專利名稱：Hk1結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
無
背景技術(shù)：
人類組織血管舒緩素包含hK1，一種由KLK1基因編碼的蛋白質(zhì)，且有時(shí)稱為胰/腎血管舒緩素、hPRK或GenBankM25629或M33105。通常參見Yousef等人，(2001)Endocrine Reviews 22184-204。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明尤其提供hK1結(jié)合蛋白?！癶K1結(jié)合蛋白”指可與hK1或其片段，尤其其蛋白酶活性片段相互作用的蛋白質(zhì)。hK1結(jié)合蛋白包含以高親和力與hK1結(jié)合的抗體和可抑制hK1酶活性的抗體。可將HK1結(jié)合蛋白投與至受檢者(例如)以治療病癥，所述病癥諸如哮喘(例如，過敏性哮喘和非過敏性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、鼻炎、竇炎、炎性腸病(諸如克羅恩氏病(Crohn′s disease)和潰瘍性結(jié)腸炎)、免疫介導(dǎo)糖尿病、急性胰腺炎、間質(zhì)性膀胱炎和贅生性病癥(例如，轉(zhuǎn)移性胰腺癌或腫瘤血管生成)或其它hK1相關(guān)病癥。
一方面，本發(fā)明的特征在于與hK1結(jié)合且包含重鏈免疫球蛋白可變域序列和輕鏈免疫球蛋白可變域序列的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)可結(jié)合于或空間上咬合hK1的活性位點(diǎn)。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)接觸一個(gè)或一個(gè)以上hK1活性位點(diǎn)殘基65、120或214，或所述殘基的5個(gè)氨基酸內(nèi)的殘基。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)抑制hK1酶活性。舉例而言，所述蛋白質(zhì)可抑制hK1，其中IC50小于200nM、80nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2.5nM或1nM，例如IC50在1nM與20nM之間，和在其它間于其中的范圍內(nèi)。所述蛋白質(zhì)可結(jié)合于hK1，其中Kd小于10-7M、10-8M、5×10-9M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M，例如Kd在10-8M與10-11M之間，和在其它間于其中的范圍內(nèi)。
在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)阻止hK1與大于12個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)底物相互作用，所述蛋白質(zhì)底物例如，高分子量激肽原、低分子量激肽原、表皮生長(zhǎng)因子、前胰島素、低密度脂蛋白、凝乳酶原、血管活性腸肽、原膠原酶和/或血管緊張素原。在另一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)阻止hK1與小于12個(gè)氨基酸的肽底物相互作用。
在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)不能結(jié)合由抗蛋白酶或諸如α1-抗胰蛋白酶或血管舒緩素結(jié)合蛋白(kallistatin)的其它蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑去活的hK1分子。
在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)并不引起人類體內(nèi)的免疫原性反應(yīng)。舉例而言，所述蛋白質(zhì)為人源化抗體、人類抗體或有效人類抗體。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上人類CDR，例如至少3、4、5或6個(gè)人類CDR。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上本文所述的CDR，例如一個(gè)或一個(gè)以上SEQ ID NO1-1020和1380-1385的CDR。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上，例如3、4、5、6個(gè)SEQ ID NO7、8、9、10、11和12的CDR。在另一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上，例如3、4、5或6個(gè)SEQ ID NO1380、1381、1382、1383、1384和1385的CDR。在另一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上，例如3、4、5、6個(gè)SEQ ID NO109、110、111、112、113和114的CDR。在另一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上，例如3、4、5、6個(gè)SEQ ID NO151、152、153、154、155和156的CDR。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上人類構(gòu)架區(qū)或大體上人類構(gòu)架區(qū)，例如包含至少3、4、5或6個(gè)人類構(gòu)架區(qū)。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上來自具有SEQ ID NO1199-1369和1377氨基酸序列的可變重鏈的構(gòu)架區(qū)和/或一個(gè)或一個(gè)以上來自具有SEQ ID NO1022-1198和1376的氨基酸序列的可變輕鏈的構(gòu)架區(qū)。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上來自SEQ ID NO1245可變重鏈序列的構(gòu)架區(qū)和/或一個(gè)或一個(gè)以上來自SEQ ID NO1070可變輕鏈序列的構(gòu)架區(qū)。在另一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上來自SEQ ID NO1206的可變重鏈序列的構(gòu)架區(qū)和/或一個(gè)或一個(gè)以上來自SEQ ID NO1029的可變輕鏈序列的構(gòu)架區(qū)。在另一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或一個(gè)以上來自SEQ ID NO1354的可變重鏈序列的構(gòu)架區(qū)和/或一個(gè)或一個(gè)以上來自SEQ ID NO1183的可變輕鏈序列的構(gòu)架區(qū)。
HC CDR1可包含具有至少5個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸序列，其中至少3、4或5個(gè)氨基酸與本文所述的抗體的HC CDR1序列(例如，SEQ ID NO10、112、154或1383的HC CDR1)一致。
HC CDR2可包含具有至少15、16或17個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸序列，其中至少10、12、14、15、16或17個(gè)氨基酸與本文所述的抗體的HC CDR2序列(例如，SEQ ID NO11、113、155或1384的HC CDR2)一致。HC CDR2可包含具有至少17個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸序列，其中至少14、15、16或17個(gè)氨基酸與本文所述的抗體的HC CDR2序列(例如，SEQ ID NO11、113、155或1384的HC CDR2)一致。
HC CDR3可包含具有至少7或8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸序列，其中至少5、6、7或8個(gè)氨基酸與本文所述的抗體的HC CDR3序列(例如，SEQ ID NO12、114、156或1385的HC CDR3)一致。
LC CDR1、CDR2和/或CDR3可包含某些氨基酸序列，所述氨基酸序列與本文所述的抗體的相應(yīng)LC CDR序列(例如SEQ ID NO7、109、151或1380的LC CDR1、SEQID NO8、110、152或1381的LC CDR2、SEQ ID NO9、111、153或1382的LC CDR3)一致或每10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度少于兩個(gè)氨基酸不同。
在一實(shí)施例中，H1和H2高變環(huán)具有與本文所述的抗體相同的正則結(jié)構(gòu)。在一實(shí)施例中，L1和L2高變環(huán)具有與本文所述的抗體相同的正則結(jié)構(gòu)。
在一實(shí)施例中，HC可變域序列的氨基酸序列與本文所述的抗體的HC可變域的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO1206、1245或1354的HC可變域)至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％一致。在一實(shí)施例中，LC可變域序列的氨基酸序列與本文所述的抗體的LC可變域的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO1029、1070或1183的LC可變域)至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％一致。舉例而言，HC和LC可變域序列的氨基酸序列與本文所述的抗體的HC和LC可變域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO1245的HC可變域和SEQ ID NO1070的輕鏈可變域、SEQ ID NO1206的HC可變域和SEQ ID NO1029的輕鏈可變域、SEQ ID NO1354的HC可變域和SEQ ID NO1183的輕鏈可變域)至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％一致。
HC和LC可變域序列的氨基酸序列可由一序列編碼，所述序列在高度嚴(yán)格條件下與本文所述的核酸序列或編碼可變域的核酸序列雜交或與編碼本文所述的氨基酸序列(例如SEQ ID NO1245和/或SEQ ID NO1070、SEQ ID NO1206和/或SEQ ID NO1029、SEQ ID NO1354和/或SEQ ID NO1183的氨基酸序列)的核酸雜交。在一實(shí)施例中，HC和/或LC可變域的一個(gè)或一個(gè)以上構(gòu)架區(qū)(例如，F(xiàn)R1、FR2、FR3和/或FR4)的氨基酸序列與本文所述的抗體的HC和LC可變域的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)(例如SEQ ID NO1245和/或SEQ ID NO1070、SEQ ID NO1206和/或SEQ ID NO1029、SEQ ID NO1354和/或SEQ ID NO1183的氨基酸序列)至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％一致。在一實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上重鏈構(gòu)架區(qū)(例如，HC FR1、FR2和FR3)與來自人類生殖系抗體的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的序列(例如，VHIII生殖系抗體或與H1和H2高變環(huán)中的1-3正則結(jié)構(gòu)兼容的生殖系抗體序列)至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或100％一致。
在一實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上輕鏈構(gòu)架區(qū)與人類生殖系抗體的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或100％一致。
在一實(shí)施例中，重鏈可變域序列形成具有H1和H2高變環(huán)的1-3 Chothia正則結(jié)構(gòu)的可變域。
HC CDR3可包含R-(RV)-G-X-(WY)-(YG)-(AGS)-(FM)-D-(YIV)-W。HC CDR3可包含Y-(YP)-Y-(YG)-(AG)-(MF)-D-(VI)。LC CDR1可包含(RG)-A-S-(QS)-S-(IV)-(SG)-(SG)-Y-(LY)-(NA)。LC CDR1 可包含(RGV)-A-S-(QS)-S-(IV)-(SG)-(ST)-(YN)-L-(NA)。LC CDR1可包含R-A-S-Q-X-I-(SG)-(SLG)-X-(LY)。LC CDR2可包含I-Y-(AG)-(AV)-S-(NS)-(RL)-(PA)-S-G-(VI)。LC CDR2可包含I-Y-(AG)-(AV)-S-S-(RL)-(PAQ)-(ST)-G-(VI)。LC CDR3 可包含Q-Q-(YS)-(TANGY)-S-(SPT)-(PS)-X-T-F。LC CDR3 可包含(CA)-Q-(QW)-(YD)-D-S-L-P-X-T-F或(CA)-Q-(QW)-(YD)-D-S-L-P-G-T-F。提供于圓括號(hào)中的氨基酸指示在所給位置的替代。
在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)結(jié)合由本文所述的例如DX-2300、M093-F09、M137-E01和M0097-B12抗體的抗體結(jié)合的抗原決定基的所有或部分。所述蛋白質(zhì)可抑制(例如競(jìng)爭(zhēng)性抑制)本文所述的例如DX-2300、M093-F09、M137-E01和M0097-B12抗體的抗體與hK1的結(jié)合。蛋白質(zhì)可結(jié)合例如構(gòu)形抗原決定基或線性抗原決定基的抗原決定基，所述抗原決定基當(dāng)結(jié)合時(shí)阻止本文所述的例如DX-2300、M093-F09、M137-E01和M0097-B12抗體的抗體與hK1的結(jié)合。所述抗原決定基可鄰近空間上或功能上相關(guān)聯(lián)的(例如重疊或鄰接)抗原決定基以線性序列或構(gòu)形間距靠近由本文所述的例如DX-2300、M093-F09、M137-E01和M0097-B12抗體的抗體識(shí)別的抗原決定基。
所述蛋白質(zhì)可為全長(zhǎng)抗體(例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(例如，IgA1、IgA2)、IgD和IgE，但優(yōu)選地為IgG)或可僅包含抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab′)2或scFv片段，或一個(gè)或一個(gè)以上CDR)?？贵w或其抗原結(jié)合片段可包含兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈或可為單鏈抗體?？贵w視需要可包含選自κ、λ、α、γ、δ、ε或μ恒定區(qū)基因的恒定區(qū)。優(yōu)選抗體包含大體上來自人類抗體的重與輕鏈恒定區(qū)，例如人類IgG1恒定區(qū)、其部分或一致序列。
在一實(shí)施例中，hK1結(jié)合蛋白結(jié)合hK1且抑制或降低hK1的hK1催化活性。在一實(shí)施例中，對(duì)于hK1而言，hK1結(jié)合蛋白可具有小于50nM、40nM、30nM、20nM、5nM、1nM、500pM、100pM、50pM、30pM的Ki。hK1結(jié)合蛋白可比另一蛋白酶優(yōu)先至少100、200、500或1000倍抑制hK1酶活性。
本發(fā)明的特征也在于編碼本文所述多肽中的每一個(gè)的核酸。所述核酸可包含同源密碼子或可經(jīng)轉(zhuǎn)譯以產(chǎn)生各自的多肽的任何密碼子組。舉例而言，所述核酸可包含一個(gè)或一個(gè)以上密碼子，所述密碼子為可經(jīng)轉(zhuǎn)譯以產(chǎn)生各自的多肽的常見密碼子且對(duì)其在其中表達(dá)的細(xì)胞類型而言為常見的。在一實(shí)施例中，對(duì)于所編碼的多肽在其中表達(dá)的細(xì)胞而言，所述核酸包含至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的常見密碼子。在一實(shí)施例中，所述核酸編碼SEQ ID NO1245的重鏈序列和/或SEQ ID NO1070的輕鏈序列、SEQ ID NO1206的重鏈序列和/或SEQ ID NO1029的輕鏈序列、SEQID NO1354的重鏈序列和/或SEQ ID NO1183的輕鏈序列。在一實(shí)施例中，所述核酸編碼SEQ ID NO1245的重鏈序列且(例如)就在中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)而言，一個(gè)或一個(gè)以上密碼子為常見密碼子，例如，所述核酸包含SEQ ID NO1379的核苷酸序列。在一實(shí)施例中，所述核酸編碼SEQ ID NO1070的輕鏈序列且(例如)就在中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)而言，一個(gè)或一個(gè)以上密碼子為常見密碼子，例如，所述核酸包含SEQ ID NO1378的核苷酸序列。另外，本發(fā)明的特征在于一種包含本文所述的核酸的宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明的特征在于一種產(chǎn)生hK1結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段的方法。所述方法包含提供含有編碼包含例如如本文所述的重鏈可變區(qū)的重鏈可變區(qū)的多肽的第一核酸序列的宿主細(xì)胞；提供編碼包含例如如本文所述的輕鏈可變區(qū)的輕鏈可變區(qū)的多肽的第二核酸序列；和在允許組裝所述輕與重鏈可變區(qū)的條件下在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述第一與第二核酸序列以形成與hK1相互作用的抗原結(jié)合蛋白。所述第一核酸序列與所述第二核酸序列可相連或不相連，例如分別于相同或不同載體上表達(dá)。所述第一核酸序列與所述第二核酸序列可為同一分子的組分或可駐留在不同分子(例如，不同染色體或質(zhì)粒)上。
宿主細(xì)胞可為例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞的真核細(xì)胞或例如大腸桿菌(E.coli)的原核細(xì)胞。舉例而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可為培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞株。例示性哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含淋巴細(xì)胞株(例如，NSO)、CHO、COS細(xì)胞、卵母細(xì)胞和來自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞(例如乳腺上皮細(xì)胞)。舉例而言，編碼本文所述的抗體的核酸可表達(dá)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中。在一實(shí)施例中，將所述核酸置放于組織特異性啟動(dòng)子(例如，乳腺特異性啟動(dòng)子)的控制下且在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生抗體。舉例而言，抗體分子分泌于諸如轉(zhuǎn)基因母牛、豬、馬、羊、山羊或嚙齒動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳液中。
本發(fā)明的特征也在于一種改善hK1相關(guān)病癥的方法。所述方法包含將有效改善所述病癥或其至少一種癥狀的量的hK1結(jié)合蛋白(例如，如本文所述)投與至受檢者。所述病癥可為發(fā)炎性病癥。所述病癥可為(例如)COPB、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥。所述病癥可為鼻炎、竇炎、炎性腸病(諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、免疫介導(dǎo)糖尿病、急性胰腺炎、間質(zhì)性膀胱炎或贅生性病癥(例如，轉(zhuǎn)移性胰腺癌或腫瘤血管生成)。所述蛋白質(zhì)可包含本文所述的其它特征。所述蛋白質(zhì)通常包含包括輕鏈(LC)可變域序列和重鏈(HC)可變域序列的抗原結(jié)合位點(diǎn)。所述蛋白質(zhì)可呈IgG或Fab形式。通常，所述蛋白質(zhì)在受檢者體內(nèi)并不具有免疫原性，例如所述蛋白質(zhì)包含人類或有效人類框架和恒定域，例如，經(jīng)修飾的人類恒定域。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)抑制hK1。所述方法可包含本文所述的其它特征。
本發(fā)明的特征也在于一種預(yù)防或治療hK1相關(guān)病癥的方法。所述方法包含將有效預(yù)防或治療所述病癥、延遲其至少一種癥狀發(fā)作或改善其至少一種癥狀的量的hK1結(jié)合蛋白(例如，如本文所述)投與至受檢者。舉例而言，所述病癥為哮喘(例如，過敏性哮喘和非過敏性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、鼻炎、竇炎、炎性腸病(諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、免疫介導(dǎo)糖尿病、急性胰腺炎、間質(zhì)性膀胱炎或贅生性病癥(例如，轉(zhuǎn)移性胰腺癌或腫瘤血管生成)。所述蛋白質(zhì)可包含本文所述的其它特征。所述蛋白質(zhì)通常包含包括輕鏈(LC)可變域序列和重鏈(HC)可變域序列的抗原結(jié)合位點(diǎn)。所述蛋白質(zhì)可呈IgG或Fab形式。通常，所述蛋白質(zhì)在受檢者體內(nèi)并不具有免疫原性，例如，所述蛋白質(zhì)包含人類或有效人類框架和恒定域，例如，經(jīng)修飾的人類恒定域。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)抑制hK1。所述方法可包含本文所述的其它特征。
本發(fā)明的特征也在于一種調(diào)節(jié)受檢者中氣管發(fā)炎或氣管過度反應(yīng)的方法。所述方法包含將有效(i)降低支氣管組織血管舒緩素活性，(ii)降低受檢者中氣管發(fā)炎和/或(iii)降低受檢者中氣管過度反應(yīng)的量的hK1結(jié)合蛋白(例如，如本文所述)投與至受檢者。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是(例如)使用計(jì)量吸入器經(jīng)吸入投與。在另一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是經(jīng)皮下注射投與。
另一方面，本發(fā)明的特征在于一種預(yù)防或治療血管生成相關(guān)病癥的方法。所述方法包含將有效降低血管生成和/或改善例如贅生性病癥的血管生成相關(guān)病癥的量的hK1結(jié)合蛋白(例如，如本文所述)投與至受檢者。舉例而言，所述病癥為以惡性腫瘤生長(zhǎng)為特征的贅生性病癥。所述蛋白質(zhì)可由多種方法投與，例如，例如皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。在一實(shí)施例中，將所述蛋白質(zhì)局部投與至腫瘤處。
hK1結(jié)合蛋白(第一藥劑)可與有效治療贅生性病癥的第二藥劑組合投與。舉例而言，第二藥劑調(diào)節(jié)VEGF類生長(zhǎng)因子的活性，例如，第二藥劑調(diào)節(jié)VEGF或VEGF受體的活性。在一實(shí)施例中，第二藥劑為與VEGF結(jié)合的抗體。本文提供第二藥劑的其它實(shí)例。
如本文所使用，“組合投與”意謂將兩種或兩種以上藥劑同時(shí)或在一定間隔內(nèi)投與至受檢者以致存在各藥劑對(duì)患者的效應(yīng)的重疊。優(yōu)選地，所述第一藥劑與所述第二藥劑的投與間隔足夠靠近以致達(dá)成組合效應(yīng)。所述間隔可為分鐘間隔、小時(shí)間隔、天間隔或周間隔。通常，藥劑在受檢者體內(nèi)同時(shí)具有生物可用性，例如可檢測(cè)。所述第一藥劑與所述第二藥劑可以任一順序投與。在一優(yōu)選實(shí)施例中，將所述藥劑中的一個(gè)(例如第一藥劑)在投與另一藥劑(例如，第二藥劑)的數(shù)分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)或4小時(shí)或甚至一或兩天內(nèi)投與至少一次。
在一實(shí)施例中，將所述第一藥劑與所述第二藥劑同時(shí)投與。舉例而言，將所述第一藥劑與所述第二藥劑共同調(diào)配。在另一實(shí)施例中，將所述第一藥劑與所述第二藥劑在不同時(shí)間投與。
所述蛋白質(zhì)可包含本文所述的其它特征。所述蛋白質(zhì)通常包含包括輕鏈(LC)可變域序列和重鏈(HC)可變域序列的抗原結(jié)合位點(diǎn)。所述蛋白質(zhì)可呈IgG或Fab的形式。通常，所述蛋白質(zhì)在受檢者體內(nèi)并不具有免疫原性，例如，所述蛋白質(zhì)包含人類或有效人類框架和恒定域，例如，經(jīng)修飾的人類恒定域。在一實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)抑制hK1。所述方法可包含本文所述的其它特征。
定義如本文所使用，術(shù)語“抗體”指包含至少一個(gè)免疫球蛋白可變域或免疫球蛋白可變域序列的蛋白質(zhì)。舉例而言，抗體可包含一個(gè)重(H)鏈可變區(qū)(本文縮寫為VH)和一個(gè)輕(L)鏈可變區(qū)(本文縮寫為VL)。在另一實(shí)例中，抗體包含兩個(gè)重(H)鏈可變區(qū)和兩個(gè)輕(L)鏈可變區(qū)。術(shù)語“抗體”涵蓋抗體的抗原結(jié)合片段(例如，單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2、Fd片段、Fv片段和dAb片段)和完全抗體。
VH和VL區(qū)可進(jìn)一步再分為稱為“互補(bǔ)判定區(qū)”(“CDR”)的高變區(qū)，其中散布更保守的稱為“構(gòu)架區(qū)”(FR)的區(qū)域。已精確定義構(gòu)架區(qū)和CDR的范圍(參見，Kabat，E.A.，等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號(hào)和Chothia，C.等人，(1987)J.Mol.Biol.196901-917)。本文便用Kabat定義。各VH和VL通常包括三個(gè)CDR和四個(gè)FR，自氨基末端至羧基末端按以下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
“免疫球蛋白域”指來自免疫球蛋白分子的可變域或恒定域的域。免疫球蛋白域通常含有兩個(gè)由約七個(gè)β鏈和一個(gè)保守二硫鍵形成的β折疊(參見，例如A.F.Williams和A.N.Barclay 1988 Ami.Rev Immunol.6381-405)。免疫球蛋白可變區(qū)的高變環(huán)的正則結(jié)構(gòu)可由其序列推斷，如Chothia等人，(1992)J.Mol.Biol.227799-817；Tomlinson等人，(1992)J.Mol.Biol.227776-798)和Tomlinson等人，(1995)EMBO J.14(18)4628-38所述。
如本文所使用，“免疫球蛋白可變域序列”指可形成免疫球蛋白可變域的結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。舉例而言，所述序列可包含天然存在的可變域的氨基酸序列的整體或部分。舉例而言，所述序列可省去一個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)N末端或C末端氨基酸、內(nèi)部氨基酸，可包含一個(gè)或一個(gè)以上插入或其它未端氨基酸或可包含其它變化。在一實(shí)施例中，包含免疫球蛋白可變域序列的多肽可與另一免疫球蛋白可變域序列締合以形成靶結(jié)合結(jié)構(gòu)(或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”)，例如與hK1相互作用(例如結(jié)合于或抑制hK1)的結(jié)構(gòu)。
抗體的VH鏈或VL鏈可進(jìn)一步包含重鏈或輕鏈恒定區(qū)的整體或部分從而分別形成重免疫球蛋白鏈或輕免疫球蛋白鏈。在一實(shí)施例中，抗體為兩個(gè)重免疫球蛋白鏈和兩個(gè)輕免疫球蛋白鏈的四聚體，其中所述重免疫球蛋白鏈和輕免疫球蛋白鏈經(jīng)(例如)二硫鍵內(nèi)連接。重鏈恒定域包含三個(gè)域，CHI、CH2和CH3。輕鏈恒定域包含CL域。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)通常介導(dǎo)抗體與宿主組織或因子的結(jié)合，所述宿主組織或因子包含免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。術(shù)語“抗體”包含IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(和其亞型)類型的完整免疫球蛋白。免疫球蛋白的輕鏈可為κ型或λ型。在一實(shí)施例中，抗體經(jīng)糖基化?？贵w可對(duì)抗體依賴性細(xì)胞毒性和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性起作用。
抗體的一個(gè)或一個(gè)以上的區(qū)域可為人類的或有效人類的。舉例而言，一個(gè)或一個(gè)以上可變區(qū)可為人類的或有效人類的。舉例而言，一個(gè)或一個(gè)以上CDR可為人類的，例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。輕鏈CDR中的每一個(gè)均可為人類的。HC CDR3可為人類的。一個(gè)或一個(gè)以上構(gòu)架區(qū)可為人類的，例如HC或LC的FR1、FR2、FR3和FR4。在一實(shí)施例中，所有構(gòu)架區(qū)均為人類的，例如源自人類體細(xì)胞，例如產(chǎn)生免疫球蛋白的造血細(xì)胞或非造血細(xì)胞。在一實(shí)施例中，人類序列為生殖系序列，例如，由生殖系核酸編碼的生殖系序列。一個(gè)或一個(gè)以上恒定區(qū)可為人類的或有效人類的。在另一實(shí)施例中，至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或98％的構(gòu)架區(qū)(例如，F(xiàn)R1、FR2和FR3全體或FR1、FR2、FR3和FR4全體)或整個(gè)抗體可為人類的或有效人類的。舉例而言，F(xiàn)R1、FR2和FR3全體可至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％與由人類生殖系VH區(qū)段編碼的人類序列一致。
抗體的整體或部分可由免疫球蛋白基因或其區(qū)段編碼。例示性人類免疫球蛋白基因包含κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定區(qū)基因和無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。全長(zhǎng)免疫球蛋白“輕鏈”(約25Kd或214個(gè)氨基酸)由NH2末端處的可變區(qū)基因(約110個(gè)氨基酸)和COOH末端處的κ或λ恒定區(qū)基因編碼。全長(zhǎng)免疫球蛋白“重鏈”(約50Kd或446個(gè)氨基酸)類似地由可變區(qū)基因(約116個(gè)氨基酸)和一個(gè)例如γ(編碼約330個(gè)氨基酸)的其它上述恒定區(qū)基因編碼。
如本文所使用，術(shù)語全長(zhǎng)抗體的“抗原結(jié)合片段”(或簡(jiǎn)稱“抗體部分”或“片段”)指保留特異性結(jié)合于所關(guān)注的靶的能力的全長(zhǎng)抗體的一個(gè)或一個(gè)以上片段。涵蓋于術(shù)語全長(zhǎng)抗體的“抗原結(jié)合片段”中的結(jié)合片段的實(shí)例包含(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab′)2片段，包含兩個(gè)在鉸鏈區(qū)由二硫橋鍵鍵聯(lián)的Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1域組成；(iv)Fv片段，由抗體的單臂的VL和VH域組成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341544-546)，其由VH域組成；和(vi)保留功能性的分離的互補(bǔ)判定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)域(VL和VH)由單獨(dú)基因編碼，但可使用重組方法將其由合成連接子接合，所述合成連接子使得所述兩個(gè)域能夠成為單蛋白質(zhì)鏈，在所述單蛋白質(zhì)鏈中VL和VH區(qū)配對(duì)形成稱為單鏈Fv(scFv)的單價(jià)分子。參見，例如Bird等人，(1988)Science 242423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883。
抗體片段可使用任何適當(dāng)技術(shù)獲得，所述技術(shù)包含所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的習(xí)知技術(shù)。術(shù)語“單特異性抗體”指對(duì)例如抗原決定基的特殊靶顯示單一結(jié)合特異性和親和力的抗體。所述術(shù)語包含在本文中使用的“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”，其是指單一分子組合物的抗體或其片段的制劑。如本文所使用，“同型”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如，IgM或IgG1)。
“有效人類”免疫球蛋白可變區(qū)為包含足夠數(shù)目的人類構(gòu)架氨基酸位置以致免疫球蛋白可變區(qū)并不在正常人類中引起免疫原性反應(yīng)的免疫球蛋白可變區(qū)?！坝行祟悺笨贵w為包含足夠數(shù)目的人類氨基酸位置以致抗體并不在正常人類中引起免疫原性反應(yīng)的抗體。
“人源化”免疫球蛋白可變區(qū)為經(jīng)修飾以包含足夠數(shù)目的人類構(gòu)架氨基酸位置以致所述免疫球蛋白可變區(qū)并不在正常人類中引起免疫原性反應(yīng)的免疫球蛋白可變區(qū)?！叭嗽椿泵庖咔虻鞍椎拿枋霭?例如)US 6,407,213和US 5,693,762。
如本文所使用，“結(jié)合親和力”指表觀締合常數(shù)或Ka。Ka為解離常數(shù)(Kd)的倒數(shù)。結(jié)合蛋白(例如)對(duì)特殊靶分子可具有小于10-5、10-6、10-7或10-8M的Kd。結(jié)合配體與第一靶比與第二靶結(jié)合具有更高的親和力可由比結(jié)合第二靶的Ka(或數(shù)值Kd)更高的結(jié)合第一靶的Ka(或更小的數(shù)值Kd)指示。在所述情況下，相對(duì)于第二靶(例如，除hK1以外的蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、層粘連蛋白或球蛋白)，結(jié)合蛋白對(duì)第一靶(例如，hK1)具有特異性。結(jié)合親和力的差異(例如，特異性或其它比較)可為至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、50倍、70倍、80倍、100倍、500倍、1000倍或105倍。
結(jié)合親和力可由多種方法測(cè)定，所述方法包含平衡透析、平衡結(jié)合、凝膠過濾、ELISA、表面等離子共振或光譜學(xué)(例如，使用熒光檢定)。評(píng)估結(jié)合親和力的例示性條件為在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)中在pH7.2下在30℃下。所述技術(shù)可用于測(cè)量作為結(jié)合蛋白(或靶)濃度的函數(shù)的結(jié)合和自由結(jié)合蛋白的濃度。結(jié)合的結(jié)合蛋白的濃度([Bound])與自由的結(jié)合蛋白的濃度([Free])和靶上結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的濃度有關(guān)，如下式，其中(N)為每靶分子的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目；[Bound]＝N·[Free]/((1/Ka)+[Free])。
并不總是必需進(jìn)行Ka的精確測(cè)定，盡管因?yàn)橛袝r(shí)(例如)使用諸如ELISA或FACS分析的方法來測(cè)定足以獲得與Ka成比例的親和力的定量測(cè)量，且因此可用于比較(諸如確定較高親和力是否(例如)高2倍)以獲得親和力的定性測(cè)量或(例如)由功能檢定(例如活體外或活體內(nèi)檢定)中的活性獲得親和力的推斷?！胺蛛x組合物”指自可獲得分離組合物的天然樣品的至少一種組分的至少90％移出的組合物。人工或天然產(chǎn)生的組合物可為“至少某種程度的純度的組合物”，如果所關(guān)注的物種或物種的群體以重量-重量計(jì)為至少5％、10％、25％、50％、75％、80％、90％、92％、95％、98％或99％純。
“抗原決定基”指由結(jié)合蛋白(例如，諸如Fab或全長(zhǎng)抗體的抗體)結(jié)合的靶化合物上的位點(diǎn)。在靶化合物為蛋白質(zhì)的情況下，所述位點(diǎn)可完全由氨基酸組分構(gòu)成，完全由蛋白質(zhì)的氨基酸化學(xué)修飾(例如糖基部分)構(gòu)成或由其組合構(gòu)成。重疊抗原決定基包含至少一個(gè)常見氨基酸殘基。
兩個(gè)序列之間的“同源性”或“序列一致性”(所述術(shù)語在本文中互換使用)的計(jì)算如下執(zhí)行。出于最佳比較的目的，排列所述序列(例如，為最佳對(duì)準(zhǔn)，可在第一和第二氨基酸或核酸序列的一個(gè)或兩個(gè)中引入間隙，且出于比較的目的，可忽視非同源序列)。使用GCG軟件包中的GAP程序在間隙處罰為12、間隙擴(kuò)展處罰為4且讀框轉(zhuǎn)移間隙處罰為5的情況下用Blossum62計(jì)分矩陣將最佳對(duì)準(zhǔn)確定為最佳分?jǐn)?shù)。隨后，比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢糜膳c第二序列中相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則所述分子在所述位置一致(如本文所使用的氨基酸或核酸“一致性”等效于氨基酸或核酸“同源性”)。兩個(gè)序列之間的一致性百分率為所述序列共享的一致位置的數(shù)目的函數(shù)。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，出于比較目的而排列的參考序列的長(zhǎng)度為參考序列的長(zhǎng)度的至少30％，優(yōu)選地至少40％，更優(yōu)選地至少50％，甚至更優(yōu)選地至少60％且甚至更優(yōu)選地至少70％、80％、90％、92％、95％、97％、98％或100％。例如，參考序列可具有免疫球蛋白可變區(qū)序列的長(zhǎng)度。
如本文所使用，本文所使用的術(shù)語“大體上一致”(或“大體上同源”)指第一氨基酸或核酸序列，其含有足夠數(shù)目的與第二氨基酸或核酸序列一致或等效(例如，具有例如保守氨基酸取代的類似側(cè)鏈)的氨基酸殘基或核苷酸以致所述第一和第二氨基酸或核酸序列具有類似活性(或編碼具有類似活性的蛋白質(zhì))，例如結(jié)合活性、結(jié)合優(yōu)先性或生物活性。在抗體的情況下，相對(duì)于相同抗原，第二抗體具有相同的特異性且具有至少50％的親和力。
與本文所揭露的序列類似或同源的序列(例如，至少約85％序列一致性)也為本申請(qǐng)案的部分。在一些實(shí)施例中，序列一致性可為約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。另外，當(dāng)核酸區(qū)段在選擇性雜交條件(例如，高度嚴(yán)格的雜交條件)下與所述鏈的互補(bǔ)序列雜交時(shí)，存在大體一致性。核酸可存在于完整細(xì)胞中，存在于細(xì)胞溶解產(chǎn)物中或以部分純或大體上純的形式存在。
如本文所使用，術(shù)語“在低度嚴(yán)格、中度嚴(yán)格、高度嚴(yán)格或極高嚴(yán)格條件下雜交”描述用于雜交和洗滌的條件。執(zhí)行雜交反應(yīng)的指南可見于Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其以引用的方式并入本文中。所述參考文獻(xiàn)描述含水和無水方法，且可使用任一者。本文所指的特定雜交條件如下(1)低度嚴(yán)格雜交條件，在約45℃下，6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，接著在50℃下，以0.2XSSC、0.1％SDS洗滌兩次(就低度嚴(yán)格條件而言，洗滌溫度可增加至55℃)；(2)中度嚴(yán)格雜交條件，在約45℃下，6X SSC，接著在60℃下，以0.2X SSC、0.1％SDS洗滌一次或一次以上；(3)高度嚴(yán)格雜交條件，在約45℃下，6X SSC，接著在65℃下，以0.2X SSC、0.1％SDS洗滌一次或一次以上；和(4)極高嚴(yán)格雜交條件為在65℃下，0.5M磷酸鈉、7％SDS，接著在65℃下，以0.2X SSC、1％SDS洗滌一次或一次以上。極高嚴(yán)格條件(4)為優(yōu)選條件且除非另有說明，否則應(yīng)使用所述極高嚴(yán)格條件。本發(fā)明包含在低度、中度、高度或極高嚴(yán)格情況下與本文所述的核酸或其互補(bǔ)序列雜交的核酸，例如編碼本文所述的結(jié)合蛋白的核酸。所述核酸可與參考核酸具有相同長(zhǎng)度或?yàn)閰⒖己怂衢L(zhǎng)度的30％、20％或10％。所述核酸可對(duì)應(yīng)于編碼免疫球蛋白可變域序列的區(qū)。
相對(duì)于本文所述的結(jié)合蛋白，hK1結(jié)合蛋白可具有突變(例如，保守或非必需氨基酸取代)，所述突變大體上不對(duì)蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響。無論特殊取代是否會(huì)容許，其均(例如)應(yīng)不不利地影響生物性質(zhì)，所述生物性質(zhì)諸如可(例如)使用Bowie，等人，(1990)Science 2471306-1310的方法預(yù)測(cè)的結(jié)合活性。
“保守氨基酸取代”為氨基酸殘基經(jīng)具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基置換的取代。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已在所屬領(lǐng)域中定義。所述家族包含具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。眾多構(gòu)架和CDR氨基酸殘基有可能包含一個(gè)或一個(gè)以上的保守取代。
生物聚合物的一致序列可包含可在多種氨基酸間變化的位置。舉例而言，在所述上下文中，符號(hào)“X”泛指任何氨基酸(例如，20種天然氨基酸中的任一種或19種非半胱氨酸氨基酸中的任一種)。其它允許氨基酸也可(例如)使用圓括號(hào)和斜線指示。舉例而言，“(A/W/F/N/Q)”意謂在所述特殊位置允許丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
“非必需”氨基酸殘基為可自例如抗體的結(jié)合劑的野生型序列變化而不消除或更優(yōu)選地大體上改變生物活性的殘基；而“必需”氨基酸殘基產(chǎn)生所述變化。
術(shù)語“多肽”或“肽”(其可互換使用)指經(jīng)肽鍵鍵聯(lián)的三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸的聚合物，例如長(zhǎng)度在3個(gè)與60個(gè)氨基酸之間，或在30個(gè)與300個(gè)氨基酸之間，或超過300個(gè)氨基酸。多肽可包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸。通常，多肽僅包含天然氨基酸。“蛋白質(zhì)”可包含一個(gè)或一個(gè)以上多肽鏈。因此，術(shù)語“蛋白質(zhì)”涵蓋多肽。蛋白質(zhì)或多肽也可包含一個(gè)或一個(gè)以上修飾，例如，糖基化、酰胺化、磷酸化等。
術(shù)語“同源底物”指天然存在的hK1底物，其包含天然存在的其變異體(例如，剪接變異體、天然存在的突變體和同功異型物)。
如本文所使用，術(shù)語“常見密碼子”指用于表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞種類的序列中表示特殊氨基酸的最常見密碼子?！按纬Ｒ娒艽a子”為通常存在于特殊物種中但不為常見密碼子的密碼子。除常見密碼子和次常見密碼子之外的所有密碼子均為“非常見密碼子”。
“hK1相關(guān)發(fā)炎性病癥”指以至少部分由hK1(例如，hK1的蛋白酶活性)介導(dǎo)的發(fā)炎性反應(yīng)為特征的病癥。就所述病癥而言，hK1活性的降低使得發(fā)炎性反應(yīng)降低。例示性hK1相關(guān)發(fā)炎性病癥包含哮喘(例如，過敏性哮喘和非過敏性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、鼻炎、竇炎、炎性腸病(諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、免疫介導(dǎo)糖尿病、急性胰腺炎和間質(zhì)性膀胱炎。
統(tǒng)計(jì)顯著性可由任何所屬領(lǐng)域已知的方法測(cè)定。例示性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)包含Student T檢驗(yàn)、Mann Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)和Wilcoxon非參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。一些統(tǒng)計(jì)上顯著的關(guān)系具有小于0.05或0.02的P值。特殊結(jié)合蛋白可展示(例如)特異性、結(jié)合或生物活性方面的差異，所述差異為統(tǒng)計(jì)上顯著的(例如，P值＜0.05或0.02)。術(shù)語“誘導(dǎo)”、“抑制”、“增強(qiáng)”、“提高”、“增加”、“降低”等(例如)表示兩個(gè)狀態(tài)之間的可區(qū)別的定性或定量差異且可指兩個(gè)狀態(tài)之間的例如統(tǒng)計(jì)上顯著的差異的差異。
除非另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中可使用與本文所述的方法和物質(zhì)類似或等效的方法和物質(zhì)，但合適的方法和物質(zhì)描述如下。本文所提及的所有公開案、專利申請(qǐng)案、專利及其它參考文獻(xiàn)均以其整體內(nèi)容以引用的方式并入本文中。


圖1.抗原決定基的SPR分組。將生物素標(biāo)記的hK1捕獲于抗生蛋白鏈菌素涂布的芯片上直至最終配體密度為88 RU。使用Biacore 3000儀器將X-2300以50nM的濃度注射于固定hK1上，接著在25℃下以50nM的濃度30μL/min的流速將第二Fab注射于PBST中。注射DX-2300，接著注射第二Fab結(jié)束時(shí)的信號(hào)為R1。單獨(dú)注射Fab結(jié)束時(shí)的信號(hào)為R2。圖A展示結(jié)合與DX-2300相同的抗原決定基的Fab(M0112-D07)的感應(yīng)圖。圖B展示結(jié)合與DX-2300不同的抗原決定基的Fab(M0139-A09)的感應(yīng)圖。
圖2.DX-2300(本文也稱為“M0131-F07”)的抑制機(jī)制。展示作為Fab的DX-2300的抑制機(jī)制(圖A)為競(jìng)爭(zhēng)性的且具有60±2pM的Ki。展示作為IgG的DX-2300的抑制機(jī)制(圖B)為競(jìng)爭(zhēng)性的且具有39±4pM的Ki。
圖3.其它hK1抑制劑的抑制機(jī)制。展示作為Fab的M0093-F09的抑制機(jī)制(圖A)為非競(jìng)爭(zhēng)性的且具有1.9nM的Ki。展示作為Fab的M0137-E01的抑制機(jī)制(圖B)為競(jìng)爭(zhēng)性的且具有0.9nM的Ki。
圖4.DX-2300的進(jìn)行曲線分析。將在漸增量的DX-2300抑制劑存在下的動(dòng)態(tài)進(jìn)行曲線(圖A)擬合于以下等式獲得kobs值F＝vs+(v0-vs)(1-exp(-kobs*t))/kobs+C，其中F＝熒光，vs＝最終穩(wěn)態(tài)速率，v0＝最初穩(wěn)態(tài)速率，kobs＝指數(shù)抑制常數(shù)，t＝以秒為單位的時(shí)間，且C為說明t＝0秒時(shí)最初本底熒光的常數(shù)。在圖B中，將kobs值對(duì)抑制劑濃度作圖且擬合于伴隨異構(gòu)化步驟的慢速緊密結(jié)合劑的等式；kobs＝k6+(k5*[I]/(Ki，app+[I]))，其中k6為酶抑制劑異構(gòu)化步驟的逆反應(yīng)速率常數(shù)，k5為所述步驟的正反應(yīng)速率常數(shù)，Ki，app為形成最初酶-抑制劑復(fù)合物的表觀平衡抑制常數(shù)，且[I]為存在于檢定中的抑制劑的濃度。
圖5.動(dòng)物尿中類血管舒緩素活性的DX-2300抑制。
動(dòng)物中類血管舒緩素活性如以上所述測(cè)量。抑制百分率為在DX-2300存在下所觀察到的初始速率(R抑制)與在其不存在下所觀察到的初始速率(Ro)的比率，因此抑制百分率＝100-(Ro-R抑制)/Ro*100。
圖6.人類或羊尿中類血管舒緩素活性的DX-2300 IC50的測(cè)定。在變化濃度的DX-2300存在或不存在的情況下，如上所述執(zhí)行活化尿中血管舒緩素活性的測(cè)量。羊尿與人尿中所測(cè)量的類血管舒緩素活性的DX-2300 IC50值為相當(dāng)?shù)?，分別為2.9±1.6nM和3.0±0.6nM。
圖7.來自鼻病毒感染后患輕度哮喘的患者的人類BAL中的類血管舒緩素活性的抑制。在0.5μM DX-2300存在或不存在的情況下，使用100μM于KAL緩沖液中的Pro-Phe-Arg-AMC底物(表4)在80μLBAL中測(cè)量BAL中的血管舒緩素活性。在添加底物之前，在30℃下將BAL與DX-2300一起培育30分鐘。
圖8.DX-2300對(duì)羊中抗原誘導(dǎo)的氣管反應(yīng)的效應(yīng)。經(jīng)吸入向羊(n＝2)投與10mgDX-2300，12小時(shí)30分鐘之后用豬蛔蟲(Ascaris suum)過敏原攻毒。過敏原攻毒后，圖A通過經(jīng)8小時(shí)測(cè)量肺阻力比較經(jīng)DX-2300處理的動(dòng)物(正方形)與對(duì)照動(dòng)物(菱形)。圖B比較經(jīng)DX-2300處理的動(dòng)物與對(duì)照動(dòng)物中所觀察到的對(duì)攻毒24小時(shí)后投與碳酰膽堿的氣管過度反應(yīng)?？招臈l指示用以在過敏原攻毒之前誘導(dǎo)支氣管收縮超過基線400％所需的碳酰膽堿的量。填充條指示用以在過敏原攻毒24小時(shí)后誘導(dǎo)支氣管收縮超過基線400％所需的碳酰膽堿的量。
圖9.DX-2300對(duì)在哮喘羊模型中誘導(dǎo)支氣管收縮的高分子量激肽原的效應(yīng)。菱形符號(hào)展示在不存在藥物的情況下，響應(yīng)所吸入的HMWK(100μg)的支氣管收縮。正方形符號(hào)展示在1mg所吸入的DX-2300存在下，響應(yīng)所吸入的HMWK(100μg)的支氣管收縮。三角形展示在5mg DX-2300存在下，響應(yīng)所吸入的HMWK(100μg)的支氣管收縮。
具體實(shí)施例方式
hK1例示性hK1蛋白包含下列序列；＞sp|P06870|KLKl_人類血管舒緩素1前體(EC3.4.21.35)(組織血管舒緩素)(腎/胰腺/唾液腺血管舒緩素)-智人(人類)。
MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGFNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKVVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECEKAHVQKVTDFMLCVGHLEGGKDTCVGDSGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSYVKWIEDTIAENS (SEQ ID NO1021)所述蛋白質(zhì)通常為例如包含約氨基酸25至262的蛋白質(zhì)的經(jīng)成熟加工的蛋白質(zhì)，或例如其具有蛋白水解活性的片段的片段。
hK1蛋白可包含一個(gè)或一個(gè)以上下列特征。

hK1蛋白也可包含下列例示性變異體；變異體77 R-＞H (于dbSNP5515中) [NCBl/Ensembl]. VAR_014567變異體145 Q-＞E (于dbSNP5516中) [NCBl/Ensembl]. VAR_006625變異體186 E-＞K (于dbSNP5517中) [NCBl/Ensembl]. VAR_006626變異體193 V-＞E (于dbSNP5518中) [NCBl/Ensembl]. VAR_014568hK1的例示性底物包含前胰島素、低密度脂蛋白、心房利尿鈉因子的前體、凝乳酶原、血管活性腸肽、原膠原酶和血管緊張素原。本文所述的hK1結(jié)合蛋白可用于調(diào)節(jié)所述底物，例如降低所述底物的蛋白水解裂解。
與hK1結(jié)合的抗體可通過使用作為(例如)用于使動(dòng)物免疫的抗原或作為(例如)用于篩選重組抗體庫的靶的hK1獲得。也可使用hK1的肽和片段。
呈現(xiàn)庫在一實(shí)施例中，使用呈現(xiàn)庫鑒別與hK1結(jié)合的蛋白質(zhì)。呈現(xiàn)庫為實(shí)體的集合，各實(shí)體包含可及蛋白質(zhì)組分(例如，F(xiàn)ab或scFv)和編碼或鑒別蛋白質(zhì)組分的可回收組分(例如，核酸)。所述蛋白質(zhì)組分可具有任何長(zhǎng)度，例如3個(gè)氨基酸至超過300個(gè)氨基酸。在選擇時(shí)，使庫的各成員的蛋白質(zhì)組分與hK1接觸且若蛋白質(zhì)組分與hK1結(jié)合，則(例如)通過滯留于一支撐物上鑒別呈現(xiàn)庫成員。所述蛋白質(zhì)組分可包含一個(gè)或一個(gè)以上免疫球蛋白可變域或另一域的變異體。使用用于呈現(xiàn)的免疫球蛋白域的方法描述如下(參見，例如“抗體呈現(xiàn)庫(Antibody Display Libraries)”)。
自支撐物回收所滯留的呈現(xiàn)庫成員且分析。分析可包含擴(kuò)增和隨后在類似或不同條件下的選擇。舉例而言，陽性與陰性選擇可交替。分析也可包含測(cè)定蛋白質(zhì)組分的氨基酸序列和為詳細(xì)特征化而純化蛋白質(zhì)組分。
對(duì)于呈現(xiàn)庫可使用多種格式。實(shí)例包含下列各者。
噬菌體呈現(xiàn)。一種格式利用病毒，尤其噬菌體。所述格式稱為“噬菌體呈現(xiàn)”。蛋白質(zhì)組分通常共價(jià)鍵聯(lián)于噬菌體鞘蛋白。所述鍵聯(lián)結(jié)果形成編碼融合于鞘蛋白的蛋白質(zhì)組分的核酸的轉(zhuǎn)譯。所述鍵聯(lián)可包含柔性肽連接子、蛋白酶位點(diǎn)或因抑止終止密碼子而并入的氨基酸。噬菌體呈現(xiàn)描述于以下各文獻(xiàn)中例如美國(guó)專利第5,223,409號(hào)；Smith(1985)Science 2281315-1317；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；WO 90/02809；de Haard等人，(1999)J.Biol.Chem 21A18218-30；Hoogenboom等人，(1998)Immunotechnology 41-20；Hoogenboom等人，(2000)Immunol Today 2371-8；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等人，(1992)Hum Antibod Hybridomas 381-85；Huse等人，(1989)Science 2461275-1281；Griffiths等人，(1993)EMBO J 12725-734；Hawkins等人，(1992)JMol Biol 226889-896；Clackson等人，(1991)Nature 352624-628；Gram等人，(1992)PNAS 893576-3580；Garrard等人，(1991)Bio/Technology 91373-1377；Rebar等人，(1996)Methods Enzymol.267129-49；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 194133-4137和Barbas等人，(1991)PNAS 887978-7982。
已開發(fā)用于絲狀噬菌體(噬菌體f1、fd和M13)和其它噬菌體(例如T7噬菌體和λ形噬菌體；參見，例如Santini(1998)J.Mol.Biol.282125-135；Rosenberg等人，(1996)Innovations 61-6；Houshm等人，(1999)Anal Biochem 268363-370)的噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)。絲狀噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)通常使用與諸如基因III蛋白的次要鞘蛋白和基因VIII蛋白(主要鞘蛋白)的融合，但也可使用與諸如基因VI蛋白、基因VII蛋白、基因IX蛋白的其它鞘蛋白或其域的融合(參見，例如WO 00/71694)。在一實(shí)施例中，所述融合是融合于基因III蛋白的域，例如，錨定域或“殘根”(stump)(參見，例如描述基因III蛋白錨定域的美國(guó)專利第5,658,727號(hào))。也有可能使用例如非共價(jià)鍵或非肽共價(jià)鍵的非肽鍵使所呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)物理締合于所述鞘。舉例而言，可使用二硫鍵和/或c-fos和c-jun卷曲螺旋以物理締合(參見，例如Crameri等人，(1993)Gene 13769和WO 01/05950)。
可使呈現(xiàn)蛋白質(zhì)組分的噬菌體生長(zhǎng)且使用例如自生長(zhǎng)培養(yǎng)基PEG沉淀的標(biāo)準(zhǔn)噬菌體預(yù)備方法收集。選擇個(gè)別呈現(xiàn)噬菌體之后，可在擴(kuò)增之后將編碼選定蛋白質(zhì)組分的所述核酸自感染選定噬菌體的細(xì)胞分離或自噬菌體本身分離?？商暨x個(gè)別群落或溶菌斑，將核酸分離且進(jìn)行序列分析。
其它呈現(xiàn)格式。其它呈現(xiàn)格式包含基于細(xì)胞的呈現(xiàn)(參見，例如WO 03/029456)，蛋白質(zhì)-核酸融合(參見，例如US 6,207,446)和核糖體呈現(xiàn)(參見，例如Mattheakis等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919022和Hanes等人，(2000)Nat Biotechnol181287-92；Hanes等人，.(2000)Methods Enzymol.328404-30和Schaffitzel等人，(1999)JImmunol Methods.231(1-2)119-35)。
抗原決定基特異性結(jié)合蛋白。呈現(xiàn)技術(shù)也可用于獲得與靶的特殊抗原決定基結(jié)合的結(jié)合蛋白，例如抗體?？乖瓫Q定基可分為“構(gòu)形型”或“序列型”。構(gòu)形抗原決定基包括氨基酸殘基，雖然所述氨基酸在序列中可能為大體上分離的(例如，由至少1個(gè)、2個(gè)、4個(gè)、6個(gè)、8個(gè)或10個(gè)氨基酸隔開)，但其在適當(dāng)折疊的靶上具有確定的相對(duì)方位。序列抗原決定基包括短的多肽鏈部分，無論蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)如何(例如，原生的或展開的)，其均結(jié)合抗體?？?例如)通過利用使缺乏特殊抗原決定基或在所述抗原決定基中突變的非靶分子與(例如)丙氨酸競(jìng)爭(zhēng)來鑒別構(gòu)形抗原決定基的結(jié)合蛋白。所述非靶分子可用于下述陰性選擇程序中，當(dāng)使呈現(xiàn)庫結(jié)合于靶時(shí)作為競(jìng)爭(zhēng)分子，或作為預(yù)洗提劑(例如)在洗滌溶液中捕獲對(duì)靶不具有特異性的解離呈現(xiàn)庫成員。在另一實(shí)施例中，抗原決定基特異性結(jié)合蛋白通過用與靶分子上所關(guān)注的抗原決定基結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白洗提呈現(xiàn)庫成員來鑒別。可(例如)使用具有見于靶蛋白質(zhì)中的氨基酸序列的短肽來選擇結(jié)合序列抗原決定基的結(jié)合蛋白。通常，結(jié)合于構(gòu)形抗原決定基的結(jié)合蛋白也弱結(jié)合于含有一些包含于構(gòu)形抗原決定基中的氨基酸的肽或其它肽。因此，可選擇在極低嚴(yán)格條件下與肽結(jié)合，且隨后選擇與折疊靶蛋白質(zhì)結(jié)合。
親和力成熟。在一實(shí)施例中，通過(例如)誘變修飾與靶結(jié)合的結(jié)合蛋白以提供修飾結(jié)合蛋白池。隨后評(píng)估所述修飾結(jié)合蛋白以鑒別一個(gè)或一個(gè)以上具有改變的功能特性(例如，提高的結(jié)合性、提高的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)的活體內(nèi)穩(wěn)定性)的改造結(jié)合蛋白。在一實(shí)施例中，使用呈現(xiàn)庫技術(shù)選擇或篩選所述修飾結(jié)合蛋白池。隨后，(例如)使用更高的嚴(yán)格條件或更具競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合和洗滌條件自第二庫鑒別具有更高親和力的結(jié)合蛋白。也可使用其它篩選技術(shù)。
在一些實(shí)施例中，誘變是靶向已知區(qū)域或可能位于結(jié)合界面的區(qū)域。若(例如)所鑒別的結(jié)合蛋白為抗體，則誘變可針對(duì)本文所述的重鏈或輕鏈的CDR區(qū)。另外，誘變可針對(duì)靠近或鄰接CDR的構(gòu)架區(qū)，例如尤其CDR結(jié)合區(qū)的10個(gè)、5個(gè)或3個(gè)氨基酸內(nèi)的構(gòu)架區(qū)。在抗體的情況下，誘變也可局限于CDR中的一個(gè)或數(shù)個(gè)(例如)以逐步改進(jìn)。
在一實(shí)施例中，使用誘變以使抗體更類似于一個(gè)或一個(gè)以上的生殖系序列。一種例示性生殖系方法可包含鑒別一個(gè)或一個(gè)以上與分離抗體的序列類似(例如，一特殊數(shù)據(jù)庫中最類似)的生殖系序列。隨后，可在分離抗體中以增量式、組合或兩者進(jìn)行突變(在氨基酸水平上)。例如，產(chǎn)生包含編碼一些或所有可能的生殖系突變的序列的核酸庫。隨后評(píng)估所述突變型抗體(例如)以鑒別相對(duì)于分離抗體具有一個(gè)或一個(gè)以上其它生殖系殘基且仍適用(例如，具有功能活性)的抗體。在一實(shí)施例中，將盡可能多的生殖系殘基引入分離抗體中。
在一實(shí)施例中，使用誘變將一個(gè)或一個(gè)以上生殖系殘基取代或插入于CDR區(qū)中。舉例而言，生殖系CDR殘基可來自與所修飾的可變區(qū)類似(例如，最類似)的生殖系序列。誘變之后，可評(píng)估抗體的活性(例如，結(jié)合或其它功能活性)以測(cè)定所述生殖系殘基是否被容許?？稍跇?gòu)架區(qū)中執(zhí)行類似誘變。
可以不同方法執(zhí)行生殖系序列的選擇。舉例而言，若生殖系序列符合選擇性或相似性的預(yù)定準(zhǔn)則，例如達(dá)到至少某一一致性百分率(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的一致性)，則可選擇所述生殖系序列?？墒褂弥辽?個(gè)、3個(gè)、5個(gè)或10個(gè)生殖系序列執(zhí)行選擇。在CDR1和CDR2的情況下，鑒別類似生殖系序列可包含選擇一個(gè)所述序列。在CDR3的情況下，鑒別類似生殖系序列可包含選擇一個(gè)所述序列，但可包含使用兩個(gè)分別有助于氨基末端部分和羧基末端部分的生殖系序列。在其它實(shí)施例中，使用多于一個(gè)或兩個(gè)生殖系序列(例如)以形成一致序列。
在一實(shí)施例中，相對(duì)于例如本文所述序列的特殊參考可變域序列，相關(guān)可變域序列具有與參考CDR序列中的殘基、與人類生殖系序列(亦即，由人類生殖系核酸編碼的氨基酸序列)中相應(yīng)位置的殘基一致的殘基至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％不一致的CDR氨基酸位置。
在一實(shí)施例中，相對(duì)于例如本文所述序列的特殊參考可變域序列，相關(guān)可變域序列具有與來自人類生殖系序列(例如，與參考可變域序列相關(guān)的生殖系序列)的FR序列至少30％、50％、60％、70％、80％、90％或100％一致的FR區(qū)。
因此，有可能分離具有與所關(guān)注的給定抗體類似的活性，但更類似于一個(gè)或一個(gè)以上生殖系序列、尤其一個(gè)或一個(gè)以上人類生殖系序列的抗體。舉例而言，抗體與生殖系序列在CDR外部的區(qū)(例如，構(gòu)架區(qū))可具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的一致性。另外，抗體在CDR區(qū)可包含至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)生殖系殘基，所述生殖系殘基是來自與所修飾的可變區(qū)類似(例如，最類似)的生殖系序列。主要受關(guān)注的生殖系序列為人類生殖系序列?？贵w的活性(例如，結(jié)合活性)可為原始抗體的1倍或100倍、10倍、5倍、2倍、0.5倍、0.1倍和0.001倍。例示性生殖系序列包含VKI-O2、VL2-1、VKIH-L2::JK2、vg3-23、V3-23::JH4和V3-23::JK6。
一些例示性誘變技術(shù)包含易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)(Leung等人，(1989)Technique 111-15)、重組(參見，例如USSN 10/279,633)、使用隨機(jī)裂解的DNA改組(Stemmer(1994)Nature 389-391；稱為“核酸改組”)、RACHITTTM(Coco等人，(2001)Nature Biotech.19354)、定位誘變(Zoller等人，Nucl Acids Res 106487-6504)、序列盒誘變(Reidhaar-Olson(1991)Methods Enzymol.208564-586)和并入簡(jiǎn)并寡聚核苷酸(Griffiths等人，(1994)EMBO J 133245)。在親和力成熟的一實(shí)例中，使用本文所述的方法首先自呈現(xiàn)庫鑒別以至少最低對(duì)靶的結(jié)合特異性或最低活性(例如，結(jié)合的平衡解離常數(shù)小于1nM、10nM或100nM)結(jié)合hK1的結(jié)合蛋白。將編碼最初鑒別的結(jié)合蛋白的核酸序列用作引入變異的模板核酸(例如)以鑒別相對(duì)于最初結(jié)合蛋白具有增強(qiáng)性質(zhì)(例如，結(jié)合親和力、動(dòng)力學(xué)或穩(wěn)定性)的第二結(jié)合蛋白?；蛘?，可將一個(gè)或一個(gè)以上CDR的氨基酸序列用作設(shè)計(jì)包含編碼分離序列和眾多相鄰序列的核酸的核酸庫的指南。可將所述多樣化核酸引入含有選自所述庫的最初分離且改進(jìn)的變異體的呈現(xiàn)載體中。
解離速率選擇法。因?yàn)槁怆x速率可預(yù)示高親和力，尤其關(guān)于多肽與其靶點(diǎn)之間的相互作用，因此可使用本文所述的方法以分離對(duì)于與靶點(diǎn)的結(jié)合相互作用具有所要?jiǎng)討B(tài)離解速率(亦即降低的)的結(jié)合蛋白。
為自呈現(xiàn)庫選擇緩慢解離結(jié)合蛋白，使所述庫與經(jīng)固定的靶接觸。隨后，將固定靶用移除非特異性結(jié)合或弱結(jié)合的生物分子的第一溶液洗滌。隨后，將固定靶用包含飽和量的例如不連接于粒子的靶的復(fù)本的自由靶的第二溶液洗提。自由靶結(jié)合于自所述靶解離的生物分子。相對(duì)于低得多濃度的固定靶，再次結(jié)合由飽和量的自由靶有效阻止。
第二溶液可具有大體上為生理學(xué)條件的溶液條件或嚴(yán)格的溶液條件。通常，第二溶液的溶液條件與第一溶液的溶液條件一致。將第二溶液的洗提份以時(shí)間順序收集以區(qū)分早期洗提份與晚期洗提份。晚期洗提份包含以比早期洗提份中的生物分子更慢的速率自靶解離的生物分子。
另外，也有可能回收甚至在延長(zhǎng)培育之后仍保持結(jié)合于所述靶的呈現(xiàn)庫成員?？墒褂秒x液條件將其解離或可在連接于靶的同時(shí)將其擴(kuò)增。舉例而言，可使結(jié)合于靶的噬菌體與細(xì)菌細(xì)胞接觸。
特異性的選擇和篩選。在呈現(xiàn)庫的情況下，“選擇”指允許許多呈現(xiàn)庫成員接觸靶且回收和增殖結(jié)合的呈現(xiàn)庫成員的過程。選擇可來自具有大量成員的庫，例如多于1010個(gè)成員。在呈現(xiàn)庫的情況下，“篩選”指逐一結(jié)合于靶測(cè)試庫的分離成員的過程。通過自動(dòng)操作，可在一高度平行的過程中篩選數(shù)千候選物。本文所述的呈現(xiàn)庫選擇法可包含舍棄結(jié)合于非靶分子的呈現(xiàn)庫成員的選擇過程。
(例如)用于hK1結(jié)合抗體的非靶分子的實(shí)例包含(例如)除hK1以外的蛋白酶，例如，除hK1以外的血管舒緩素(例如hK2、hK3、hK4、hK5、hK6、hK7、hK8、hK9、hK10、hK11、hK12、hK13、hK14或hK15)。適用hK1結(jié)合抗體可能對(duì)血管舒緩素子集具有特異性，例如，其可與多個(gè)血管舒緩素相互作用，其中至少一個(gè)為hK1。
在一實(shí)施例中，使用所謂的“陰性選擇”步驟辯別靶與相關(guān)的非靶分子和相關(guān)的但獨(dú)特的非靶分子。使呈現(xiàn)庫或其池與非靶分子接觸。收集并不結(jié)合非靶的樣品成員且用于隨后的與靶分子結(jié)合的選擇中或甚至用于隨后的陰性選擇中。陰性選擇步驟可在選擇與靶分子結(jié)合的庫成員之前或之后。
在另一實(shí)施例中，使用篩選步驟。將呈現(xiàn)庫成員分離以結(jié)合于靶分子之后，就其結(jié)合于非靶分子(例如，以上所列的非靶)的能力測(cè)試各分離庫成員。舉例而言，可使用高通量ELISA篩選獲得所述數(shù)據(jù)。也可使用ELISA篩選獲得各庫成員結(jié)合于靶的定量數(shù)據(jù)。比較非靶和靶結(jié)合數(shù)據(jù)(例如，使用電腦和軟件)以鑒別特異性結(jié)合于hK1的庫成員。
本文所述的呈現(xiàn)庫選擇法和篩選法可包含選擇結(jié)合于靶分子上特異性位點(diǎn)的呈現(xiàn)庫成員的選擇和篩選過程。舉例而言，用高濃度的本文所述的抗體洗提選擇結(jié)合于由所述抗體結(jié)合的抗原決定基的噬菌體?？赏ㄟ^在緩沖液中在有或無識(shí)別所述抗原決定基的競(jìng)爭(zhēng)抗體存在的情況下執(zhí)行ELISA篩選結(jié)合于hK1的特殊抗原決定基的噬菌體。
抗體呈現(xiàn)庫在一實(shí)施例中，呈現(xiàn)庫存在蛋白質(zhì)的多樣性池，其中每一個(gè)均包含至少一個(gè)和通常兩個(gè)免疫球蛋白可變域。呈現(xiàn)庫尤其適用于(例如)鑒別識(shí)別人類抗原的人類或有效人類的抗體。因?yàn)榭贵w的恒定區(qū)和構(gòu)架區(qū)為人類的，所以所述治療抗體可使其自身避免被作為抗原識(shí)別為或靶向。也將恒定區(qū)優(yōu)化以招募人類免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子功能?；铙w外呈現(xiàn)選擇過程克服正常人類免疫系統(tǒng)不能對(duì)自身抗原產(chǎn)生抗體的能力。
典型的抗體呈現(xiàn)庫呈現(xiàn)包含VH域和VL域的蛋白質(zhì)。呈現(xiàn)庫可呈現(xiàn)呈Fab片段形式的抗體(例如，使用兩個(gè)多肽鏈)或呈單鏈Fv形式的抗體(例如，使用單個(gè)多肽鏈)。也可使用其它格式。
在Fab和其它格式的情況下，所呈現(xiàn)的抗體可包含作為輕鏈或重鏈的部分的恒定區(qū)。在一實(shí)施例中，各鏈包含一個(gè)恒定區(qū)，例如在Fab的情況下。在其它實(shí)施中，呈現(xiàn)其它恒定區(qū)。
抗體庫可由多種方法構(gòu)造(參見，例如de Haard等人，(1999)J.Biol.Chem27418218-30；Hoogenboom等人，(1998)Immunotechnology 41-20；Hoogenboom等人，(2000)Immunol Today 21371-8；US 2003-0232333和US 2004-0029113)。另外，各方法的要素可與其它方法的要素組合。可使用所述方法以將變異引入單個(gè)免疫球蛋白域(例如，VH或VL)中或多個(gè)免疫球蛋白域(例如，VH和VL)中?？蓪⒆儺愐朊庖咔虻鞍卓勺冇蛑校鏑DR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4中的一個(gè)或一個(gè)以上的所述區(qū)中，其指重鏈和輕鏈可變域的任一者或兩者的所述區(qū)。在一實(shí)施例中，將變異引入給定可變域的所有三個(gè)CDR中。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，將變異引入CDR1和CDR2中，例如重鏈可變域的CDR1和CDR2中。任何組合均為可行的。在一方法中，抗體庫通過將編碼CDR的多種寡聚核苷酸插入編碼呈現(xiàn)蛋白質(zhì)或其部分的核酸的相應(yīng)區(qū)中來構(gòu)造。所述寡聚核苷酸可使用多種例如單體核苷酸或三核苷酸的亞單元合成。舉例而言，Knappik等人，(2000)J.Mol.Biol.29657-86描述使用三核苷酸合成法和用于接受寡聚核苷酸的具有工程化限制酶切位點(diǎn)的模板構(gòu)造編碼所述寡聚核苷酸的CDR的方法。
在另一方法中，用hK1使例如嚙齒動(dòng)物的動(dòng)物免疫。視需要，將所述動(dòng)物用抗原激發(fā)以進(jìn)一步刺激反應(yīng)。隨后，將脾細(xì)胞自動(dòng)物分離，且將編碼VH和/或VL域的核酸擴(kuò)增且克隆以在呈現(xiàn)庫中表達(dá)。
在又一方法中，抗體庫是由自天然生殖系免疫球蛋白基因(例如，人類基因)擴(kuò)增的核酸構(gòu)造。所述擴(kuò)增核酸包含編碼VH和/或VL域的核酸。編碼免疫球蛋白的核酸的來源在以下描述。擴(kuò)增可包含(例如)使用與保守恒定區(qū)退火的引物的PCR或另一擴(kuò)增方法。
編碼免疫球蛋白域或其片段的核酸可獲自(例如)人類、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、兔、駱駝或嚙齒動(dòng)物的免疫細(xì)胞。可就特殊性質(zhì)選擇細(xì)胞。舉例而言，可選擇在各種成熟階段的B細(xì)胞，包含天然B細(xì)胞。
可使用熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS)分選表達(dá)表面結(jié)合IgM、IgD或IgG分子的B細(xì)胞。另外，可分離表達(dá)IgG的不同同型的B細(xì)胞?？蓪和T細(xì)胞(例如)通過與喂養(yǎng)細(xì)胞一起培養(yǎng)或通過將促細(xì)胞分裂劑或其它諸如抗體的調(diào)節(jié)劑添加至CD40、CD40配體或CD20、佛波醇十四烷酸酯乙酸酯、細(xì)菌脂多糖、刀豆球蛋白A、植物凝血素或商陸促細(xì)胞分裂劑中而在活體外加以培養(yǎng)和刺激。
細(xì)胞也可自具有免疫學(xué)病癥的受檢者分離，所述病癥例如，全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎、修格連氏綜合癥(Sjogren syndrome)、全身性硬化癥或抗磷脂綜合癥。受檢者可為人類或動(dòng)物，例如，人類疾病的動(dòng)物模型或具有類似病癥的動(dòng)物。細(xì)胞可自包含人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物分離。
所述細(xì)胞可能已活化體細(xì)胞高突變的程序?？?例如)通過用抗免疫球蛋白、抗CD40和抗CD38抗體處理來刺激細(xì)胞經(jīng)歷免疫球蛋白基因的體細(xì)胞誘變(參見，例如Bergthorsdottir等人，(2001)JImmunol.1662228)。在另一實(shí)施例中，細(xì)胞是天然的。
可通過下列例示性方法將編碼免疫球蛋白可變域的核酸自天然庫中分離。首先，將RNA自免疫細(xì)胞分離。將全長(zhǎng)(例如，帶帽)mRNA分離(例如，通過用小牛腸磷酸酶使去帽RNA去磷酸化)。隨后，將帽用煙草酸焦磷酸酶移除且使用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。
第一(反義)鏈的逆轉(zhuǎn)錄可用任何合適的引物以任何方式完成。參見，例如Haard等人，(1999)J.Biol.Chem 27418218-30。引物結(jié)合區(qū)在不同免疫球蛋白間可為恒定的(例如)以逆轉(zhuǎn)錄免疫球蛋白的不同同型。引物結(jié)合區(qū)也可對(duì)免疫球蛋白的特殊同型具有特異性。通常，引物對(duì)為編碼至少一個(gè)CDR的序列的3′的區(qū)域具有特異性。在另一實(shí)施例中，可使用poly-dT引物(且對(duì)重鏈基因而言可能為優(yōu)選的)。
可將合成序列接合于逆轉(zhuǎn)錄鏈的3′端。逆轉(zhuǎn)錄之后PCR擴(kuò)增期間，可將合成序列用作結(jié)合正向引物的引物結(jié)合位點(diǎn)。合成序列的使用可免除使用不同正向引物池以完全捕獲可用多樣性的需要。
隨后，(例如)使用一個(gè)或一個(gè)以上循環(huán)使編碼可變域的基因擴(kuò)增。如果使用多個(gè)循環(huán)，則為增加的保真度可使用套式引物(nested primer)。隨后，將擴(kuò)增的核酸克隆于呈現(xiàn)庫載體中。
抗體產(chǎn)生一些例如Fab的抗體可在例如大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生。舉例而言，若Fab由呈現(xiàn)實(shí)體與噬菌體蛋白質(zhì)(或其片段)之間包含可抑止終止密碼子的噬菌體呈現(xiàn)載體中的序列編碼，則可將載體核酸穿梭入不能抑止終止密碼子的細(xì)菌細(xì)胞中。在此情況下，F(xiàn)ab并不與基因III蛋白融合且分泌于培養(yǎng)基中。
抗體也可在真核細(xì)胞中產(chǎn)生。在一實(shí)施例中，抗體(例如，scFv)在諸如畢赤酵母(Pichia)(參見，例如Powers等人，(2001)JImmunol Methods.251123-35)、漢遜氏酵母(Hanseula)或酵母菌(Saccharomyces)的酵母細(xì)胞中表達(dá)。
在一實(shí)施例中，抗體，尤其例如IgG的全長(zhǎng)抗體，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。用于重組表達(dá)的例示性哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包含中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)(包含描述于Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220中的dhfr-CHO細(xì)胞，與(例如)描述于Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621中的DHFR選擇標(biāo)記一起使用)、例如NSO骨髓瘤細(xì)胞和SP2細(xì)胞的淋巴細(xì)胞株、COS細(xì)胞、K562和來自例如轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞。舉例而言，所述細(xì)胞為乳腺上皮細(xì)胞。
除編碼免疫球蛋白域的核酸序列外，重組表達(dá)載體可帶有其它諸如調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中載體的復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因的序列。選擇標(biāo)記基因利于已引入載體的宿主細(xì)胞的選擇(參見，例如美國(guó)專利第4,399,216號(hào)、第4,634,665號(hào)和第5,179,017號(hào))。例示性選擇標(biāo)記基因包含二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(供在用甲胺喋呤選擇/擴(kuò)增的dhff宿主細(xì)胞中使用)和neo基因(供G418選擇用)。
在一用于抗體(例如，全長(zhǎng)抗體或其抗原結(jié)合部分)的重組表達(dá)的例示性系統(tǒng)中，將編碼抗體重鏈與抗體輕鏈的重組表達(dá)載體通過磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染引入dhfr-CHO細(xì)胞中。在重組表達(dá)載體中，抗體重鏈和輕鏈基因各操作性連接于增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件(例如，源自SV40、CMV、腺病毒等，諸如CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件或SV40增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件)以驅(qū)動(dòng)基因的高水平轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)載體也帶有DHFR基因，所述基因允許使用甲胺喋呤選擇/擴(kuò)增選擇已經(jīng)用載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。培養(yǎng)所選擇的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以允許表達(dá)抗體重鏈和輕鏈且自培養(yǎng)基回收完整抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，選擇轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)宿主細(xì)胞且自培養(yǎng)基回收抗體。舉例而言，一些抗體可通過親和性色譜法用蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G分離。
就包含F(xiàn)c域的抗體而言，抗體產(chǎn)生系統(tǒng)可合成其中Fc區(qū)被糖基化的抗體。舉例而言，IgG分子的Fc域在CH2域中的天冬酰胺297處糖基化。所述天冬酰胺為用雙觸角型寡糖修飾的位點(diǎn)。所述糖基化作用參與由Fc γ受體和補(bǔ)體Clq介導(dǎo)的效應(yīng)子功能(Burton和Woof(1992)Adv.Immunol.511-84；Jefferis等人，(1998)Immunol.Rev.16359-76)。Fc域可產(chǎn)生于使對(duì)應(yīng)于天冬酰胺297的殘基適當(dāng)糖基化的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中。Fc域也可包含其它真核轉(zhuǎn)譯后修飾。
抗體也可包含(例如)改變Fc功能的修飾。舉例而言，人類IgG1恒定區(qū)可在一個(gè)或一個(gè)以上殘基處，例如殘基234和237(例如根據(jù)US 5,648,260中的數(shù)目)中的一個(gè)或一個(gè)以上處突變。其它例示性修飾包含描述于US 5,648,260中的修飾。
抗體也可由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生。舉例而言，U.S 5,849,992描述在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺中表達(dá)抗體的方法。轉(zhuǎn)基因經(jīng)構(gòu)造包含乳液特異性啟動(dòng)子和編碼所關(guān)注的抗體的核酸和用于分泌的信號(hào)序列。由所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的雌性產(chǎn)生的乳液包含分泌于其中的所關(guān)注的抗體。可將抗體自乳液純化，或就一些應(yīng)用而言，可直接使用。
也有可能(例如)使用(例如)具有天然的人類或部分人類免疫球蛋白基因座的動(dòng)物由免疫產(chǎn)生與hK1結(jié)合的抗體。在一實(shí)施例中，非人類動(dòng)物包含至少部分人免疫球蛋白基因。舉例而言，有可能用人類Ig基因座的大片段使小鼠抗體產(chǎn)生有缺陷的小鼠品系工程化。使用雜交瘤技術(shù)，可產(chǎn)生且選擇源自具有所要特異性的基因的抗原特異性單克隆抗體。參見，例如XenoMouseTM，Green等人，Nature Genetics 713-21(1994)；U.S.2003-0070185和WO 96/34096。
hK1的整體或部分可用作免疫原。
非人類抗體也可經(jīng)修飾以包含插入人類免疫球蛋白序列的取代，例如，在例如一或一個(gè)以上(優(yōu)選地至少5個(gè)、10個(gè)、12個(gè)或所有)下列位置的特殊位置處的一致人類氨基酸殘基(在輕鏈的可變域的FR中)4L、35L、36L、38L、43L、44L、58L、46L、62L、63L、64L、65L、66L、67L、68L、69L、70L、71L、73L、85L、87L、98L和/或(在重鏈的可變域的FR中)2H、4H、24H、36H、37H、39H、43H、45H、49H、58H、60H、67H、68H、69H、70H、73H、74H、75H、78H、91H、92H、93H和/或103H(根據(jù)Kabat編號(hào))。參見，例如U.S.6,407,213。
例示性人類抗體在一實(shí)施例中，本文所述的hK1結(jié)合抗體包含一個(gè)或一個(gè)以上人類構(gòu)架序列，例如重鏈和/或輕鏈可變域序列中的人類或有效人類的FR1、FR2、FR3和/或FR4。
在一實(shí)施例中，重鏈可變域序列具有H1和H2高變環(huán)，所述高變環(huán)具有1-3正則結(jié)構(gòu)(根據(jù)Chothia等人，(1992)J.Mol.Biol.227799-817；Tomlinson等人，(1992)J.Mol.Biol.227776-798)。就FR1、FR2和FR3而言，與所述結(jié)構(gòu)相容的例示性構(gòu)架分別包含下列序列；EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVARFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFWIRQAPGKGLEWVSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCAREVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFWVRQAPGKGLEWVSRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKD通常，與1-3正則結(jié)構(gòu)相容的來自任何人類生殖系抗體序列的構(gòu)架可用于重鏈。類似地，就各自的輕鏈CDR而言，輕鏈構(gòu)架可選自相容的人類生殖系抗體序列。VH或VL區(qū)段的構(gòu)架可用于FR1、FR2和FR3。
靶蛋白質(zhì)的產(chǎn)生hK1可通過例如于大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)的重組表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生。基本上如Irie等人，(1986)Biochem.Int.13，375-382所述，人類血管舒緩素hK1也可自尿中純化至均一。
結(jié)合檢定ELISA。使用ELISA檢定可就例如結(jié)合性質(zhì)的相互作用性質(zhì)評(píng)估例如可與hK1相互作用的抗體的蛋白質(zhì)。舉例而言，使各蛋白質(zhì)接觸底面已涂有靶(例如限量的靶)的微量滴定盤。將所述盤用緩沖液洗滌以移除非特異性結(jié)合的多肽。隨后，通過用可識(shí)別多肽(例如多肽的標(biāo)記部分或恒定部分)的抗體探測(cè)所述盤而測(cè)定結(jié)合于所述盤的蛋白質(zhì)的量。所述抗體是連接于諸如堿性磷酸酶的酶，當(dāng)提供適當(dāng)?shù)孜飼r(shí)，其產(chǎn)生比色產(chǎn)物。可將蛋白質(zhì)自細(xì)胞純化或以呈現(xiàn)庫格式，例如呈與絲狀噬菌體鞘的融合的形式檢定?；蛘撸瑢⒈磉_(dá)例如hK1的靶分子的細(xì)胞(例如，活的或固定的)涂于微量滴定盤中且用于測(cè)試存在于呈現(xiàn)庫中或自呈現(xiàn)庫中通過選擇而獲得的肽/抗體的親和力。
在ELISA檢定的另一型式中，使用多樣性鏈庫中的各多肽涂布微量滴定盤的不同孔。隨后，使用恒定靶分子進(jìn)行ELISA以探查各孔。
均相結(jié)合檢定。候選蛋白質(zhì)與靶的結(jié)合相互作用可使用均相檢定分析，例如在添加檢定的所有組分之后，不需要其它液相操作。舉例而言，熒光共振能量傳遞(FRET)可用作均相檢定(參見，例如，Lakowicz等人，美國(guó)專利第5,631,169號(hào)；Stavrianopoulos，等人，美國(guó)專利第4,868,103號(hào))。若第二分子鄰近第一分子，則選擇第一分子上的熒光團(tuán)標(biāo)記(例如，在洗提份中鑒別出的分子)以致其所發(fā)射的熒光能量可為第二分子(例如，靶)上的熒光標(biāo)記所吸收。當(dāng)?shù)诙肿由系臒晒鈽?biāo)記吸收傳遞的能量時(shí)，其發(fā)出熒光。因?yàn)闃?biāo)記之間的能量傳遞的效率與分隔分子的距離有關(guān)，所以可評(píng)估分子之間的空間關(guān)系。在分子之間發(fā)生結(jié)合的情形下，檢定中‘受體’分子標(biāo)記的熒光發(fā)射應(yīng)最大。經(jīng)配置以由FRET監(jiān)測(cè)的結(jié)合結(jié)果可通過所屬領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)熒光檢測(cè)方法(例如，使用熒光計(jì))方便地測(cè)量。通過滴定第一或第二結(jié)合分子的量，可產(chǎn)生結(jié)合曲線以估算平衡結(jié)合常數(shù)。
均相檢定的另一實(shí)例為α篩選(Packard Bioscience，Meriden CT)。α篩選使用兩個(gè)經(jīng)標(biāo)記的珠粒。一個(gè)珠粒當(dāng)受激光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生單重態(tài)氧。當(dāng)單重態(tài)氧自第一珠粒擴(kuò)散且與另一珠粒接觸時(shí)，另一珠粒產(chǎn)生光信號(hào)。僅當(dāng)兩個(gè)珠粒鄰近時(shí)，所述信號(hào)才產(chǎn)生?？蓪⒁粋€(gè)珠粒連接于呈現(xiàn)庫成員，另一者可連接于靶。測(cè)量信號(hào)以測(cè)定結(jié)合的程度。
當(dāng)候選蛋白質(zhì)連接于例如噬菌體的呈現(xiàn)庫載體時(shí)或使用候選蛋白質(zhì)作為自由分子，可進(jìn)行均相檢定。
表面等離子共振(SPR)。自呈現(xiàn)庫分離的分子與靶的結(jié)合相互作用可使用SPR加以分析。SPR或生物分子相互作用分析(BIA)實(shí)時(shí)檢測(cè)生物特異性相互作用，而無需標(biāo)記反應(yīng)物中的任一個(gè)。BIA芯片的結(jié)合表面(指示結(jié)合結(jié)果)上的質(zhì)量變化導(dǎo)致靠近所述表面的光的折射率改變(表面等離子共振(SPR)的光學(xué)現(xiàn)象)。折射率的變化產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，所述信號(hào)測(cè)量為生物分子之間的實(shí)時(shí)反應(yīng)的指示。使用SPR的方法描述于以下各文獻(xiàn)中，例如美國(guó)專利第5,641,640號(hào)；Raether(1988)Surface Plasmons SpringerVerlag；Sjolander和Urbaniczky(1991)Anal.Chem.632338-2345；Szabo等人，(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705和由BIAcore International AB(Uppsala，Sweden)提供的在線資源。
來自SPR的信息可用于提供生物分子與靶的結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Kd)和包含Kon和Koff的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的精確和定量的測(cè)量。所述數(shù)據(jù)可用于比較不同生物分子。舉例而言，可比較由選自多樣性鏈的庫的核酸編碼的蛋白質(zhì)以鑒別對(duì)靶具有高親和力或具有慢Koff的個(gè)體。所述信息也可用于闡明結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)。舉例而言，可將母蛋白質(zhì)的成熟型式的動(dòng)力學(xué)和平衡結(jié)合參數(shù)與所述母蛋白質(zhì)的參數(shù)比較。可鑒別出給定位置的變異氨基酸與例如高親和力和慢Koff的特殊結(jié)合參數(shù)相關(guān)?？蓪⑺鲂畔⑴c結(jié)構(gòu)模型化組合(例如，使用同源模型化、能量最低化或通過結(jié)晶學(xué)或NMR進(jìn)行的結(jié)構(gòu)測(cè)定)。因此，對(duì)蛋白質(zhì)與其靶之間的物理相互作用的理解可公式化且用于指導(dǎo)其它設(shè)計(jì)方法。
蛋白質(zhì)陣列?？蓪⒆猿尸F(xiàn)庫鑒別出的多肽固定于固相支撐物上，例如，于珠?；蜿嚵猩?。就蛋白質(zhì)陣列而言，將多肽中的每一個(gè)均固定于支撐物上的唯一地址上。通常，所述地址為二維地址。蛋白質(zhì)陣列描述如下(參見，例如診斷學(xué))。
生物檢定可使用活體外生物化學(xué)檢定評(píng)估hK1蛋白水解的抑制。參見，例如Bourgeois等人，(1997)J.Biol.Chemistry 27229590-29595?？捎糜诒O(jiān)測(cè)hK1蛋白水解的例示性肽底物包含Abz-FRSARQ-EDDnp、Abz-TFRSARQ-EDDnp、Abz-FTFRSARQ-EDDnp、Abz-AIKFFSAQ-EDDnp、Abz-VIAGRSLNPNQ-EDDnp、Abz-AMSRMSLSSFSVNRQ-EDDnp、Abz-AIKFFSRQ-EDDnp和Abz-TFFSARQ-EDDnp，其中Abz表示鄰氨基苯甲?；褽DDnp表示N-(2，4-二硝基苯基)乙二胺。分子內(nèi)淬滅的熒光肽可通過經(jīng)典解決方法合成；谷氨酰胺可定位作為C末端殘基。參見，例如Hirata等人，Lett.Pept.Sci.1，299-308。合成可用Fmoc方法使用多重自動(dòng)化肽合成器(PSSM-8，Shimadzu Co.)執(zhí)行?？蓪⒎肿觾?nèi)淬滅熒光底物制備為于N，N-二甲基甲酰胺中的2mM儲(chǔ)備溶液且用活化緩沖液稀釋。底物純度可由MALDI-TOF質(zhì)譜分析(TofSpec-E，Micromass)且由用于0.075％TFA中的0-60％乙腈的10min線性梯度以2.0mL/min洗提的C18管柱逆相層析核對(duì)。
評(píng)估酶動(dòng)力學(xué)的例示性條件為在37℃下在含有1mM EDTA和0.02％IGEPAL(先前為Nonidet P-40)的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.3)。
動(dòng)物模型US5,911,988描述用于哮喘的例示性小鼠模型。所述小鼠模型可用于評(píng)估也識(shí)別鼠類動(dòng)物KLK1蛋白的hK1結(jié)合蛋白的能力。小鼠也可經(jīng)改造以表達(dá)hK1。小鼠經(jīng)受長(zhǎng)期重復(fù)的過敏原吸入且可用于評(píng)估肺中過敏疾病的長(zhǎng)期效應(yīng)且用于描繪人類肺的氣管過度反應(yīng)的誘導(dǎo)中涉及的細(xì)胞、機(jī)制、分子和介體。
可使用雌性BALB/c小鼠(6-8周)且將其維持在用于研究的習(xí)知條件下。
試劑獲自Pierce Chem.Co.(Rockford，111.)的Crystalline OVA、來自Sigma Chem.Co.(St.Louis，Mo.)的硫酸鋁鉀(明礬)、來自Baxter，Healthcare Corporation(Deerfield，111.)的無熱原蒸餾水、來自lymphomed(Deerfield，111.)的0.9％氯化鈉(生理鹽水)和來自Cyclodextrin Technologies Development、Inc.(Gainesville，F(xiàn)la.)的TRAPPSOLTMHPB-L100(含水羥丙基β環(huán)糊精；45重量/體積％水溶液)。
過敏原免疫/攻毒方案。小鼠接受0.2ml(100μg)的OVA和明礬(J.Exp Med.1996；1841483-1494)的腹膜內(nèi)注射?？墒褂貌煌桨?。舉例而言，在分別在不同天接受以于0.05ml生理鹽水中的100μgOVA鼻內(nèi)(i.n.)給藥和以于0.05ml生理鹽水中的50μgOVA鼻內(nèi)給藥之前，可用腹膜內(nèi)給予0.2ml于生理鹽水中的克他命(ketamine)(0.44mg/ml)/甲苯噻嗪(6.3mg/ml)使小鼠麻醉。為評(píng)估hK1結(jié)合蛋白，(例如)在鼻內(nèi)給藥攻毒之前，可將蛋白質(zhì)與測(cè)試劑量的hK1結(jié)合蛋白一起投與，且與接受不包含hK1結(jié)合蛋白的對(duì)照投藥的相應(yīng)對(duì)照小鼠比較。
組織學(xué)。獲得氣管和左肺(右肺用于支氣管肺泡灌洗(“BAL”))且在室溫下將其于10％中性甲醛溶液中固定6至約15小時(shí)。包埋于石蠟中之后，將組織切成5μm的切片且可用不同染色或免疫標(biāo)記進(jìn)一步處理。Discombe嗜伊紅血球染色可與亞甲基藍(lán)對(duì)比染色一起用于計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。每單位氣管面積(2,200μm2)的嗜伊紅血球數(shù)目可由形態(tài)測(cè)定法(J.Pathol.1992；166395-404；Am Rev RespirDis.1993；147448-456)測(cè)定。纖維化可用Masson三色染色法鑒別。氣管粘液可通過下列染色法鑒別亞甲基藍(lán)、蘇木精和曙紅、粘液素卡紅(mucicarmine)、愛爾新藍(lán)(alcian blue)和愛爾新藍(lán)/過碘酸-希夫氏(periodic acid-Schiff)(PAS)反應(yīng)(Troyer，H.，″Carbohydrates″in Principles andTechniques of Histochemistry，Little，Brown and Company，Boston，Mass.，198089-121；Sheehan，D.C，等人，″Carbohydrates″in Theory and Practice of Histotechnology，BattlePress，Columbus，Ohio，1980159-179)?？蓪⒄骋核赜谜骋核乜t溶液染色；使用間胺黃對(duì)比染色?？蓪⑺嵝哉骋核睾土蛩嵴骋何镔|(zhì)用愛爾新藍(lán)(pH2.5)染色；也可使用核固紅對(duì)比染色。中性和酸性粘液物質(zhì)由愛爾新藍(lán)(pH2.5)和PAS反應(yīng)鑒別。粘液堵塞氣管(直徑為0.5-0.8mm)的程度也可由形態(tài)測(cè)定法評(píng)定。將因粘液的氣管直徑的堵塞百分率按0至4+的半定量標(biāo)度分級(jí)。組織學(xué)和形態(tài)測(cè)定分析可由對(duì)方案設(shè)計(jì)未知的個(gè)體執(zhí)行。
肺功能測(cè)試。在第28天，最后一次鼻內(nèi)投與生理鹽水或OVA之后24小時(shí)，經(jīng)靜脈內(nèi)輸入乙酰甲膽堿的肺機(jī)制可在小鼠中通過體積描記方法活體內(nèi)測(cè)定，例如如先前所述(10，1958；192364-368；J.Appl.Physiol.1988；642318-2323；J.Exp.Med.1996；1841483-1494)或使用其修改方案。肺功能測(cè)試完成時(shí)，可通過心臟穿刺對(duì)各小鼠抽血且使用具有氣管的肺組織用于進(jìn)一步分析。
支氣管肺泡灌洗。在主流支氣管處將左肺打結(jié)之后，可將右肺用0.4ml生理鹽水灌洗3次。將來自匯集樣品的0.05ml等分試樣的支氣管肺泡灌洗(BAL)液體細(xì)胞使用血球計(jì)計(jì)數(shù)且在4℃下將剩余液體在200g下離心10分鐘。將上清液儲(chǔ)存于-70℃下直至執(zhí)行類廿烷酸分析。在將細(xì)胞塊再懸浮于含有10％牛血清白蛋白(“BSA”)的生理鹽水中之后，可在玻璃載片上制造BAL細(xì)胞涂片。為將嗜伊紅血球染色，將干燥載片用Discombe稀釋液體(于蒸餾水中的0.05％曙紅水溶液和5％丙酮(體積/體積)；J.Exp.Med.1970；1311271-1287)染色5-8分鐘，用水漂洗0.5分鐘且用0.07％亞甲基藍(lán)對(duì)比染色2分鐘。
氣管粘液糖蛋白檢定。將BAL液體中的粘液糖蛋白通過狹縫墨點(diǎn)法和PAS染色法(Anal.Biochem.1989；182160-164；Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.1995；12296-306)檢定。在置放于Minifold II72-孔狹縫墨點(diǎn)設(shè)備(Schleicher&Schuell)之前在蒸餾水中且隨后在生理鹽水中將硝化纖維膜(0.2-.mu.m孔徑；Schleicher&Schuell，Keene，N.H.)潤(rùn)濕。將BAL液體樣品(0.05ml)和人類呼吸粘液素糖蛋白的儲(chǔ)備溶液(2.mu.m/ml)的等分試樣(0.05-0.751)(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.1991；571-79)通過水抽吸真空點(diǎn)樣于硝基纖維素膜上，且使粘液糖蛋白通過PAS反應(yīng)顯現(xiàn)?？蓤?zhí)行反射密度測(cè)定法以量化PAS染色?？赏ㄟ^與人類呼吸粘液素的標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較將BAL樣品的PAS反應(yīng)性的整體強(qiáng)度量化。
免疫細(xì)胞化學(xué)。可使用單克隆抗體CD11c(DAB方法)和Mac1(Beringer Mannheim，用Hitomouse試劑盒(Zymed)的ABC方法)鑒別維管結(jié)構(gòu)、氣管和纖維化區(qū)域內(nèi)/周圍的發(fā)炎性細(xì)胞型，例如樹狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
US 6,462,020描述用于關(guān)節(jié)炎的例示性小鼠模型，誘導(dǎo)II型膠原關(guān)節(jié)炎小鼠模型。所述小鼠模型可用于評(píng)估hK1結(jié)合蛋白對(duì)誘導(dǎo)II型膠原關(guān)節(jié)炎的組織、射線攝影和臨床表現(xiàn)的效應(yīng)。
自體免疫疾病引起顯著的且慢性的病態(tài)和功能缺損。多種形式的關(guān)節(jié)炎代表自體免疫疾病家族。在臨床領(lǐng)域內(nèi)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)為最常見形式的嚴(yán)重關(guān)節(jié)異常疾病。RA為進(jìn)行性疾病。
存在于鼠類動(dòng)物CIA中的關(guān)節(jié)炎病變的組織病理學(xué)與人類患者中的RA的關(guān)節(jié)炎病變的組織病理學(xué)具有極大的相似性。鼠類動(dòng)物CIA為研究RA潛在治療性治療的適用模型。
物質(zhì)和方法。小鼠重25gms的DBA/1(2)雄性小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Me.或B&K Universal，Kent Wash.)用于所述研究中。小鼠的所述品系易于通過注射異源II型膠原感染CIA。牛膠原(BC)、完全弗氏佐劑(Complete Freund′s Adjuvant)(CFA)和不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund′s Adjuvant)(ICFA)可獲自Sigma Chemical。將用于免疫的抗原以0.1M乙酸處理且用CFA或ICFA調(diào)配。
關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)。免疫方案在研究期間，以預(yù)定間隔給小鼠注射100μg于CFA中的II型膠原。
以預(yù)定間隔檢查小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。關(guān)節(jié)炎的推測(cè)證據(jù)包含兩次連續(xù)觀測(cè)時(shí)前腳和/或后腳上至少一個(gè)趾關(guān)節(jié)的腫脹和紅斑。
關(guān)節(jié)炎的確認(rèn)診斷。關(guān)節(jié)的組織學(xué)檢查將在適當(dāng)間隔處死的動(dòng)物的趾關(guān)節(jié)移除、固定、脫鈣、包埋于石蠟、切片且染色以觀測(cè)一般性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)特征且適當(dāng)時(shí)檢測(cè)各關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)翳的軟骨基質(zhì)。細(xì)胞性程度和發(fā)炎面積通過使用組織顯微攝影的數(shù)字化且應(yīng)用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)面積和點(diǎn)計(jì)數(shù)技術(shù)定量。
執(zhí)行趾關(guān)節(jié)的射線攝影評(píng)估以檢測(cè)用II型膠原免疫之后關(guān)節(jié)改變的發(fā)病率。已改造乳腺攝影成像系統(tǒng)用于所述研究。關(guān)節(jié)的軟組織(關(guān)節(jié)翳)的平均面積通過電腦數(shù)字化射線攝影分析測(cè)定，同時(shí)通過與各射線攝影所包含的內(nèi)標(biāo)物比較而測(cè)定相鄰硬組織的密度變化。為用作硬組織密度變化和關(guān)節(jié)翳面積的基線對(duì)照，可經(jīng)相同時(shí)間使用其它小鼠且比較密度和面積數(shù)據(jù)。在各時(shí)間點(diǎn)使用對(duì)偶T測(cè)試評(píng)定對(duì)照小鼠和實(shí)驗(yàn)小鼠的密度和面積的差異的顯著性。
關(guān)節(jié)炎評(píng)估。每日觀察動(dòng)物關(guān)節(jié)炎的發(fā)作。關(guān)節(jié)炎指數(shù)通過將各腳爪受牽連的嚴(yán)重性按0至4的標(biāo)度分級(jí)而得出?；陉P(guān)節(jié)周圍的紅斑和水腫的程度和關(guān)節(jié)畸形而計(jì)分。也通過用恒定張力測(cè)徑規(guī)自內(nèi)踝至外踝測(cè)量踝的厚度而量化后腳爪的腫脹。
Tuohy等人(J.Immunol.(1988)1411126-1130)，Sobel等人(J.Immunol.(1984)1322393-2401)和Traugott(Cell Immunol.(1989)119114-129)，描述用于多發(fā)性硬化癥的實(shí)驗(yàn)性自體免疫性腦炎(EAE)小鼠模型。所述小鼠模型可用于評(píng)估調(diào)節(jié)多發(fā)性硬化癥的癥狀的hK1結(jié)合蛋白。
醫(yī)藥組合物本發(fā)明的特征也在于一種組合物，例如醫(yī)藥學(xué)上可接受的組合物，其包含例如(例如)如本文所述的hK1結(jié)合抗體的hK1結(jié)合蛋白。如本文所使用，“醫(yī)藥組合物”涵蓋用于診斷(例如，活體內(nèi)成像)用途的化合物(例如，標(biāo)記化合物)和用于治療或預(yù)防用途的化合物。
如本文所使用，“醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑”包含任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑和生理學(xué)上兼容的類似物。在一實(shí)施例中，所述載劑不是水。優(yōu)選地，所述載劑適用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、非經(jīng)腸、脊椎或表皮投藥(例如通過注射或輸液)。根據(jù)投藥途徑，可將活性化合物包覆于物質(zhì)中以保護(hù)所述化合物免受酸和其它可使所述化合物失活的自然條件的作用。
“醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽”指保留母化合物的所要生物活性且并不賦予任何不當(dāng)毒理學(xué)效應(yīng)的鹽(參見，例如Berge，S.M.，等人，(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。所述鹽的實(shí)例包含酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包含衍生自諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等的無毒無機(jī)酸的酸加成鹽，和衍生自諸如脂族單羧酸和脂族二羧酸、經(jīng)苯基取代的烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族磺酸和芳族磺酸等的無毒有機(jī)酸的酸加成鹽。堿加成鹽包含衍生自諸如鈉、鉀、鎂、鈣等的堿土金屬的堿加成鹽，和衍生自諸如N，N′-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)等的無毒有機(jī)胺的的堿加成鹽本發(fā)明的組合物可呈多種形式。所述形式包含(例如)液體、半固體和固體劑量形式，諸如液體溶液(例如，可注射的溶液和可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、藥丸、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選形式根據(jù)所欲投藥模式和治療應(yīng)用而定。典型的優(yōu)選組合物呈可注射和可輸注溶液形式，諸如類似于用于與抗體一起投與人類的組合物的組合物。投藥的優(yōu)選模式為非經(jīng)腸投藥(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi))。在一優(yōu)選實(shí)施例中，化合物經(jīng)靜脈內(nèi)輸液或注射投與。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，化合物經(jīng)肌肉內(nèi)或皮下注射投與。
如本文所使用的短語“非經(jīng)腸投與”意謂除經(jīng)腸或局部投藥的投藥模式，通常通過注射，且包含(但不限于)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊椎內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸液。
醫(yī)藥組合物通常必須為無菌的且在制造和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定。醫(yī)藥組合物也可經(jīng)測(cè)試以確保其符合投藥的管理和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。舉例而言，根據(jù)USP 24/NF 19方法，制劑中的內(nèi)毒素水平可使用鱟變形細(xì)胞溶胞物檢定(Limulus amebocyte lysate assay)(例如，使用來自Bio Whittaker lot#7L3790的試劑盒，敏感性0.125 EU/mL)測(cè)試。醫(yī)藥組合物的無菌狀態(tài)可根據(jù)USP 24/NF 19方法使用巰基乙酸鹽培養(yǎng)基測(cè)定。舉例而言，將所述制劑用于接種所述巰基乙酸鹽培養(yǎng)基且將其在35℃下培育14天或更長(zhǎng)。周期性檢查培養(yǎng)基以檢測(cè)微生物的生長(zhǎng)。
可將組合物調(diào)配為溶液、微乳液、分散液、脂質(zhì)體或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。無菌可注射溶液可通過將所需量的活性化合物按需要與以上所列舉的一種成分或其組合并入適當(dāng)溶劑中，接著過濾滅菌來制備。通常，分散液通過將活性化合物并入含有堿性分散介質(zhì)和所需的其它來自以上所列舉的成分中的成分的無菌載劑中來制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，優(yōu)選制備方法為真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分的粉末加上任何其它所要的來自其先前經(jīng)無菌過濾的溶液的成分。溶液的適當(dāng)流動(dòng)性可(例如)通過使用諸如卵磷脂的包衣維持，在分散液的情況下，通過維持所需的粒度和通過使用表面活性劑。可注射組合物的延長(zhǎng)吸收可通過使組合物中包含例如單硬脂酸鹽和明膠的延遲吸收的藥劑達(dá)成。
調(diào)配用于經(jīng)吸入遞送的抗體的例示性方法描述如下。
在一實(shí)施例中，hK1結(jié)合抗體經(jīng)調(diào)配以經(jīng)皮下遞送，例如，皮下注射?？墒褂闷は逻f送治療本文所述的任何病癥。在一實(shí)施例中，抗體提供為穩(wěn)定的包含水溶性保護(hù)劑(例如，諸如蔗糖或海藻糖的糖)的凍干蛋白質(zhì)調(diào)配物。凍干調(diào)配物可復(fù)水以產(chǎn)生穩(wěn)定的具有比預(yù)凍干調(diào)配物中的蛋白質(zhì)濃度顯著高(例如，高約2-4倍、優(yōu)選地高3-10倍且更優(yōu)選地高3-6倍)的蛋白質(zhì)濃度的復(fù)水調(diào)配物。尤其，當(dāng)預(yù)凍干調(diào)配物中的蛋白質(zhì)濃度可能為5mg/mL或更低時(shí)，復(fù)水調(diào)配物中的蛋白質(zhì)濃度可為50mg/mL或更高。因此，調(diào)配物可包含至少約50mg/mL的hK1結(jié)合蛋白。復(fù)水調(diào)配物中的所述高蛋白質(zhì)濃度可適用于經(jīng)皮下投藥。
所述復(fù)水調(diào)配物可為等張的。其可包含防腐劑(諸如注射用抑菌水，BWFI)。復(fù)水調(diào)配物可用作多用途調(diào)配物。所述調(diào)配物適用于(例如)患者需要頻繁經(jīng)皮下投與蛋白質(zhì)以治療慢性醫(yī)學(xué)病狀的情況。水溶性保護(hù)劑與蛋白質(zhì)的比率可(例如)為約100-1500摩爾海藻糖或蔗糖1摩爾抗體。緩沖液可用于穩(wěn)定預(yù)凍干制劑的pH值，例如將pH值穩(wěn)定在6-8范圍內(nèi)。舉例而言，緩沖液可包含一種或一種以上例如組氨酸的氨基酸，或其它在6-8范圍內(nèi)緩沖或具有所述范圍內(nèi)的pKa的藥劑。調(diào)配物可進(jìn)一步包含表面活性劑(例如，聚山梨醇酯)。
本文所述的化合物可通過所屬領(lǐng)域已知的多種方法投與。對(duì)多種應(yīng)用而言，投藥的途徑/模式為靜脈內(nèi)注射或輸液。舉例而言，就治療應(yīng)用而言，化合物可通過靜脈內(nèi)輸液以小于30mg/min、20mg/min、10mg/min、5mg/min或1mg/min的速率投與以達(dá)到約1至100mg/m2或7至25mg/m2的劑量。投藥的途徑和/或模式應(yīng)根據(jù)所要的結(jié)果而變化。在某些實(shí)施例中，活性化合物可用保護(hù)化合物以免快速釋放的載劑制備，諸如包含植入物和微囊密封遞送系統(tǒng)的受控釋放調(diào)配物?？墒褂每缮锝到狻⑸锛嫒菪跃酆衔?，諸如乙烯-乙酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。多種制備所述調(diào)配物的方法已取得專利權(quán)或通常為已知的。參見，例如Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems，J.R.Robinson編，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。醫(yī)藥調(diào)配為眾所公認(rèn)的技術(shù)，且進(jìn)一步描述于以下各文獻(xiàn)中Gennaro(編)，RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott，Williams&Wilkins(2000)(ISBN0683306472)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN0683305727)和Kibbe(編)，Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association，第3版，(2000)(ISBN091733096X)。
在某些實(shí)施例中，組合物可(例如)與惰性稀釋劑或可吸收食用載劑一起經(jīng)口投與。化合物(必要時(shí)，和其它成分)也可裝入硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓制成錠劑或直接并入受檢者的飲食中。就經(jīng)口治療性投藥而言，化合物可與賦形劑合并而且以下列形式使用可攝取錠劑、頰含片、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑等。為通過除非經(jīng)腸投藥以外的模式投與化合物，可能必需將化合物用防止其失活的物質(zhì)包覆或?qū)⒒衔锱c防止其失活的物質(zhì)共同投與。
醫(yī)藥組合物可用所屬領(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置投與。舉例而言，在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可用無針皮下注射裝置投與，所述裝置諸如揭露于美國(guó)專利第5,399,163號(hào)、第5,383,851號(hào)、第5,312,335號(hào)、第5,064,413號(hào)、第4,941,880號(hào)、第4,790,824號(hào)或第4,596,556號(hào)中的裝置。眾所周知的適用于本發(fā)明的植入物和組件的實(shí)例包含美國(guó)專利第4,487,603號(hào)，其揭露用于以受控速率分配藥物的可植入微量輸液泵；美國(guó)專利第4,486,194號(hào)，其揭露用于通過皮膚投與藥物的治療裝置；美國(guó)專利第4,447,233號(hào)，其揭露以精確輸液速率遞送藥物的醫(yī)藥輸液泵；美國(guó)專利第4,447,224號(hào)，其揭露用于連續(xù)藥物遞送的可變流速可植入輸液設(shè)備；美國(guó)專利第4,439,196號(hào)，其揭露具有多腔室隔室的滲透藥物遞送系統(tǒng)；和美國(guó)專利第4,475,196號(hào)，其揭露滲透藥物遞送系統(tǒng)。當(dāng)然，也已知多種其它所述植入物、遞送系統(tǒng)和組件。
在某些實(shí)施例中，化合物可經(jīng)調(diào)配以確保在活體內(nèi)適當(dāng)分布。舉例而言，血腦障壁(BBB)排斥多種高親水性化合物。為確保本發(fā)明的治療化合物通過BBB(若想要)，則可將其調(diào)配(例如)于脂質(zhì)體中。就制造脂質(zhì)體的方法而言，參見，例如美國(guó)專利4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂質(zhì)體可包括一個(gè)或一個(gè)以上選擇性運(yùn)輸至特定細(xì)胞或器官中的部分，因此增強(qiáng)靶向藥物遞送(參見，例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。
試劑盒也在本發(fā)明的范疇內(nèi)，其包括本文所述的組合物(例如，含有hK1結(jié)合蛋白的化合物和例如治療、預(yù)防或診斷使用的使用說明書的組合物)。在一實(shí)施例中，試劑盒包含(a)化合物，例如包含所述化合物的組合物，和視需要(b)信息材料。所述信息材料可為描述性的、指導(dǎo)性的、銷售用的或其它與本文所述的方法和/或用于本文所述的方法的化合物的使用相關(guān)的材料。舉例而言，信息材料描述投與化合物以降低hK1活性或治療或預(yù)防hK1相關(guān)病癥的化合物的方法。
在一實(shí)施例中，信息材料可包含以例如，合適劑量、劑型或投藥模式的合適方式(例如以本文所述的劑量、劑型或投藥模式)投與化合物的說明書。在另一實(shí)施例中，信息材料可包含鑒別合適受檢者的說明書，所述合適受檢者例如人類，例如具有或處于hK1相關(guān)病癥或以過度hK1活性為特征的病癥的風(fēng)險(xiǎn)的人類。信息材料可包含以下信息關(guān)于化合物的制造、化合物的分子量、濃度、截止日期、批次或制造場(chǎng)所信息等。試劑盒的信息材料并不受其形式限制。在多種情況下，將例如說明書的信息材料提供為例如印刷文本、圖式和/或照片的印刷品，例如標(biāo)簽或印刷紙張。然而，信息材料也可以其它格式提供，諸如盲文、電腦可讀材料、視頻記錄或音頻記錄。在另一實(shí)施例中，試劑盒的信息材料為聯(lián)系信息或聯(lián)絡(luò)信息，例如實(shí)際地址、電子郵件地址、超鏈接、網(wǎng)址或電話號(hào)碼，其中試劑盒的使用者可獲得大量關(guān)于化合物和/或其在本文所述的方法中的用途的信息。當(dāng)然，信息材料也可以任何格式的組合的形式提供。
除化合物以外，試劑盒的組合物可包含其它成分，諸如溶劑或緩沖液、穩(wěn)定劑或防腐劑，和/或用于治療本文所述的病狀或病癥的第二藥劑?；蛘?，試劑盒中可包含其它成分，但位于與所述化合物不同的組合物或容器中。在所述實(shí)施例中，試劑盒可包含將化合物與其它成分混合或?qū)⒒衔镞B同其它成分一起使用的說明書。
化合物可以任何形式提供，例如液體、干燥或凍干形式。優(yōu)選地，所述化合物為大體上純的和/或無菌的。當(dāng)以液體溶液提供化合物時(shí)，所述液體溶液優(yōu)選地為水溶液，其中無菌水溶液為優(yōu)選的。當(dāng)以干燥形式提供化合物時(shí)，復(fù)水通常是通過添加合適溶劑。視需要可于試劑盒中提供例如無菌水或緩沖液等溶劑。
試劑盒可包含一個(gè)或一個(gè)以上用于含有化合物的組合物的容器。在一些實(shí)施例中，試劑盒含有獨(dú)立的用于組合物和信息材料的容器、分隔器或隔室。舉例而言，組合物可包含于瓶、小瓶或注射器中，且信息材料可包含于塑料套或包裝中。在其它實(shí)施例中，試劑盒的獨(dú)立元件包含于單個(gè)未分開的容器中。舉例而言，組合物包含于其上粘附有標(biāo)簽形式的信息材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些實(shí)施例中，試劑盒包含多個(gè)(例如，一包)個(gè)別容器，其各含有一個(gè)或一個(gè)以上化合物的單位劑型(例如，本文所述的劑型)。舉例而言，試劑盒包含多個(gè)注射器、安瓿、箔片包裝或發(fā)泡包裝，其各含有化合物的單個(gè)單位劑量。試劑盒的容器可為氣密、防水的(例如，不能透過水份或蒸氣的變化)和/或不透光的。
在一其中化合物含有hK1結(jié)合抗體的實(shí)施例中，用于診斷應(yīng)用的說明書包含化合物在活體外(例如，在例如來自患有肺病或本文所述的其它病癥的患者的活組織檢查樣品或細(xì)胞的樣品中)或活體內(nèi)檢測(cè)hK1的用途。在另一實(shí)施例中，用于治療應(yīng)用的說明書包含患有肺病或本文所述的例如哮喘(例如，過敏性哮喘和非過敏性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、鼻炎、竇炎、炎性腸病(諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、免疫介導(dǎo)糖尿病、急性胰腺炎、間質(zhì)性膀胱炎或贅生性病癥(例如，轉(zhuǎn)移性病癥或腫瘤血管生成)等其它病癥的患者中所建議的劑量和/或投藥模式。試劑盒可進(jìn)一步含有至少一種酌情調(diào)配于一個(gè)或一個(gè)以上獨(dú)立醫(yī)藥制劑中的其它試劑，諸如，例如如本文所述的診斷劑或治療劑的診斷劑或治療劑和/或一種或一種以上其它治療所述病癥的藥劑。
治療可將hK1結(jié)合蛋白投與例如人類受檢者的受檢者以治療、預(yù)防和/或診斷多種病癥，諸如hK1相關(guān)病癥和以不當(dāng)或異常hK1活性為特征的疾病。例示性病癥包含哮喘(例如，過敏性哮喘和非過敏性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、鼻炎、竇炎、諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎的炎性腸病、免疫介導(dǎo)糖尿病、急性胰腺炎、間質(zhì)性膀胱炎或其它hK1相關(guān)病癥，或贅生性病癥(例如，轉(zhuǎn)移性胰腺癌、腫瘤血管生成)?！癶K1相關(guān)病癥”為其中hK1至少部分介導(dǎo)的病癥，以致于降低hK1蛋白水平或活性可改善病癥的至少一個(gè)方面，例如，病癥的至少一個(gè)癥狀。
除投與至受檢者外，也可將化合物投與至培養(yǎng)物(例如活體外或離體)的細(xì)胞、組織或器官中。
如本文所使用，術(shù)語“治療”定義為出于醫(yī)治、治愈、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、改進(jìn)或影響病癥、病癥的癥狀或病癥的誘因的目的，向例如患者的受檢者單獨(dú)或與一種或一種以上其它藥劑組合施用或投與化合物，或向來自例如患者的受檢者的分離組織或例如細(xì)胞株的細(xì)胞施用或投與所述藥劑，所述受檢者具有病癥(例如如本文所述的病癥)、病癥的癥狀或病癥的誘因。
如本文所使用，有效治療病癥的hK1結(jié)合蛋白的量或“治療有效量”指在向受檢者投與單劑量或多劑量之后，在治療受檢者中為有效的化合物的量，例如將受檢者的病癥的至少一個(gè)癥狀醫(yī)治、緩解、減輕或改善至超出在不存在所述治療的情況下預(yù)期的程度。舉例而言，所述病癥可為肺病，例如本文所述的肺病。
“局部有效量”指在檢測(cè)調(diào)節(jié)組織中(例如暴露于hK1的肺的區(qū)域中)的靶蛋白質(zhì)(例如，hK1)的活性方面有效的化合物的量(例如，濃度)。調(diào)節(jié)的證據(jù)可包含(例如)底物的量增加，例如底物的蛋白水解降低。
如本文所使用，有效預(yù)防病癥的hK1結(jié)合蛋白的量或蛋白質(zhì)的“預(yù)防有效量”指在向受檢者投與單劑量或多劑量之后，在預(yù)防或延遲例如hK1相關(guān)病癥的病癥的發(fā)作或復(fù)發(fā)的發(fā)生方面為有效的hK1結(jié)合蛋白的量。
(例如)表示兩個(gè)狀態(tài)之間的定量差異的術(shù)語“誘導(dǎo)”、“抑制”、“增強(qiáng)”、“提高”、“增加”、“降低”等指兩個(gè)狀態(tài)之間的差異，例如統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(例如，P＜0.05、0.02或0.005)。
給藥方案經(jīng)調(diào)節(jié)以提供最佳的所要反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。舉例而言，可投與單次大丸劑，可隨時(shí)間投與數(shù)次分開的劑量，或可如治療情形的緊急狀態(tài)指示將劑量按比例降低或增加。為便于投藥和劑量的均勻性，以劑量單位形式調(diào)配非經(jīng)腸組合物尤其有利。如本文所使用的劑量單位形式指適合以單一劑量用于所欲治療的受檢者的物理離散的單位；各單位含有與所需醫(yī)藥載劑相關(guān)聯(lián)的經(jīng)計(jì)算以產(chǎn)生所要治療效應(yīng)的預(yù)定量的活性化合物。
本文所述的化合物的治療上或預(yù)防上有效的量的例示性非限制性范圍為0.1-20mg/kg，更優(yōu)選地為1-10mg/kg?；衔锟赏ㄟ^靜脈內(nèi)輸液以小于20mg/min、10mg/min、5mg/min或1mg/min的速率投與以達(dá)到約1至50mg/m2或約5至20mg/m2的劑量。應(yīng)注意劑量值可隨所欲緩解的病狀的類型和嚴(yán)重性而變化。進(jìn)一步應(yīng)理解，對(duì)于任何特殊受檢者，特定給藥方案應(yīng)根據(jù)個(gè)人需要和投與或監(jiān)督組合物的投藥的人的專業(yè)判斷隨時(shí)間調(diào)整，且本文所述的劑量范圍僅為例示性的。
醫(yī)藥組合物可包含“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本文所述的化合物，例如包含結(jié)合且抑制hK1的多肽的化合物。
組合物的治療有效量可根據(jù)諸如疾病狀態(tài)、個(gè)體的年齡、性別和重量和化合物在個(gè)體中引起所要反應(yīng)的能力的因素而變化。治療有效量也為其中治療上有益的效應(yīng)勝過組合物的任何毒性或不利效應(yīng)的量。
如本文所使用，術(shù)語“受檢者”意欲包含人類和非人類動(dòng)物。本發(fā)明的術(shù)語“非人類動(dòng)物”包含所有脊椎動(dòng)物，例如非哺乳動(dòng)物(諸如雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物)和諸如非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物、羊、犬、母牛、豬等的哺乳動(dòng)物。
本方法可用于培養(yǎng)物中(例如活體外或離體)的細(xì)胞。所述方法可作為活體內(nèi)(例如，治療或預(yù)防)方案的部分對(duì)存在于受檢者中的細(xì)胞執(zhí)行。就活體內(nèi)實(shí)施例而言，接觸步驟是在受檢者中實(shí)施且包含在有效允許蛋白質(zhì)結(jié)合于hK1的條件下向受檢者投與hK1結(jié)合蛋白。
投與化合物的方法描述于“醫(yī)藥組合物”中。所使用的化合物的合適劑量應(yīng)根據(jù)受檢者的年齡和重量和所使用的特定藥物而定。化合物可用作競(jìng)爭(zhēng)性藥劑以抑制、降低(例如)天然底物與hK1之間的不當(dāng)相互作用。
hK1結(jié)合蛋白也可用于遞送多種有效負(fù)載，例如，包含治療藥物的藥物、發(fā)射輻射的化合物、植物、真菌或細(xì)菌來源的分子、生物蛋白質(zhì)和其混合物。hK1結(jié)合蛋白可使有效負(fù)載靶向hK1所位于的受檢者的區(qū)域。
酶活性毒素和其片段例如為白喉毒素A片段、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosd))、篦麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-sacrin、某些油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、某些康乃馨蛋白(Dianthin protein)、美洲商陸蛋白(Phytolaccaamericana protein)(PAP、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑(Morodica charantia inhibitor)、麻瘋樹毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制劑(Saponaria officinalis inhibitor)、介樂寧(gelonin)、絲林霉素(mitogillin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)和伊諾霉素(enomycin)。制備免疫毒素的酶活性多肽的程序描述于WO 84/03508和WO85/03508中?？膳c抗體接合的細(xì)胞毒素部分的實(shí)例包含阿霉素(adriamycin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾霉素(daunomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)、新制癌菌素(neocarzinostatin)和鉑。
在多肽毒素的情況下，可使用重組核酸技術(shù)構(gòu)造編碼呈轉(zhuǎn)譯融合體形式的hK1結(jié)合蛋白和細(xì)胞毒素(或其多肽組分)的核酸。隨后，使重組核酸在(例如)細(xì)胞中表達(dá)且將所編碼的融合多肽分離。融合蛋白質(zhì)可與(例如)為穩(wěn)定活體內(nèi)半衰期而增加化合物的分子量的部分物理締合，且隨后連接于部分(例如，聚合物)。
先前已描述使蛋白質(zhì)與細(xì)胞毒性劑接合的程序。關(guān)于使苯丁酸氮芥與蛋白質(zhì)接合，參見，例如Flechner(1973)European Journal of Cancer，9741-745；Ghose等人，(1972)British Medical Journal，3495-499和Szekerke，等人，(1972)Neoplasma，19211-215。關(guān)于使道諾霉素和阿霉素與蛋白質(zhì)接合，參見，例如Hurwitz，E.等人，(1975)Cancer Research，351175-1181和Arnon等人，(1982)Cancer Surveys，1429-449。關(guān)于制備蛋白質(zhì)-篦麻毒素接合物，參見，例如U.S.4,414,148和Osawa，T.，等人的(1982)Cancer Surveys，1373-388和其中所引用的參考文獻(xiàn)。偶合程序也描述于EP 226 419中。
在一些實(shí)施例中，hK1結(jié)合抗體無需與另一部分接合即可使用，例如，作為全長(zhǎng)抗體。
慢性阻塞性肺病(COPD)。hK1結(jié)合蛋白也可用于改善慢性阻塞性肺病(COPD)的至少一個(gè)癥狀。肺氣腫和慢性支氣管炎為慢性阻塞性肺病(COPD)的部分。其為嚴(yán)重的肺部疾病且為進(jìn)行性的，通常發(fā)生于老年患者中。COPD引起肺中稱為肺泡或氣囊的結(jié)構(gòu)的過度膨脹。氣泡壁破裂從而導(dǎo)致肺呼吸能力下降?；加兴黾膊〉幕颊呖赡苁紫冉?jīng)歷呼吸急促和咳嗽。評(píng)估COPD的一個(gè)臨床指數(shù)為破壞性指數(shù)，其測(cè)量肺泡隔膜損傷和肺氣腫的量度，且已建議作為肺破壞的敏感性指數(shù)，其密切反映功能異常，尤其彈性回彈的損失。參見，例如Am Rev Respir Dis 1991 Jul；144(1)156-9。所述化合物可用于使患者的破壞性指數(shù)降低(例如)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的量，例如至少10％、20％、30％或40％，或降低至少至相應(yīng)年齡且性別匹配的個(gè)體的正常值的50％、40％、30％或20％。
組合物可經(jīng)調(diào)配以用于吸入或肺遞送的其它模式。因此，本文所述的化合物可經(jīng)吸入投與至肺組織中。除非另外指示，否則如本文所使用的術(shù)語“肺組織”指呼吸道的任何組織且包含上呼吸道與下呼吸道。
因此，在治療(例如，降低、改善)或預(yù)防一種或一種以上與呼吸病癥相關(guān)聯(lián)的癥狀的方法中，可投與hK1結(jié)合蛋白，所述呼吸病癥例如哮喘(例如，過敏性哮喘和非過敏性哮喘)；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及氣管發(fā)炎、嗜伊紅血球增多、纖維化和產(chǎn)生過量粘液的病狀，例如囊腫性纖維化和肺纖維化。
哮喘。哮喘的癥狀包含(例如)喘鳴、呼吸急促、支氣管收縮、氣管過度反應(yīng)、肺活量降低、纖維化、氣管發(fā)炎和產(chǎn)生粘液。hK1結(jié)合蛋白可用于改善或預(yù)防哮喘的至少一個(gè)癥狀，例如上述癥狀中的一個(gè)。hK1結(jié)合蛋白也可與另一用于治療哮喘的藥劑結(jié)合投與，所述另一藥劑例如，抗IgE抗體、色甘酸鈉和奈多羅米納(nedocromil)、吸入類固醇、白三烯調(diào)節(jié)劑、長(zhǎng)效β-促效劑、口服類固醇和茶堿。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。所述病癥的特征為關(guān)節(jié)和/或其它內(nèi)部器官的內(nèi)層發(fā)炎。其通常為慢性的，但可包含突然發(fā)作。例示性癥狀包含關(guān)節(jié)發(fā)炎、腫脹、運(yùn)動(dòng)困難、疼痛、食欲不振、發(fā)燒、精力損失、貧血、皮膚下(尤其經(jīng)受壓力的區(qū)域(例如，肘的背面))的腫塊(類風(fēng)濕性皮下小結(jié))。hK1結(jié)合蛋白可用于改善或預(yù)防至少一個(gè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀。
hK1結(jié)合蛋白可與用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的諸如NSAID和阿司匹靈(aspirin)、止痛劑和皮質(zhì)類固醇的另一藥劑結(jié)合投與以有助于降低關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和腫脹。例示性藥劑包含疾病修飾抗風(fēng)濕藥(DMARD)，諸如甲胺喋呤、來氟米特(leflunornide)、D-青霉胺(D-Penicillamine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、金治療劑(gold therapy)、米諾環(huán)素(minocycline)、硫唑嘌呤(azathioprine)、羥基氯喹(hydroxychloroquine)(和其它抗瘧藥)、環(huán)孢素(cyclosporine)、Prosorba療法和生物劑。
多發(fā)性硬化癥(MS)。多發(fā)性硬化癥為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特征為發(fā)炎和髓鞘損失?；加蠱S或臨床上可能的MS的患者可由確認(rèn)如MS診斷研討會(huì)所定義的臨床上明確的MS的診斷的標(biāo)準(zhǔn)來鑒別(Poser等人，Ann.Neurol.13227，1983)。簡(jiǎn)言之，患有臨床上明確的MS的個(gè)體已具有兩種發(fā)作和兩種病變的臨床跡象或一種病變的臨床跡象和另一獨(dú)立病變的亞臨床跡象。明確的MS也可由兩種發(fā)作的跡象和腦脊髓液中IgG的寡克隆區(qū)帶診斷或由發(fā)作、兩種病變的臨床跡象和腦脊髓液中IgG的寡克隆區(qū)帶的組合診斷。
可向患有MS或臨床上可能的MS的患者投與例如hK1結(jié)合抗體的hK1結(jié)合蛋白以改善MS的至少一個(gè)癥狀。hK1結(jié)合蛋白也可與另一藥劑結(jié)合提供，所述另一藥劑例如EFNβ-1α和IFNβ-1b、模擬髓磷脂堿性蛋白的蛋白質(zhì)(例如，例如格拉默乙酸鹽(glatiramer acetate)COPAXONE的合成蛋白質(zhì))、皮質(zhì)類固醇或米托蒽醌(mitoxantrone)。
多發(fā)性硬化癥的有效治療可以數(shù)種不同方式檢查。滿足下列標(biāo)準(zhǔn)的任一項(xiàng)表明治療有效。使用三個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)EDSS(擴(kuò)展的功能缺損狀況標(biāo)度)、惡化表現(xiàn)或MRI(磁共振成像)。EDSS為將歸因于MS的臨床損傷分級(jí)的方法(Kurtzke，Neurology331444，1983)。就神經(jīng)損傷的類型和嚴(yán)重性評(píng)估8個(gè)功能系統(tǒng)。簡(jiǎn)言之，在治療之前，就下列系統(tǒng)中的損傷評(píng)估患者錐體、小腦、腦干、感官、腸和膀胱、視覺、大腦和其它。在確定的間隔執(zhí)行跟蹤檢查。標(biāo)度范圍為0(正常)至10(由于MS而死亡)。在本發(fā)明的情況下，一個(gè)滿級(jí)的下降定義為有效治療(Kurtzke，Ann.Neurol.36573-79，1994)。惡化定義為可歸因于MS的新癥狀的表現(xiàn)且伴隨適當(dāng)新的神經(jīng)異常(上述IFNB MS研討會(huì))。另外，惡化必須持續(xù)至少24小時(shí)且在此之前穩(wěn)定或改善至少30天。簡(jiǎn)言之，由臨床醫(yī)師對(duì)患者進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)檢查。根據(jù)神經(jīng)等級(jí)量表(NeurologicalRating Scale)(Sipe等人，Neurology 341368，1984)中的變化，惡化為輕度、中度或重度。測(cè)定年度惡化速率和無惡化患者的比例。若速率或無惡化患者的比例在治療組與安慰劑組之間就所述量度中的任一者而言存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異，則認(rèn)為療法有效。另外，也可測(cè)量第一次惡化的時(shí)間和惡化持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重性。作為療法，在此方面，效用的量度為與對(duì)照組相比治療組中第一次惡化的時(shí)間或持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重性的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異。MRI可用于使用釓-DTPA-增強(qiáng)成像測(cè)量活性病變(McDonald等人Ann.Neurol.3614，1994)或使用T2-加權(quán)技術(shù)測(cè)量病變的位置和程度。
與多發(fā)性硬化癥相關(guān)的例示性癥狀包含視神經(jīng)炎、復(fù)視、眼球震顫、視覺辨距障礙、核間眼肌麻痹、運(yùn)動(dòng)和聲音光幻視、傳入瞳孔缺陷、輕癱、單肢輕癱、下肢輕癱、半身輕癱、四分之一輕癱(quadraparesis)、麻痹、后軀麻痹、半身麻痹、四肢麻痹、四分之一麻痹(quadraplegia)、痙攣狀態(tài)、構(gòu)音障礙、肌肉萎縮、痙攣、抽搐、低張癥、陣攣、肌陣攣、多發(fā)性肌陣攣、腿不寧綜合癥、足下垂、異常反射、感覺異常、麻木、神經(jīng)痛、神經(jīng)性和神經(jīng)原性疼痛、l′hermitte′s、本體感受功能障礙、三叉神經(jīng)痛、共濟(jì)失調(diào)、意向顫動(dòng)、辨距障礙、前庭性共濟(jì)失調(diào)、眩暈、說話共濟(jì)失調(diào)、肌張力障礙、輪替運(yùn)動(dòng)障礙、尿頻、膀胱痙攣狀態(tài)、弛緩性膀胱、逼尿肌-括約肌協(xié)同失調(diào)、勃起功能障礙、性快感缺失、性感缺失、便秘、便急、大便失禁、抑郁、認(rèn)知功能障礙、癡呆、情緒擺動(dòng)、情緒不穩(wěn)、欣快癥、雙極性綜合癥、焦慮、失語癥、言語障礙、疲勞、烏托夫癥狀(uhthoff′s symptom)、胃食道逆流和睡眠障礙。
骨關(guān)節(jié)炎。骨關(guān)節(jié)炎為退化性關(guān)節(jié)病。其特征在于關(guān)節(jié)中的軟骨破壞，因此使得骨彼此摩擦，引起疼痛和運(yùn)動(dòng)損失。hK1結(jié)合蛋白可用于改善或預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的至少一個(gè)癥狀。hK1結(jié)合蛋白可與諸如皮質(zhì)類固醇或NSAID的用于治療骨關(guān)節(jié)炎的另一藥劑結(jié)合投與。
與血管生成相關(guān)聯(lián)的和贅生性病癥在一實(shí)施例中，hK1結(jié)合蛋白可投與至受檢體以調(diào)節(jié)血管生成或其它與瘤形成和腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)的過程。hK1結(jié)合蛋白，尤其抑制hK1酶活性的hK1結(jié)合蛋白，可用于阻止腫瘤血管生成和/或癌細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移。hK1抑制劑抗體為有效和選擇性的抑制劑，且因此為用于腫瘤治療的理想藥劑。
舉例而言，hK1結(jié)合蛋白可用于降低血管生成(例如，不受控制的血管生成或不當(dāng)血管生成)-諸如與血管畸形和心血管病癥(例如，動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄和動(dòng)靜脈畸形)相關(guān)聯(lián)的血管生成、慢性發(fā)炎性疾病(例如，糖尿病、炎性腸病、牛皮癬和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、異常傷口修復(fù)(例如，受激準(zhǔn)分子激光器眼睛手術(shù)后所觀察到的異常傷口修復(fù))、循環(huán)病癥(例如，雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud′s phenomenon))、肢端硬化綜合癥(crest syndrome)(例如，鈣質(zhì)沉著、食管擴(kuò)張和dyomotiloty)、皮膚學(xué)病癥(例如，葡萄酒色斑、動(dòng)脈性潰瘍、全身性血管炎和硬皮病)或視覺病癥(例如，因新生血管性疾病引起的盲癥、新生血管性青光眼、角膜新血管形成、沙眼、糖尿病視網(wǎng)膜病和近視退化)。參見，例如Carmeliet和Jain，2000，Nature，407249-257。
具體而言，HK1結(jié)合蛋白可用于降低與例如癌癥和腫瘤生長(zhǎng)(例如，良性、惡性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長(zhǎng))的瘤形成相關(guān)聯(lián)的血管生成。
癌病癥的實(shí)例包含(但不限于)實(shí)體腫瘤、軟組織腫瘤和轉(zhuǎn)移性病變。實(shí)例包含各種器官系統(tǒng)的肉瘤、腺癌和癌瘤，諸如影響肺、乳腺、淋巴、胃腸(例如，結(jié)腸)和泌尿生殖道(例如，腎、泌尿上皮細(xì)胞)、咽、前列腺、卵巢的肉瘤、腺癌和癌瘤，和包含惡性腫瘤的腺癌，所述惡性腫瘤諸如大多數(shù)結(jié)腸癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、咽癌、小腸癌、食道癌和其它癌癥。
可治療的例示性實(shí)體腫瘤包含纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏肉瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、惡性合胞體瘤、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、韋爾姆斯氏瘤(Wilms′tumor)、頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)管母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、寡枝神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。
hk1結(jié)合蛋白也可用于治療癌，例如上皮或內(nèi)分泌組織的惡性腫瘤，包含呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、生殖泌尿系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳癌、前列腺癌瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌和黑素瘤。例示性癌包含子宮頸、肺、前列腺、乳腺、頭和頸、結(jié)腸和卵巢的組織的腺癌、癌。
hk1結(jié)合蛋白也可用于治療例如間葉細(xì)胞衍化的惡性腫瘤的肉瘤。
所述方法也可用于抑制造血起源(例如，源自骨髓系、淋巴系或紅血球系)的增生性/贅生性細(xì)胞或其前體細(xì)胞的增生。舉例而言，所述方法可用于治療各種骨髓病癥，包含急性前骨髓白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)(概述于Vaickus，L.，1991，Crit.Rev.in Oncol./Hemotol.11267-297中)。可由本方法治療的淋巴惡性腫瘤包含(但不限于)包含B-系A(chǔ)LL和T-系A(chǔ)LL的急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、前淋巴細(xì)胞性白血病(PLL)、毛細(xì)胞白血病(HLL)和Waldenstrom氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom′s macroglobulinemia)(WM)。惡性淋巴瘤的其它形式包含(但不限于)非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)和其變體、末梢T細(xì)胞淋巴瘤、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)、大顆粒淋巴細(xì)胞性白血病(LGF)和霍奇金氏病(Hodgkin′s disease)。
hK1結(jié)合蛋白可與用于治療贅生性和/或轉(zhuǎn)移性病癥的另一藥劑組合投與。所述其它藥劑的實(shí)例包含(i)其它抗血管生成劑(例如，三羧氨基喹啉(linomide)、整合素αvβ3功能的抑制劑、血管生成抑制素、雷佐生(razoxane))；(ii)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，諸如抗雌激素藥(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛西芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、引哆昔芬(iodoxifene))、助孕素(例如，甲地孕酮(megestrol acetate))、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(Letrozole)、硼吖嗪(borazole)、依西美坦(exemestane))、抗激素、抗孕激素、抗雄激素(例如，氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、必卡他胺(bicalutamide)、乙酸賽普龍(cyproterone acetate))、LHRH促效劑和拮抗劑(例如，乙酸戈舍瑞林(gosereline acetate)、亮丙立德(leuprolide))、睪固酮5α-二氫還原酶的抑制劑(例如，非那雄胺(finasteride))、法呢基轉(zhuǎn)移酶(farnesyltransferase)抑制劑、抗侵入劑(例如，金屬蛋白酶抑制劑(如馬立馬司他(marimastat))和尿激酶纖溶酶原激活物受體功能的抑制劑)和生長(zhǎng)因子功能的抑制劑，(所述生長(zhǎng)因子包含(例如)EGF、FGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，所述抑制劑包含生長(zhǎng)因子抗體、諸如AVASTIN(貝伐株單抗(bevacizumab))和ERBITUX(西妥昔單抗(cetuximab))的生長(zhǎng)因子受體抗體，酪氨酸激酶抑制劑和絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑)；和(iii)用于醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)的抗增生/抗腫瘤藥物和其組合，諸如抗代謝物(例如，如甲胺喋呤的抗葉酸物、如5-氟尿嘧啶的氟嘧啶、嘌呤和腺苷類似物、阿糖胞苷(cytosinearabinoside))；嵌入抗腫瘤抗生素(例如，如多柔比星(doxorubicin)的蒽環(huán)霉素(anthracycline)、道諾霉素(daunomycin)、表柔比星(epirubicin)和黃膽素(idarubicin)、絲裂霉素-C、放線菌素(dactinomycin)、普卡霉素(mithramycin))；鉑衍生物(例如，順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin))；烷化劑(例如，氮芥(nitrogen mustard)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺亞硝基脲(ifosfamide nitrosoureas)、噻替派(thiotepa))；抗有絲分裂劑(例如，如長(zhǎng)春新堿(vincristine)的長(zhǎng)春花堿(vinca alkaloids)和如TAXOL太平洋紫杉醇(paclitaxel)、TAXOTERE多烯紫杉醇(docetaxel)的紫杉醇)和諸如埃坡霉素(epothilone)類似物、discodermolide類似物和eleutherobin類似物的新微管劑)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)的表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)、安吖啶(amsacrine)、托泊替康(topotecan))；細(xì)胞周期抑制劑(例如，黃吡哆醇(flavopyridol))；生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和諸如VELCADE(硼替佐米(bortezomib))的蛋白酶體抑制劑。
VEGF類生長(zhǎng)因子的例示性調(diào)節(jié)劑多種藥劑可用于調(diào)節(jié)VEGF類生長(zhǎng)因子的活性，例如調(diào)節(jié)VEGF活性(例如，通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)自身、其受體或其它信號(hào)組分的活性)。所述藥劑可與hK1結(jié)合蛋白組合投與以調(diào)節(jié)血管生成且治療贅生性和/或轉(zhuǎn)移性病癥。
藥劑可為小分子抑制劑(例如，并不包含肽鍵的化合物和/或小于700道爾頓分子量的化合物)。其它藥劑包含與VEGF、VEGF-C或其受體結(jié)合的化合物，例如小分子化合物或蛋白質(zhì)。又，其它藥劑調(diào)節(jié)VEGF、VEGF-C或其受體的表達(dá)或活性。例示性藥劑包含下列各物；貝伐株單抗(AVASTIN)為與VEGF結(jié)合的抗體。已批準(zhǔn)貝伐株單抗用于治療某些癌癥。US 2004-0133357描述可抑制VEGF的其它抗體。
US 2003-0120038描述可具有抑制活性的可溶性VEGF受體片段。2004-0054143描述具有抑制活性的VEGF的小肽片段。
已知大量VEGF活性的小分子抑制劑。2004-0147449描述VEGF-R抑制劑，其包含一類化合物，例如(4-氯苯基)[4-(4-吡啶基甲基)-呔嗪-1-基]琥珀酸氫銨。
SU5416(塞嗎杉呢(semaxanib))為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體-2和KIT受體酪氨酸激酶的小分子抑制劑。參見，例如Heymach等人，Clin Cancer Res.2004 Sep1；10(17)5732-40。SU11248為另一例示性抑制劑。參見，例如Mendel(2003)Clin CancerRes.9(1)327-37。
4-[4-(1-氨基-1-甲基乙基)苯基]-2-[4-(2-嗎啉-4-基-乙基)苯基胺基]嘧啶-5-腈(JNJ-17029259)和5-氰基嘧啶結(jié)構(gòu)類別中的相關(guān)化合物為可經(jīng)口利用的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGF-R2)和諸如血小板衍生生長(zhǎng)因子受體、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、VEGF-R1和VEGF-R3的血管生成中涉及的其它酪氨酸激酶的選擇性毫微摩爾濃度抑制劑。毫微摩爾濃度水平的JNJ-17029259可抑制增生/遷移、在血管生成的大鼠主動(dòng)脈環(huán)模型中出現(xiàn)的血管形成和絨毛尿囊膜檢定中的新靜脈和動(dòng)脈的發(fā)育。參見，例如Emanuel等人，(2004)Mol Pharmacol.2004年9月；66(3)635-47。
又一小分子抑制劑為ZD6474，雖然其抑制VEGF-R2酪氨酸激酶活性，但對(duì)其它生長(zhǎng)因子具有其它抑制效應(yīng)。參見，例如Sandstrom等人，British Journal of Cancer advanceonline publication，2004年8月10日；doi10.1038/sj.bjc.6602108www.bjcancer.com。
PTK787/ZK 222584為VEGF受體酪氨酸激酶活性的另一小分子抑制劑。(參見，例如Thomas等人，(2003)Semin Oncol.2003年6月；30(3 Suppl 6)32-8)。Mohammadi等人在(1998)EMBO Journal第17卷，第5896-5904頁，1998中描述吡啶并[2，3-d]嘧啶類分子，將其命名為PD 173074，其選擇性抑制FGF和VEGF受體的酪氨酸激酶活性。向小鼠投與PD 173074可有效阻止血管生成而無明顯的毒性。
US 2002-0165174描述抑制VEGF的寡聚核苷酸?？墒褂梅戳x寡聚核苷酸降低VEGF和VEGF-C水平。所述寡聚核苷酸可降低癌細(xì)胞生長(zhǎng)，例如間皮瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。也已觀察到VEGF受體(VEGFR-2)和VEGF-C(VEGFR-3)的抗體使癌細(xì)胞生長(zhǎng)減慢。US2004-0138163描述可抑制VEGF的siRNA。諸如反義寡聚核苷酸的抑制劑核酸、siRNA和核糖酶可用于調(diào)節(jié)VEGF、VEGF-C或其受體的表達(dá)。參見，例如Int J Cancer 2003年5月1日；104(5)603-10。
其它方法包含殺死或抑制產(chǎn)生VEGF的細(xì)胞。對(duì)表達(dá)VEGF的細(xì)胞具有高毒性的白喉毒素-VEGF融合蛋白(DT-VEGF)抑制間皮瘤細(xì)胞增生。參見，例如Blood 2001年9月15日；98(6)1904-13。
VEGF類分子的抑制劑也概述于(例如)Verheul等人，(2003)Drugs Today(Bare).2003；39增刊C81-93中。
吸入包含hK1結(jié)合抗體的組合物可經(jīng)調(diào)配以用于吸入或肺遞送的其它模式。因此，本文所述的化合物可經(jīng)吸入投與至肺組織中。除非另外指示，否則如本文所使用的術(shù)語“肺組織”指呼吸道的任何組織且包含上呼吸道與下呼吸道。hK1結(jié)合抗體可與一種或一種以上用于治療肺部疾病的現(xiàn)有藥征組合投與。
在一實(shí)例中，化合物經(jīng)調(diào)配以用于噴霧器。在一實(shí)施例中，化合物可以凍干形式儲(chǔ)存(例如，在室溫下)且在吸入之前復(fù)水于溶液中。
也有可能調(diào)配化合物以使用例如吸入器的醫(yī)藥裝置吸入。參見，例如U.S.6,102,035(粉劑吸入器)和6,012,454(干粉吸入器)。所述吸入器可包含處于適合儲(chǔ)存的pH值下的用于活性化合物的單獨(dú)隔室和用于中和緩沖液的另一隔室和用于在霧化之前使所述化合物與中和緩沖液立即組合的機(jī)構(gòu)。在一實(shí)施例中，吸入器為計(jì)量吸入器。
用于將藥物局部遞送至肺部氣道的3個(gè)常見系統(tǒng)包含干粉吸入器(DPI)、計(jì)量吸入器(MDI)和噴霧器。MDI，吸入投藥的最流行方法，可用于遞送呈溶液化形式或分散液形式的藥物。通常，MDI包括氟利昂(Freon)或其它相對(duì)高氣壓推進(jìn)劑，其在所述裝置起動(dòng)之后迫使霧化藥物進(jìn)入呼吸道。不同于MDI，DPI通常完全依賴于患者的吸氣動(dòng)力將呈干粉形式的藥物引入至肺中。噴霧器通過將能量賦予液體溶液形成所欲吸入的藥物氣霧劑。也已使用含氟化合物介質(zhì)探究液體換氣或肺灌洗期間藥物的直接肺部遞送。所述方法及其它方法均可用于遞送hK1結(jié)合抗體。在一實(shí)施例中，hK1結(jié)合抗體與例如使所述化合物穩(wěn)定或使其半衰期增加的聚合物的聚合物締合。
舉例而言，為通過吸入投藥，將hK1結(jié)合抗體以氣霧劑噴霧形式自加壓容器或含有合適推進(jìn)劑的分配器或噴霧器遞送。所述化合物可呈干燥粒子或液體形式。包含所述化合物的粒子可(例如)通過噴霧干燥、通過用帶電中和劑干燥hK1結(jié)合抗體的水溶液且隨后自干粉產(chǎn)生粒子或通過干燥于有機(jī)改質(zhì)劑中的水溶液且隨后自干粉產(chǎn)生粒子來制備。
所述化合物可以氣霧劑噴霧表現(xiàn)形式借助于合適的推進(jìn)劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體)自加壓包裝或噴霧器方便地遞送。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過提供遞送計(jì)量的量的閥門確定。若粒子為調(diào)配粒子，則用于吸入器或吹入器中的膠囊和藥筒可經(jīng)調(diào)配含有hK1結(jié)合抗體與諸如乳糖或淀粉的合適的粉末基質(zhì)的粉劑混合物。除調(diào)配或未調(diào)配的化合物以外，諸如100％DPPC或其它表面活性劑的其它物質(zhì)可與hK1結(jié)合抗體混合以促進(jìn)調(diào)配或未調(diào)配化合物的遞送和分散。制備干燥粒子的方法描述于(例如)PCT公開案WO 02/32406中。
hK1結(jié)合抗體可經(jīng)調(diào)配以用于(例如)作為干燥氣霧劑粒子氣霧劑遞送，以致當(dāng)投與時(shí)，其可快速吸收且可產(chǎn)生快速的局部或全身治療結(jié)果。可調(diào)整投藥以在投藥的2分鐘、5分鐘、1小時(shí)或3小時(shí)內(nèi)提供可檢測(cè)放射性。在一些實(shí)施例中，峰值活性甚至可更快速達(dá)成，例如在半小時(shí)或甚至10分鐘內(nèi)?？山?jīng)調(diào)配以達(dá)成更長(zhǎng)生物半衰期的hK1結(jié)合抗體(例如，通過與諸如PEG的聚合物締合)可用作其他投藥模式的替代方案，(例如)以致所述化合物進(jìn)入肺循環(huán)且分布于其它器官或特定靶器官。
在一實(shí)施例中，hK1結(jié)合抗體以一定量遞送以致多肽質(zhì)量的至少5％遞送至下呼吸道或肺深處。肺深處具有極其豐富的毛細(xì)管網(wǎng)。將毛細(xì)管腔與肺泡氣室隔開的呼吸膜極薄(≤6μm)且極具透過性。另外，襯于肺泡表面的液體層富有肺表面活性劑。在其它實(shí)施中，至少2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的hK1結(jié)合抗體的組合物遞送至下呼吸道或肺深處。遞送至所述組織中的任一者或兩者產(chǎn)生所述化合物的有效吸收和高生物利用率。在一實(shí)施例中，化合物是使用(例如)吸入器或噴霧器以計(jì)量劑量提供。舉例而言，化合物以每劑(puff)至少約0.02mg、0.1mg、0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、5mg、10mg、20mg、40mg或50mg或更多的劑量單位形式遞送。
生物利用率百分率可計(jì)算如下生物利用率百分率＝(AUC非侵入性/AUC靜脈內(nèi)或皮下)×(劑量靜脈內(nèi)或皮下/劑量非侵入性)×100。
雖然遞送增強(qiáng)劑并非必需，但可使用諸如表面活性劑的遞送增強(qiáng)劑進(jìn)一步增強(qiáng)肺遞送。如本文所使用的“表面活性劑”指具有親水和親脂部分的化合物，其通過與兩個(gè)不混溶的相之間的界面相互作用而促進(jìn)藥物吸收。出于多種原因，例如降低粒子凝聚、降低巨噬細(xì)胞吞噬作用等，表面活性劑適用于干燥粒子。當(dāng)與肺表面活性劑偶合時(shí)，因?yàn)橹T如DPPC的表面活性劑將非常有利于化合物的擴(kuò)散，所以可達(dá)成所述化合物的更有效吸收。表面活性劑在所屬領(lǐng)域?yàn)槭熘那移浒?但不限于)磷酸甘油酯，例如，磷脂酰膽堿、L-α-磷脂酰膽堿棕櫚酰(DPPC)和二磷脂酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-；氧金根醚；棕櫚酸；油酸；脫水山梨醇三油酸酯(Span85)；甘膽酸酯；表面活性素；泊洛沙姆(poloxomer)；山梨醇脂肪酸酯；脫水山梨醇三油酸酯；四丁酚醛和磷脂。
在一實(shí)施例中，本文提供的用于包含濃縮物和稀釋組合物的所述組合物的表面活性劑為高HLB(親水親脂平衡值)表面活性劑。所述高HLB表面活性劑通常具有大于約10的HLB。HLB為表面活性劑或表面活性劑混合物的極性的任意標(biāo)度。在一實(shí)施例中，本文提供的組合物含有約3重量％至約85重量％的高HLB表面活性劑。在一實(shí)施例中，高HLB表面活性劑為維生素E的乙氧基化衍生物，諸如聚乙二醇1000琥珀酸生育酚酯(TPGS)。TPGS具有約15與19之間的HLB。參見，例如US 2004-0023935。
穩(wěn)定化和保持力在一實(shí)施例中，使hK1結(jié)合抗體與使其在例如血液、血清、淋巴、支氣管肺泡灌洗液或其它組織的循環(huán)中的穩(wěn)定性和/或保持力提高(例如)至少1.5倍、2倍、5倍、10倍或50倍的部分物理締合。
舉例而言，hK1結(jié)合抗體可與例如大體上不具抗原性的聚合物(諸如聚氧化烯或聚氧化乙烯)的聚合物締合。合適聚合物應(yīng)大體上隨重量而變化?？墒褂脭?shù)量平均分子量在約200至約35,000(或約1,000至約15,000，和2,000至約12,500)范圍內(nèi)的聚合物。
舉例而言，可將hK1結(jié)合抗體與例如親水聚乙烯聚合物(例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮)的水溶性聚合物接合。所述聚合物的非限制性列表包含諸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇的聚氧化烯均聚物，其共聚物和其嵌段共聚物，只要維持嵌段共聚物的水溶性。其它適用聚合物包含諸如聚氧乙烯、聚氧丙烯的聚氧化烯，和聚氧乙烯與聚氧丙烯(Pluronics)的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆(carbomer)；包括糖單體(D-甘露糖、D-半乳糖和L-半乳糖、巖藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如多聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神經(jīng)氨酸)的分枝或未分枝多糖，其包含同多糖和雜多糖，諸如乳糖、支鏈淀粉、淀粉、羥乙基淀粉、直鏈淀粉、硫酸右旋糖酐、葡聚糖、糊精、糖原或例如透明質(zhì)酸的酸性粘多糖的多糖亞單元；糖醇的聚合物，諸如聚山梨糖醇和聚甘露醇；肝素或類肝素。
其它化合物也可連接于同一聚合物，例如細(xì)胞毒素、標(biāo)記或另一靶向劑，例如另一hK1結(jié)合抗體或無關(guān)配體。例如單甲氧基封端的聚乙二醇(mPEG)的單活化烷氧基封端的聚氧化烯(PAO)、C1-4烷基封端的聚合物和雙活化聚氧化乙烯(二元醇類)可用于交聯(lián)。參見，例如U.S.5,951,974。
在一實(shí)施例中，雖然聚合物在交聯(lián)于配體之前不必為水溶性的，但優(yōu)選地為水溶性的。通常，在交聯(lián)之后，產(chǎn)物為水溶性的，例如展示至少約0.01mg/ml、且更優(yōu)選地至少約0.1mg/ml且甚至更優(yōu)選地至少約1mg/ml的水溶性。另外，聚合物在接合物形式中應(yīng)不具有高度免疫原性，若接合物意欲通過靜脈內(nèi)輸液、氣霧劑化或注射投與，則其也不應(yīng)具有與所述途徑不兼容的粘度。
在一實(shí)施例中，聚合物僅含有單個(gè)具有反應(yīng)性的基團(tuán)。其幫助避免配體分子彼此交聯(lián)。然而，最優(yōu)化反應(yīng)條件以減少配體分子之間的交聯(lián)或通過凝膠過濾或離子交換色譜法純化反應(yīng)產(chǎn)物以回收大體上均相的衍生物也在本文的范疇內(nèi)。在其它實(shí)施中，出于使多個(gè)配體連接于聚合物骨架的目的，聚合物含有兩個(gè)或兩個(gè)以上反應(yīng)性基團(tuán)。又，可使用凝膠過濾或離子交換色譜法回收呈大體上均相形式的所要衍生物。
聚合物的分子量可在至多約500,000 D的范圍內(nèi)，且優(yōu)選地為至少約20,000 D或至少約30,000 D或至少約40,000D。所選擇的分子量可根據(jù)所欲達(dá)成的接合物的有效大小、聚合物的性質(zhì)(例如，結(jié)構(gòu)(諸如線性或分枝))和衍生化的程度而定。
可使用共價(jià)鍵使hK1結(jié)合抗體連接于聚合物，例如，交聯(lián)于配體的N末端氨基和存在于配體的賴氨酸殘基上的ε氨基和其它氨基、亞氨基、羧基、硫氫基、羥基或其它親水基團(tuán)。聚合物可與hK1結(jié)合抗體直接共價(jià)鍵結(jié)而無需使用多官能(通常雙官能)交聯(lián)劑。與氨基共價(jià)結(jié)合通過基于以下各基團(tuán)的已知化學(xué)實(shí)現(xiàn)氰尿酰氯、羰基二咪唑、醛反應(yīng)性基團(tuán)(PEG烷醇鹽加溴代乙醛的二乙基乙?；籔EG加DMSO和乙酸酐或PEG氯化物加4-羥基苯甲醛的苯氧化物、活化琥珀酰亞胺酯、活化二硫代碳酸酯PEG、2，4，5-三氯苯基氯甲酸酯或P-硝基苯基氯甲酸酯活化PEG)。羧基可通過使用碳化二酰亞胺使PEG-胺偶合來衍生。硫氫基可通過偶合于經(jīng)順丁烯二酰亞胺基取代的PEG(例如，烷氧基-PEG胺加4-(N-順丁烯二酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸硫代琥珀酰亞胺酯)WO97/10847或購自Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Ala.的PEG-順丁烯二酰亞胺)來衍生?；蛘?，配體上的自由氨基(例如，賴氨酸殘基上的ε氨基)可用2-亞胺基-硫醇烷(Traut試劑)硫醇化，且隨后偶合于含順丁烯二酰亞胺的PEG衍生物，例如，如Pedley等人，Br.J.Cancer，701126-1130(1994)中所述。
可利用可連接于hK1結(jié)合抗體的官能化PEG聚合物，例如來自Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Ala.)。所述市售PEG衍生物包含(例如)氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧甲基化PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酸琥珀酰亞胺酯、PEG丙酸琥珀酰亞胺酯、羧甲基化PEG的琥珀酰亞胺酯、PEG的碳酸琥珀酰亞胺酯、氨基酸PEG的琥珀酰亞胺酯、PEG-氧基羰基咪唑、PEG-碳酸硝基苯酯、PEG三氟乙磺酸酯、PEG-縮水甘油醚、PEG-醛、PEG乙烯砜、PEG-順丁烯二酰亞胺、PEG-鄰吡啶基-二硫化物、雜官能化PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷和PEG二乙氧膦酰硫膽堿。偶合所述PEG衍生物的反應(yīng)條件可根據(jù)hK1結(jié)合抗體、所要PEG化程度和所使用的PEG衍生物而變化。一些涉及PEG衍生物的選擇的因素包含所要連接點(diǎn)(諸如，賴氨酸或半胱氨酸R基團(tuán))，所述衍生物的水解穩(wěn)定性和反應(yīng)性、鍵聯(lián)的穩(wěn)定性、毒性和抗原性、分析的適用性等。任何特殊衍生物的特定使用說明書可自制造商獲得。
hK1結(jié)合抗體與聚合物的接合物可(例如)通過凝膠過濾或例如HPLC的離子交換色譜法與未反應(yīng)的起始物質(zhì)分離。以相同方式將接合物的異源物質(zhì)彼此純化。不同物質(zhì)(例如，含有一或兩個(gè)PEG殘基)的解析度也可能歸因于未反應(yīng)氨基酸的離子性質(zhì)的差異。參見，例如WO 96/34015。
實(shí)例以下為用于鑒別hK1結(jié)合蛋白，尤其hK1抑制劑的一個(gè)例示性策略。
1)KLK1 cDNA將KLK1 cDNA亞克隆于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、大腸桿菌和馬斯德畢赤酵母(P.pastoris)中表達(dá)的表達(dá)載體中。通過DNA序列分析確認(rèn)所亞克隆的物質(zhì)。
2)在馬斯德畢赤酵母中的蛋白質(zhì)表達(dá)將馬斯德畢赤酵母用上述亞克隆cDNA轉(zhuǎn)化且選擇克隆來表達(dá)hK1，由蛋白質(zhì)凝膠電泳和酶活性測(cè)量評(píng)定。測(cè)定優(yōu)化表達(dá)條件且以大的馬斯德畢赤酵母培養(yǎng)體積(2L)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)。
3)蛋白質(zhì)純化根據(jù)Chan等人，(1998)Protein Expr Purif，12(3)第361-70頁純化hK1。
4)噬菌體呈現(xiàn)選擇和篩選已自Fab噬菌體呈現(xiàn)庫選擇重組hK1的結(jié)合劑。
使用兩種策略促成結(jié)合于hK1酶活性位點(diǎn)的抗體的選擇(圖)。活性位點(diǎn)結(jié)合劑與用于與hK1結(jié)合的酶底物競(jìng)爭(zhēng)且可抑制hK1蛋白水解活性。兩種噬菌體呈現(xiàn)選擇策略利用固定于珠粒的hK1的用途。通過將5μg經(jīng)生物素標(biāo)記的hK1與5mg經(jīng)抗生蛋白鏈菌素包覆的順磁珠粒(Dynal)在具有磷酸鹽緩沖鹽水和0.1％吐溫20(Tween20)(PBST)的500μL的總體積中混合且在4℃下將所述混合物培育隔夜來制備珠粒。隨后，將所述混合物用PBST洗滌5次，添加1μM游離生物素，隨后用PBST再洗滌5次，且最后用2％于PBST中的脫脂奶粉阻斷1小時(shí)。所述固定程序使得經(jīng)生物素標(biāo)記的hK1完全捕獲且產(chǎn)生具有酶活性的固定hK1。
在第一選擇策略中，將噬菌體(滴度＝1×1013pfu)與0.25mL于PBST中的固定hK1珠粒一起培育5分鐘且總體積為1mL。使用磁裝置提取結(jié)合固定hK1的噬菌體且將非特異性噬菌體用PBST在自動(dòng)洗碟器上經(jīng)12次洗滌循環(huán)洗提(選擇1)。隨后，通過培育25μM抑肽酶(hK1的活性位點(diǎn)抑制劑)2小時(shí)，將噬菌體自提取珠粒中洗提以獲得自hK1的活性位點(diǎn)洗提的噬菌體。將由抑肽酶洗提的噬菌體和仍保留在珠粒上的噬菌體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序擴(kuò)增且將其各調(diào)整至1×1011pfu的滴度且隨后分別用作所述策略的下一輪選擇和最后一輪選擇的輸入噬菌體(第II輪)。
在第II輪中，將所述兩個(gè)噬菌體群(也稱為兩個(gè)“組”，一個(gè)用抑肽酶洗提，另一個(gè)在抑肽酶洗提之后仍保持結(jié)合)分別添加至0.05mL固定hK1珠粒中，用PBST產(chǎn)生1mL的總體積且在執(zhí)行12次洗滌循環(huán)之前允許培育5分鐘。隨后使來自第II輪的兩個(gè)“組”經(jīng)受用25μM抑肽酶的洗提歷時(shí)2小時(shí)以產(chǎn)生總共4個(gè)用于由ELISA篩選以與hK1結(jié)合的噬菌體群(也稱為“池”)，其中池1是來源于第I輪的抑肽酶洗提和第II輪的抑肽酶洗提，池2是來源于第I輪的抑肽酶洗提和第II輪的仍保留在珠粒上的噬菌體，池3是來源于第1輪中仍保留于珠粒上的噬菌體和第II輪中由抑肽酶洗提的噬菌體，且池4是來源于第1輪中仍保留于珠粒上的噬菌體和第II輪中仍保留于珠粒上的噬菌體。
選擇2中援引不同策略，其中通過將噬菌體與固定hK1-抑肽酶復(fù)合物培育3次歷時(shí)1小時(shí)使噬菌體(滴度＝1×1013pfu)耗盡非活性位點(diǎn)hK1結(jié)合劑，所述固定hK1-抑肽酶復(fù)合物是通過將25μM抑肽酶添加至0.25mL固定hK1珠粒中而制備且用PBST使總體積達(dá)到1mL。隨后，將耗盡噬菌體添加至0.25mL固定hK1珠粒中達(dá)成1mL歷時(shí)5分鐘且用PBST執(zhí)行12次洗滌循環(huán)。隨后，將仍保留于珠粒上的噬菌體擴(kuò)增，調(diào)節(jié)至1×1011pfu的滴度且用作第2輪的輸入物。第2輪和第3輪如第1輪所述執(zhí)行，其中在利用0.25mL固定hK1珠粒的選擇之前，各輪均具有利用hK1-抑肽酶復(fù)合物的初始耗盡步驟。所述選擇策略產(chǎn)生一個(gè)噬菌體群(池5)，將其由ELISA篩選以作為hK1的結(jié)合劑。
由可溶性Fab ELISA檢定來自上述5個(gè)池的噬菌體的結(jié)合hK1的能力。在執(zhí)行所述ELISA之前，必需修飾噬粒DNA以允許Fab表達(dá)而無需基因III融合。所述DNA修飾通過如下步驟完成首先將所述5個(gè)池中的每一個(gè)的噬粒DNA制備于大腸桿菌TG1細(xì)胞中，隨后使用MluI限制酶執(zhí)行雙重DNA消化釋放編碼基因III根片段的DNA。凝膠純化之后，將載體再連接(無基因III根的pMID21載體)且電穿孔進(jìn)入大腸桿菌TG1細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化株涂鋪且挑選菌落且使其在30℃下于96孔板中的含有100μg/mL安比西林(ampicillin)和0.1％葡萄糖的100μl2xYT中生長(zhǎng)約3小時(shí)。在30℃下，在添加1mM異丙硫基-β-半乳糖苷(IPTG)后表達(dá)Fab，歷時(shí)16小時(shí)。隨后，將板在600g下離心10min且將50μL上清液用于ELISA。
在4℃下，通過首先用于0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)中的2μg/mL抗生蛋白鏈菌素涂鋪96孔板的孔執(zhí)行可溶性Fab ELISA過夜。接著用PBST洗滌且用1％牛血清白蛋白阻斷，添加10ng經(jīng)生物素標(biāo)記的hK1且在室溫下培育1小時(shí)。隨后，通過用PBST洗滌5次將游離hK1移除。將來自上述Fab表達(dá)的上清液(50μl)添加至固定于板上的hK1中且在室溫下培育1小時(shí)。隨后，將未結(jié)合的Fab通過用PBST洗滌7次移除，且將100μL辣根過氧化物酶接合的抗Fab抗體添加至所述孔中。將游離二級(jí)抗體通過用PBST洗滌7次移除且添加100μl比色過氧化酶底物(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺/過氧化氫)以允許通過630nm處的吸收增加檢測(cè)結(jié)合Fab。使用所述ELISA，就5個(gè)選擇池中的每一者分析960個(gè)所表達(dá)的Fab，總共分析4800個(gè)Fab。
5)DNA序列分析對(duì)1152個(gè)ELISA陽性可溶Fab進(jìn)行DNA序列分析，其中335個(gè)Fab具有獨(dú)特的重鏈。
6)Fab結(jié)合親和力和酶抑制效能的測(cè)定通過表面等離子共振(SPR)測(cè)定335個(gè)Fab的結(jié)合親和力。獲得0.4至100nM以上范圍內(nèi)的結(jié)合常數(shù)(表1)。首先在單個(gè)Fab濃度為120nM下對(duì)所有335個(gè)Fab篩選酶活性抑制，接著測(cè)定選定數(shù)目的Fab的IC50值(表1)。無論Fab的IC50是否測(cè)定到，F(xiàn)ab均可能是或可能不是酶抑制劑。抑制劑可經(jīng)進(jìn)一步評(píng)估以測(cè)定其抑制存在于支氣管肺泡灌洗(BAL)液中的支氣管組織血管舒緩素活性的能力。
另外，進(jìn)一步詳細(xì)地檢查發(fā)現(xiàn)可抑制hK1的最高親和力Fab中的24個(gè)。表1中，使用星號(hào)指示所述Fab。最初使用高通量SPR和酶抑制篩選的組合使用利用新穎高通量方法純化的少量Fab鑒別所述Fab。使用標(biāo)準(zhǔn)抗體純化法純化大量的所述24個(gè)Fab允許更精確且詳細(xì)地檢查其生物化學(xué)性質(zhì)。穩(wěn)態(tài)酶抑制檢定在黑色、96孔、圓底微定量板中在總體積為100uL的含有5nM hK1、變化濃度的Fab和100μM Pro-Phe-Arg-AMC底物的反應(yīng)緩沖液(20mM Tris pH7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％PEG、0.1％TritonX-100)中執(zhí)行。在添加底物以起始反應(yīng)之前，在30℃下將hK1和Fab于檢定板的孔中培育1小時(shí)。隨后，添加底物且使用熒光板讀數(shù)器(Gemini XS，Molecular Devices)使用360nm的激發(fā)波長(zhǎng)和460nm的發(fā)射波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)所述反應(yīng)。將底物水解的初始速率對(duì)抑制劑濃度作圖且由非線性回歸擬合酶抑制的標(biāo)準(zhǔn)雙曲線方程以提供IC50的估計(jì)值。
將特定例示性抗體指定為M0103-A01形式。所有名稱均以“M0”開頭，因此有時(shí)通過移除領(lǐng)頭“M0”簡(jiǎn)化?？贵w名稱“103-A01”與“M0103-A01”是指同一抗體。M0103-A01的HC命名為HC-103-A01且LC命名為“LC-103-A01”。
7)氣管發(fā)炎研究的小鼠模型可就調(diào)節(jié)氣管發(fā)炎的能力在哮喘的小鼠模型中評(píng)估Fab，例如如Kips等人，(2003)″Murine models of asthma″Eur.Respir.J.22，374-382中所述。Fab也可重定格式為IgG分子且使用一個(gè)或一個(gè)以上本文所述的檢定評(píng)估。
表1結(jié)合數(shù)據(jù)







例示性抗體包含下列序列下列為例示性輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列＞LC-092-B12 (SEQ ID NO1022)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISNYLAWYQQ KPGKVPKLLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQSYSTPYTFGQGTKLEVRR TVAAP＞LC-092-F08 (SEQ ID NO1023)AQDIQMTQSP ATLSLSPGER ATLSCGASQS VSSSYLAWYQ QKPGLAPRLLIYDASSRATG IPDRFSGSGS GTDFTLTISS LQPEDFATYY CLHDYNFPFTFGPGTKVDIK RTVAAP＞LC-092-G06 (SEQID NO1024)AQSELTQPRS VSGSPGQSVT ISCTGTSGEV ANYNYVSWYH QDPGLVPKLKIYDVSRRPSG VPDRFSGAKS GDTASLTISG LQAEDEGDYY CASYVGNDKLVFGGGTKLTV LGQPKAAP＞LC-093-C02 (SEQ ID NO1025)AQDIQMTQSP GTLSLSPGDR ATLSCRASQS VGSDYLAWYQ QKPGQAPRLLIFAASTRATG IPDRFSGSGS ATDFTLTISS LEPEDFAVYF CQQYASPPRTFGQGTKVEIK RTVAAP＞LC-093-C08 (SEQ ID NO1026)
AQDIQMTQSP GTLSLSPGER ATLSCRASQS VSSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIFAASTRATG IPDRFSGSGS ATDFTLTISS LEPEDFAVYY CQQRSNWPPELTFSGGTKVE IKRTVAAP＞LC-093-C10 (SEQ ID NO1027)AQDIQITQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISNYLAWYQQ KPGKVPKLLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC EQLNSFPHAFGQGTKVEIKR TVAAP＞LC-093-E11(SEQ ID NO1028)AQDIQMTQSP ATLSLSPGER ATLSCRASQS VSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASNRATGI PARFSGSGSG TDFTLTISSL EPEDFAVYYC QQRSNWLTFGGGTKVEIKRT VAAP＞LC-093-F09 (SEQ ID NO1029)AQSALTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTSTDD VGGYNYVSWY QQHPGKAPKLMIYDVINRPS GVSNRFSGSK SGNTASLTIS GLQAEDEADY YCSSYTSRGTRVFGTGTKVT VLGQPKANP＞LC-093-G06 (SEQ ID NO1030)AQSALTQPRS VSGSLGQSVT ISCTGSTSDV GGYTYVSWYQ QEPGKAPKLMIHDVSKRPSG VPDRFSGSKS GNTASLIISG LQAEDEADYY CCSYAGSYSYVFGTGTKVTV LGQPKANP＞LC-093-G09 (SEQ ID NO1031)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQS ISSFLNWYQQ KPGKAPKLLLMYAASSLQSG VPSRFSGSGS GTDFTLTISS LQPEDFATYY CQQSYSTPYTFGQGTKLEIK RTVAAP＞LC-094-D08 (SEQ ID NO1032)AQSALTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGSSSNI GSNNVNWYQQ LPGTAPKLLIYSNDQRPSGV PDRFSGSKSA TSASLAISGL QSEDEADYHC AAWDDSLNGPVFGGGTKLTV LGQPKAAP＞LC-094-E08 (SEQ ID NO1033)AQSVLTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTSSDV GAYNYVSWYQ QHPGKVPELMIYDVSNRPSG VSHRFSGSKS GNTASLTISG LQAEDDADYY CSSFTSRKTWVFGTGTKVTV LGQPKANP＞LC-094-F03 (SEQ ID NO1034)AQDIQMTQSP GTLSLSLGET ATLSCRASQT VGGSYLAWYR QKPGQAPSLLIYAASNRAPG IPDRFSGSGS GTDFTLTISS LQSEDFAVYY CQQYGSSMYTFGQGTILEIK RTVAAP＞LC-095-A11 (SEQ ID NO1035)AQDIQMTQSP ATLSLSPGER ATLSCRASQS VSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASNRATGI PARFSGSGSG TDFTLTISSL EPEDFAVYYC QQRSNWPPYTFGQGTKLEIK RTVAAP＞LC-095-G09 (SEQ ID NO1036)
AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQS ISNWLAWYQQ KPGKAPKLLIYKASTLQTGV PSRFSGSGSG TEFSLTISSL QPDDFATYYC QQTYSAPFNFGPGTKVDIKR TVAAP＞LC-095-H10 (SEQ ID NO1037)AQDIQMTQSP STLSASVGDR VTITCRASQS ISSWLAWYQQ KPGKAPKLLIYTASSLESGV PSRFSAGGSG TEFTLTISSL QPDDFGTYYC QQYNSYSLTFGGGTKVEIKR TVAAP＞LC-096-D03 (SEQ ID NO1038)AQSELTQPRS VSGSPGQSVT ISCTGTTRDV GAYKYVSWYQ QYPGKAPKLMLSDVSKRPSG VPDRFSGSKS GNTASLTISG LQSEDEADYY CCSFAGSYTWIFGGGTKVTV LGQPKAAP＞LC-096-D09 (SEQ ID NO1039)AQSALTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGSSSNI GTNRVNWYQQ IPGTAPKLLIYSNNQRPSGV PDRFSDSKSG TSASLAISGL qSEDEADYYC AAWDDSLNGVVFGGGTKLTV LGQPKAAP＞LC-096-E11 (SEQ ID NO1040)AQDIQMTQSP LSLSASVGDR VTMTCRASQT ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYTTSSLQSGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPEDFATYYC QQSHSSPTFGGGTKVEIKRT VAAP＞LC-097-D04(SEQ ID NO1041)AQSELTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGSSSNI GSNYVYWYQQ LPGMAPKLLIYRNNQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC AAWDDSMSGVVFGGGTKLTV LSQPKAAP＞LC-097-E07 (SEQ ID NO1042)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQS ISSYLSWFQQ RPGKAPKLLIYSASNLQSGV PLRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQIYRTPLTFGGGTKVEIKR TVAAP＞LC-097-F03 (SEQ ID NO1043)AQDIQMTQSP ATLSVSPGGR ATLSCRASQS VRKNVAWYQQ KPGQPPRLLIYGASTRATGV PARFSGSGSG TEFTLTISRM QPEDFVVYHC QQYSSWPAFGQGTMVEINRT VAAP＞LC-097-F04 (SEQ ID NO1044)AQYELTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGSSSNI GSNYVHWYQQ LPGTAPKLLIYRNNRRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC AAWDDSLSGLVVFGGGTKLT VLGQPKAAP＞LC-097-F08 (SEQ ID NO1045)AQDIQMTQSP STLSASVGDR VTISCRASQG IGTHLNWYQQ KLGNVPKLLIYAASGLQSGV PPRFSGSGSG TDFTLTISSL HPEDSATYFC QQSYSVPRTFGQGTKVEIKR TVAAP＞LC-097-G01(SEQ ID NO1046)
AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG IGNYLVWYQH KPGNVPRVLIYAASTLQSGV PSRFRGSGSG TDFTLTISGL QPEDVATYYC QKYDGAPFTFGPGTKVDLKR TVAAP＞LC-097-G07 (SEQ ID NO1047)AQDIQMTQSP FLPVCILqET ESPSLAGQVR PLAGILNWYQ QKPGTAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGDGS GTDFTLTISS LQPEDFGIYF CQQSYSAPRTFGQGTKVEIK RTVAAP＞LC-098-C10 (SEQ ID NO1048)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASHN IYTSLNWLQQ KPGKAPKLLIYGASTLENGV PSRFSGSASG TDFTLTISSL QPEDSATYYC QQSYTSVTFGQGTKLEIRRT VAAP＞LC-098-E01 (SEQ ID NO1049)AQDIQMTQSP ATLSLSPGER ATLSCRASQS VSGFLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASNRATGI PARFSGSGSG TDFTLTITRL EPEDFAVYYC QQYGDSSPITFGPGTRLEIK RTVAAP＞LC-098-E09 (SEQ ID NO1050)AQDIQMTQSP SSVSASVGDS VTISCWTIYD ISSWLAWYQQ RPGQAPKLLIYAASRLATGV PSRFRGSGSG TDFTLTITNL QPEDVATYYC QQTKDFPLTFGGGTRVDLKR TVAAP＞LC-098-G05 (SEQ ID NO1051)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQT ISRYLNWYQQ KPGTAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGDGSG TDFTLTISSL QPEDFGIYFC QQSYSAPRTFGQGTKVEIKR TVAAP＞LC-098-H04 (SEQ ID NO1052)AQSELTQPPS ASGSPGQSLT ISCTGGRRDI GNYNYVSWYQ QHPGKAPRLIIYDVRKRPSG VPDRFSGSKS GNVAFLTVSG LQTDDEADYY CGSYTGTSNVFGSGTTVTVL GQPKANP＞LC-131-G03(SEQ ID NO1052) LC-098-H04與LC-131-G03相同AQSELTQPPS ASGSPGQSLT ISCTGGRRDI GNYNYVSWYQ QHPGKAPRLIIYDVRKRPSG VPDRFSGSKS GNVAFLTVSG LQTDDEADYY CGSYTGTSNVFGSGTTVTVL GQPKANP＞LC-099-A09 (SEQ ID NO1053)AQDIQMTQSP GTLSLSPGER ATLSCRASQS VYSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYAASNRAIG IPDRFSGSGS GTDFTLTISS MQPEDFATYY CQQSYSTPRFGQGTKLEIKR TVAAP＞LC-099-C12(SEQ ID NO1054)AQSVLTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTTSDV GGYKYVSWYQ HHPGKVPKLIIYEVNHRPSG VSHRFSGSKS GNTASLIISA LQAEDEADYY CYSYTSDSTPYVFGTGTKVT VLGQPKANP＞LC-099-D05(SEQ ID NO1055)
AQDIQMTQSP GTLSLSPGER ATLSCRASQT VSSNYLAWYQ QKPGLAPRLLIYGVSNRAAG IPDRFSGRGS GTDFTLIINR LEPEDFAVYY CQHYGSSAFTFGRGTKLEIE RTVAAP＞LC-099-E11 (SEQ ID NO1056)AQDIQMTQSP STLSASVGDR VTITCRASQS ISNWLAWYQQ KPGRAPKLLIYKASTLESGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC QHYNSYSLFGQGTKLEIKRT VAAP＞LC-101-E01 (SEQ ID NO1057)AQDIQMTQSP SSVSASVGDR VTITCRAGQN IYYWLAWYQQ KPGKAPQLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQAKSFPVTFGGGTKVEIKR TVAAP＞LC-102-A04(SEQ ID NO1058)AQSELTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGSSSNI GSNYVYWYQQ YPGTVPKLLIHSNNQRPSGV PDRFSGPKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC ATWDNSLSAWVFGGGTKLTV LRQPKAAP＞LC-102-C02 (SEQ ID NO1059)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSSLAWYQQ KPGKVPKLLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQSYSTPWTFGQGTKVEIKR TVAAP＞LC-102-C12 (SEQ ID NO1060)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISNYLAWYQQ KPGKVPKLLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDVATYYC QKYNSAPWTFGQGTKVEIKR TVAAP＞LC-102-D07 (SEQ ID NO1061)AQDIQMTQSP GTLSLSPGER ATLSCGASQS VSTTYIAWYQ HKPGQPPRLLIYGASNRATG IPDRFRGSGS GTDFTLTISR LEPEDFAVYY CQQYGSSPYTFGQGTKLEIK RTVAAP＞LC-102-E09 (SEQ ID NO1062)AQDIQMTQSP DSLSLSPGER ATLSCRASQS ISSSYLAWYQ QTPGQAPRLLIYHASSRATG VPARFSGSGS GTDFTLTISS LEPEDFAVYY CQQRNNWPPSFTFGGGTKVE TKRTVAP＞LC-102-G11 (SEQ ID NO1063)AQDIQMTQSP DTLSLSPGER ATLSCRASES VSSSYFAWYQ QKRGQAPRLLIYGASRRVTG IPDRFSGSGS GTDFTLTITR LEPEDFAVYY CQQYGGSPRSFGQGTKVEIK RTVAAP＞LC-102-G12(SEQ ID NO1064)AQSELTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGTLSNI GTNIVSWFQQ LPGTAPKLLIYNDHRRPSGV PDRFSGSKSA TSASLAISGL QSEDEADYYC AAWDDSLNGVVFGGGTKLTV LSQPKAAP＞LC-133-E08(SEQ ID NO1064)LC-102-G12與LC-133-E08一致
AQSELTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGTLSNI GTNIVSWFQQ LPGTAPKLLIYNDHRRPSGV PDRFSGSKSA TSASLAISGL QSEDEADYYC AAWDDSLNGVVFGGGTKLTV LSQPKAAP＞LC-102-H02(SEQ ID NO1065)AQDIQMTQSP ATLSLSPGER AALSCRASQS VSNFLAWYQQ KPGQAPRLLIYGASNRATDI PARFSGSGSG TDFTLTISSL EPEDFATYYC QQANSFPLTFGGGTKVEIKR TVAAP＞LC-102-H11(SEQ ID NO1066)AQDIQMTQSP ATLSLSPGER ATLSCRASQS VSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSG TDFTLTISSL EPEDFAVYYC QQRGGWPLTFGGGTKVEIRR TVAAP＞LC-103-A01 (SEQ ID NO1067)AQSALTQPPS ASGTPGQTVT ISCSGSSSNI GTNFVYWYQQ LPGTAPKLLIYRSIKRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC AAWDDSLSGVVFGGGTKLTV LGQPKAAP＞LC-103-A03 (SEQ ID NO1068)AQDIQMTQSP SSVSASVGDR VTITCRASQD VRRFLAWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQANSFPITFGQGTRLEIKR TVAAP＞LC-103-E09 (SEQ ID NO1069)AQYELTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTNTDV GGYNFVSWYQ QYPGKAPKLIIFDVTNRPSG VSNRFSGSKS GNTASLTISG LQAEDEADYY CCSYTNTNTLVFAGGTKVTV LGQPKANP＞LC-103-F07 (SEQ ID NO1070)AQSALTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTSNDI GRTNYVSWYR QDPGRAPKLILFEVSNRPSG ISNRFSASKS GSTASLTISG LQADDESDYY CSSCTTAPVCVFGNGTRVTV LGQPKANP＞LC-103-H07(SEQ ID NO1071)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VAITCRASQS IDTYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASKLEDGV PSRFSGSGTG TDFTLTIRSL QPEDFATYYC QPYNTYPITFGQGTRLEIKR TVAAP＞LC-104-A12 (SEQ ID NO1072)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQS IGASLNWYQQ KPQKAPKLLIYTASNLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL LPEDFATYYC QQNYRGRTFGQGTKLEIKRT VAAP＞LC-104-B03 (SEQ ID NO1073)AQDIQMTQSP GTLSLSPGER ATLSCRASQS VSSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASSRATG IPDRFSGSGS GTDFTLTISR LEPEDFAVYY CQQYGSSRYTFGQGTKLEIK RTVAAP＞LC-104-B12(SEQ ID NO1074)
AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQA ISNYLAWYQQ QPGKVPKLLISAASTLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLSISSL QPEDVATYYC QTYYSVPFTFGPGTKVDFKR TVAAP＞LC-104-D12(SEQ ID NO1075)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASLS VSGYLNWYQH KPGRAPNLLIYATSSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTVSSL QPEDLATYYC QQSYSSPYTFGQGTKVEIKG TVAAP＞LC-104-H12(SEQ ID NO1076)AQSELTQPPS ASGSPGQSVT ISCTGTSSDV GAYNYVSWYQ QHPGKAPKLIIYEVNKRPSG VPDRFSASKS GNTASLTVSG LQAEDEADYY CNSYAGSNSLIFGGGTKLTV LGQPKAAP＞LC-105-B06(SEQ ID NO1077)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTLTCRASQS IANYLNWYQQ KPGKAPKLLVYAASRLHSGV PSRFSGRGSG TDFTLTITSL EPDDLATYYC QQSHASPLTFGGGTKVEIKR TVAAP＞LC-105-F02 (SEQ ID NO1078)AQDIQMTQSP STLSASVGDR VTITCRASQS ISSWLAWYQQ KPGEAPKLLIYAASSLRNGV PSRFIGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQSYSTPPTFGGGTKVEIKR TVAAP＞LC-106-C06 (SEQ ID NO1079)AQDIQMTQSP ATLSASVGDR VTITCRASQS VSRWLAWYQQ KPGKAPKLLIYKASTLESGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC QQYGAFGQGTKVEIRRTVAA P＞LC-106-D06 (SEQ ID NO1080)AQDIQMTQSP SSVSASVGDR VTITCRASQG ISSWLAWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQANSFPYTFGQGTKLEIKR TVAP＞LC-106-E12 (SEQ ID NO1081)AQDIQMTQSP GTLSLSPGER ATLSCRPSQS VYSNYLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASTRATG IPDRFSGSAS GTDFTLTISR LEPEDFAVYY CQQYGNSYTFGPGTKVDIKR TVAAP＞LC-106-G12 (SEQ ID NO1082)AQDIQMTQSP SFVSASIGDR VTITCRASQS IGTLLNWYQH KPGTVPSLLIYGASNLRGGV PARFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QHDTFGGGTKVDIKRTVAAP＞LC-107-B05 (SEQ ID NO1083)AQSELTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTSSDV GAYNYVSWYQ QHPGKVPKLMIYEVSNRPSG VSNRFSGSKS GNTASLTISG LQAEDEADYY CNSYTTSATLVFGGGTKLTV LSQPKAAP＞LC-107-D01 (SEQ ID NO1084)
AQSELTQPAS VSGPPGQSIT ISCTGTSSDV GGYNYVSWYQ QHPGKAPKLIIYEVSNRPSG VSYRFSASKS DNTASLTISG VQAEDEADYY CSSYKRGGTYVFGTGTTVIV LGQPKANP＞LC-107-D05 (SEQ ID NO1085)AQDIQMTQSP STLSASVGDR VTITCRASQS ISSWLAWYQQ KPGKVPKLLIHAASTLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDVATYYC QKYNSAPLTFGGGTKVEIKR TVAAP＞LC-107-D12 (SEQ ID NO1086)AQYELTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGSSSDI GSNTVNWYQQ LPGTAPKLLIYSNNQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL QSEDEADYYC AAWDDSLNGYVFGTGTKVTV LGQPKANP＞LC-107-F11(SEQ ID NO1087)AQDIQMTQSP GTLSLSPGER ATLSCRASQS VSGSYLAWYQ QKPGQAPSLLIYGAYSRATG IPDRFSGSGS GTDFTLTISR LEPEDFAVYY CQHYGSSPRTFGGGTKVEIK RTVAAP＞LC-108-C10 (SEQ ID NO1088)AQSVLTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTSSDV GGYNYVSWYQ QHPGQPPKLIIYEVSNRASG VSNRFSGSKF GNTASLTISG LQSEDEADYH CSSYTSSTTLLFGGGTRLTV LGQPKAAP＞LC-108-D11 (SEQ ID NO1089)AQSVLTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTNTDV GGYNLVSWYQ QHPGKAPKLIIYEVSNRPSG VSNRFSGSKS GNTASLTISG LQAEDEVDYY CGSYTSSSTHVFGSGTKVTV LGQPKANP＞LC-108-E10 (SEQ ID NO1090)AQDIQMTQSP GTLSLSPGER ATLSCRASQT VSSTYLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASSRATG IPDRFSGGGS GTDFTLTISR LEPEDFAVYY CQQYGSSPPRYTFGQGTKLE IKRTVAAP＞LC-108-E11 (SEQ ID NO1091)AQYELTQPAS VSGSPGQSIT ISCTATSSDL GSYNFVSWYQ QHPDKAPKLMIFEVSRRPSG VSNRFSGSKS GNTASLTISG LQAEDEADYY CCSYAGSNTYVFGTGTKVTV LGQPKANP＞LC-109-A11 (SEQ ID NO1092)AQSELTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTSSDV GGYNYLSWYQ QHPGKAPKLMIYGVSNRPSG VSTRFSGSKS GNTASLTISG LQAEDEADYY CSSYTSTGTRVFGGGTRLTV LGQPKAAP＞LC-109-E08 (SEQ ID NO1093)AQDIQMTQSP ATLSVSPGER ATLSCRASQS VSSNLAWYQQ KPGQAPRLLIYGASTRATGI PARFSGSGSG TEFTLTISSL QSEDFAVYYC QQNNNWPPSFTFGPGTKVDI KRTVAAP＞LC-110-D06(SEQ ID NO1094)
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AQDIQMTQSP GTLSLSPGDR ATLSCRASQS VSSSYLAWYQ QKAGQAPRLLIYGAASRATG IPDRFSGSGS GTDFTLTISR LEREDFAVYY CQQYGSSPLITFGQGTRLEI KRTVAAP＞LC-139-A09 (SEQ ID NO1194)AQDIVMTQTP PSLPVNPGEP ASISCRSSQS LVYSDGNTYL NWFQQRPGQSPRRLIYKVSN RDSGVPDRFS GSGSGTDFTL KISRVEAEDV GVYYCMQGTHWQRLTFGGGT KVEIKRTVAA P＞LC-139-C02 (SEQ ID NO1195)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG IRRALAWYQQ KPGKPPKLLINDASSLESGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQSYSTPPWTFGQGTKVEIK RTVAAP＞LC-139-E12 (SEQ ID NO1196)AQDIQMTQSP SSVSASVGDR VTMTCRASRG ISNWLAWYQQ KPGKAPELLIHSASTLHAGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPGDFATYYC QEGNSFPYTFGQGTNLQIKR TVAAP＞LC-139-F04 (SEQ ID NO1197)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQA ISTNLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFIGSGSG TDFTLTISSL HPEDFATYHC QQTFSPPHTFGQGTKVEIQR TVAAP＞LC-139-F09 (SEQ ID NO1198)AQDIQMTQSP GTLSLSPGER ATLSCRASQS VSSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASSRATG IPDRFSGSGS GTDFTLTISS LQLEDFGTYF CQQSYRSPYTFGQGTKVDIK RTVAAP＞LC-135-H01 (SEQ ID NO1376)AQSVLTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGSSSNI GSNYVYWYQQ LPGTAPKLLIYRNNQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC AAWDDSLSGVVFGGGTKLTV LGQPKAAP上述輕鏈可變域是來自下列輕鏈可變類型LC-092-B12κA20LC-092-F08κA11LC-092-G06λ2eLC-093-C02κA27LC-093-C08κA27LC-093-C10κA20LC-093-E11κL6LC-093-F09λ2a2LC-093-G06λ2e
LC-093-G09κ012LC-094-D08λ1cLC-094-E08λ2a2LC-094-F03κA27LC-095-A11κL6LC-095-G09κL12LC-095-H10κL12LC-096-D03λ2eLC-096-D09λ1cLC-096-E11κ012LC-097-D04λ1gLC-097-E07κ012LC-097-F03κL2LC-097-F04λ1gLC-097-F08κ012LC-097-G01κA20LC-097-G07κ012LC-098-C10κ012LC-098-E01κA27LC-098-E09κL19LC-098-G05κ012LC-098-H04λ2cLC-099-A09κA27LC-099-C12λ2a2LC-099-D05κA27LC-099-E11κL12LC-101-E01κL5LC-102-A04λ1gLC-102-C02κA20LC-102-C12κA20LC-102-D07κA27LC-102-E09κL6LC-102-G11κA27LC-102-G12λ1cLC-102-H02κL6
LC-102-H11κL6LC-103-A01λ1gLC-103-A03κL5LC-103-E09λ2a2LC-103-F07λ2a2LC-103-H07κ012LC-104-A12κ012LC-104-B03κA27LC-104-B12κA20LC-104-D12κ012LC-104-H12λ2cLC-105-B06κ012LC-105-F02κL11LC-106-C06κL12LC-106-D06κL5LC-106-E12κA27LC-106-G12κ012LC-107-B05λ2a2LC-107-D01λ2a2LC-107-D05κA20LC-107-D12λ1cLC-107-F11κA27LC-108-C10λ2a2LC-108-D11λ2a2LC-108-E10κA27LC-108-E11λ2b2LC-109-A11λ2a2LC-109-E08κL2LC-110-D06κ012LC-110-D11λ2a2LC-110-F08κA27LC-110-G01λ1cLC-110-H11κ012LC-111-B02λ31LC-111-C10κ012
LC-111-D11κA27LC-112-C02κA27LC-1 12-C12κL16LC-112-D04λ3jLC-112-D07κ012LC-113-D05κA27LC-113-E03κ012LC-113-G11κ012LC-114-D02κA20LC-114-E02κL6LC-114-F04λ2a2LC-114-G06κL15LC-114-G09λ2b2LC-114-H07κA27LC-115-F04λ3rLC-115-F08λ2a2LC-115-G12κA27LC-116-A08κA27LC-116-C09λ3rLC-116-E08κL5LC-117-A12κA27LC-117-B07κL6LC-117-C04κ012LC-117-F04κL12LC-117-F08λ1gLC-118-E07κA20LC-119-B09κL2LC-121-A07κL16LC-121-H07κ012LC-122-A05κL12LC-122-D01κL19LC-122-G06λ2a2LC-122-H04λ2eLC-123-E02λ2a2LC-124-A01κ012
LC-124-C04κ012LC-124-C12κ012LC-124-G12κL5LC-124-H10κL6LC-125-C04λ2a2LC-126-B12κA27LC-126-C10κ012LC-126-F11κL12LC-126-H09λ31LC-127-C06κL12LC-127-D05κ012LC-127-H05κ012LC-128-A06λ3rLC-128-E07κL12LC-128-F11κL12LC-129-B09κL8LC-130-B02λ2b2LC-131-A03λ2a2LC-131-B05λ2a2LC-131-C08κL5LC-131-C09λ1cLC-131-D01κA27LC-131-D12λ3rLC-131-F07κ012LC-131-F09κL6LC-131-F12κ012LC-131-G03λ2c，與LC-098-H04相同LC-131-G06λ1cLC-132-C01λ2eLC-132-C08κ012LC-132-D02λ2cLC-132-D08κL12LC-132-H11λ1gLC-133-E02λ1c
LC-133-E08λ1c，與LC-102-G12相同LC-134-B03λ2cLC-134-D07κL11LC-135-B05κ012LC-135-C11κL5LC-135-C12λ1gLC-135-E10κ012LC-135-F03κL6LC-136-A07λ1cLC-136-B06κ012LC-136-D07κL5LC-136-E10κA27LC-136-E12κL11LC-136-F08κL6LC-137-B01κA27LC-137-E01λ1gLC-137-G10κ012LC-138-A03κL5LC-138-B04κ012LC-138-B06κL5LC-138-B10κA27LC-138-C04λ2a2LC-138-C09λ2a2LC-138-E02κL5LC-138-E12λ2a2LC-138-G11λ1c，與LC-133-E02相同LC-139-A04κA27LC-139-A09κA17LC-139-C02κL4LC-139-E12κL5LC-139-F04κ012LC-139-F09κA27下列為例示性重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
＞HC-092-B12(SEQ ID NO1199)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYLMAWVRQA PGKGLEWVSSIYPSGGNTNY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDRSIVPYSSSWY MPRDYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAP＞HC-092-F08 (SEQID NO1200)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYPMIWVRQA PGKGLEWVSGIYSSGGTTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVGVWYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA P＞HC-092-G06 (SEQID NO1201)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYGMNWVRQA PGKGLEWVSSIWSSGGYTTY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVGIWYSMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA P＞HC-093-C02 (SEQ ID NO1202)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMHWVRQA PGKGLEWVSWISPSGGQTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARAKVLRYFDWLLG GDAFDIWGQG TMVTVSSAST KGPSVFPLAP＞HC-093-C08 (SEQID NO1203)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYPMGWVRQA PGKGLEWVSSIYPSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVGVWYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA P＞HC-093-C10 (SEQID NO1204)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMEWVRQA PGKGLEWVSVIRPSGGTTMY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARVGVWYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA P＞HC-093-E11 (SEQID NO1205)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYEMAWVRQA HGKGLEWVSV
IYPSGGATRY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVAQYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA P＞HC-093-F09 (SEQ ID NO1206)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYRMWWVRQA PGKGLEWVSYIVPSGGQTSY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGSAYQRRTYSSG WYSASGRRGT AEYFQHWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP＞HC-093-G06(SEQ ID NO1207)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYHMDWVRQA PGKGLEWVSVIGPSGGFTRY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARALGGSLDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP＞HC-093-G09 (SEQ ID NO1208)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYSMTWVRQA PGKGLEWVSSISPSGGATKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGGAASLPFDYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL AP＞HC-094-D08 (SEQ ID NO1209)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMVWVRQA PGKGLEWVSGIVPSGGYTMY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTRASYSSFGLDYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL AP＞HC-094-E08 (SEQ ID NO1210)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYAMVWVRQA PGKGLEWVSYISPSGGATWY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPSRPRYYYDSSG YYSSAFDIWG QGTMVTVSSA STKGPSVFPL AP＞HC-094-F03 (SEQ ID NO1211)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYQMSWVRQA PGKGLEWVSSIYPSGGATKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARMGLHHSFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA P＞HC-095-A11 (SEQ ID NO1212)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYMMGWNRQA PGKGLEWVSSIRSSGGATAY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCARVGVWYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA P＞HC-095-G09 (SEQ ID NO1213)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYNMHWVRQA PGKGLEWVSVIYPSGGYTVY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARRGNWGGIDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA P＞HC-095-H10 (SEQ ID NO1214)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYKMQWVRQA PGKGLEWVSSIYSSGGKTVY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARTPGYNYFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA P＞HC-096-D03 (SEQ ID NO1215)
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抗體131-F07具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO7)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO8)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPLT(SEQ IDNO9)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列KYKMV(SEQ ID NO10)，在CDR2處包含序列SIYPSGGITAYADSVKG(SEQ ID NO11)，且在CDR3處包含序列DITPGGGSGFRLPKNYYYYGMDV(SEQ ID NO12)的HC可變域。
抗體139-F04具有在CDR1處包含序列RASQGISSWLA(SEQ ID NO13)，在CDR2處包含序列AASSLER(SEQ ID NO14)，且在CDR3處包含序列QQYHNFPLT(SEQ IDNO15)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列YYEME(SEQ ID NO16)，在CDR2處包含序列SIRPSGGRTVYADSVKG(SEQ ID NO17)，且在CDR3處包含序列GRSNYYGSGSYSPKYFQH(SEQ ID NO18)的HC可變域。
抗體139-E12具有在CDR1處包含序列RASQSVSSNYLS(SEQ ID NO19)，在CDR2處包含序列GTSNRAS(SEQ ID NO20)，且在CDR3處包含序列QQYGGAPLFI(SEQID NO21)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYNMN(SEQ ID NO22)，在CDR2處包含序列VIYPSGGQTHYADSVKG(SEQ ID NO23)，且在CDR3處包含序列RGIWHSFDI(SEQ ID NO24)的HC可變域。
抗體097-F03具有在CDR1處包含序列SGTNSNIGSNSVF(SEQ ID NO25)，在CDR2處包含序列RNSQRPS(SEQ ID NO26)，且在CDR3處包含序列ATWDDSLRSPV(SEQ ID NO27)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYSMT(SEQ ID NO28)，在CDR2處包含序列SIYPSGGKTTYADSVKG(SEQ ID NO29)，且在CDR3處包含序列MVAPYYYDSSGYPPAEYFQH(SEQ ID NO30)的HC可變域。
抗體102-G12具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO3 1)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO32)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPRT(SEQ IDNO33)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列LYFMT(SEQ ID NO34)，在CDR2處包含序列SISSSGGSTKYADSVKG(SEQ ID NO35)，且在CDR3處包含序列GGQWLAFDY(SEQ ID NO36)的HC可變域。
抗體102-E09具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGSYKLVS(SEQ ID NO37)，在CDR2處包含序列EGSKRPS(SEQ ID NO38)，且在CDR3處包含序列CSYAGSSTWV(SEQ ID NO39)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYAMD(SEQ ID NO40)，在CDR2處包含序列VIYSSGGKTTYADSVKG(SEQ ID NO41)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO42)的HC可變域。
抗體106-G12具有在CDR1處包含序列RASQGISSWLA(SEQ ID NO43)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO44)，且在CDR3處包含序列QQANSFPHT(SEQ IDNO45)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列FYLMF(SEQ ID NO.46)，在CDR2處包含序列GIYPSGGQTVYADSVKG(SEQ ID NO47)，且在CDR3處包含序列AIGAGSSF(SEQ ID NO48)的HC可變域。
抗體102-H11具有在CDR1處包含序列RASRGISNWLA(SEQ ID NO49)，在CDR2處包含序列SASTLHA(SEQ ID NO50)，且在CDR3處包含序列QEGNSFPYT(SEQ IDNO51)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYSMN(SEQ ID NO52)，在CDR2處包含序列SIGPSGGGTKYADSVKG(SEQ ID NO53)，且在CDR3處包含序列RGQRKQWLPPNGAFDI(SEQ ID NO54)的HC可變域。
抗體138-C09具有在CDR1處包含序列WTIYDISSWLA(SEQ ID NO55)，在CDR2處包含序列AASRLAT(SEQ ID NO56)，且在CDR3處包含序列QQTKDFPLT(SEQ IDNO57)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYGMQ(SEQ ID NO58)，在CDR2處包含序列YIYPSGGGTVYADSVKG(SEQ ID NO59)，且在CDR3處包含序列RVAVAGSWYYYYYGMDV(SEQ ID NO60)的HC可變域。
抗體098-G05具有在CDR1處包含序列SGSSSNIGSNYVY(SEQ ID NO61)，在CDR2處包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO62)，且在CDR3處包含序列AAWDDSLSGVV(SEQ ID NO63)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列AYLMA(SEQ ID NO64)，在CDR2處包含序列SIRPSGGETRYADSVKG(SEQ ID NO65)，且在CDR3處包含序列DQKGYPDSSSFRRYYYYYGMDV(SEQ ID NO66)的HC可變域。
抗體136-E10具有在CDR1處包含序列TGTNTDVGGYNLVS(SEQ ID NO67)，在CDR2處包含序列EVSNRPS(SEQ ID NO68)，且在CDR3處包含序列GSYTSSSTHV(SEQ ID NO69)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYVMT(SEQ ID NO70)，在CDR2處包含序列VIYPSGGATKYADSVKG(SEQ ID NO71)，且在CDR3處包含序列RGAGGMDV(SEQ ID NO72)的HC可變域。
抗體136-A07具有在CDR1處包含序列RASHVINIDLG(SEQ ID NO73)，在CDR2處包含序列GASHLQR(SEQ ID NO74)，且在CDR3處包含序列LQDSFYPRT(SEQ IDNO75)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYSMQ(SEQ ID NO76)，在CDR2處包含序列SIGPSGGRTWYADSVKG(SEQ ID NO77)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO78)的HC可變域。
抗體097-G01具有在CDR1處包含序列RASQDIASWLA(SEQ ID NO79)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO80)，且在CDR3處包含序列QQANSFPFT(SEQ IDNO81)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列PYKMG(SEQ ID NO82)，在CDR2處包含序列SIYPSGGVTTYADSVKG(SEQ ID NO83)，且在CDR3處包含序列NINLRYDILTGYFDI(SEQ ID NO84)的HC可變域。
抗體138-G11具有在CDR1處包含序列RASQGISSWLV(SEQ ID NO85)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO86)，且在CDR3處包含序列QQAKTFPLT(SEQ IDNO87)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYMMH(SEQ ID NO88)，在CDR2處包含序列GIGPSGGKTPYADSVKG(SEQ ID NO.89)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO90)的HC可變域。
抗體139-A09具有在CDR1處包含序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO.91)，在CDR2處包含序列DASNRAT(SEQ ID NO92)，且在CDR3處包含序列QQRSNWLWT(SEQID NO93)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMQ(SEQ ID NO94)，在CDR2處包含序列GIGPSGGSTTYADSVKG(SEQ ID NO95)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO96)的HC可變域。
抗體114-G06具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGAYNYVS(SEQ ID NO97)，在CDR2處包含序列EVNKRPS(SEQ ID NO98)，且在CDR3處包含序列NSYAGSNSLI(SEQ ID NO99)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYSMF(SEQ ID NO100)，在CDR2處包含序列SIYPSGGQTDYADSVKG(SEQ ID NO101)，且在CDR3處包含序列RGLLWSFDS(SEQ ID NO102)的HC可變域。
抗體139-C02具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGAYNYVS(SEQ ID NO103)，在CDR2處包含序列EVNKRPS(SEQ ID NO104)，且在CDR3處包含序列NSYAGSNSLI(SEQ ID NO105)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列YYQMS(SEQ ID NO106)，在CDR2處包含序列RIGPSGGLTSYADSVKG(SEQ ID NO107)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO108)的HC可變域。
抗體093-F09具有在CDR1處包含序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO109)，在CDR2處包含序列DASNRAT(SEQ ID NO110)，且在CDR3處包含序列QQRSNWPSPIA(SEQID NO111)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMI(SEQ ID NO112)，在CDR2處包含序列WIYPSGGNTIYADSVKG(SEQ ID NO113)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO114)的HC可變域。
抗體110-F08具有在CDR1處包含序列RASQGIRNDLG(SEQ ID NO115)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO116)，且在CDR3處包含序列LQDYNYPRT(SEQID NO117)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYFMI(SEQ ID NO118)，在CDR2處包含序列SIVPSGGPTRYADSVKG(SEQ ID NO119)，且在CDR3處包含序列RGPVYYYDSSGSHSAFDI(SEQ ID NO120)的HC可變域。
抗體117-F04具有在CDR1處包含序列SGSNSNIGNNFVY(SEQ ID NO121)，在CDR2處包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO122)，且在CDR3處包含序列AAWDDSLSGVL(SEQ ID NO123)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYHMS(SEQ ID NO124)，在CDR2處包含序列SIRPSGGSTIYADSVKG(SEQ ID NO125)，且在CDR3處包含序列EPRRYYYDSSGSYDAFDI(SEQ ID NO126)的HC可變域。
抗體111-D11具有在CDR1處包含序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO127)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO128)，且在CDR3處包含序列QQRGGWPLT(SEQID NO129)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列KYPMT(SEQ ID NO130)，在CDR2處包含序列SISSSGGKTQYADSVKG(SEQ ID NO131)，且在CDR3處包含序列GGSSTLYFMDV(SEQ ID NO132)的HC可變域。
抗體112-D07具有在CDR1處包含序列SGSSSNIGSNYVH(SEQ ID NO133)，在CDR2處包含序列RNNRRPS(SEQ ID NO134)，且在CDR3處包含序列AAWDDSLSGLVV(SEQ ID NO135)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列PYQMW(SEQ ID NO136)，在CDR2處包含序列SISSSGGLTRYADSVKG(SEQ ID NO137)，且在CDR3處包含序列VKLNYYGSGSYSLDAFDI(SEQ ID NO138)的HC可變域。
抗體131-B05具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO139)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO140)，且在CDR3處包含序列QQSYNAPWT(SEQID NO141)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYVMS(SEQ ID NO142)，在CDR2處包含序列SIRSSGGRTMYADSVKG(SEQ ID NO143)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO144)的HC可變域。
抗體131-DO1具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGAYNYVS(SEQ ID NO.145)，在CDR2處包含序列DVSNRPS(SEQ ID NO146)，且在CDR3處包含序列SSFTSRKTWV(SEQ ID NO147)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列FYAMV(SEQ ID NO148)，在CDR2處包含序列YISPSGGATWYADSVKG(SEQ ID NO149)，且在CDR3處包含序列PSRPRYYYDSSGYYSSAFDI(SEQ ID NO150)的HC可變域。
抗體137-E01具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO151)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO152)，且在CDR3處包含序列QQYGSSLT(SEQ ID NO153)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYSMT(SEQ ID NO154)，在CDR2處包含序列RIYPSGGRTGYADSVKG(SEQ ID NO155)，且在CDR3處包含序列DSGGYYYGMDV(SEQ ID NO156)的HC可變域。
抗體132-C08具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO157)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO158)，且在CDR3處包含序列QQSYRSPYT(SEQ ID NO159)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMA(SEQ ID NO160)，在CDR2處包含序列RIGPSGGYTMYADSVKG(SEQ ID NO161)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO162)的HC可變域。
抗體114-G09具有在CDR1處包含序列RASQSIGASLN(SEQ ID NO163)，在CDR2處包含序列TASNLQS(SEQ ID NO164)，且在CDR3處包含序列QQNYRGRT(SEQ IDNO165)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYNMG(SEQ ID NO166)，在CDR2處包含序列RIGSSGGKTAYADSVKG(SEQ ID NO167)，且在CDR3處包含序列TNYDFWSGYLPNPNPYPLDY(SEQ ID NO168)的HC可變域。
抗體138-A03具有在CDR1處包含序列TGTSSDVNYVS(SEQ ID NO169)，在CDR2處包含序列AVTKRPS(SEQ ID NO170)，且在CDR3處包含序列SSYAGSNNLV(SEQ ID NO171)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYPMD(SEQ ID NO172)，在CDR2處包含序列YIGPSGGSTRYADSVKG(SEQ ID NO173)，且在CDR3處包含序列HVPPGT(SEQ ID NO174)的HC可變域。
抗體135-H01具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGAYNYVS(SEQ ID NO175)，在CDR2處包含序列DVSNRPS(SEQ ID NO176)，且在CDR3處包含序列SSYTSSYTWV(SEQ ID NO177)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYHMQ(SEQ ID NO178)，在CDR2處包含序列SIRPSGGETRYADSVKG(SEQ ID NO179)，且在CDR3處包含序列EVTMVRGVYYYYYGMDV(SEQ ID NO180)的HC可變域。
抗體108-D11具有在CDR1處包含序列SGSSSNIGSNYVY(SEQ ID NO181)，在CDR2處包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO182)， 且在CDR3處包含序列AAWDDSLSGHAV(SEQ ID NO183)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYQMH(SEQ ID NO184)，在CDR2處包含序列RIRSSGGATSYADSVKG(SEQ ID NO185)，且在CDR3處包含序列GGGYSYYFDY(SEQ ID NO186)的HC可變域。
抗體136-E12具有在CDR1處包含序列TGTSTDDVGGYNYVS(SEQ ID NO187)，在CDR2處包含序列DVINRPS(SEQ ID NO188)，且在CDR3處包含序列SSYTSRGTRV(SEQ ID NO189)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列DYRMW(SEQ ID NO190)，在CDR2處包含序列YIVPSGGQTSYADSVKG(SEQ ID NO191)，且在CDR3處包含序列GSAYQRRTYSSGWYSASGRRGTAEYFQH(SEQIDNO192)的HC可變域。
抗體136-D07具有在CDR1處包含序列RASQSISNWLA(SEQ ID NO193)，在CDR2處包含序列MASTLES(SEQ ID NO194)，且在CDR3處包含序列QQYNSYSVT(SEQID NO195)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMY(SEQ ID NO196)，在CDR2處包含序列WIGPSGGHTMYADSVKG(SEQ ID NO197)，且在CDR3處包含序列LQQGLDY(SEQ ID NO198)的HC可變域。
抗體138-E02具有在CDR1處包含序列RASQSVSSNYLA(SEQ ID NO199)，在CDR2處包含序列YGASYRAT(SEQ ID NO200)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPWT(SEQ ID NO201)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMY(SEQ IDNO202)，在CDR2處包含序列RIYPSGGATSYADSVKG(SEQ ID NO203)，且在CDR3處包含序列SGSWYSFDY(SEQ ID NO204)的HC可變域。
抗體131-F09具有在CDR1處包含序列RASQGIGNYLV(SEQ ID NO205)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ID NO206)，且在CDR3處包含序列QKYDGAPFT(SEQID NO207)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列PYYMQ(SEQ ID NO208)，在CDR2處包含序列GISSSGGSTQYADSVKG(SEQ ID NO209)，且在CDR3處包含序列SQRRTYYPNFGDAFDI(SEQ ID NO210)的HC可變域。
抗體1 34-B03具有在CDR1處包含序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO211)，在CDR2處包含序列KASSLES(SEQ ID NO212)，且在CDR3處包含序列QQYNSYRYT(SEQID NO213)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYWMM(SEQ ID NO214)，在CDR2處包含序列WIGSSGGFTWYADSVKG(SEQ ID NO215)，且在CDR3處包含序列GNGGFDS(SEQ ID NO.216)的HC可變域。
抗體104-H12具有在CDR1處包含序列SGTLSNIGTNIVS(SEQ ID NO217)，在CDR2處包含序列NDHRRPS(SEQ ID NO218)，且在CDR3處包含序列AAWDDSLNGVV(SEQ ID NO219)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列KYKMV(SEQ ID NO220)，在CDR2處包含序列SIYPSGGITAYADSVKG(SEQ ID NO221)，且在CDR3處包含序列DITPGGGSGFRLPKNYYYYGMDV(SEQ ID NO222)的HC可變域。
抗體135-F03具有在CDR1處包含序列RSSQSLVYSDGNTYLN(SEQ ID NO223)，在CDR2處包含序列KVSNRDS(SEQ ID NO224)，且在CDR3處包含序列MQGTHWQRLT(SEQ ID NO225)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYFMV(SEQ ID NO226)，在CDR2處包含序列GIGPSGGLTYADSVKG(SEQ ID NO227)，且在CDR3處包含序列SDWLNY(SEQ ID NO228)的HC可變域。
抗體134-D07具有在CDR1處包含序列TGGRRDIGNYNYVS(SEQ ID NO229)，在CDR2處包含序列DVRKRPS(SEQ ID NO230)，且在CDR3處包含序列GSYTGTSNV(SEQ ID NO231)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMS(SEQ ID NO232)，在CDR2處包含序列RIYPSGGQTYYADSVKG(SEQ ID NO233)，且在CDR3處包含序列GAGWFDP(SEQ ID NO234)的HC可變域。
抗體135-C12具有在CDR1處包含序列RASQSVGSDYLA(SEQ ID NO235)，在CDR2處包含序列AASTRAT(SEQ ID NO236)，且在CDR3處包含序列QQYASPPRT(SEQ ID NO237)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYAMH(SEQ ID NO238)，在CDR2處包含序列WISPSGGQTKYADSVKG(SEQ ID NO239)，且在CDR3處包含序列AKVLRYFDWLLGGDAFDI(SEQ ID NO240)的HC可變域。
抗體097-F04具有在CDR1處包含序列RASQSVSFNLA(SEQ ID NO241)，在CDR2處包含序列FDASNRAT(SEQ ID NO242)，且在CDR3處包含序列QQYGTSPFT(SEQID NO243)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列PYFME(SEQ ID NO244)，在CDR2處包含序列GISSSGGNTLYADSVKG(SEQ ID NO.245)，且在CDR3處包含序列DRFGNYYGSGSKLQHDAFDI(SEQ ID NO246)的HC可變域。
抗體111-C10具有在CDR1處包含序列RASQTIRTYLN(SEQ ID NO247)，在CDR2處包含序列DASNLQT(SEQ ID NO248)，且在CDR3處包含序列QQSYGGPPT(SEQID NO249)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列FYSMS(SEQ ID NO250)，在CDR2處包含序列RIRPSGGRTDYADSVKG(SEQ ID NO251)，且在CDR3處包含序列DRLYYYGSGSYYYGAFDI(SEQ ID NO252)的HC可變域。
抗體094-E08具有在CDR1處包含序列RASQSISTYLN(SEQ ID NO253)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO254)，且在CDR3處包含序列QQYNSFPFS(SEQ IDNO255)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMD(SEQ ID NO.256)，在CDR2處包含序列VIYPSGGHTNYADSVKG(SEQ ID NO257)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO258)的HC可變域。
抗體138-B10具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO259)，在CDR2處包含序列DASNRAT(SEQ ID NO260)，且在CDR3處包含序列QQWDT(SEQID NO261)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYKMG(SEQ ID NO262)，在CDR2處包含序列SIRPSGGATKYADSVKG(SEQ ID NO263)，且在CDR3處包含序列VGIWDAFDI(SEQ ID NO264)的HC可變域。
抗體139-F09具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO265)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO266)，且在CDR3處包含序列QQTYSTLFT(SEQ IDNO267)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYKME(SEQ ID NO268)，在CDR2處包含序列RIRPSGGVTKYADSVKG(SEQ ID NO269)，且在CDR3處包含序列GGLWDAFDI(SEQ ID NO270)的HC可變域。
抗體104-A12具有在CDR1處包含序列SGSSSNIGSNIVS(SEQ ID NO271)，在CDR2處包含序列SNNRRPS(SEQ ID NO272)，且在CDR3處包含序列AAWDDSLNGHV(SEQ ID NO273)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYTMT(SEQ ID NO274)，在CDR2處包含序列SIYPSGGHTSYADSVKG(SEQ ID NO275)，且在CDR3處包含序列DTRVGPWLVRAPLDY(SEQ ID NO276)的HC可變域。
抗體132-D02具有在CDR1處包含序列TGTSTDVGGYNYVS(SEQ ID NO277)，在CDR2處包含序列DVSNRPS(SEQ ID NO278)，且在CDR3處包含序列SSYTNTITW(SEQ ID NO279)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMY(SEQ ID NO280)，在CDR2處包含序列RIGPSGGWTKYADSVKG(SEQ ID NO281)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO282)的HC可變域。
抗體138-C04具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO；283)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO284)，且在CDR3處包含序列QQYGSSPFT(SEQ ID NO285)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMH(SEQ ID NO286)，在CDR2處包含序列VIYPSGGTTKYADSVKG(SEQ ID NO287)，且在CDR3處包含序列GNSGSHDY(SEQ ID NO288)的HC可變域。
抗體132-H11具有在CDR1處包含序列RASQGIGNYLA(SEQ ID NO289)，在CDR2處包含序列KTSNLQS(SEQ ID NO290)，且在CDR3處包含序列QRYDSYSQYI(SEQID NO291)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列MYVMN(SEQ ID NO292)，在CDR2處包含序列RIGSSGGGTLYADSVKG(SEQ ID NO293)，且在CDR3處包含序列VSVYRIRNYYYYAMDV(SEQ ID NO294)的HC可變域。
抗體132-D08具有在CDR1處包含序列RASQSVSGFLA(SEQ ID NO295)，在CDR2處包含序列DASNRAT(SEQ ID NO296)，且在CDR3處包含序列QQYGDSSPIT(SEQID NO297)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列MYGMT(SEQ ID NO298)，在CDR2處包含序列GISPSGGRTYYADSVKG(SEQ ID NO299)，且在CDR3處包含序列HRRDYVWWTYGMDV(SEQ ID NO300)的HC可變域。
抗體121-A07具有在CDR1處包含序列RASQGISSWLA(SEQ ID NO301)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO302)，且在CDR3處包含序列QQANSFPSLT(SEQID NO303)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYSMQ(SEQ ID NO304)，在CDR2處包含序列GIRPSGGSTRYADSVKG(SEQ ID NO305)，且在CDR3處包含序列STGGYYYGMDV(SEQ ID NO306)的HC可變域。
抗體126-F11具有在CDR1處包含序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO307)，在CDR2處包含序列DASNRAT(SEQ ID NO308)，且在CDR3處包含序列QQRSNWPPYT(SEQID NO309)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列PYMMG(SEQ ID NO310)，在CDR2處包含序列SIRSSGGATAYADSVKG(SEQ ID NO311)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO312)的HC可變域。
抗體098-H04具有在CDR1處包含序列RASQAISTNLN(SEQ ID NO313)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO314)，且在CDR3處包含序列QQTFSPPHT(SEQ IDNO.315)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYYME(SEQ ID NO316)，在CDR2處包含序列SISSSGGSTEYADSVKG(SEQ ID NO317)，且在CDR3處包含序列DITPGGGSGFRLPKNYYYYGMDV(SEQ ID NO318)的HC可變域。
抗體093-C02具有在CDR1處包含序列GASQSVSSSYLA(SEQ ID NO319)，在CDR2處包含序列DASSRAT(SEQ ID NO320)，且在CDR3處包含序列LHDYNFPFT(SEQ ID NO.321)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYPMI(SEQ ID NO322)，在CDR2處包含序列GIYSSGGTTKYADSVKG(SEQ ID NO323)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO324)的HC可變域。
抗體115-G12具有在CDR1處包含序列RASQAISNYLA(SEQ ID NO325)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ID NO326)，且在CDR3處包含序列QTYYSVPFT(SEQID NO327)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列IYAMI(SEQ ID NO328)，在CDR2處包含序列SIYSSGGPTQYADSVKG(SEQ ID NO329)，且在CDR3處包含序列GRRTYYYDSSGYYKYAAFDI(SEQ ID NO330)的HC可變域。
抗體135-B05具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGGYNYLS(SEQ ID NO331)，在CDR2處包含序列GVSNRPS(SEQ ID NO332)，且在CDR3處包含序列SSYTSTGTRV(SEQ ID NO333)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYTMT(SEQ ID NO334)，在CDR2處包含序列VIYPSGGHTTYADSVKG(SEQ ID NO335)，且在CDR3處包含序列GGRWFSLDY(SEQ ID NO336)的HC可變域。
抗體136-F08具有在CDR1處包含序列TGGRRDIGNYNYVS(SEQ ID NO337)，在CDR2處包含序列DVRKRPS(SEQ ID NO338)，且在CDR3處包含序列GSYTGTSNV(SEQ ID NO339)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMQ(SEQ ID NO340)，在CDR2處包含序列SIYPSGGSTRYADSVKG(SEQ ID NO341)，且在CDR3處包含序列FNVGFDL(SEQ ID NO342)的HC可變域。
抗體110-H11具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO343)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO344)，且在CDR3處包含序列QQSYSTLYT(SEQID NO345)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYRMS(SEQ ID NO.346)，在CDR2處包含序列SISPSGGPTKYADSVKG(SEQ ID NO347)，且在CDR3處包含序列PSGDSSVYRPFAS(SEQ ID NO348)的HC可變域。
抗體110-D11具有在CDR1處包含序列TDTSGNVGSYNLVS(SEQ ID NO.349)，在CDR2處包含序列EVSRRPS(SEQ ID NO350)，且在CDR3處包含序列CSYAGSNTYV(SEQ ID NO351)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYSMV(SEQ ID NO352)，在CDR2處包含序列RIYSSGGSTHYADSVKG(SEQ ID NO353)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO354)的HC可變域。
抗體114-H07具有在CDR1處包含序列SGGSSNIGSNRVN(SEQ ID NO355)，在CDR2處包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO356)，且在CDR3處包含序列AAWDDNLIGPV(SEQ ID NO357)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYHMY(SEQ ID NO358)，在CDR2處包含序列YIRPSGGNTNYADSVKG(SEQ ID NO359)，且在CDR3處包含序列DRRGYSSSKGYYYYGMDV(SEQ ID NO360)的HC可變域。
抗體098-E01具有在CDR1處包含序列SGSSSNIGSNYVY(SEQ ID NO361)，在CDR2處包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO362)，且在CDR3處包含序列AAWDDSMSGVV(SEQ ID NO363)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYFMH(SEQ ID NO364)，在CDR2處包含序列YISSSGGLTGYADSVKG(SEQ ID NO365)，且在CDR3處包含序列RGPVYYYDSSGSHSAFDI(SEQ ID NO366)的HC可變域。
抗體135-C11具有在CDR1處包含序列TGSTSDVGGYTYVS(SEQ ID NO367)，在CDR2處包含序列DVSKRPS(SEQ ID NO368)，且在CDR3處包含序列CSYAGSYSYV(SEQ ID NO369)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYHMD(SEQ ID NO370)，在CDR2處包含序列VIGPSGGFTRYADSVKG(SEQ ID NO371)，且在CDR3處包含序列ALGGSLDY(SEQ ID NO372)的HC可變域。
抗體095-A11具有在CDR1處包含序列TATSSDLGSYNFVS(SEQ ID NO.373)，在CDR2處包含序列EVSRRPS(SEQ ID NO374)，且在CDR3處包含序列CSYAGSNTYV(SEQ ID NO375)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYSMM(SEQ ID NO376)，在CDR2處包含序列SIYPSGGFTKYADSVKG(SEQ ID NO377)，且在CDR3處包含序列VGFYGGFV(SEQ ID NO378)的HC可變域。
抗體092-F08具有在CDR1處包含序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO379)，在CDR2處包含序列KASSLGS(SEQ ID NO380)，且在CDR3處包含序列QQYYSYSQT(SEQID NO381)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYPMH(SEQ ED NO382)，在CDR2處包含序列YIGPSGGWTRYADSVKG(SEQ ID NO383)，且在CDR3處包含序列APSGY(SEQ ID NO384)的HC可變域。
抗體104-B12具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGLYNFVS(SEQ ID NO385)，在CDR2處包含序列DVSRRPS(SEQ ID NO386)，且在CDR3處包含序列SSYAGSNNYV(SEQ ID NO387)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列PYRMS(SEQ ID NO388)，在CDR2處包含序列VISPSGGITEYADSVKG(SEQ ID NO389)，且在CDR3處包含序列HERGSGYYVTPPAGAFDI(SEQ ID NO390)的HC可變域。
抗體109-A11具有在CDR1處包含序列RASQSIANYLN(SEQ ID NO391)，在CDR2處包含序列AASRLHS(SEQ ID NO392)，且在CDR3處包含序列QQSHASPLT(SEQID NO393)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYAMG(SEQ ID NO394)，在CDR2處包含序列RIWPSGGHTQYADSVKG(SEQ ID NO395)，且在CDR3處包含序列GYSSTWGAFDI(SEQ ID NO396)的HC可變域。
抗體131-G03具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO397)，在CDR2處包含序列EVSNRPS(SEQ ID NO398)，且在CDR3處包含序列SSYKRGGTYV(SEQ ID NO399)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYGMG(SEQ ID NO400)，在CDR2處包含序列VIRPSGGTTRYADSVKG(SEQ ID NO401)，且在CDR3處包含序列GGRYYSLDY(SEQ ID NO402)的HC可變域。
抗體135-E10具有在CDR1處包含序列RASQSVTTFLA(SEQ ID NO403)，在CDR2處包含序列GASSRAA(SEQ ID NO404)，且在CDR3處包含序列QQYRFSPPT(SEQID NO405)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列PYNMA(SEQ ID NO406)，在CDR2處包含序列SIWPSGGRTRYADSVKG(SEQ ID NO407)，且在CDR3處包含序列GVRSSGLLERGRVYDAFDI(SEQ ID NO408)的HC可變域。
抗體130-B02具有在CDR1處包含序列RASQSVSGSYLA(SEQ ID NO409)，在CDR2處包含序列GAYSRAT(SEQ ID NO410)，且在CDR3處包含序列QHYGSSPRT(SEQ ID NO411)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYQMH(SEQ ID NO412)，在CDR2處包含序列SIRPSGGRTAYADSVKG(SEQ ID NO413)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO414)的HC可變域。
抗體097-D04具有在CDR1處包含序列RAGQMYYWLA(SEQ ID NO415)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO416)，且在CDR3處包含序列QQAKSFPVT(SEQ ID NO417)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列PYBVIS(SEQ ID NO418)，在CDR2處包含序列SIVSSGGVTLYADSVKG(SEQ ID NO419)，且在CDR3處包含序列NINLRYDILTGYFDI(SEQ ID NO420)的HC可變域。
抗體093-G06具有在CDR1處包含序列SGTSSDVGAYYHVS(SEQ ID NO421)，在CDR2處包含序列EVTNRPS(SEQ ID NO422)，且在CDR3處包含序列SSYTTSNTLV(SEQ ID NO423)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYVMR(SEQ ID NO424)，在CDR2處包含序列SIYPSGGQTRYADSVKG(SEQ ID NO.425)，且在CDR3處包含序列GYSSTWGAFDI(SEQ ID NO426)的HC可變域。
抗體108-E11具有在CDR1處包含序列RASQSVSSNLA(SEQ ID NO.427)，在CDR2處包含序列GASTRAT(SEQ ID NO428)，且在CDR3處包含序列QQNNNWPPSFT(SEQID NO429)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYTML(SEQ ID NO430)，在CDR2處包含序列SIYSSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO431)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO432)的HC可變域。
抗體127-C06具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO433)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO434)，且在CDR3處包含序列QQYGSSRYT(SEQ ID NC-.435)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYTMF(SEQ ID NO436)，在CDR2處包含序列SIYPSGGITRYADSVKG(SEQ ID NO437)，且在CDR3處包含序列VSFWNAFDI(SEQ ID NO438)的HC可變域。
抗體105-B06具有在CDR1處包含序列RASQTISSYLN(SEQ ID NO439)，在CDR2處包含序列TTSSLQS(SEQ ED NO440)，且在CDR3處包含序列QQSHSSPT(SEQ IDNO441)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMY(SEQ ID NO442)，在CDR2處包含序列SIYPSGGFTAYADSVKG(SEQ ID NO443)，且在CDR3處包含序列RGVYGTFDI(SEQ ID NO444)的HC可變域。
抗體107-D01具有在CDR1處包含序列RASQDVRRFLA(SEQ ID NO445)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO446)，且在CDR3處包含序列QQANSFPIT(SEQ ID NO447)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYPMS(SEQ ID NO448)，在CDR2處包含序列YIRSGGYTTYADSVKG(SEQ ID NO449)，且在CDR3處包含序列ERVFCSGGRCGSYFDY(SEQ ID NO450)的HC可變域。
抗體107-F11具有在CDR1處包含序列RASQSVYSSYLA(SEQ ID NO451)，在CDR2處包含序列AASNR(SEQ ID NO452)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPR(SEQID NO453)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYAMF(SEQ ID NO454)，在CDR2處包含序列SISPSGGKTRYADSVKG(SEQ ID NO455)，且在CDR3處包含序列GGGTALDY(SEQ ID NO.456)的HC可變域。
抗體101-E01具有在CDR1處包含序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO.457)，在CDR2處包含序列AASSLRN(SEQ ID NO458)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPPT(SEQ IDNO459)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYWMA(SEQ ID NO460)，在CDR2處包含序列SIGPSGGSTKYADSVKG(SEQ ID NO461)，且在CDR3處包含序列TARWLSFDY(SEQ ID NO462)的HC可變域。
抗體138-E12具有在CDR1處包含序列RASQSVSSNYLA(SEQ ID NO463)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO464)，且在CDR3處包含序列QQFGSSLFT(SEQ ID NO465)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYYML(SEQ ID NO466)，在CDR2處包含序列YIRSSGGSTRYADSVKG(SEQ ID NO467)，且在CDR3處包含序列PTVDGAFDY(SEQ ID NO468)的HC可變域。
抗體109-E08具有在CDR1處包含序列AGTSSDLGGYDYVS(SEQ ID NO469)，在CDR2處包含序列QVGRRPS(SEQ ID NO470)，且在CDR3處包含序列SSYTSSRTRV(SEQ ID NO471)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMD(SEQ ID NO472)，在CDR2處包含序列SIYPSGGWTRYADSVKG(SEQ ID NO473)，且在CDR3處包含序列RGQWLVLDY(SEQ ID NO474)的HC可變域。
抗體104-B03具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGGFNYVS(SEQ ID NO475)，在CDR2處包含序列DVSKRPS(SEQ ID NO476)，且在CDR3處包含序列CSYTGNYTYV(SEQ ID NO477)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYAMA(SEQ ID NO478)，在CDR2處包含序列SIGSSGGVTKYADSVKG(SEQ ID NO479)，且在CDR3處包含序列PRGRYYYDSSGYYYGGVFDY(SEQ ID NO480)的HC可變域。
抗體096-E11具有在CDR1處包含序列RASQGISNYLA(SEQ ID NO481)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ID NO482)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPYT(SEQID NO483)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列QYLMA(SEQ ID NO484)，在CDR2處包含序列SIYPSGGNTNYADSVKG(SEQ ID NO485)，且在CDR3處包含序列DRSIVPYSSSWYMPRDYYYGMDV(SEQ ID NO486)的HC可變域。
抗體103-A03具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO487)，在CDR2處包含序列GAASRAT(SEQ ID NO488)，且在CDR3處包含序列QQYGSSPLIT(SEQ ID NO489)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYPMT(SEQ ID NO490)，在CDR2處包含序列SIRPSGGNTGYADSVKG(SEQ ID NO491)，且在CDR3處包含序列LTGYSSGWFWAYGMDV(SEQ ID NO492)的HC可變域。
抗體099-A09具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO493)，在CDR2處包含序列EVSNRAS(SEQ ID NO494)，且在CDR3處包含序列SSYTSSTTLL(SEQ ID NO495)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYVMA(SEQ ID NO496)，在CDR2處包含序列VIRPSGGKTLYADSVKG(SEQ ID NO497)，且在CDR3處包含序列VAGRVGVPATKKNWFDP(SEQ ID NO498)的HC可變域。
抗體105-F02具有在CDR1處包含序列RASQGISSWLA(SEQ ID NO499)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO.500)，且在CDR3處包含序列QQANSFPLT(SEQ IDNO501)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列PYTMS(SEQ ID NO502)，在CDR2處包含序列GIYPSGGETWYADSVKG(SEQ ID NO503)，且在CDR3處包含序列NINLRYDILTGYFDF(SEQ ID NO504)的HC可變域。
抗體112-C02具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO505)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO506)，且在CDR3處包含序列QQYGSSGWT(SEQ ID NO.507)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列YYRMT(SEQ ID NO508)，在CDR2處包含序列SIYPSGGYTIYADSVKG(SEQ ID NO.509)，且在CDR3處包含序列LGQWLALDH(SEQ ID NO510)的HC可變域。
抗體125-C04具有在CDR1處包含序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO511)，在CDR2處包含序列SKSNRPS(SEQ ID NO-.512)，且在CDR3處包含序列NSRDSSGNHLV(SEQID NO513)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列KYWMA(SEQ ID NO514)，在CDR2處包含序列VIYPSGGQTKYADSVKG(SEQ ID NO515)，且在CDR3處包含序列MRYGDRFDY(SEQ ID NO516)的HC可變域。
抗體122-H04具有在CDR1處包含序列RASQGISSYLA(SEQ ID NO517)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ID NO518)，且在CDR3處包含序列QQLNSYPRT(SEQID NO519)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYWMH(SEQ ID NO520)，在CDR2處包含序列SIGPSGGVTKYADSVKG(SEQ ID NO521)，且在CDR3處包含序列HGSWGGMDV(SEQ ID NO522)的HC可變域。
抗體092-B12具有在CDR1處包含序列TGTTSDVGGYKYVS(SEQ ID NO523)，在CDR2處包含序列EVNHRPS(SEQ ID NO524)，且在CDR3處包含序列YSYTSDSTPYV(SEQ ID NO525)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYAMH(SEQ ID NO526)，在CDR2處包含序列SIWPSGGATFYADSVKG(SEQ ID NO527)，且在CDR3處包含序列SPTLNAFHI(SEQ ID NO528)的HC可變域。
抗體139-A04具有在CDR1處包含序列RASQSISNWLA(SEQ ID NO529)，在CDR2處包含序列KASTLES(SEQ ID NO530)，且在CDR3處包含序列QHYNSYSL(SEQ IDNO531)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYTMV(SEQ ID NO532)，在CDR2處包含序列SIYSSGGRTNYADSVKG(SEQ ID NO533)，且在CDR3處包含序列IVWPSAQFYFYYGMDV(SEQ ID NO534)的HC可變域。
抗體108-C10具有在CDR1處包含序列TGTSNDIGRTNYVS(SEQ ID NO535)，在CDR2處包含序列EVSNRPS(SEQ ID NO536)，且在CDR3處包含序列SSCTTAPVCV(SEQ ID NO537)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列LYAMH(SEQ ID NO538)，在CDR2處包含序列SIRPSGGLTKYADSVKG(SEQ ID NO539)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO540)的HC可變域。
抗體138-B06具有在CDR1處包含序列SGSSSNIGSNYVY(SEQ ID NO541)，在CDR2處包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO542)，且在CDR3處包含序列ATWDNSLSAWV(SEQ ID NO543)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMN(SEQ ID NO544)，在CDR2處包含序列RIYPSGGVTVYADSVKG(SEQ ID NO545)，且在CDR3處包含序列GYGMDV(SEQ ID NO546)的HC可變域。
抗體137-B01具有在CDR1處包含序列RASQSVGNSLA(SEQ ID NO547)，在CDR2處包含序列GASTRAS(SEQ ID NO548)5 and，在CDR3處包含序列QEYNKWPIT(SEQ ID NO.549)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYWMY(SEQ ID NO550)，在CDR2處包含序列VIGSSGGVTKYADSVKG(SEQ ID NO551)，且在CDR3處包含序列GPYRGYFDY(SEQ ID NO552)的HC可變域。
抗體111-B02具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLS(SEQ ID NO553)，在CDR2處包含序列SASNLQS(SEQ ID NO554)，且在CDR3處包含序列QQIYRTPLT(SEQ IDNO555)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYQMM(SEQ ID NO.556)，在CDR2處包含序列SYIRSSGGKTDYADSVKG(SEQ ID NO557)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO558)的HC可變域。
抗體129-B09具有在CDR1處包含序列RASQSVGSDYLA(SEQ ID NO559)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO560)，且在CDR3處包含序列QQYGSSLYT(SEQ ID NO561)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYKMS(SEQ ID NO562)，在CDR2處包含序列GIYPSGGLTQYADSVKG(SEQ ID NO563)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO564)的HC可變域。
抗體099-C12具有在CDR1處包含序列RAGQTINNYLN(SEQ ID NO565)，在CDR2處包含序列AASNLQS(SEQ ID NO566)，且在CDR3處包含序列QQTYRTPFT(SEQ ID NO567)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYKMH(SEQ ID NO568)，在CDR2處包含序列SIWPSGGGTFYADSVKG(SEQ ID NO569)，且在CDR3處包含序列TSGGFGAFDI(SEQ ID NO570)的HC可變域。
抗體099-E11具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO571)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO572)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPRT(SEQ IDNO573)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYYMM(SEQ ID NO.574)，在CDR2處包含序列SIGPSGGMTDYADSVKG(SEQ ID NO.575)，且在CDR3處包含序列GGTASLDY(SEQ ID NO576)的HC可變域。
抗體103-F07具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO577)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO578)，且在CDR3處包含序列QQYGSSSYT(SEQ ID NO579)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMG(SEQ ID NO580)，在CDR2處包含序列SIYPSGGKTTYADSVKG(SEQ ID NO58 1)，且在CDR3處包含序列PSTGSWSAFDI(SEQ ID NO582)的HC可變域。
抗體102-A04具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO583)，在CDR2處包含序列DVSKRPS(SEQ ID NO584)，且在CDR3處包含序列SSYTSSITLVV(SEQ ID NO585)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYAMH(SEQ ID NO586)，在CDR2處包含序列VISPSGGATRYADSVKG(SEQ ID NO587)，且在CDR3處包含序列ASTVTTLFQH(SEQ ID NO588)的HC可變域。
抗體119-B09具有在CDR1處包含序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO589)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ID NO590)，且在CDR3處包含序列QKYNSAPLT(SEQID NO591)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYHMQ(SEQ ID NO592)，在CDR2處包含序列SIYPSGGFTRYADSVKG(SEQ ID NO593)，且在CDR3處包含序列DGGQGG(SEQ ID NO594)的HC可變域。
抗體097-E07具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO595)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO596)，且在CDR3處包含序列QQTFSTWT(SEQ IDNO597)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMG(SEQ ID NO598)，在CDR2處包含序列SIWPSGGHTSYADSVKG(SEQ ID NO599)，且在CDR3處包含序列HYGMDV(SEQ ID NO600)的HC可變域。
抗體117-A12具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO601)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO602)，且在CDR3處包含序列QQYNNWPPLT(SEQ ID NO603)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYMMY(SEQ ID NO604)，在CDR2處包含序列SIYPSGGKTLYADSVKG(SEQ ID NO605)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO606)的HC可變域。
抗體126-C10具有在CDR1處包含序列RASHNIYTSLN(SEQ ID NO607)，在CDR2處包含序列GASTLEN(SEQ ID NO608)，且在CDR3處包含序列QQSYTSVT(SEQ IDNO609)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列FYSMM(SEQ ID NO610)，在CDR2處包含序列GISSSGGTTKYADSVKG(SEQ ID NO611)，且在CDR3處包含序列GGTNYDYVWGSYRSHYYYYGMDV(SEQ ID NO612)的HC可變域。
抗體127-D05具有在CDR1處包含序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO613)，在CDR2處包含序列TASSLES(SEQ ID NO614)，且在CDR3處包含序列QQYNSYSLT(SEQ IDNO615)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYKMQ(SEQ ID NO616)，在CDR2處包含序列SIYSSGGKTVYADSVKG(SEQ ID NO617)，且在CDR3處包含序列TPGYNYFDY(SEQ ID NO618)的HC可變域。
抗體126-B12具有在CDR1處包含序列RASQTFNNYLN(SEQ ID NO619)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ID NO620)，且在CDR3處包含序列QQANSFPFT(SEQ ID NO621)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMF(SEQ ID NO622)，在CDR2處包含序列SIWPSGGNTKYADSVKG(SEQ ID NO623)，且在CDR3處包含序列PAYYYAMDV(SEQ ID NO624)的HC可變域。
抗體122-G06具有在CDR1處包含序列RASQTVGGSYLA(SEQ ID NO625)，在CDR2處包含序列AASNRAP(SEQ ID NO626)，且在CDR3處包含序列QQYGSSMYT(SEQ ID NO627)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYQMS(SEQ ID NO628)，在CDR2處包含序列SIYPSGGATKYADSVKG(SEQ ID NO629)，且在CDR3處包含序列MGLHHSFDY(SEQ ID NO630)的HC可變域。
抗體107-D05具有在CDR1處包含序列RASQGISSWLA(SEQ ID NO63 1)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO632)，且在CDR3處包含序列QQANSFPLT(SEQ IDNO633)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYWMR(SEQ ID NO634)，在CDR2處包含序列SIGSSGGMTKYADSVKG(SEQ ID NC-.635)，且在CDR3處包含序列ALRWRAFDI(SEQ ID NO636)的HC可變域。
抗體127-H05具有在CDR1處包含序列TGTNTDVGGYNYVS(SEQ ID NO637)，在CDR2處包含序列EVNHRPS(SEQ ID NO638)，且在CDR3處包含序列SSYTYRNTYV(SEQ ID NO639)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYTMG(SEQ ID NO640)，在CDR2處包含序列VIYPSGGMTKYADSVKG(SEQ ID NO641)，且在CDR3處包含序列TSGGTPWGF(SEQ ID NO642)的HC可變域。
抗體112-C12具有在CDR1處包含序列RASQTVSSNYLA(SEQ ID NO643)，在CDR2處包含序列GVSNRAA(SEQ ID NO644)，且在CDR3處包含序列QHYGSSAFT(SEQ ID NO645)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYMS(SEQ ID NO646)，在CDR2處包含序列SIWPSGGHTRYADSVKG(SEQ ID NO647)，且在CDR3處包含序列AGSYYAGDY(SEQ ID NO648)的HC可變域。
抗體098-C10具有在CDR1處包含序列RASQDVLVSFA(SEQ ID NO649)，在CDR2處包含序列AASHLHP(SEQ ID NO650)，且在CDR3處包含序列QQARSFPHT(SEQID NO.651)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYSMT(SEQ ID NO652)，在CDR2處包含序列SISPSGGATKYADSVKG(SEQ ID NO653)，且在CDR3處包含序列GGAASLPFDY(SEQ ID NO654)的HC可變域。
抗體095-H10具有在CDR1處包含序列FGDKLGDKYGS(SEQ ID NO655)，在CDR2處包含序列QYWKRPS(SEQ ID NO656)，且在CDR3處包含序列QAWDSNTVV(SEQ ID NO657)的LC可變域。其具有在CDR1處the.sequence NYKMH(SEQ ID NO658)，在CDR2處包含序列SIYPSGGWTVYADSVKG(SEQ ID NO659)，且在CDR3處包含序列GYSSTWGAFDI(SEQ ID NO660)的HC可變域。
抗體117-C04具有在CDR1處包含序列RASQYISTYLA(SEQ ID NO661)，在CDR2處包含序列KASDLES(SEQ ID NO662)，且在CDR3處包含序列QQYNTYWT(SEQID NO663)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列FYVMG(SEQ ID NO664)，在CDR2處包含序列WIGPSGGRTWYADSVKG(SEQ ID NO.665)，且在CDR3處包含序列DRGWYGIDV(SEQ ID NO666)的HC可變域。
抗體094-F03具有在CDR1處包含序列SGNILDNSYAS(SEQ ID NO667)，在CDR2處包含序列RDNKRPS(SEQ ID NO668)，且在CDR3處包含序列QAWDRTGV(SEQID NO669)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYNMY(SEQ ID NO670)，在CDR2處包含序列YIVPSGGATHYADSVKG(SEQ ID NO671)，且在CDR3處包含序列ALRGYSYGPRGYYYYGMDV(SEQ ID NO.672)的HC可變域。
抗體124-G12具有在CDR1處包含序列SPSGGGLRNKYVS(SEQ ID NO673)，在CDR2處包含序列KDAERPS(SEQ ID NO674)，且在CDR3處包含序列LAWDSTTRV(SEQ ID NO675)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYKMN(SEQ ID NO676)，在CDR2處包含序列YIGSSGGKTGYADSVKG(SEQ ID NO677)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO678)的HC可變域。
抗體131-A03具有在CDR1處包含序列RASQSISNWLA(SEQ ID NO.679)，在CDR2處包含序列KASTLQT(SEQ ID NO680)，且在CDR3處包含序列QQTYSAPFN(SEQID NO681)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYNMH(SEQ ID NO682)，在CDR2處包含序列VIYPSGGYTVYADSVKG(SEQ ID NO683)，且在CDR3處包含序列RGNWGGIDY(SEQ ID NO684)的HC可變域。
抗體099-D05具有在CDR1處包含序列RTSQTVSTFLN(SEQ ID NO685)，在CDR2處包含序列AASRLQS(SEQ ID NO686)，且在CDR3處包含序列QQSFTSPRT(SEQ IDNO.687)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYVMH(SEQ ID NO688)，在CDR2處包含序列YISPSGGVTKYADSVKG(SEQ ID NO.689)，且在CDR3處包含序列ALYPGMGYYYGMDV(SEQ ID NO690)的HC可變域。
抗體131-C08具有在CDR1處包含序列RPSQSVYSNYLA(SEQ ID NO691)，在CDR2處包含序列GASTRAT(SEQ ID NO692)，且在CDR3處包含序列QQYGNSYT(SEQ ID NO693)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYNMT(SEQ ID NO694)，在CDR2處包含序列SIWPSGGATRYADSVKG(SEQ ID NO695)，且在CDR3處包含序列TSRFYGMDV(SEQ ID NO696)的HC可變域。
抗體116-C09具有在CDR1處包含序列RASQSVNIDVG(SEQ ID NO697)，在CDR2處包含序列DASKRAT(SEQ ID NO698)，且在CDR3處包含序列QQRARWLT(SEQ IDNO699)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYFMN(SEQ ID NO700)，在CDR2處包含序列SIGSSGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO701)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO702)的HC可變域。
抗體128-F11具有在CDR1處包含序列RASQDIRTWLA(SEQ ID NO.703)，在CDR2處包含序列SSSSLQS(SEQ ID NO704)，且在CDR3處包含序列QQATTFPWT(SEQ IDNO705)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYIMH(SEQ ID NO706)，在CDR2處包含序列GIYPSGGSTKYADSVKG(SEQ ID NO707)，且在CDR3處包含序列ALVGALDY(SEQ ID NO708)的HC可變域。
抗體131-D12具有在CDR1處包含序列RASQGISNYLA(SEQ ID NO709)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ED NO710)，且在CDR3處包含序列EQLNSFPHA(SEQ IDNO711)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYTME(SEQ ED NO712)，在CDR2處包含序列VERPSGGTTMYADSVKG(SEQ ID NO713)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO714)的HC可變域。
抗體128-A06具有在CDR1處包含序列RASQSVSRWLA(SEQ ID NO715)，在CDR2處包含序列KASTLES(SEQ ED NO716)，且在CDR3處包含序列QQYGA(SEQID NO717)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYTMQ(SEQ ID NO718)，在CDR2處包含序列SIYPSGGATKYADSVKG(SEQ ID NO719)，且在CDR3處包含序列SGYYYGLDV(SEQ ED NO720)的HC可變域。
抗體095-G09具有在CDR1處包含序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO721)，在CDR2處包含序列DASNRAT(SEQ ID NO722)，且在CDR3處包含序列QQRSN(SEQ ID NO723)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYTMW(SEQ ED NO724)，在CDR2處包含序列RTWPSGGTTRYADSVKG(SEQ ID NO725)，且在CDR3處包含序列GGSYLAFDI(SEQ ID NO726)的HC可變域。
抗體137-G10具有在CDR1處包含序列QGDSLRNYHPS(SEQ ED NO727)，在CDR2處包含序列FGRNNRPS(SEQ ED NO728)，且在CDR3處包含序列SSRDGSGNFL(SEQ ED NO729)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYTMM(SEQ ID NO730)，在CDR2處包含序列GIYPSGGQTAYADSVKG(SEQ ID NO731)，且在CDR3處包含序列GGSWYAFDI(SEQ ID NO732)的HC可變域。
抗體106-E12具有在CDR1處包含序列RASQSISSFLN(SEQ ID NO733)，在CDR2處包含序列YAASSLQS(SEQ ID NO734)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPYT(SEQID NO735)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYSMT(SEQ ID NO736)，在CDR2處包含序列SISPSGGATKYADSVKG(SEQ ID NO737)，且在CDR3處包含序列GGAASLPFDY(SEQ ID NO738)的HC可變域。
抗體124-H10具有在CDR1處包含序列RASQSVGGYLA(SEQ ID NO739)，在CDR2處包含序列DASKRAT(SEQ ID NO740)，且在CDR3處包含序列QQRSKWPPYT(SEQ ID NO741)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYKMM(SEQ ID NO742)，在CDR2處包含序列YIYPSGGWTGYADSVKG(SEQ ID NO743)，且在CDR3處包含序列VGPWDAFDI(SEQ ID NO744)的HC可變域。
抗體122-D01具有在CDR1處包含序列RASESVSSSYFA(SEQ ID NO745)，在CDR2處包含序列GASRRVT(SEQ ID NO746)，且在CDR3處包含序列QQYGGSPRS(SEQ ID NO747)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYMME(SEQ IDNO-.748)，在CDR2處包含序列GISPSGGTTKYADSVKG(SEQ ID NO749)，且在CDR3處包含序列GGYNNYYYALDV(SEQ ID NO750)的HC可變域。
抗體093-C10具有在CDR1處包含序列TGTGSNIDGYNYVS(SEQ ID NO751)，在CDR2處包含序列DVGKRPS(SEQ ID NO752)，且在CDR3處包含序列CSYAGSYSYV(SEQ ID NO753)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYLMW(SEQ ID NO754)，在CDR2處包含序列VIGPSGGWTRYADSVKG(SEQ ID NO755)，且在CDR3處包含序列HPGDY(SEQ ID NO756)的HC可變域。
抗體106-C06具有在CDR1處包含序列SGTSSDVGAYYHVS(SEQ ID NO757)，在CDR2處包含序列DVSNRPS(SEQ ID NO.758)，且在CDR3處包含序列SLYIGTSTPWV(SEQ ID NO759)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYRMD(SEQ ID NO760)，在CDR2處包含序列GIYPSGGHTNYADSVKG(SEQ ID NO761)，且在CDR3處包含序列DRGWYGADY(SEQ ID NO762)的HC可變域。
抗體117-B07具有在CDR1處包含序列TGTTRDVGAYKYVS(SEQ ID NO763)，在CDR2處包含序列DVSKRPS(SEQ ID NO764)，且在CDR3處包含序列CSFAGSYTWI(SEQ ID NO765)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYWMV(SEQ ID NO766)，在CDR2處包含序列WIGPSGGGTVYADSVKG(SEQ ID NO.767)，且在CDR3處包含序列GNGGFDS(SEQ ID NO768)的HC可變域。
抗體126-H09具有在CDR1處包含序列SGSRSNIGTNPVN(SEQ ID NO769)，在CDR2處包含序列VNNQRPS(SEQ ID NO770)，且在CDR3處包含序列ATWDGSLNGPV(SEQ ID NO771)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列SYAMT(SEQ ID NO772)，在CDR2處包含序列SISSSGGDTAYADSVKG(SEQ ID NO773)，且在CDR3處包含序列ERHYIWGSYRYSWFDP(SEQ ID NO774)的HC可變域。
抗體093-G09具有在CDR1處包含序列SGSSSNIGSNNVN(SEQ ID NO775)，在CDR2處包含序列SNDQRPS(SEQ ID NO776)，且在CDR3處包含序列AAWDDSLNGPV(SEQ ID NO.777)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMV(SEQ ID NO778)，在CDR2處包含序列GIVPSGGYTMYADSVKG(SEQ ID NO779)，且在CDR3處包含序列ASYSSFGLDY(SEQ ID NO780)的HC可變域。
抗體114-E02具有在CDR1處包含序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO781)，在CDR2處包含序列KASSLES(SEQ ID NO782)，且在CDR3處包含序列QQYNSYPVT(SEQID NO783)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列FYPMS(SEQ ID NO.784)，在CDR2處包含序列YIWPSGGATRYADSVKG(SEQ ID NO785)，且在CDR3處包含序列GNGGFDS(SEQ ID NO786)的HC可變域。
抗體102-G11具有在CDR1處包含序列TGTSSDIGAYPFVS(SEQ ID NO787)，在CDR2處包含序列GVTTRPF(SEQ ID NO788)，且在CDR3處包含序列SSYAGGRNLPYV(SEQ ID NO789)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYYMA(SEQ ID NO790)，在CDR2處包含序列YISPSGGSTKYADSVKG(SEQ ID NO791)，且在CDR3處包含序列GGGTGTFDI(SEQ ID NO792)的HC可變域。
抗體132-C01具有在CDR1處包含序列RASQSISRWLA(SEQ ID NO793)，在CDR2處包含序列EASTLES(SEQ ID NO794)，且在CDR3處包含序列QQYNSYPLT(SEQ IDNO795)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYPMH(SEQ ID NO796)，在CDR2處包含序列SIWPSGGHTSYADSVKG(SEQ ID NO797)，且在CDR3處包含序列LSQPI(SEQ ID NO798)的HC可變域。
抗體123-E02具有在CDR1處包含序列RASQSVSNFLA(SEQ ID NO799)，在CDR2處包含序列GASNRAT(SEQ ID NO800)，且在CDR3處包含序列QQANSFPLT(SEQID NO801)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列MYRMF(SEQ ID NO802)，在CDR2處包含序列VIGPSGGQTAYADSVKG(SEQ ID NO803)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO804)的HC可變域。
抗體096-D03具有在CDR1處包含序列TGTSGEVANYNYVS(SEQ ID NO805)，在CDR2處包含序列DVSRRPS(SEQ ID NO806)，且在CDR3處包含序列ASYVGNDKLV(SEQ ID NO-.807)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYGMN(SEQ ID NO808)，在CDR2處包含序列SIWSSGGYTTYADSVKG(SEQ ID NO809)，且在CDR3處包含序列VGIWYSMDV(SEQ ID NO810)的HC可變域。
抗體131-G06具有在CDR1處包含序列RASQSINSYLN(SEQ ID NO811)，在CDR2處包含序列AASSLQN(SEQ ID NO812)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPLT(SEQID NO813)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYTMF(SEQ ID NO814)，在CDR2處包含序列GIYPSGGKTIYADSVKG(SEQ ID NO815)，且在CDR3處包含序列GGVFGVVDY(SEQ ID NO816)的HC可變域。
抗體094-D08具有在CDR1處包含序列RASQGISNYLA(SEQ ID NO817)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ID NO818)，且在CDR3處包含序列QKYNSAPLT(SEQID NO819)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYPMD(SEQ ID NO820)，在CDR2處包含序列RIYPSGGATKYADSVKG(SEQ ID NO.821)，且在CDR3處包含序列GGGAFDI(SEQ ID NO822)的HC可變域。
抗體128-E07具有在CDR1處包含序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO823)，在CDR2處包含序列DASNRAT(SEQ ID NO824)，且在CDR3處包含序列QQRSNWLT(SEQ IDNO825)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYEMA(SEQ ID NO826)，在CDR2處包含序列SVIYPSGGATRYADSVKG(SEQ ID NO827)，且在CDR3處包含序列VAQYYGMDV(SEQ ID NO828)的HC可變域。
抗體114-F04具有在CDR1處包含序列RASQSVSSNYLA(SEQ ID NO829)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO830)，且在CDR3處包含序列QQRWT(SEQID NO831)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYTMQ(SEQ ID NO832)，在CDR2處包含序列RIYSSGGGTYYADSVKG(SEQ ID NO.833)，且在CDR3處包含序列VGPWGAFDI(SEQ ID NO834)的HC可變域。
抗體122-A05具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO835)，在CDR2處包含序列EVSNRPS(SEQ ID NO836)，且在CDR3處包含序列SSYTSSSTWV(SEQ ID NO837)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMV(SEQ ID NO838)，在CDR2處包含序列SIYPSGGMTVYADSVKG(SEQ ID NO839)，且在CDR3處包含序列RGIANSFNI(SEQ ID NO840)的HC可變域。
抗體102-H02具有在CDR1處包含序列RASQSISRYLN(SEQ ID NO841)，在CDR2處包含序列AASNLQS(SEQ ID NO842)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPWT(SEQID NO843)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列KYYMV(SEQ ID NO844)，在CDR2處包含序列VIGPSGGWTTYADSVKG(SEQ ID NO845)，且在CDR3處包含序列VDYSNYFDY(SEQ ID NO846)的HC可變域。
抗體092-G06具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO847)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO848)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPWT(SEQID NO849)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列SYMI(SEQ ID NO850)，在CDR2處包含序列YIRPSGGYTKYADSVKG(SEQ ID NO851)，且在CDR3處包含序列VINAGPGRGYYWRGYSYSDAFDI(SEQ ID NO852)的HC可變域。
抗體113-E03具有在CDR1處包含序列RASQGIGTHLN(SEQ ID NO853)，在CDR2處包含序列AASGLQS(SEQ ID NO854)，且在CDR3處包含序列QQSYSVPRT(SEQID NO855)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYPMV(SEQ ID NO856)，在CDR2處包含序列VIGPSGGKTKYADSVKG(SEQ ID NO857)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO858)的HC可變域。
抗體118-E07具有在CDR1處包含序列TGTSSDVGAYNYVS(SEQ ID NO859)，在CDR2處包含序列EVSNRPS(SEQ ID NO860)，且在CDR3處包含序列NSYTTSATLV(SEQ ID NO861)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMM(SEQ ID NO862)，在CDR2處包含序列SIRSSGGITRYADSVKG(SEQ ID NO.863)，且在CDR3處包含序列VGYYYGMDV(SEQ ID NO.864)的HC可變域。
抗體093-E11具有在CDR1處包含序列RASQSITGYLN(SEQ ID NO865)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO866)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPYT(SEQID NO867)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYPMY(SEQ ID NO868)，在CDR2處包含序列RIGPSGGHTDYADSVKG(SEQ ID NO869)，且在CDR3處包含序列AGVWSGLDY(SEQ ID NO.870)的HC可變域。
抗體124-C12具有在CDR1處包含序列RASQGISNYLA(SEQ ID NO871)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ID NO872)，且在CDR3處包含序列QKYNSAPWT(SEQID NO873)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMG(SEQ ID NO874)，在CDR2處包含序列VIWPSGGITKYADSVKG(SEQ ID NO875)，且在CDR3處包含序列GNGGFDS(SEQ ID NO.876)的HC可變域。
抗體115-F08具有在CDR1處包含序列TGTNTDVGGYNFVS(SEQ ID NO877)，在CDR2處包含序列DVTNRPS(SEQ ID NO878)，且在CDR3處包含序列SSYTSSSTWV(SEQ ID NO879)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYSML(SEQ ID NO880)，在CDR2處包含序列SIRPSGGFTKYADSVKG(SEQ ID NO881)，且在CDR3處包含序列RGVWDAFDI(SEQ ID NO882)的HC可變域。
抗體121-H07具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO883)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO884)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPRT(SEQ IDNO885)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYAMG(SEQ ID NO886)，在CDR2處包含序列YIGPSGGNTTYADSVKG(SEQ ID NO.887)，且在CDR3處包含序列DVGGSGSYYMLSYYYYGMDV(SEQ ID NO888)的HC可變域。
抗體136-B06具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO889)，在CDR2處包含序列AASTRAT(SEQ ID NO890)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPWT(SEQ ID NO891)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYPMG(SEQ ID NO892)，在CDR2處包含序列SIYPSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO893)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO894)的HC可變域。
抗體097-F08具有在CDR1處包含序列SGDDLGGRHVS(SEQ ID NO895)，在CDR2處包含序列QDDKRPS(SEQ ID NO896)，且在CDR3處包含序列LAWHNYKYV(SEQ ID NO897)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYLMG(SEQ ID NO898)，在CDR2處包含序列SIGPSGGYTKYADSVKG(SEQ ID NO899)，且在CDR3處包含序列GTGTTFF(SEQ ID NO900)的HC可變域。
抗體107-B05具有在CDR1處包含序列RASQSISSYLN(SEQ ID NO901)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO902)，且在CDR3處包含序列QQSYSTLVT(SEQID NO903)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYMMQ(SEQ ID NO904)，在CDR2處包含序列GIGPSGGWTKYADSVKG(SEQ ID NO905)，且在CDR3處包含序列LNYGDYV(SEQ ID NO906)的HC可變域。
抗體124-A01具有在CDR1處包含序列RASQGISSSLA(SEQ ID NO907)，在CDR2處包含序列AASTLQS(SEQ ID NO908)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPWT(SEQID NO909)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYLMH(SEQ ID NO.910)，在CDR2處包含序列SIYPSGGKTQYADSVKG(SEQ ID NO911)，且在CDR3處包含序列 VFGYYDFWSGYPGAFDY(SEQ ID NO912)的HC可變域。
抗體102-C12具有在CDR1處包含序列GGNNIGSKNVH(SEQ ID NO913)，在CDR2處包含序列RDSNRPS(SEQ ID NO914)，且在CDR3處包含序列QVWDSSTV(SEQ ID NO915)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYVMV(SEQ ID NO916)，在CDR2處包含序列GIRSSGGVTAYADSVKG(SEQ ID NO917)，且在CDR3處包含序列VGVWYGMDV(SEQ ID NO918)的HC可變域。
抗體103-E09具有在CDR1處包含序列RASQTVSSTYLA(SEQ ID NO.919)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO920)，且在CDR3處包含序列QQYGSSPPRYT(SEQ ID NO921)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYRMV(SEQ ID NO922)，在CDR2處包含序列SIYPSGGYTKYADSVKG(SEQ ID NO923)，且在CDR3處包含序列VITYNNFDS(SEQ ID NO924)的HC可變域。
抗體13 1-F12具有在CDR1處包含序列RASLSVSGYLN(SEQ ID NO925)，在CDR2處包含序列ATSSLQS(SEQ ID NO926)，且在CDR3處包含序列QQSYSSPYT(SEQ IDNO927)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYAMF(SEQ ID NO928)，在CDR2處包含序列SIWPSGGKTMYADSVKG(SEQ ID NO.929)，且在CDR3處包含序列GGSYLAFDI(SEQ ID NO930)的HC可變域。
抗體093-C08具有在CDR1處包含序列LASQSISSYLN(SEQ ID NO931)，在CDR2處包含序列DASSLES(SEQ ID NO932)，且在CDR3處包含序列QQFNGYPPIT(SEQID NO933)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYPMI(SEQ ID NO934)，在CDR2處包含序列VIYPSGGMTKYADSVKG(SEQ ID NO935)，且在CDR3處包含序列VGSYGSLGY(SEQ ID NO936)的HC可變域。
抗體115-F04具有在CDR1處包含序列GASQSVSTTYIA(SEQ ID NO937)，在CDR2處包含序列GASNRAT(SEQ ID NO938)，且在CDR3處包含序列QQYGSSPYT(SEQ ID NO939)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列RYWMW(SEQ ID NO940)，在CDR2處包含序列SIGPSGGATRYADSVKG(SEQ ID NO941)，且在CDR3處包含序列GSAGN(SEQ ID NO942)的HC可變域。
抗體113-G11具有在CDR1處包含序列RASQSIDTYLN(SEQ ID NO943)，在CDR2處包含序列AASKLED(SEQ ID NO944)，且在CDR3處包含序列QPYNTYPIT(SEQID NO945)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYGMY(SEQ ID NO946)，在CDR2處包含序列SIYPSGGWTNYADSVKG(SEQ ID NO947)，且在CDR3處包含序列RGSWGAFDI(SEQ ID NO948)的HC可變域。
抗體102-C02具有在CDR1處包含序列RASQSVSNSYLA(SEQ ID NO949)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO950)，且在CDR3處包含序列QQFGSSTGYT(SEQ ID NO951)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列YYMMG(SEQ ID NO952)，在CDR2處包含序列SIYTSGGYTKYADSVKG(SEQ ID NO953)，且在CDR3處包含序列ASIYYGMDV(SEQ ID NO.954)的HC可變域。
抗體112-D04具有在CDR1處包含序列RASQGISSWLA(SEQ ID NO955)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO956)，且在CDR3處包含序列QQANSFPYT(SEQID NC-.957)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列YYLMG(SEQ ID NO958)，在CDR2處包含序列SIGPSGGTTKYADSVKG(SEQ ID NO959)，且在CDR3處包含序列RGLGAAFDY(SEQ ID NO960)的HC可變域。
抗體108-E10具有在CDR1處包含序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO961)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO962)，且在CDR3處包含序列QQYGSSSFT(SEQ ID NO963)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列HYMM(SEQ ID NO964)，在CDR2處包含序列SIYPSGGSTIYADSVKG(SEQ ID NO.965)，且在CDR3處包含序列ATEGYYYGMDV(SEQ ID NO966)的HC可變域。
抗體104-D12具有在CDR1處包含序列RASQGIRSWLA(SEQ ID NO967)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO968)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPWT(SEQ ID NO969)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYRMA(SEQ ID NO970)，在CDR2處包含序列YIGPSGGSTSYADSVKG(SEQ ID NO.971)，且在CDR3處包含序列VGTFYGMDV(SEQ ID NO972)的HC可變域。
抗體116-E08具有在CDR1處包含序列RASQTISSYLN(SEQ ID NO973)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO974)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPMYT(SEQID NO975)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYLMG(SEQ ID NO976)，在CDR2處包含序列VIGPSGGLTKYADSVKG(SEQ ID NO.977)，且在CDR3處包含序列FRGYYGMDV(SEQ ID NO978)的HC可變域。
抗體102-D07具有在CDR1處包含序列RASQSVRKNVA(SEQ ID NO979)，在CDR2處包含序列GASTRAT(SEQ ID NO980)，且在CDR3處包含序列QQYSSWPA(SEQ ID NO.981)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYLMY(SEQ ID NO982)，在CDR2處包含序列SIRPSGGNTLYADSVKG(SEQ ID NO983)，且在CDR3處包含序列GRGILTGYYWGYYYYMDV(SEQ ID NO984)的HC可變域。
抗體103-H07具有在CDR1處包含序列RASQSISSSYLA(SEQ ID NO985)，在CDR2處包含序列HASSRAT(SEQ ID NO986)，且在CDR3處包含序列QQRNNWPPSFT(SEQ ID NO987)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列LYLME(SEQ ID NO988)，在CDR2處包含序列SIGSSGGATWYADSVKG(SEQ ID NO989)，且在CDR3處包含序列DTSRVAGTRLRNYYYYYGMDV(SEQ ID NO990)的HC可變域。
抗體116-A08具有在CDR1處包含序列RASQSIGTLLN(SEQ ID NO991)，在CDR2處包含序列GASNLRG(SEQ ID NO992)，且在CDR3處包含序列QHDT(SEQ ID NO993)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYRMH(SEQ ID NO994)，在CDR2處包含序列SIWPSGGKTHYADSVKG(SEQ ID NO995)，且在CDR3處包含序列ALQYGSGSYFYAPKSYYYYGMDV(SEQ ID NO996)的HC可變域。
抗體106-D06具有在CDR1處包含序列RASQTISRYLN(SEQ ID NO997)，在CDR2處包含序列AASSLQS(SEQ ID NO998)，且在CDR3處包含序列QQSYSAPRT(SEQID NO999)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列KYKMG(SEQ ID NO.1000)，在CDR2處包含序列YIRPSGGMTFYADSVKG(SEQ ID NO1001)，且在CDR3處包含序列EHYQASYSSSAWFRMVPAGAFDI(SEQ ID NO1002)的HC可變域。
抗體113-D05具有在CDR1處包含序列RASQGIRRALA(SEQ ID NO1003)，在CDR2處包含序列DASSLES(SEQ ID NO.1004)，且在CDR3處包含序列QQSYSTPPWT(SEQ ID NO1005)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列YYKMH(SEQ ID NO1006)，在CDR2處包含序列VIYPSGGKTTYADSVKG(SEQ ID NO1007)，且在CDR3處包含序列EHYQASYSSSAWFRMVPAGAFDI(SEQ ID NO1008)的HC可變域。
抗體110-D06具有在CDR1處包含序列RASQSWSNFLA(SEQ ID NO.1009)，在CDR2處包含序列GASSRAT(SEQ ID NO1010)，且在CDR3處包含序列QQYGSSPYS(SEQ ID NO1011)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列NYVMY(SEQ ID NO1012)，在CDR2處包含序列GIGPSGGFTTYADSVKG(SEQ ID NO1013)，且在CDR3處包含序列DRYFGSGYYMAAYYYYGMDV(SEQ ID NO1014)的HC可變域。
抗體124-C04具有在CDR1處包含序列RASQRVSSTFLA(SEQ ID NO1015)，在CDR2處包含序列GTSSRAT(SEQ ID NO1016)，且在CDR3處包含序列HQYGSSPRT(SEQ ID NO.1017)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列WYAMM(SEQ ID NO1018)，在CDR2處包含序列SIWPSGGHTKYADSVKG(SEQ ID NO.1019)，且在CDR3處包含序列DQGYF(SEQ ID NO1020)的HC可變域。
抗體097-B12具有在CDR1處包含序列RASQPISTSLA(SEQ ID NO1380)，在CDR2處包含序列KASILET(SEQ ID NO1381)，且在CDR3處包含序列QQYASPSYT(SEQID NO1382)的LC可變域。其具有在CDR1處包含序列KYVMW(SEQ ID NO1383)，在CDR2處包含序列SIVSSGGRTSYADSVKG(SEQ ID NO1384)，且在CDR3處包含序列AYDYVWGSYRYKGRPVGAFDI(SEQ ID NO1385)的HC可變域?？梢娝隹贵w抑制mK1與hK1。
一些本文描述的例示性抗體具有序列內(nèi)在關(guān)系。共享LC、HC CDR3或HC CDR1和HC CDR2的兩個(gè)抗體可能與hK1上大致相同的位點(diǎn)結(jié)合。共有的HC CDR3尤其指示共享結(jié)合位點(diǎn)。因此，共享序列指定區(qū)域的兩個(gè)抗體的抑制性質(zhì)可能類似。具體而言，若一個(gè)抗體為hK1的抑制劑，則任何共享所述第一抗體的序列的抗體有可能也為抑制劑。舉例而言M0098-G05與M0097-G07具有一致的HC可變域，但其LC可變域不同。
M0103-A01與M0096-D09具有一致的HC可變域，但其LC可變域不同。
M0114-D02與M0097-G01具有一致的HC可變域，但其LC可變域不同。
M0117-F08與M0102-G12具有一致的HC可變域，但其LC可變域不同。已知M0102-G12抑制hK1。
M0131-C08與M0093-G09具有一致的HC可變域，但其LC可變域不同。
M0131-C09與M0096-D09具有一致的HC可變域，但其LC可變域不同。
M0131-F07與M0102-G12具有一致的HC可變域，但其LC可變域不同。已知M0131-F07與M0102-G12抑制hK1。
M0131-G03與M0098-H04具有一致的LC可變域。
M0133-E08與M0102-G12具有一致的LC可變域。已知M0102-G12抑制hK1。
M0136-A07與M0096-D09具有一致的HC可變域，但其LC可變域不同。
M0138-B04與M0102-G12具有一致的HC可變域，但其LC可變域不同。已知M0102-G12抑制hK1。
M0138-G11與M0133-E02具有一致的LC可變域。
下列HC可變域具有相同的CDR3序列(VGVWYGMDV)M0092-F08、M0093-C08、M0093-C10、14(M0095-A11、M0097-E07、M0097-F08、M0102-H02、M0103-F07、M0104-H12、M0107-F11、M0109-E08、M0110-D11、M0111-C10、M0112-C12、M0112-D04、M0114-G09、M0117-A12、M0124-H10、M0128-A06、M0130-B02、M0131-B05、M0131-F09、M0135-B05、M0135-F03、M0136-E12、M0138-E02、M0139-F09)。
M0096-D03、M0102-C12、M0126-F11和M0128-E07的HC可變域共享cdr3＝GNGGFDS。M0097-D04與M0134-D07的HC可變域共享cdr3＝RGPVYYYDSSGSHSAFDI。
M0097-G07與M0139-C02的HC可變域共享cdr3＝EHYQASYSSSAWFRMVPAGAFDI。M0101-E01與1M0136-D07的HC可變域共享cdr3＝NINLRYDILLTTLTGYFDI。M0102-G12與 M0110-G01的HC可變域共享cdr3＝DITPGGGSGFRLPKNYYYYGMDV。M0102-G12抑制hK1。M0102-G12與M0133-E08的HC可變域共享cdr3＝DITPGGGSGFRLPKNYYYYGMDV。M0102-G12抑制hK1。其LC可變域相同。M0102-G12與M0139-F04的HC可變域共享cdr3＝DITPGGGSGFRLPKNYYYYGMDV；M0139-F04與M0102-G12抑制hK1。其LC可變域不同。M0104-D12與M0117-B07的HC可變域共享cdr3＝GGSYLAFDI，LC不同。M0105-B06與M0116-C09共享cdr3＝GYSSTWGAFDI。M0105-B06與M0138-E12共享cdr3＝GYSSTWGAFDI。M0133-E02與M0138-G11共享cdr3＝DTRVGPWLVRAPLDY。
M0102-G12與M0133-E08共享HC CDR1＝KyKmV(SEQ ID NO10)和HC CDR2＝SiYPsggItAyadsvkg(SEQ ID NO11)。M0102-G12抑制hK1。M0107-D12與M0110-G01共享HC CDR1＝MyKmG和HC CDR2＝SiVPsggKtQyadsvkg。M0133-E02與M0138-G11共享HC CDR1＝WyTmT和HC CDR2＝SiYPsggHtSyadsvkg。
具有至少一個(gè)與所鑒別hK1抑制劑一樣的CDR的例示性抗體的序列有可能也為抑制劑。
M0103-A03在第96位處不具有C。
M0107-D12含有終止子。
M0107-D12在FR4的起始處不具有WG主結(jié)構(gòu)(motif)。
如下為例示性HC可變域的序列和所述可變域的C末端的序列(例如，延伸至CH1的末端)。
＞HC-092-B12-CH1(SEQ ID NO1370)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYLMAWVRQA PGKGLEWVSSIYPSGGNTNY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDRSIVPYSSSWY MPRDYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSC在真核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)具有適當(dāng)折疊的VL-輕鏈恒定域與VH-CH1的組合產(chǎn)生Fab。Fab為單體的且通常具有約50 kDa的分子質(zhì)量。
下列序列例證延伸至人類IgG1的CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3的HC可變域＞HC-093-C10-CH1-H-CH2-CH3 (SEQID NO1371)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMEWVRQA PGKGLEWVSVIRPSGGTTMY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARVGVWYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK包括VH::CH1::鉸鏈區(qū)::CH2::CH3的HC連同包括輕鏈可變域::輕鏈恒定域的LC的表達(dá)產(chǎn)生IgG。在所給實(shí)例中，應(yīng)獲得IgG1。其它IgG類型可通過用編碼(例如)IgG4的DNA替換編碼CH1::鉸鏈區(qū)::CH2::CH3的DNA或使用經(jīng)修飾的Fc序列獲得。
如下為例示性LC可變域的序列和所述可變域的C末端的序列(例如，延伸至Cκ的終端)＞LC-092-B12-Cκ(SEQID NO1372)AQDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISNYLAWYQQ KPGKVPKLLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQSYSTPYTF
GQGTKLEVRR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC下列LC序列具有λ1恒定區(qū)＞LC-103-F07-Cλ(SEQID NO1373)AQSALTQPAS VSGSPGQSIT ISCTGTSNDI GRTNYVSWYR QDPGRAPKLILFEVSNRPSG ISNRFSASKS GSTASLTISG LQADDESDYY CSSCTTAPVCVFGNGTRVTV LGQPKANPTV TLFPPSSEEL QANKATLVCL ISDFYPGAVTVAWKADGSPV KAGVETTKPS KQSNNKYAAS SYLSLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKT VAPTECS下列LC序列具有λ2恒定區(qū)＞LC-131-D12- Cλ2 (SEQ ID NO1374)AQSALTQPPS VSVAPGQTAS ISCSGNILDN SYASWFQQKP GQSPVMVIHRDNKRPSGIPE RFSGSTSGNT ATLTISGTQA VDEADYYCQA WDRTTGVFGTGTRLTVLRQP KAAPSVTLFP PSSEELQANK ATLVCLISDF YPGAVTVAWKADSSPVKAGV ETTTPSKQSN NKYAASSYLS LTPEQWKSHR SYSCQVMHEGSTVEKTVAPA ECS下列LC序列具有λ7恒定區(qū)＞LC-132-H11- Cλ7 (SEQ ID NO1375)AQYELTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGSSSNI GSNYVYWYQQ LPGTAPKLLIYRNNQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC AAWDDSLSGHAVFGGGTQLT VLGQPKAAPS VTLFPPSSEE LQANKATLVC LVSDFYPGAVTVAWKADGSP VKVGVETTKP SKQSNNKYAA SSYLSLTPEQ WKSHRSYSCRVTHEGSTVEK TVAPTECS
λ輕鏈呈現(xiàn)數(shù)種類型例如λ1、λ2和λ7，根據(jù)Cλ的序列而定。具有λLC的抗體可分類如下。
λ7LC-132-H11λ2LC-131-D12LC-131-G06LC-132-D02LC-134-B03LC-136-A07LC-104-H12LC-109-A11LC-122-G06LC-125-C04LC-102-G12LC-092-G06LC-110-D11LC-108-C10LC-128-A06LC-135-H01LC-123-E02λ1LC-116-C09LC-108-E11LC-099-C12LC-131-A03LC-108-D11LC-114-F04LC-132-C01LC-122-H04LC-094-E08LC-093-F09LC-093-G06LC-103-E09LC-103-F07LC-098-H04LC-131-G03
LC-097-F04LC-135-C12LC-131-B05LC-112-D04LC-096-D03LC-126-H09LC-114-G09LC-094-D08LC-102-A04無論如何不希望Cλ由(例如)Cλ1變化至Cλ2改變所表達(dá)的抗體的結(jié)合性質(zhì)。因此，我們變更λ恒定區(qū)以改變表達(dá)或藥物動(dòng)力學(xué)而不改變結(jié)合性質(zhì)(諸如抑制hK1)。
選定抑制劑的蛋白酶特異性測(cè)試選定抗體抑制其它蛋白酶的能力。展示于表2中的是測(cè)試3個(gè)抗體針對(duì)13個(gè)除hK1以外的絲氨酸蛋白酶的結(jié)果。顯然，在抗體的最大測(cè)試濃度(1μM)下，我們不能觀察對(duì)任何其它蛋白酶的抑制。
程序。檢定是以100μL的總體積在黑色的96孔圓底微定量板中執(zhí)行。酶、底物、緩沖液和實(shí)驗(yàn)條件列于表3和4中。在黑暗中在室溫下，將酶和Fab抑制劑培育1小時(shí)，其后添加指示量的底物。隨后，使用Spectramax Gemini XS熒光板讀數(shù)器使用表3中所列的波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)酶底物水解的速率。
表2.hK1抗體抑制劑的特異性

表3.用于蛋白酶特異性測(cè)量的檢定條件的概述

表4.表3的緩沖液組分

選定抗體抑制劑對(duì)hK1激肽原酶活性的效應(yīng)檢查選定抗體抑制劑以測(cè)定其對(duì)hK1激肽原酶活性的效應(yīng)。SDS-PAGE展示所檢查的所有9個(gè)抗體抑制hK1對(duì)高分子量激肽原(HMWK)的激肽原酶活性。完整的HMWK呈100kDa蛋白質(zhì)遷移，其經(jīng)hK1消化產(chǎn)生以大約60kDa運(yùn)動(dòng)的片段(泳道1和2)。所有測(cè)試的9個(gè)hK1抑制劑(泳道4至12)阻止HMWK消化。通過在37℃下將10nM hK1與1μM Ab一起培育3小時(shí)，其后添加0.1mg/mL HMWK來執(zhí)行實(shí)驗(yàn)。在37℃下使HMWK與hK1反應(yīng)3小時(shí)。給非還原性SDS-PAGE凝膠(10％丙烯酰胺)加載1μg HMWK且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序電泳。泳道1含有未消化的HMWK，泳道2含有消化的HMWK，泳道3含有來自Invitrogen的分子量標(biāo)記，泳道4含有HMWK+hK1+DX-2300，泳道5含有HMWK+hK1+M0106-G12，泳道6含有HMWK+hK1+M0111-C12，泳道7含有HMWK+hK1+M0098-G05，泳道8含有HMWK+hK1+M0137-E01，泳道9含有HMWK+hK1+M0112-D03，泳道10含有HMWK+hK1+M0102-H11，泳道11含有HMWK+hK1+M0114-G06，泳道12含有HMWK+hK1+M0098-E09。
顯然所有9個(gè)Fab抑制消化LMWK的程度。然而，僅DX-2300(泳道4)和M0137-E01(泳道8)似乎完全抑制LMWK消化。就HMWK而言，反應(yīng)如上所述執(zhí)行且除用LMWK代替HMWK以外，泳道含有相同的上述內(nèi)含物。
選定的hK1結(jié)合抗體的抗原決定基分組使用表面等離子共振(SPR)法(圖1，表5)根據(jù)是否與DX-2300識(shí)別hK1上相同的抗原決定基將選定抗體分組。此類信息可使得發(fā)現(xiàn)用于定量測(cè)量生物樣品中的hK1的配對(duì)抗體。所述信息對(duì)將抗體與主要抑制劑(DX-2300)比較和選擇與DX-2300共享相同抗原決定基或者不同抗原決定基的后備抑制劑也具有價(jià)值。圖1展示與DX-2300共享相同抗原決定基的Fab(M0112-D07)(圖A)和結(jié)合不同抗原決定基的Fab(圖B)的兩個(gè)代表性感應(yīng)圖。將注射DX-2300之后的Fab的SPR信號(hào)(R1)除以僅Fab的所述信號(hào)(R2)所得到的比率提供何者Fab與DX-2300共享相同抗原決定基的指示。因?yàn)镈X-2300的第二次注射產(chǎn)生的R2/R1比率為0.1，所以具有顯著大于0.1的R2/R1比率的Fab指示結(jié)合與DX-2300不同的抗原決定基。所檢查的12個(gè)Fab中，僅M0111-C12、M0137-E01和M0139-A09不與DX-2300共享相同的抗原決定基(表5)。某些Fab(M0109-F02和M0098-E09)的抗原決定基可與DX-2300的抗原決定基部分重疊，因?yàn)橛^察到中間信號(hào)響應(yīng)(表5)。
表5.通過表面等離子共振進(jìn)行抗原決定基分組

hK1抑制的機(jī)制和選定抑制劑的Ki測(cè)定因?yàn)樗l(fā)現(xiàn)的最佳抗體為hK1的緊密結(jié)合抑制劑，所以不應(yīng)用經(jīng)典的Michaelis-Menten方法測(cè)定酶抑制機(jī)制。測(cè)定緊密結(jié)合抑制劑的抑制機(jī)制的方法已經(jīng)描述(R.A.Copeland，″Enzymes″，第2版，Wiley，Toronto，2000)。緊密結(jié)合抑制劑指具有接近可用于測(cè)量活性的最小酶濃度的抑制常數(shù)(Ki值)的抑制劑，就hK1而言，抑制常數(shù)為大約1nM。緊密結(jié)合抑制法需要測(cè)量不同底物濃度范圍內(nèi)的抑制劑的IC50。在所述條件下，以相對(duì)于底物為競(jìng)爭(zhēng)性的方式結(jié)合酶的抑制劑應(yīng)展示回應(yīng)底物濃度的IC50的線性增加。相反，不隨底物濃度變化的IC50值指示抑制劑以相對(duì)于底物為非競(jìng)爭(zhēng)性的方式結(jié)合酶。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與酶的結(jié)合并不阻斷底物結(jié)合酶的能力，但可能通過使催化上重要的氨基酸變形阻止隨后的底物水解步驟。
DX-2300展示IC50值對(duì)底物濃度的線性依賴性(圖2)。因此，DX-2300為以競(jìng)爭(zhēng)性方式抑制hK1的緊密結(jié)合抑制劑，其指示其與hK1的結(jié)合阻止底物結(jié)合。對(duì)抑制機(jī)制的認(rèn)識(shí)也允許測(cè)定抑制常數(shù)(Ki)。DX-2300作為Fab具有60pM的Ki值且作為IgG具有大約39pM的Ki值。
也測(cè)定選定后備抗體(M0093-F09和M0137-E01)的抑制機(jī)制和Ki值。如圖3A所示，M0093-F09以非競(jìng)爭(zhēng)性方式抑制hK1，其中Ki為1.9nM。圖3B證明后備抗體抑制劑M0137-E01以競(jìng)爭(zhēng)性方式抑制hK1，其中Ki為0.9nM。
DX-2300的進(jìn)行曲線抑制分析已使用進(jìn)行曲線方法(R.A.Copeland，″Enzymes″，第2版，Wiley，Toronto，2000)研究DX-2300抑制hK1的時(shí)間依賴性。所述方法用于表征動(dòng)力學(xué)步驟或描述抑制劑與酶之間的相互作用的步驟。展示于圖4A中的進(jìn)行曲線證明DX-2300對(duì)hK1的時(shí)間依賴性抑制且將對(duì)于各濃度的抑制劑所獲得的數(shù)據(jù)擬合以提供描述酶與抑制劑之間的相互作用的動(dòng)力學(xué)的指數(shù)速率常數(shù)。當(dāng)對(duì)抑制劑濃度作圖時(shí)，所述速率常數(shù)(kobs值)展示雙曲線依賴性(圖4B)，其指示DX-2300與hK1之間的初始復(fù)合物經(jīng)歷異構(gòu)化以形成具有甚至更高親和力的新復(fù)合物。
動(dòng)物尿中類血管舒緩素活性的DX-2300抑制先前已展示組織血管舒緩素(K1)分泌于尿中。Kizuki，K.等人，Adv Exp Med Biol，1986.198 Pt A-.329-337；Takaoka，M.等人，Biochem Biophys Res Commun，1984.122(3)1282-1288；Murthy，K.K.等人，Arch BiochemBiophys，1986.244(2)563-571；Stella，R.C.等人，Adv Exp Med Biol，1989.247B195-200。使用合成肽底物，可測(cè)量于尿中的K1的活性。因?yàn)樗置诘腒1的大部分通常呈非活性替代形式，所以必需用另一諸如胰蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶的蛋白酶活化所述酶。在測(cè)量于尿中的K1的活性之前，使用特異性抑制劑(對(duì)胰蛋白酶而言為大豆胰蛋白酶抑制劑或?qū)κ葻峋鞍酌付詾殪Ⅴ６?抑制活化酶。
由圖5顯然可知DX-2300抑制存在于人類、羊、犬、猴、兔和母牛的尿中的類血管舒緩素活性。然而，其并不抑制嚙齒動(dòng)物(小鼠、大鼠、天竺鼠或倉鼠)中所觀察到的或來自豬尿的類血管舒緩素活性。羊尿與人尿中所測(cè)量到的類血管舒緩素活性的DX-2300 IC50值相當(dāng)，分別為2.9±1.6nM和3.0±0.6nM(圖6)。
程序。首先通過添加1/10體積的1M HEPES(pH7.7)將動(dòng)物尿緩沖，且離心以移除固體。隨后，在31℃下，將上清液(1mL)通過添加50μL胰蛋白酶瓊脂糖樹脂活化30分鐘。隨后，將樣品離心以移除胰蛋白酶瓊脂糖且將可能已自樹脂浸出的任何殘余胰蛋白酶用10μM大豆胰蛋白酶抑制劑去活。在存在或不存在0.5μM DX-2300的情況下，在96孔板的Kal緩沖液(表4)孔(100μL總體積)中測(cè)量活化尿(9μL)中血管舒緩素對(duì)合成底物Pro-Phe-Arg-AMC(100μM[最終])的活性。首先，在37℃下將活化尿與DX-2300一起培育30分鐘，其后添加底物。
人類支氣管肺泡灌洗液中類血管舒緩素活性的抑制如在支氣管肺泡灌洗液(BAL)中所測(cè)量，已證明與健康個(gè)體相比，在哮喘患者的氣管中組織血管舒緩素1(hK1)增加。Proud，D.等人，Am JRespir CellMolBiol，1993.8(1)16-19；Christiansen，S.C.等人，Am Rev Respir Dis，1992.145(4Pt 1)900-905；Christiansen，S.C.等人，JClin Invest，1987.79(1)188-197。如使用合成底物Pro-Phe-Arg-AMC所測(cè)量，可見DX-2300抑制來自4個(gè)不同輕度哮喘患者的BAL中的類血管舒緩素活性(參見圖7)。所述合成底物可由BAL中的其它蛋白酶水解且因此所述底物不是激肽原酶活性的選擇性底物。因?yàn)橐颜故綝X-2300為K1的高度特異性抑制劑，所以其不可能抑制BAL中的所述其它蛋白酶。因此，不希望DX-2300完全抑制BAL中的蛋白酶活性。對(duì)具有K1活性的所述特異性抑制劑在BAL中產(chǎn)生實(shí)質(zhì)量的蛋白酶抑制的觀察結(jié)果確認(rèn)哮喘患者中K1活性升高。
DX-2300在哮喘的羊模型中的效應(yīng)哮喘的羊模型先前已用于確認(rèn)潛在的哮喘藥物靶和測(cè)試藥劑。Forteza，R.等人，AmJRespir Crit Care Med，1996.154(1)36-42；Rosen，S.D.等人，Am JPathol，2005.166(3)935-944；Scuri，M.等人，JAppl Physiol，2002.93(6)1900-1906。在所述模型中，將過敏性羊用豬蛔蟲抗原攻毒且肺阻力的測(cè)量提供伴隨支氣管收縮的指示。如圖8A所示，DX-2300使早期支氣管收縮稍降低且抑制晚期支氣管收縮達(dá)80％以上。
哮喘的羊模型中的氣管過度反應(yīng)(AHR)的測(cè)量也指示在人類患者中的功效。如圖9B所示，在過敏原攻毒之后，DX-2300完全阻斷AHR。根據(jù)使支氣管收縮增加基線的400％以上(PC400)需要多少碳酰膽堿(一種膽堿能促效劑)來測(cè)量AHR。過敏原攻毒之后，氣管對(duì)所述促效劑過度反應(yīng)，所以誘導(dǎo)相同程度的支氣管收縮所需的量降低。圖9B證明DX-2300阻斷AHR發(fā)展，因?yàn)楣ザ局?，達(dá)到PC400程度的支氣管收縮需要相同量的碳酰膽堿。
如通過肺阻力增加所測(cè)量，將高分子量激肽原(HMWK)(K1底物)通過吸入投與至羊?qū)е轮卸戎夤苁湛s。所述增加是歸因于由氣管激肽原酶引起的激肽的產(chǎn)生。DX-2300抑制HMWK誘導(dǎo)的支氣管收縮的觀察結(jié)果(圖10)支持K1為氣管中主要激肽原酶的觀察結(jié)果。Christiansen，S.C.等人，Am Rev Respir Dis，1992.145(4Pt1)900-905；Lauredo，IT.等人，Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2004.286(4)L734-40。
編碼DX-2300的重鏈和輕鏈的DNA的密碼子優(yōu)化由GENEART，領(lǐng)域內(nèi)專家，使用專有算法將編碼DX-2300的重鏈和輕鏈的DNA的兩者均優(yōu)化以在中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)。密碼子優(yōu)化期間，根據(jù)倉鼠屬基因的密碼子偏性調(diào)適使用。盡可能避免高(＞80％)或低(＜30％)GC含量區(qū)。另外，就重鏈而言，移除4個(gè)原核抑制主結(jié)構(gòu)和7個(gè)一致隱蔽剪接供體位點(diǎn)。就輕鏈而言，移除單個(gè)內(nèi)含子。
經(jīng)優(yōu)化的DX-2300輕鏈(SBQ ID NO1378)
AAGCTTATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCTCTGGCGTGAACTCCTCCAGACTGGAGGTGTGGACCTACATCTGGGTGACCATGACCTCCACCCTGCCTTTCTCTCCAGGCGTGCACTCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCTCCCAGTCCATCTCCTCCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCCTCTCTGCAGTCTGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCTACTCTACCCCTCTGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAGAGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCTCTGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAATTCCCAGGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCTACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGATGAGAATTC經(jīng)優(yōu)化的DX-2300重鏈(SEQ ID NO1379)AAGCTTATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGCTCACTCTGAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAAGTACAAGATGGTGTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCTCCATCTACCCATCTGGCGGCATCACCGCCTACGCCGATTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGATACCGCCATGTACTACTGTGCCAAGGACATCACCCCTGGCGGAGGATCTGGCTTCCGGCTGCCCAAGAATTACTACTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCTGCTTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTCCTCCAAGTCTACCTCCGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCCGTGACAGTGTCTTGGAACTCTGGCGCTCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCTTCTTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGTCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGATCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTAGCAGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCC
CTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCTGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCCCGGCAAGTGATGAGAATTC所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可認(rèn)識(shí)到或能夠確認(rèn)本文所述的本發(fā)明的特定實(shí)施例的多個(gè)等效物。所述等效物意欲涵蓋于下列權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，其包括免疫球蛋白重鏈(HC)可變域序列和免疫球蛋白輕鏈(LC)可變域序列，其中所述HC可變域序列和所述LC可變域序列形成與hK1結(jié)合且抑制hK1的酶活性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)對(duì)hK1具有小于10nM的Ki。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)對(duì)hK1具有小于1nM的Ki。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)對(duì)hK1具有小于0.1nM的Ki。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有一種或一種以上下列性質(zhì)中(i)所述重鏈可變域序列包括(a)包括氨基酸序列Xaa1-Tyr-Xaa2-Met-Xaa3的CDR1，其中Xaa1是選自Lys和His；Xaa2是選自Lys、Va1和Ser；Xaa3是選自Va1、Ile和Thr；(b)包括氨基酸序列Xaa1-Ile-Tyr-Pro-Ser-Gly-Gly-Xaa2-Thr-Xaa3-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly的CDR2，其中Xaa1是選自Ser、Trp和Arg；Xaa2是選自Ile、Asn和Arg；Xaa3是選自Ala、Ile和Gly；和/或(c)包括至少8個(gè)氨基酸的來自DITPGGGSGFRLPKNYYYYGMDV(SEQ ID NO12)、VGVWYGMDV(SEQ IDNO114)或DSGGYYYGMDV(SEQ ID NO156)的CDR3；(ii)所述輕鏈可變域序列包括(a)包括氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Xaa1-Ser-Ser-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(SEQ ID NO1380)的CDR1，其中Xaa1是選自Ile和Val；Xaa2是選自Tyr和Ser；Xaa3是選自Leu和Tyr；Xaa4是選自Asn、Ala和Leu且Xaa5為Ala或不存在；(b)包括氨基酸序列Xaa1-Ala-Ser-Xaa2-Xaa3-Xaa4的CDR2，其中Xaa1是選自Ala、Asp和Gly；Xaa2是選自Ser和Asn；Xaa3是選自Leu和Arg；Xaa4是選自Gln和Ala；且Xaa4是選自Ser和Thr；和/或(c)包括至少5個(gè)氨基酸的來自QQSYSTPLT(SEQ ID NO9)、QQRSNWPSPIA(SEQ ID NO111)和QQYGSSLT(SEQ ID NO153)的CDR3；(iii)所述重鏈可變域序列包括與SEQ ID NO1206、1245或1354的重鏈可變域序列具有至少85％一致性的序列；(iv)所述輕鏈可變域序列包括與SEQ ID NO1029、1070或1183的輕鏈可變域序列具有至少85％一致性的序列；(v)所述重鏈可變域序列包括由在嚴(yán)格條件下與編碼SEQ ID NO1206、1245或1354的重鏈可變域序列的序列雜交的核酸編碼的序列；(vi)所述輕鏈可變域序列包括由在嚴(yán)格條件下與編碼SEQ ID NO1029、1070或1183的輕鏈可變域序列的序列雜交的核酸編碼的序列；和/或(vii)所述蛋白質(zhì)與抗體DX-2300、M093-F09或M137-E01競(jìng)爭(zhēng)與hK1結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其包括所述DX-2300抗體的CDR區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其包括所述M093-F09抗體的CDR區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其包括所述M137-E01抗體的CDR區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述重鏈和輕鏈可變域序列與SEQ ID NO1245和1070的相應(yīng)可變域序列具有至少90％的一致性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述重鏈和輕鏈可變域序列與SEQ ID NO1206和1029的相應(yīng)可變域序列具有至少90％的一致性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述重鏈和輕鏈可變域序列與SEQ ID NO1183和1354的相應(yīng)可變域序列具有至少90％的一致性。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中至少80％的FR區(qū)與來自人類生殖系序列的FR序列或DX-2300、M093-F09或M137-E01的FR序列一致。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其在人類體內(nèi)不具有免疫原性。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其為全長(zhǎng)IgG抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其為抗體的抗原結(jié)合片段且不包含F(xiàn)c域。
16.一種醫(yī)藥組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
17.一種治療或預(yù)防hK1相關(guān)病癥的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)以有效治療或預(yù)防hK1相關(guān)病癥的量投與至受檢者。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述病癥是選自由以下各病組成的群組哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、鼻炎、竇炎、炎性腸病、免疫介導(dǎo)糖尿病、急性胰腺炎、間質(zhì)性膀胱炎或贅生性病癥。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述病癥為哮喘且所述哮喘為過敏性哮喘或非過敏性哮喘。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述病癥為贅生性病癥且所述贅生性病癥為轉(zhuǎn)移性胰腺癌或腫瘤血管生成。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述醫(yī)藥組合物是通過吸入投與。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述醫(yī)藥組合物是使用吸入器投與。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其進(jìn)一步包括投與調(diào)節(jié)血管生成的第二藥劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述第二藥劑為抗VEGF抗體或其抗原結(jié)合片段。
25.一種調(diào)節(jié)hK1活性的方法，所述方法包括提供根據(jù)權(quán)利要求1所述的hK1結(jié)合蛋白；和使所述蛋白質(zhì)以足以調(diào)節(jié)hK1活性的量與hK1接觸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述接觸是在活體外。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述接觸是在活體內(nèi)。
28.一種在活體外檢測(cè)樣品中hK1蛋白存在的方法，所述方法包括(i)在允許根據(jù)權(quán)利要求1所述的hK1結(jié)合蛋白與所述hK1蛋白發(fā)生相互作用的條件下，使所述樣品與所述hK1結(jié)合蛋白接觸；和(ii)檢測(cè)所述hK1結(jié)合蛋白與樣品之間的相互作用。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中固定所述hK1結(jié)合蛋白或所述hK1中的至少一個(gè)。
30.一種在活體內(nèi)檢測(cè)hK1存在的方法，所述方法包括(i)在允許根據(jù)權(quán)利要求1所述的hK1結(jié)合蛋白與所述hK1蛋白發(fā)生相互作用的條件下，將所述hK1結(jié)合蛋白投與至受檢者；和(ii)檢測(cè)所述hK1結(jié)合蛋白在所述受檢者體內(nèi)的位置或所述受檢者體內(nèi)所述hK1結(jié)合蛋白與hK1之間的復(fù)合物的形成。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述受檢者為人類受檢者。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述檢測(cè)包括對(duì)受檢者成像。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中用MRI可檢測(cè)標(biāo)記給所述hK1結(jié)合蛋白加以標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明的特征在于hK1結(jié)合多肽，以及包括所述多肽的組合物和制造和使用所述多肽的方法。
文檔編號(hào)C07K16/40GK101094869SQ200580032154
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月3日
發(fā)明者丹尼爾·J·塞克斯頓, 安德魯·尼克松, 安東尼·威廉斯, 羅伯特·C·蘭德, 吳啟龍 申請(qǐng)人:戴?？怂褂邢薰?br>