可以利用任何多種體外白細(xì)胞移行功能測定法加以證明，包括但不限于Boyden室與相關(guān)跨孔移行測定法、瓊脂糖下移行測定法和直接肉眼觀察室，例如Dunn室。
例如，為了證明抑制響應(yīng)于趨化因子(而非其他化學(xué)引誘劑)的白細(xì)胞移行，使用來自Neuroprobe(Gaithersburg，MD，USA)的96-孔微量跨孔測定系統(tǒng)。原則上，這種測定法由被多孔膜隔開的兩個(gè)室組成。將化學(xué)引誘劑放置在下部室內(nèi)，將細(xì)胞放置在上部室內(nèi)。在37℃下溫育一段時(shí)間后，細(xì)胞朝向化學(xué)引誘劑移動(dòng)，下部室內(nèi)的細(xì)胞數(shù)與化學(xué)引誘劑活性成比例(相對(duì)于一系列對(duì)照而言)。
這種測定法可以適用一些不同的白細(xì)胞種群。例如，可以使用新鮮制備的人外周血白細(xì)胞。作為替代選擇，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如密度梯度離心或磁性珠粒分離，可以制備白細(xì)胞亞群，包括多形核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞。作為替代選擇，可以使用已被廣泛驗(yàn)證為人外周血白細(xì)胞模型的無限增殖化細(xì)胞系，包括但不限于作為單核細(xì)胞模型的THP-1細(xì)胞或者作為幼稚T細(xì)胞模型的Jurkat細(xì)胞。
盡管有一些測定條件是證明抑制趨化因子-誘導(dǎo)的白細(xì)胞移行可接受的，不過提供具體的實(shí)例。
材料跨孔移行系統(tǒng)是由Neuroprobe，Gaithersburg，MD，USA制造的。
所用平板為ChemoTx平板(Neuroprobe 101-8)和30μl透明平板(Neuroprobe MP30)。
Geys平衡鹽溶液是從Sigma購買的(Sigma G-9779)。
無脂肪酸BSA是從Sigma購買的(Sigma A-8806)。
MTT、即3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物是從Sigma購買的(Sigma M-5655)。
不含酚紅的RPMI-1640是從Sigma購買的(Sigma R-8755)。
使用THP-1細(xì)胞系(European Cell culture Collection)作為白細(xì)胞種群。
試驗(yàn)方案利用下列工藝測試本發(fā)明化合物對(duì)MCP-1誘導(dǎo)的白細(xì)胞移行的影響首先，制備所要放置在上部室內(nèi)的細(xì)胞懸液。離心(770xg；4min)沉淀出THP-1細(xì)胞，用含有1mg/ml BSA的Geys平衡鹽溶液(GBSS+BSA)洗滌。然后重復(fù)這種洗滌，重新使細(xì)胞沉淀，然后重新懸浮在少量GBSS+BSA中供計(jì)數(shù)，例如利用標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。
然后根據(jù)細(xì)胞數(shù)調(diào)整GBSS+BSA的體積，以便細(xì)胞的最終濃度為4.45×106細(xì)胞每ml GBSS+BSA。這樣確保在每25μl將要放置在平板上部室內(nèi)的溶液中存在100,000 THP-1細(xì)胞。
為了測試單一化合物抑制MCP-1誘導(dǎo)的移行的能力，有必要準(zhǔn)備兩批細(xì)胞。將4.45×106細(xì)胞/ml的THP-1細(xì)胞懸液分成兩批。向其中一批加入適當(dāng)最終濃度的供試抑制劑在適當(dāng)載體中的溶液(例如1μM，載體為不超過1％的DMSO)。向第二批加入等體積的GBSS+BSA，酌情加上載體(例如不超過1％的DMSO)，作為對(duì)照。
下面，制備所要放置在下部室內(nèi)的化學(xué)引誘劑溶液。將MCP-1稀釋在GBSS+BSA中，得到最終濃度為25ng/ml。將其分成兩批，與細(xì)胞懸液一樣。向其中一批加入供試化合物，最終濃度與向細(xì)胞懸液中加入的相同，向另一批加入等體積的GBSS+BSA，酌情加上載體(例如不超過1％的DMSO)。
注意，在建立下部室內(nèi)溶液中MCP-1的最終濃度和上部室內(nèi)細(xì)胞的最終濃度時(shí)，需要考慮為加入供試化合物所加入的液體體積。
一旦已經(jīng)制備用于下部小孔的化學(xué)引誘劑溶液和用于上部室的細(xì)胞溶液，應(yīng)當(dāng)裝配移行室。將29μl適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)引誘劑溶液放置在下部小孔內(nèi)。每種條件應(yīng)當(dāng)進(jìn)行至少一式三份測定。一旦已經(jīng)填充所有下部室，按照廠商指導(dǎo)向該室安裝多孔膜。最后，向每一上部室加入25μl適當(dāng)?shù)募?xì)胞溶液。將塑料蓋放置在整個(gè)裝置上，防止蒸發(fā)。
將裝配好的室在37℃、5％CO2下溫育2小時(shí)。在試管中也在等同條件下溫育細(xì)胞在GBSS+BSA中的懸液這些細(xì)胞將用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，供測定在每一條件下移行至下部室的細(xì)胞數(shù)。
在溫育結(jié)束時(shí)，小心地從上部室除去液體細(xì)胞懸液，向上部室加入20μl冰冷的20mM EDTA的PBS溶液，將裝置在4℃下溫育15min。這種工藝導(dǎo)致所有細(xì)胞粘附于膜的下側(cè)，落入下部室內(nèi)。
這種溫育之后，將濾器小心地用GBSS+BSA沖洗，以洗去EDTA，然后除去濾器。
然后可以借助多種方法測定在每種條件下移行至下部室的細(xì)胞數(shù)，包括直接計(jì)數(shù)、用熒光或放射性標(biāo)志物標(biāo)記或者使用活體染劑。通常，我們采用活體染劑MTT。向每孔加入3μl儲(chǔ)備MTT溶液，然后將平板在37℃下溫育1-2小時(shí)，在此期間細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶轉(zhuǎn)化可溶性MTT為不溶性藍(lán)色甲 產(chǎn)物，可以用分光光度法量化。
并列設(shè)置8-點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。開始于向每一上部室加入的細(xì)胞數(shù)(100,000)，繼之以在GBSS+BSA中的2-倍系列稀釋液，向平板加入25μl細(xì)胞，并且加入3μl MTT儲(chǔ)備溶液。沿著移行平板溫育標(biāo)準(zhǔn)曲線平板。
在這種溫育結(jié)束時(shí)，小心地從下部室除去液體，注意不要擾亂已沉淀的甲 產(chǎn)物。簡單風(fēng)干后，向每一下部室加入20μl DMSO，以增溶藍(lán)色染劑，利用96-孔平板讀數(shù)器測定在595nm下的吸光度。然后向標(biāo)準(zhǔn)曲線插入每孔吸光度，以估計(jì)每一下部室中的細(xì)胞數(shù)。
從到達(dá)含有25ng/ml MCP-1的下部室的平均細(xì)胞數(shù)中減去到達(dá)沒有加入MCP-1的小孔下部室的平均細(xì)胞數(shù)，測定MCP-1刺激的移行。
通過比較在有或沒有各種濃度供試物質(zhì)的存在下發(fā)生的MCP-1誘導(dǎo)的移行，計(jì)算供試物質(zhì)的影響。通常，抑制移行以總MCP-1誘導(dǎo)的移行因化合物的存在而受阻滯的百分比表示。就大多數(shù)化合物而言，通過測定抑制在一定范圍的不同化合物濃度下(通常從1nM至1μM，或者更高，在弱活性化合物的情況下)發(fā)生的MCP-1誘導(dǎo)的移行，構(gòu)建劑量-響應(yīng)圖。然后，每種化合物的抑制活性以減少M(fèi)CP-1誘導(dǎo)的移行達(dá)50％所需化合物濃度(ED50濃度)表示。
結(jié)果測試了實(shí)施例1至8和10化合物，在本試驗(yàn)中其顯示100nM或以下的ED50。
對(duì)映體選擇性可以合成氨基己內(nèi)酰胺系列的兩種不同成員的(S)-和(R)-對(duì)映體，以測定生物活性是否顯示對(duì)映體選擇性。
利用跨孔移行測定法可以測定每種化合物作為MCP-1誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞移行抑制劑的劑量-響應(yīng)曲線。
就本發(fā)明化合物作為體內(nèi)抗炎劑的應(yīng)用而言，優(yōu)選使用化合物的純(S)-對(duì)映體，而不是兩種對(duì)映體的外消旋混合物或者純(R)-對(duì)映體。
權(quán)利要求
1.通式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備治療炎性障礙的藥物 其中X是-CO-Y-(R1)n或SO2-Y-(R1)n；Y是環(huán)烷基或多環(huán)烷基(例如金剛烷基、金剛烷甲基、雙環(huán)辛基、環(huán)己基、環(huán)丙基)；或者是環(huán)烯基或多環(huán)烯基；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫或者烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、鏈烯基、炔基或烷基氨基原子團(tuán)，具有1至20個(gè)碳原子(例如5至20個(gè)碳原子、8至20個(gè)碳原子、9至20個(gè)碳原子、10至18個(gè)碳原子、12至18個(gè)碳原子、13至18個(gè)碳原子、14至18個(gè)碳原子、13至17個(gè)碳原子)；或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自氟、氯、溴、碘、羥基、氧基烷基、氨基、氨基烷基或氨基二烷基原子團(tuán)；n是1至m的任意整數(shù)，其中m是環(huán)狀基團(tuán)Y上可允許的最大取代數(shù)；或者作為替代選擇，R1選自肽基原子團(tuán)，具有1至4個(gè)肽片段，通過肽鍵連接在一起。
2.式(I’)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備治療炎性障礙的藥物 (I’)其中X具有上述相同含義。
3.藥物組合物，包含作為活性成分的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體 其中X是-CO-Y-(R1)n或SO2-Y-(R1)n；Y是環(huán)烷基或多環(huán)烷基(例如金剛烷基、金剛烷甲基、雙環(huán)辛基、環(huán)己基、環(huán)丙基)；或者是環(huán)烯基或多環(huán)烯基；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫或者烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、鏈烯基、炔基或烷基氨基原子團(tuán)，具有1至20個(gè)碳原子(例如5至20個(gè)碳原子、8至20個(gè)碳原子、9至20個(gè)碳原子、10至18個(gè)碳原子、12至18個(gè)碳原子、13至18個(gè)碳原子、14至18個(gè)碳原子、13至17個(gè)碳原子)；或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自氟、氯、溴、碘、羥基、氧基烷基、氨基、氨基烷基或氨基二烷基原子團(tuán)；n是1至m的任意整數(shù)，其中m是環(huán)狀基團(tuán)Y上可允許的最大取代數(shù)；或者作為替代選擇，R1選自肽基原子團(tuán)，具有1至4個(gè)肽片段，通過肽鍵連接在一起(例如1至4個(gè)氨基酸殘基的肽基原子團(tuán))。
4.藥學(xué)上可接受的組合物，包含作為活性成分的式(I’)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體 (I’)其中X具有上述相同含義。
5.通式(I)化合物 其中X是-CO-Y-(R1)n或SO2-Y-(R1)n；Y是環(huán)烷基或多環(huán)烷基(例如金剛烷基、金剛烷甲基、雙環(huán)辛基、環(huán)己基、環(huán)丙基)；或者是環(huán)烯基或多環(huán)烯基；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫或者烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、鏈烯基、炔基或烷基氨基原子團(tuán)，具有1至20個(gè)碳原子(例如5至20個(gè)碳原子、8至20個(gè)碳原子、9至20個(gè)碳原子、10至18個(gè)碳原子、12至18個(gè)碳原子、13至18個(gè)碳原子、14至18個(gè)碳原子、13至17個(gè)碳原子)；或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自氟、氯、溴、碘、羥基、氧基烷基、氨基、氨基烷基或氨基二烷基原子團(tuán)；n是1至m的任意整數(shù)，其中m是環(huán)狀基團(tuán)Y上可允許的最大取代數(shù)；或者作為替代選擇，R1選自肽基原子團(tuán)，具有1至4個(gè)肽片段，通過肽鍵連接在一起。
6.通式(I’)化合物 其中X具有上述相同含義。
7.根據(jù)任意在先權(quán)利要求的通式(I)或(I’)化合物或它們藥學(xué)上可接受的鹽的化合物、組合物和用途，其中Y的一個(gè)或多個(gè)環(huán)限制α-碳的鍵角為本質(zhì)上四面體的(也就是sp3雜化鍵)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的用途或者根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物或者根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中該化合物選自下組-(S)-3-(環(huán)己烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(1’-甲基環(huán)己烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(環(huán)己-1’-烯羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(反式-4’-戊基環(huán)己烷-1-羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(4’-戊基[2，2，2]雙環(huán)-辛烷-1-羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(1’-金剛烷基甲烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(3’-氯-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(3’，5’-二甲基-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；-(S)-3-(3’，5’，7’-三甲基-1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺；及其磺?；愃莆铮缓推渌帉W(xué)上可接受的鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的用途或者根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物或者根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中該化合物是(S)-3-(1’-金剛烷羰基)氨基-己內(nèi)酰胺及其藥學(xué)上可接受的鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、8和9之一的式(I)或(I’)化合物的用途，其中該炎性障礙選自自身免疫疾病、血管障礙、病毒感染或復(fù)制、哮喘、骨質(zhì)疏松(低骨礦質(zhì)密度)、腫瘤生長、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、器官移植排斥和/或移植物或器官功能遲緩、以TNF-α水平升高為特征的障礙、牛皮癬、皮膚傷口、由細(xì)胞內(nèi)寄生蟲導(dǎo)致的障礙、變態(tài)反應(yīng)、阿爾茨海默氏病、抗原誘導(dǎo)的回憶應(yīng)答、免疫應(yīng)答抑制、多發(fā)性硬化、ALS、纖維化和粘連形成。
11.治療、改善或預(yù)防炎性疾病癥狀(包括對(duì)于任何物質(zhì)的不良炎性反應(yīng))的方法，該方法給予患者抗炎量的如任意權(quán)利要求1至9所要求保護(hù)的化合物、組合物或藥物。
12.根據(jù)任意在先權(quán)利要求的通式(I)或(I’)化合物或它們藥學(xué)上可接受的鹽的化合物、組合物和用途或治療方法，其中取代基R1不是直鏈烷基。
13.根據(jù)任意在先權(quán)利要求的通式(I)或(I’)化合物或它們藥學(xué)上可接受的鹽的化合物、組合物和用途或治療方法，其中取代基R1是支鏈烷基。
14.根據(jù)任意在先權(quán)利要求的通式(I)或(I’)化合物或它們藥學(xué)上可接受的鹽的化合物、組合物和用途或治療方法，其中取代基R1不是烷基。
全文摘要
本發(fā)明提供通式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的化合物、組合物和用途，它們是3－氨基己內(nèi)酰胺衍生物，用于制備治療炎性障礙的藥物，其中，X是－CO－Y－(R
文檔編號(hào)C07D233/10GK101014347SQ200580030186
公開日2007年8月8日 申請日期2005年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月11日
發(fā)明者D·J·格蘭杰, D·J·?？怂?申請人:劍橋企業(yè)有限公司