專利名稱：用于免疫測(cè)定的茚地那韋衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于免疫測(cè)定的蛋白酶抑制劑衍生物。更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生免疫原的活化茚地那韋半抗原，還涉及可用作免疫原以產(chǎn)生抗茚地那韋抗體和用于在免疫測(cè)定中測(cè)定生物樣品中的茚地那韋的綴合衍生物。
背景技術(shù)：
HIV蛋白酶抑制劑是重要的一類新藥物，自從第一個(gè)藥物沙奎那韋在1995年上市以來(lái)，這類藥物已對(duì)艾滋病患者的健康護(hù)理產(chǎn)生顯著的效果。其它蛋白酶抑制劑的實(shí)例包括氨普那韋、奈非那韋、洛匹那韋、利托那韋、茚地那韋、阿扎那韋。它們與其它抗HIV藥物如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或與其它HIV蛋白酶抑制劑聯(lián)合用藥特別有效。雖然這些新的治療方案獲得的顯著的成功，但有強(qiáng)烈的跡象表明，如果有治療藥物試驗(yàn)方法可供監(jiān)測(cè)蛋白酶抑制劑的濃度，則結(jié)果會(huì)變得更好。并不是所有的患者都對(duì)蛋白酶抑制劑聯(lián)合療法有最佳的反應(yīng)。即使那些有反應(yīng)的患者后來(lái)也會(huì)發(fā)展出藥物抗性，這是由于HIV病毒眾所周知的高突變率所致。但是，已證實(shí)蛋白酶抑制劑的血漿水平與基于病毒負(fù)荷減少和CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)增加的治療功效之間存在著明確關(guān)系。有一個(gè)問(wèn)題在于這個(gè)事實(shí)，即藥物被大量代謝并受到復(fù)雜的藥物-藥物相互作用。其結(jié)果是，藥物動(dòng)力學(xué)極其復(fù)雜，任何具體患者在任何具體時(shí)間下劑量和所致藥物水平之間存在強(qiáng)烈的不可預(yù)測(cè)性因素。如能進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，就能針對(duì)患者個(gè)別地考慮藥物劑量，且病毒受到監(jiān)視的機(jī)會(huì)大大提高。但是，蛋白酶抑制劑的常規(guī)治療藥物監(jiān)測(cè)要求有適應(yīng)于高通量臨床分析儀的簡(jiǎn)單自動(dòng)試驗(yàn)可使用。目前，大多數(shù)有關(guān)蛋白酶抑制劑的治療藥物監(jiān)測(cè)的報(bào)告都使用慢速、費(fèi)力和昂貴的HPLC方法。最近有一份關(guān)于沙奎那韋放射免疫測(cè)定(RIA)方法的報(bào)告(Wiltshire等，AnalyticalBiochemistry 281，105-114，2000)。但是，這種方法不能適用于高通量治療藥物監(jiān)測(cè)，且和所有的RIA方法一樣都遭受這樣的缺點(diǎn)，即存在與測(cè)定中使用的放射性同位素標(biāo)記有關(guān)的法規(guī)、安全和廢物處理的問(wèn)題。最可取的治療藥物監(jiān)測(cè)用測(cè)定模式(assay format)是非同位素免疫測(cè)定，迄今為止未知有這種方法用于監(jiān)測(cè)HIV蛋白酶抑制劑。
茚地那韋(CRIXIVAN，Merck&Co.，Inc.)是人類免疫缺陷病毒蛋白酶的有效和特異性抑制劑之一。茚地那韋被代謝成低水平的季吡啶N-葡糖苷酸(M1)類似物、2′，3′-反式-二羥基茚滿基吡啶-N-氧化物(M2)類似物、2′，3′-反式-二羥基茚滿(M3)類似物和吡啶-N-氧化物(M4a)類似物，以及M3和茚地那韋的去吡啶基甲基類似物(分別為M5和M6)。M6是尿液及血漿中的主要代謝物之一(Drug Metabolism andDisposition 24，1389-94，1996)。
前文提到，HPLC已經(jīng)是監(jiān)測(cè)HIV蛋白酶抑制劑的可選方法。最近文獻(xiàn)中的兩份報(bào)告描述了用于同時(shí)測(cè)定人血漿中幾種蛋白酶抑制劑的HPLC測(cè)定法，Poirier等，Therapeutic Drug Monitoring 22，465-473，2000和Remmel等，Clinical Chemistry46，73-81，2000。
化學(xué)和生物測(cè)定法通常涉及使目的分析物與預(yù)定量的一種或多種測(cè)定試劑接觸，測(cè)量所產(chǎn)生的產(chǎn)物(檢測(cè)產(chǎn)物)的一種或多種性質(zhì)，和將測(cè)量值與原始樣品中存在的分析物的量建立關(guān)聯(lián)，通常是使用從含已知量(在待測(cè)樣品的預(yù)期范圍內(nèi))的目的分析物標(biāo)準(zhǔn)或校準(zhǔn)樣品所測(cè)定的關(guān)系來(lái)建立關(guān)聯(lián)。通常，檢測(cè)產(chǎn)物摻入了一種或多種由一種或多種測(cè)定試劑提供的可檢測(cè)標(biāo)記。常用標(biāo)記的實(shí)例包括官能化微顆粒、放射性同位素標(biāo)記如125I和32P、酶如過(guò)氧化物酶和β-半乳糖苷酶及酶底物標(biāo)記、熒光標(biāo)記如熒光素和羅丹明、電子自旋共振標(biāo)記如硝基氧自由基、免疫應(yīng)答性標(biāo)記如抗體和抗原、作為結(jié)合對(duì)如生物素-親和素和生物素-鏈霉親和素的一個(gè)成員的標(biāo)記以及電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記如含有聯(lián)吡啶釕部分的標(biāo)記。夾心測(cè)定法通常涉及形成目的分析物夾在兩種測(cè)定試劑中間的復(fù)合物，其中一種測(cè)定試劑最終用于進(jìn)行分離，例如抗體、抗原或結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員，另一種測(cè)定試劑提供可檢測(cè)標(biāo)記。競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法通常涉及這樣的系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中目的分析物和分析物的類似物競(jìng)爭(zhēng)另一試劑例如抗體上的結(jié)合位點(diǎn)，其中分析物、類似物或結(jié)合試劑之一者具有可檢測(cè)標(biāo)記。
2000年11月14日提交的共同待審美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/712,525(其受讓人與本申請(qǐng)相同，2002年5月22日以EP 1 207 394公布)描述了HIV蛋白酶抑制劑的非同位素免疫測(cè)定法，該法包括將含有抑制劑的樣品與對(duì)所述抑制劑或所述抑制劑的代謝物有特異性的受體以及與包含所述抑制劑類似物和非同位素信號(hào)產(chǎn)生部分的綴合物一起溫育。測(cè)量因受體結(jié)合抑制劑所產(chǎn)生的信號(hào)，并將該信號(hào)與原始樣品中蛋白酶抑制劑的存在或數(shù)量建立關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的蛋白酶抑制劑綴合物特別適用于這種測(cè)定法。
2002年7月10日提交的共同待審美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)10/192,052(其受讓人與本中請(qǐng)相同，2003年1月23日以WO03/006506公布)描述了用于產(chǎn)生針對(duì)HIV蛋白酶抑制劑的免疫原的活化半抗原。具體公開(kāi)的是從茚地那韋分子的中心羥基出發(fā)合成的茚地那韋衍生物和免疫原。
除了其它問(wèn)題以外，另外還需要有HIV蛋白酶抑制劑茚地那韋的改進(jìn)的活化半抗原、衍生物和綴合物以及用以測(cè)定生物樣品中的茚地那韋的免疫測(cè)定方法，該方法適合于進(jìn)行自動(dòng)高通量藥物監(jiān)測(cè)。本發(fā)明解決了這些和其它的問(wèn)題。
發(fā)明概述本發(fā)明正是在上述背景下提供一些優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的非顯而易見(jiàn)的優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)步。具體的說(shuō)，本發(fā)明人已認(rèn)識(shí)到用于免疫測(cè)定的茚地那韋衍生物和綴合物需要改進(jìn)。
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生針對(duì)HIV蛋白酶抑制劑茚地那韋的免疫原的活化半抗原，涉及用于產(chǎn)生抗茚地那韋抗體的免疫原，和涉及用于用以測(cè)定生物樣品中茚地那韋的免疫測(cè)定法的標(biāo)記綴合物。這些化合物是從茚地那韋的吡啶環(huán)氮的茚滿環(huán)羥基出發(fā)和從茚地那韋的吡啶氮出發(fā)合成的。本發(fā)明還涉及在氫氣和鈀催化劑存在下從茚地那韋一步合成茚地那韋代謝物M6的方法，和涉及從茚地那韋M6代謝物衍生的活化半抗原和綴合物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有以下結(jié)構(gòu)的活化半抗原 其中Y＝O或S，m＝0或1，X＝CH2或NH，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺、硫內(nèi)酯、重氮基團(tuán)和醛的活化官能度。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有以下結(jié)構(gòu)的綴合衍生物
其中Y＝O或S，m＝0或1，X＝CH2或NH，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還包含最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-N HOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖、合成聚合物和非同位素標(biāo)記，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有以下結(jié)構(gòu)的活化半抗原 其中L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺、硫內(nèi)酯、重氮基團(tuán)和醛的活化官能度。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有以下結(jié)構(gòu)的綴合衍生物 其中L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖、合成聚合物和非同位素標(biāo)記，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有以下結(jié)構(gòu)的活化半抗原 其中X為N或C，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺、硫內(nèi)酯、重氮基團(tuán)和醛的活化官能度。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有以下結(jié)構(gòu)的綴合衍生物 其中X為N或C，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還包含最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖、合成聚合物和非同位素標(biāo)記，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有以下結(jié)構(gòu)的活化半抗原 其中L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和0-20個(gè)雜原子的脂族連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺、硫內(nèi)酯、重氮基團(tuán)和醛的活化官能度。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有以下結(jié)構(gòu)的綴合衍生物
其中L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還包含0-20個(gè)雜原子的脂族連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖、合成聚合物和非同位素標(biāo)記，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供在氫氣和鈀催化劑存在下從茚地那韋一步合成茚地那韋代謝物M6的方法。合成的M6用于從M6的哌嗪氮出發(fā)合成具有連接基團(tuán)的茚地那韋衍生物。這些連接基團(tuán)包括脂族基團(tuán)、取代的芳族基團(tuán)和吡啶基。
從下文對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并結(jié)合所附的權(quán)利要求書(shū)，將更能完整地理解本發(fā)明的這些和其它特征和優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)注意，權(quán)利要求的范圍由權(quán)利要求書(shū)的敘述來(lái)確定，而不是由本描述中所提出的對(duì)各特征和優(yōu)點(diǎn)的具體討論來(lái)確定。
附圖簡(jiǎn)述結(jié)合以下附圖進(jìn)行閱讀，能最好地理解下文對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述。


圖1是按實(shí)施例29的描述用高組校準(zhǔn)血清用綴合物6C制作的校準(zhǔn)曲線。
圖2是按實(shí)施例29的描述用低組校準(zhǔn)血清用綴合物6C制作的校準(zhǔn)曲線。
圖3是按實(shí)施例29的描述用高組校準(zhǔn)血清用綴合物13C制作的校準(zhǔn)曲線。
圖4是按實(shí)施例29的描述用低組校準(zhǔn)血清用綴合物13C制作的校準(zhǔn)曲線。
圖5說(shuō)明按實(shí)施例1-6的描述從茚地那韋的茚滿環(huán)羥基出發(fā)合成活化茚地那韋半抗原12的方案。
圖6說(shuō)明分別按實(shí)施例7、8和26的描述合成活化半抗原12的BSA、KLH和氨基葡聚糖衍生物的方案。
圖7說(shuō)明按實(shí)施例9-11的描述從茚地那韋的吡啶環(huán)氮出發(fā)合成活化茚地那韋半抗原5的方案和分別按實(shí)施例12、13和27的描述合成KLH、BSA和氨基葡聚糖衍生物的方案。
圖8說(shuō)明按實(shí)施例14的描述在氫氣和鈀催化劑存在下從茚地那韋一步合成茚地那韋代謝物M6(2)的方案。
圖9說(shuō)明按實(shí)施例15和16的描述從M6的哌嗪氮出發(fā)合成具有取代芳族連接基團(tuán)的茚地那韋衍生物的方案。
圖10說(shuō)明按實(shí)施例17和18的描述從M6的哌嗪氮出發(fā)合成具有脂族連接基團(tuán)的茚地那韋衍生物的方案。
圖11說(shuō)明按實(shí)施例19-21的描述從M6的哌嗪氮出發(fā)合成具有吡啶基連接基團(tuán)的茚地那韋衍生物的方案。
圖12說(shuō)明按實(shí)施例22-24的描述從M6的哌嗪氮出發(fā)合成具有吡啶基連接基團(tuán)的茚地那韋衍生物的方案。
發(fā)明詳述為使本發(fā)明可更容易地理解，提到了以下實(shí)施例，這些實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明而不是限制其范圍。
應(yīng)注意，諸如“優(yōu)選”、“常常”、“通常”的術(shù)語(yǔ)在本文中并不用來(lái)限制要求保護(hù)的發(fā)明范圍，或者用來(lái)暗示某些特征對(duì)于要求保護(hù)的發(fā)明的結(jié)構(gòu)或功能是關(guān)鍵的、必需的乃至重要的。更確切地，這些術(shù)語(yǔ)僅僅旨在強(qiáng)調(diào)可或可不用于本發(fā)明具體實(shí)施方案的替代型特征或附加特征。
出于描述和定義本發(fā)明的目的，應(yīng)注意的是術(shù)語(yǔ)“基本上”在本文中用來(lái)代表可歸結(jié)于任何定量比較、數(shù)值、測(cè)量和其它表示法的固有不確定程度。術(shù)語(yǔ)“基本上”在本文中還用來(lái)代表某定量表示在不導(dǎo)致所討論主題的基本功能發(fā)生變化下可偏離規(guī)定基準(zhǔn)的程度。
參考本發(fā)明的具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述后，顯而易見(jiàn)的是在不偏離所述權(quán)利要求書(shū)所定義的本發(fā)明范圍下，有可能對(duì)本發(fā)明作出修改和變化。更具體的說(shuō)，雖然本發(fā)明的一些方面在本文中確認(rèn)為是優(yōu)選的或特別有利的，但還設(shè)想到本發(fā)明未必限于本發(fā)明的這些優(yōu)選方面。
在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，黑體字?jǐn)?shù)字用來(lái)指附圖中所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
本文所用的分析物指其存在或數(shù)量待測(cè)定的物質(zhì)或一組物質(zhì)。
抗體是指分析物的特異性結(jié)合伴侶，是對(duì)分析物具有特異性結(jié)合親和力而基本上排除其它非相關(guān)物質(zhì)的任何物質(zhì)或一組物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)包括多克隆抗體、單克隆抗體和抗體片斷。
半抗原是部分抗原或不完全抗原。它們是不能夠刺激抗體形成、但的確能與抗體反應(yīng)的無(wú)蛋白質(zhì)物質(zhì)，主要是低分子量物質(zhì)。將半抗原偶聯(lián)到高分子量載體并將此偶聯(lián)產(chǎn)物注射入人體或動(dòng)物體中，就形成抗體。半抗原的實(shí)例包括治療藥物如地高辛和茶堿、蛋白酶抑制劑如沙奎那韋和茚地那韋、濫用藥物如嗎啡和LSD、抗生素如慶大霉素和萬(wàn)古霉素、激素如雌激素和孕酮、維生素如維生素B12和葉酸、甲狀腺素、組胺、5-羥色胺、腎上腺素等。
活化半抗原指提供了可供反應(yīng)的位點(diǎn)的半抗原，如通過(guò)附著或供應(yīng)活化基團(tuán)而用于合成衍生綴合物。
術(shù)語(yǔ)接頭指將半抗原連接到載體、免疫原、標(biāo)記、示蹤物或另一接頭的化學(xué)部分。接頭可以是直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的碳鏈。接頭在鏈當(dāng)中或在鏈末端還可包括一個(gè)或多個(gè)雜原子。所謂雜原子是指選自氧、氮和硫的碳以外原子。取決于具體的半抗原和載體對(duì)，使用接頭可能是或可能不是有利或需要的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”是能與半抗原連接從而使半抗原能夠刺激免疫應(yīng)答的免疫原性物質(zhì)，通常是蛋白質(zhì)。載體物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、復(fù)合多糖和核酸，它們被宿主識(shí)別為外來(lái)物質(zhì)，從而引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原”和“免疫原性”指能夠在生物體中引起或產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)綴合物和衍生物指從母體化合物或分子通過(guò)一個(gè)或多個(gè)化學(xué)反應(yīng)制成的化學(xué)化合物或分子。
本文所用的檢測(cè)分子、標(biāo)記或示蹤物是當(dāng)連接到載體物質(zhì)或分子試劑時(shí)能用來(lái)檢測(cè)分析物的可識(shí)別標(biāo)志。標(biāo)記可直接或間接通過(guò)連接或橋接部分附著到其載體物質(zhì)。標(biāo)記的實(shí)例包括酶如β-半乳糖苷酶和過(guò)氧化物酶、熒光化合物如羅丹明和異硫氰酸熒光素(FITC)、發(fā)光化合物如二氧雜環(huán)丁烷和螢光素以及放射性同位素如125I。
本發(fā)明意義下的術(shù)語(yǔ)活性酯涵括活化酯基團(tuán)，其在不能有效地與攜親核體物質(zhì)的其它反應(yīng)性基團(tuán)發(fā)生干擾性副反應(yīng)的條件下，能與親核體(例如但不限于肽的游離氨基、聚氨基酸、多糖或標(biāo)記)發(fā)生反應(yīng)。
以下結(jié)構(gòu)說(shuō)明用于進(jìn)行本文所提到的衍生化的各個(gè)位置，其中X＝CH2或N 從茚地那韋分子的中心羥基出發(fā)合成的茚地那韋衍生物和綴合物在WO 03/006506中描述。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及從茚地那韋的吡啶氮出發(fā)引出的茚地那韋半抗原結(jié)構(gòu)。
調(diào)節(jié)反應(yīng)條件就可選定一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)而不是另一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。這個(gè)方法的一個(gè)實(shí)例涉及在叔胺優(yōu)選三乙胺存在下進(jìn)行的硫酸茚地那韋的烷基化反應(yīng)。如圖7所示，這種烷基化反應(yīng)選擇性地將茚地那韋吡啶氮官能化 其中L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基因，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起。A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺和硫內(nèi)酯的活化官能度。
烷基化試劑優(yōu)選是帶有受保護(hù)的羧酸或適當(dāng)保護(hù)的官能度(如被保護(hù)成鄰苯二甲酰亞胺基團(tuán)的氨基)的鹵代烷化劑。受保護(hù)的羧基基團(tuán)優(yōu)選是酯，其在附著到茚地那韋例如圖7的化合物4后在酸性或堿性條件下被除去。游離羧酸基團(tuán)可加以活化以產(chǎn)生活性酯，供隨后綴合到多肽、多糖和標(biāo)記基團(tuán)。游離氨基基團(tuán)在脫保護(hù)后，也可用帶活化羧酸基團(tuán)的雙官能接頭延伸，或者可通過(guò)脲連接或類似基團(tuán)偶聯(lián)到多肽。
也可用異雙功能試劑如馬來(lái)酰亞胺鏈烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯來(lái)實(shí)現(xiàn)接頭延伸，以產(chǎn)生末端馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，供隨后綴合到多肽和標(biāo)記上的巰基基團(tuán)?；蛘?，可用異雙功能硫醇化劑來(lái)延伸以氨基為末端的接頭，該異雙功能硫醇化劑能在一端形成酰胺鍵，在另一端形成游離或保護(hù)的硫醇。本領(lǐng)域公知的這種類型硫醇化劑的一些實(shí)例是2-亞氨基四氫噻吩(2-IT)、琥珀酰亞胺基乙酰硫代丙酸酯(SATP)和琥珀酰亞胺基(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。初始巰基基團(tuán)在脫保護(hù)后就可供與馬來(lái)酰亞胺或溴乙?；男揎椕庖咴驑?biāo)記形成硫醇酯。
本發(fā)明的活性酯能與親核體尤其是伯胺在多種含水或非水溶劑混合物中在相對(duì)較低的溫度下發(fā)生反應(yīng)。活性酯與伯胺或仲胺偶聯(lián)產(chǎn)生酰胺的典型條件是，在偶極非質(zhì)子溶劑如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亞砜(DMSO)中加水或不加水在室溫下發(fā)生反應(yīng)。
往往加入緩沖劑或叔胺，以維持將伯胺反應(yīng)物保持在脫質(zhì)子狀態(tài)所需的堿性pH。常用的活性酯是對(duì)硝基苯酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯、1-羥基苯并三唑酯和五氟苯酯。優(yōu)選的活性酯是N-羥基琥珀酰亞胺酯，因?yàn)樗鼈冊(cè)诜€(wěn)定性、反應(yīng)性和副產(chǎn)物N-羥基琥珀酰亞胺的易除去性方面達(dá)到平衡。其它活性酯是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，同樣可以使用。
或者，具有攜酯接頭或亞胺基團(tuán)作為活化基團(tuán)的茚地那韋衍生物可例如使用攜帶合適的前體基團(tuán)如末端腈基團(tuán)的接頭來(lái)獲得。舉例說(shuō)，可按類似上述的方式合成攜帶末端腈的茚地那韋衍生物，然后通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，例如通過(guò)用氯化氫的醇溶液處理，將腈轉(zhuǎn)化成亞氨酸酯部分(亞酰胺基亞氨酸酯基團(tuán))。另參見(jiàn)Hermanson，出處同上；和Jerry March，Advanced Organic Chemistry，第3版，JohnWiley&Sons，1985。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)想到其它獲得亞胺基酯的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及從茚滿羥基出發(fā)引出的茚地那韋衍生物。這些活化半抗原具有以下結(jié)構(gòu)
其中Y為O、S或NH，m為0或1，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起。A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺、硫內(nèi)酯和醛的活化官能度。
茚地那韋含有兩個(gè)仲羥基——茚滿羥基和中心羥基，先保護(hù)茚滿環(huán)的羥基可能是有必要的。選擇性修飾要求在對(duì)茚地那韋的中心羥基進(jìn)行保護(hù)后，用亞異丙基環(huán)狀系統(tǒng)將茚地那韋茚滿環(huán)的羥基橋接到鄰近的酰胺氮而對(duì)該羥基進(jìn)行保護(hù)。許多合適的保護(hù)基是本領(lǐng)域公知的。參見(jiàn)例如“Protective Groups in Organic Synthesis”，第2版，T.Greene和P.Wuts，Wiley-Interscience，1991。
中心羥基可被保護(hù)成甲硅烷基保護(hù)基，例如TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)或TBDPS(叔丁基二苯基甲硅烷基)。也可用酯基團(tuán)來(lái)保護(hù)亞異丙基保護(hù)的茚地那韋的中心羥基官能度，優(yōu)選為堿尤其是三乙胺存在下的苯甲酸酯基團(tuán)。見(jiàn)實(shí)施例2和圖5的化合物8。通過(guò)?；磻?yīng)對(duì)中心羥基的保護(hù)是在合適的溶劑如DMF優(yōu)選THF中進(jìn)行通常0.5小時(shí)至7天的時(shí)間。在亞異丙基基團(tuán)脫保護(hù)后，可對(duì)茚滿羥基進(jìn)行修飾，以在附著點(diǎn)產(chǎn)生尿烷鍵。茚地那韋的茚滿羥基也可修飾成在附著點(diǎn)產(chǎn)生醚鍵，而中心羥基則被保護(hù)成甲硅烷基。例如，在中心羥基位置有TBDMS保護(hù)的茚地那韋衍生物的亞異丙基可在酸性條件下脫保護(hù)，所釋放出的茚滿羥基可用鹵烷基化劑使其經(jīng)歷烷基化條件形成醚鍵，所述鹵烷基化劑攜有受保護(hù)的羧酸或適當(dāng)保護(hù)的官能度，如被保護(hù)成鄰苯二甲酰亞胺的氨基。在羧基上有或沒(méi)有保護(hù)基的羧基烷基異氰酸酯可直接與茚地那韋的目標(biāo)羥基反應(yīng)，產(chǎn)生受保護(hù)的羧基尿烷或羧基芳基尿烷。受保護(hù)的羧基優(yōu)選是在堿性或酸性條件下被除去的酯?？蓪Ⅳ然D(zhuǎn)化成活性酯以便隨后進(jìn)行綴合，或者可將其直接綴合到多肽、多糖和標(biāo)記。或者，可使預(yù)活化的羧基烷基異氰酸酯或羧基芳基異氰酸酯如異氰酸基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯直接與茚地那韋羥基反應(yīng)。
替代性的羧酸活化是通過(guò)酸酐形成來(lái)進(jìn)行。一般地，使羧酸與氯甲酸烷基酯如氯甲酸異丁酯在通常-30℃至+30℃、常常-20℃至0℃的溫度下，在叔胺如三乙胺或N-甲基嗎啉存在下，在溶劑如DMF或THF中反應(yīng)。然后使混合的酸酐與標(biāo)記、蛋白質(zhì)或肽上的氨基反應(yīng)，產(chǎn)生穩(wěn)定的酰胺綴合物。
連接有羧酸的蛋白酶抑制劑的另一種活化方法是，通過(guò)用諸如同型半胱氨酸硫內(nèi)酯的物質(zhì)將羧酸基團(tuán)偶聯(lián)，轉(zhuǎn)化成掩蔽的巰基基團(tuán)如硫內(nèi)酯(美國(guó)專利第5,302,715號(hào))。所得的接頭-硫內(nèi)酯然后可用溫和的堿脫掩蔽，產(chǎn)生的末端硫醇接著與諸如馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)或溴乙酰基團(tuán)或碘乙?；鶊F(tuán)(這些基團(tuán)如在馬來(lái)酰亞胺基或鹵乙酰基修飾的肽、多糖、聚氨基酸和標(biāo)記上)的部分反應(yīng)，產(chǎn)生硫醇-馬來(lái)酰亞胺或硫醇-乙酰加合物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及產(chǎn)生茚地那韋M6的方法。這個(gè)一步還原反應(yīng)可在如下氫化條件下進(jìn)行使用例如10％Pd-C、5％Pd-C、甲酸銨/Pd-C和20％氫氧化靶-C的催化劑，在例如甲醇、乙醇、乙酸或THF尤其是甲醇的溶劑中，在室溫下和1atm至60psi的壓力下。
所得的茚地那韋M6可用來(lái)如下所述制備新的茚地那韋半抗原衍生物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，茚地那韋衍生物從下式所示的吡啶環(huán)或苯環(huán)出發(fā)引出 其中Y為O、S或NH，m為0或1，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起。A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐和馬來(lái)酰亞胺的活化官能度。
可將適當(dāng)官能化和保護(hù)的烷基鹵代吡啶衍生物在堿性條件下與茚地那韋M6偶聯(lián)。茚地那韋M6的哌嗪部分的環(huán)狀仲胺基團(tuán)與適當(dāng)官能化和保護(hù)的甲酰吡啶衍生物的偶聯(lián)反應(yīng)也可在還原性胺化條件下進(jìn)行，產(chǎn)生相同的產(chǎn)物。
適當(dāng)保護(hù)的烷基鹵代苯衍生物和芳族醛衍生物也可按類似的方式使用以偶聯(lián)到茚地那韋M6(見(jiàn)實(shí)施例21和圖12)。也可使用適當(dāng)官能化的脂族鹵代烷基接頭在堿性條件下，或者使用適當(dāng)官能化的脂族醛或市售的琥珀醛在還原性胺化條件下，用類似上述的化學(xué)方式將脂族接頭附著到茚地那韋M6的哌嗪部分。例如，化合物16(圖10)可用琥珀半醛在氰基硼氫化鈉存在下制備。
這些活化半抗原具有以下結(jié)構(gòu)
其中Y為O、S或NH，m為0或1，L為由0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和0-20個(gè)雜原子組成的脂族連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起。A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐和馬來(lái)酰亞胺的活化官能度。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及具有選自以下的結(jié)構(gòu)的免疫原
其中X為N或C，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還包含最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖、合成聚合物和非同位素標(biāo)記，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字，另外的條件是在結(jié)構(gòu)VIII中，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還包含0-20個(gè)雜原子的脂族連接基團(tuán)。
免疫原性載體通常是分子量大于10kD的多肽或多糖。優(yōu)選的載體物質(zhì)的實(shí)例包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、美洲鱟血藍(lán)蛋白(LPH)和牛甲狀腺球蛋白(BTG)。如前所述的活化半抗原衍生物和載體上的氨基之間的反應(yīng)，通常在水和水混溶性有機(jī)溶劑如DMSO的緩沖混合物中在室溫下進(jìn)行0.5-5天。緩沖液的pH通常對(duì)于活性酯、異氰酸酯和異硫氰酸酯為6-8，或者對(duì)于亞氨基酯為7-10，并根據(jù)載體氨基和活化官能度的已知反應(yīng)性加以調(diào)整。在末端基團(tuán)A為馬來(lái)酰亞胺的情況下，載體上的反應(yīng)基團(tuán)為巰基。這些巰基基團(tuán)為載體本來(lái)所有，或者可用硫醇化試劑如2-IT或SATP引入。馬來(lái)酰亞胺綴合到巰基基團(tuán)以產(chǎn)生硫醚的最佳pH通常為5-7。反應(yīng)后，將免疫原透析或進(jìn)行尺寸排阻層析，以除去未綴合的半抗原和有機(jī)溶劑。
獲得免疫原的替代性方法是，使其中活化基團(tuán)為醛的活化半抗原與載體蛋白質(zhì)或多肽的氨基反應(yīng)形成席夫堿，然后用溫和的還原劑如硼氫化氰還原形成穩(wěn)定的胺鍵。這后一方法的變化方案也是本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)想到的。
為產(chǎn)生抗體，可通過(guò)再水化凍干免疫原形成免疫原溶液或混懸液，制備供注射到宿主動(dòng)物中的免疫原?；蛘撸庖咴勺鳛轭A(yù)先制備好的液體溶液或作為緩沖液中的混懸液來(lái)使用。然后再將免疫原溶液與佐劑如弗氏佐劑組合形成免疫原混合物。免疫原可在多個(gè)部位，以數(shù)個(gè)劑量，一次或多次，在許多星期時(shí)間里給予。
用本發(fā)明的免疫原進(jìn)行的多克隆抗體制備可遵循本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何常規(guī)技術(shù)。通常，給宿主動(dòng)物如兔、山羊、小鼠、豚鼠或馬注射免疫原混合物。再進(jìn)行更多的注射，同時(shí)測(cè)定血清的抗體滴度，直到確定已達(dá)到最佳滴度。然后將宿主動(dòng)物放血，產(chǎn)出合適體積的特異性抗血清。如有需要，可進(jìn)行純化步驟以除去不需要的材料如非特異性抗體，直到抗血清被認(rèn)為適合用于進(jìn)行測(cè)定。
單克隆抗體可通過(guò)用聚乙二醇方法如Methods in Enzymology 73(Part B)，第3-46頁(yè)，1981中描述的技術(shù)，使來(lái)自如上所述進(jìn)行免疫的小鼠的小鼠淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交來(lái)獲得。
在ELISA測(cè)定的情況下，優(yōu)選用偶聯(lián)到牛血清白蛋白(BSA)的茚地那韋衍生物來(lái)包覆微量滴定板。
對(duì)于茚地那韋和非放射性標(biāo)記的綴合物的合成，采用與免疫原制備類似的程序。
或者，可將活化半抗原綴合到酶上的氨基或巰基基團(tuán)，以制備供ELISA應(yīng)用的標(biāo)記。其綴合物為本領(lǐng)域公知的用于ELISA的酶實(shí)例是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。蛋白質(zhì)(包括酶)的綴合物通常是在水和水混溶性有機(jī)溶劑的緩沖混合物中制備，然后按與免疫原制備類似的條件進(jìn)行透析。在乳膠凝集試驗(yàn)的情況下，與分子量在10kD至300kD之間、優(yōu)選40kD的胺化葡聚糖載體所成的綴合物尤其有用。這些綴合物如上所述在緩沖溶劑混合物中制備，或者在含有用以促進(jìn)反應(yīng)的叔胺如三乙胺的無(wú)水有機(jī)溶劑如DMSO中制備。在小分子量(即小于1kD)標(biāo)記的情況下，根據(jù)該標(biāo)記的性質(zhì)調(diào)整反應(yīng)條件。一種特別優(yōu)選的標(biāo)記是與標(biāo)記親和素或鏈霉親和素組合的生物素。(鏈霉)親和素/生物素系統(tǒng)對(duì)非同位素檢測(cè)的多功能性是生物綴合物化學(xué)領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)Hermanson，出處同上)。有多種親和素和鏈霉親和素的酶和熒光團(tuán)標(biāo)記綴合物市售，供以高親和力相互作用來(lái)檢測(cè)生物素標(biāo)記的物質(zhì)。此外，有多種生物素?；瘎┦惺郏┡c活化官能度A反應(yīng)。例如，生物素-胺衍生物可與本發(fā)明的其中A為活性酯、異氰酸酯或異硫氰酸酯的活化半抗原反應(yīng)，分別產(chǎn)生生物素酰胺、生物素脲和生物素硫脲綴合物。這些偶聯(lián)反應(yīng)通常在含有有機(jī)堿如三乙胺的偶極非質(zhì)子溶劑如DMF或DMSO中室溫下進(jìn)行0.5-5天。生物素綴合物優(yōu)選通過(guò)色譜方法如反相HPLC分離。
其它的優(yōu)選標(biāo)記是熒光團(tuán)如熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、丹磺酰和花菁染料(例如Cy-5)，它們的許多活化衍生物可市售獲得。一般地，這些綴合物可如同生物素綴合物在含有叔胺的偶極非質(zhì)子溶劑制備，然后進(jìn)行色譜分離。
還有可能使用間接偶聯(lián)到檢測(cè)系統(tǒng)的報(bào)道基團(tuán)作為標(biāo)記。一個(gè)實(shí)例是如上所述的生物素。另一個(gè)實(shí)例是如2001年1月4日公布的PCT出版物WO 200101135所描述的用以抑制肌苷一磷酸脫氫酶的霉酚酸衍生物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道可能還有其它非放射性標(biāo)記，包括電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記如聯(lián)吡啶釕衍生物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記如吖啶酯、電化學(xué)介體和多種微顆粒和納米顆粒，它們?cè)谄渖线m當(dāng)引入合適的親核基團(tuán)如胺或硫醇后用于本發(fā)明，供與HIV蛋白酶抑制劑活化半抗原上的活化基團(tuán)A進(jìn)行反應(yīng)。
在下文的實(shí)施例中，黑體字?jǐn)?shù)字指附圖中所示的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)。這些實(shí)施例只為說(shuō)明而提出，并不意圖限制本發(fā)明。
具體實(shí)施方案所有溶劑均獲自J.T.Baker，除非另有規(guī)定。分析型反相RP-HPLC分析在配置有二極管陣列檢測(cè)器和四元泵的Agilent HP1100 LC/MS系統(tǒng)上進(jìn)行。LC/MS分析用裝備有帶AJO-4287(C-180DS)筒的Phenomenex KJO-4282 guard kit的Vydac 218TP54柱(300A，5μ；C18，4.6mm×250mm)進(jìn)行。色譜流在柱后流出到MS檢測(cè)器中。所采用的MSD以電噴霧正離子模式“ES(+)模式”運(yùn)行。
HPLC級(jí)分的凍干，除另有規(guī)定外，如下進(jìn)行減壓蒸發(fā)乙腈，接著用例如干冰/丙酮浴冷凍含水殘余物，然后用冷凍干燥器冷凍干燥。
制備型HPLC使用了以下Varian DYNAMAX(Rainin)徑向壓縮柱柱之一。HpLC工作用含0.1％三氟乙酸的水-乙腈梯度系統(tǒng)進(jìn)行。
R00083221C(Microsorb 60-8，C-18；250mm×21.4mm)，帶VarianDYNAMAX(Rainin)guard module R00083221G(C-18，8μ)。
R00083241C(Microsorb 60-8，C-18；250mm×41.4mm)，帶VarianDYNAMAX(Rainin)guard module R00083241G(C-18,8μ)。
實(shí)施例1N-(1(S)，2(R)-2，2-二甲基茚滿基唑)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-羥基-5-[1-[4-(3-吡啶基甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(7)給燒瓶裝配上磁力攪拌棒、回流冷凝器和連接有氬氣入口的隔板。在室溫下，給該反應(yīng)燒瓶一并裝入1g(1.4mmol)硫酸茚地那韋(1)、33ml(28.7mmol)乙酸異丙酯、10ml無(wú)水DMF、2.0ml(52.5mmol)2-甲氧基丙烯接著是1.8gm(15.5mmol)對(duì)甲苯磺酸吡啶嗡鹽。然后在40℃下攪拌加熱反應(yīng)1.5小時(shí)。通過(guò)LC/MS監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，指示反應(yīng)的結(jié)束。然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入1.0g氫氧化鋰，讓反應(yīng)混合物攪拌約5分鐘。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓除去溶劑。然后將所得的物料再溶于水中，用乙酸乙酯萃取。合并有機(jī)相，用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑。然后將粗油在硅膠柱上以20∶1 CHCl3∶MeOH洗脫進(jìn)行純化。收集Rf0.43的含產(chǎn)物級(jí)分，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，真空干燥，得乳白色粉末產(chǎn)物，收率86％(0.72g)，MS(m/z)654.4(M+H)。見(jiàn)圖5。
實(shí)施例2N-(1(S)，2(R)-2，2-二甲基茚滿基唑)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-苯甲酰基-5-[1-[4-(3-吡啶基甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(8)給燒瓶裝配上磁力攪拌棒和連接有氬氣入口的隔板。給該燒瓶裝入0.67g(0.44mmol)7、10ml無(wú)水DMF、738μL(5.3mmol)Et3N。將混合物加熱直至65℃，并在該溫度下滴加1.0g(4.4mmol)溶于5ml無(wú)水DMF中的苯甲酸酐。然后將反應(yīng)混合物加熱至80℃保持3天，通過(guò)LC/MS監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，減壓除去溶劑。然后通過(guò)制備型HPLC梯度運(yùn)行含0.1％三氟乙酸的乙腈-水溶劑系統(tǒng)對(duì)粗油進(jìn)行純化。收集含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得0.30g所需產(chǎn)物，收率89％。MS(EI)758.4(M+H)。見(jiàn)圖5。
實(shí)施例3N-(2R-羥基-1(S)-茚滿基)-2R-(苯基甲基)-4(S)-苯甲?；?5-[1-[4-(3-吡啶基甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(9)給燒瓶裝配上磁力攪拌棒和連接有氬氣入口的隔板。給該燒瓶裝入受保護(hù)的茚地那韋衍生物8，然后是10ml的三氟乙酸∶二氯甲烷的1∶1混合物。在室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)。粗物料的LC/MS證實(shí)反應(yīng)已完成。然后在高真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，通過(guò)制備型HPLC梯度運(yùn)行含0.1％三氟乙酸的乙腈-水溶劑系統(tǒng)對(duì)粗物料進(jìn)行純化。收集含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得77％(0.22g)所需產(chǎn)物9。MS(EI)741.3[(M+H)+Na]，718.3(M+H)，586.3，359.7，298.7，133.1，HRMSC43H51N5O5計(jì)算值718.3963；實(shí)測(cè)值718.3967，[α]20D＝-28.42°(C＝1.034，CH2Cl2)。見(jiàn)圖5。
實(shí)施例4N-(2(R)-(4-甲酰氨基丁酸乙酯)-1(S)-茚滿基)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-苯甲酰基-5-[1-[4-(3-吡啶基甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(10)給燒瓶裝配上磁力攪拌棒和連接有氬氣入口的隔板。給燒瓶裝入220mg(0.30mmol)茚地那韋衍生物9和1.2ml(9.2mmol)Et3N的無(wú)水THF溶液。向反應(yīng)混合物中加入0.90ml(11.5mmol)4-異氰酸基丁酸乙酯，然后在80℃下加熱反應(yīng)2天。LC/MS證實(shí)產(chǎn)物的形成。將反應(yīng)冷卻至室溫，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，通過(guò)制備型HPLC梯度運(yùn)行含0.1％三氟乙酸的乙腈-水溶劑系統(tǒng)對(duì)殘余物進(jìn)行純化。收集含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得87％(235g)所需產(chǎn)物。MS(EI)875.4(M+H)，438.3，359.7，158.1。見(jiàn)圖5。
實(shí)施例5N-(2(R)-(4-甲酰氨基丁酸)-1(S)-茚滿基)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-羥基-5-[1-[4-(3-吡啶基甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(11)向含有235mg(0.268mmol)10的燒瓶中加入10mL甲醇和10ml1N NaOH水溶液。在室溫下攪拌反應(yīng)1天。通過(guò)LC/MS監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，指示產(chǎn)物形成的完成。減壓濃縮反應(yīng)混合物，通過(guò)制備型HPLC梯度運(yùn)行含0.1％三氟乙酸的乙腈-水溶劑系統(tǒng)對(duì)殘余物進(jìn)行純化。收集合產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得96％(190g)產(chǎn)物11。MS(EI)766.3(M+Na)，743.3(M+H)，372.1，307.7，60.1。見(jiàn)圖5。
實(shí)施例6N-(2(R)-[(4-甲酰氨基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯)]-1(S)-茚滿基)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-羥基-5-[1-[4-(3-吡啶基甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(12)給50-ml圓底燒瓶裝配上磁力攪拌棒和連接有氬氣入口的隔板。在0℃下，給燒瓶裝入190mg(0.25mmol)11、5ml無(wú)水THF、0.133ml(0.74mmol)的無(wú)水二異丙基乙胺和207mg(0.69mmol)四氟硼酸O-(N-琥珀酰亞胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲。讓反應(yīng)混合物升溫至室溫，在該溫度下攪拌24小時(shí)，減壓濃縮。殘余物在制備型HPLC上用含0.1％三氟乙酸的水-乙腈梯度系統(tǒng)進(jìn)行純化。合并含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得57g(27％)白色固體產(chǎn)物12。MS(m/z)840.4(M+H)，725.4，482.3，420.7，298.7，130.2。見(jiàn)圖5。
實(shí)施例7從茚滿環(huán)出發(fā)的茚地那韋-BSA綴合物(13A)將0.34g牛血清白蛋白(BSA)于5.8mL 50mM磷酸鉀(pH7.5)中的溶液在冰浴中冷卻。向該溶液中滴加8.5mL DMSO，使反應(yīng)混合物維持在低于室溫。向該蛋白質(zhì)溶液滴加15mg(0.017mmol)茚地那韋衍生物(12)于1.5mL無(wú)水DMF中的溶液。讓反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。將所產(chǎn)生的綴合物放入透析管(截留分子量10,000)，室溫下在1L的70％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(pH7.5，3次換液，每次至少3小時(shí))、1L的50％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))、1L的30％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))、1L的10％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))中透析，然后在4℃下用50mM磷酸鉀(pH7.5)換液6次(每次1L，每次至少6小時(shí))。蛋白質(zhì)濃度用Biorad考馬斯藍(lán)蛋白質(zhì)測(cè)定法(Bradford，M.，Anal.Biochem.72，248，1976)測(cè)出為14mg/mL。共獲得21.5mL綴合物。見(jiàn)圖6。
實(shí)施例8從茚滿環(huán)出發(fā)的茚地那韋-KLH綴合物(13B)將72mg匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)于2mL 50mM磷酸鉀(pH7.5)中的溶液在冰浴中冷卻。向反應(yīng)混合物溶液中滴加4.7mL DMSO，并使反應(yīng)溫度維持在低于室溫。然后向該蛋白質(zhì)溶液滴加16.7mg(0.018mmol)5于670μL DMF中的溶液。讓混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將所產(chǎn)生的綴合物放入透析管(截留分子量10,000)，室溫下在1L的70％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(pH7.5，3次換液，每次至少3小時(shí))、1L的50％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))、1L的30％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))、1L的10％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))中透析。蛋白質(zhì)濃度用Biorad考馬斯藍(lán)蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)出為11mg/mL。可利用的賴氨酸修飾程度通過(guò)TNBS方法(Habeeb AFSA，Anal.Biochem.14，328-34，1988)測(cè)出為46％。見(jiàn)圖6。
實(shí)施例9三氟乙酸N-(2(R)-羥基-1(S)-茚滿基)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-羥基-5-[1-[4-(3-{1-(3-叔丁氧基羰基丙基)}吡啶基甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(3)向裝配上磁力攪拌棒和連接有氬氣入口的隔板的燒瓶加入0.2g(0.28mmol)硫酸茚地那韋、5-ml無(wú)水DMF接著是72μl(0.56mmol)Et3N。通過(guò)注射器向此攪拌下的溶液加入0.43g(1.96mmol)4-溴丁酸叔丁酯。然后將燒瓶中的內(nèi)容物在80℃下加熱16小時(shí)。粗物料的LC/MS證實(shí)產(chǎn)物的形成，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑。然后將殘余物在制備型HPLC上用含0.1％三氟乙酸的水-乙腈梯度系統(tǒng)進(jìn)行純化。合并含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得71％(0.174gm)單烷基化產(chǎn)物。此時(shí)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)未知，因?yàn)榭赡馨l(fā)生烷基化的位點(diǎn)有多個(gè)。
偶然發(fā)現(xiàn)的是，親電體的烷基化發(fā)生在吡啶環(huán)的氮上，產(chǎn)生相應(yīng)的吡啶陽(yáng)離子。其結(jié)構(gòu)用IH NMR和NOE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行解析。鄰近吡啶氮的亞甲基質(zhì)子顯示為4.70ppm處的三重峰。被照射時(shí)這些亞甲基質(zhì)子(4.70ppm處)在鄰近吡啶基氮原子的兩個(gè)Hα次甲基質(zhì)子上于8.9ppm和9.02ppm處顯示NOE效應(yīng)，該效應(yīng)確切地指示了烷基化吡啶環(huán)，從而確定了產(chǎn)物3的結(jié)構(gòu)。MS(EI)756.4(M+H)，378.7，330.2，133.1，HRMSC44H62N5O6計(jì)算值756.4695，實(shí)測(cè)值756.4693。見(jiàn)圖7。
實(shí)施例10三氟乙酸N-(2(R)-羥基-1(S)-茚滿基)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-羥基-5-[1-[4-(3-{1-(3-丁酸)}吡啶基甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(4)向0.165g(0.19mmol)3加入10ml 1∶1三氟乙酸∶二氯甲烷。在室溫下攪拌反應(yīng)30分鐘。粗反應(yīng)混合物的LC/MS顯示只有產(chǎn)物峰。將反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。殘余物在制備型HPLC上用含0.1三氟乙酸的水-乙腈梯度系統(tǒng)進(jìn)行純化。合并含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得38％(0.059gm)產(chǎn)物4。MS(EI)700.3(M+H)，568.3，551.3，350.8，341.7，133.1.，HRMSC40H54N5O6計(jì)算值700.4069，實(shí)測(cè)值700.4075，[α]20D＝+30.5°(C＝1.0，CH2Cl2)。見(jiàn)圖7。
實(shí)施例11三氟乙酸N-(2(R)-羥基-1(S)-茚滿基)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-羥基-5-[1-[4-(3-{1-(4-N-丁酸琥珀酰亞胺酯)}吡啶基甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(5)給50-ml圓底燒瓶(之前在真空下用空氣加熱槍干燥過(guò))裝配上磁力攪拌棒和連接有氬氣入口的隔板。給燒瓶一并裝入20mg(0.024mmol)4、5ml無(wú)水THF、12μl Et3N接著是19.9mg(0.066mmol)四氟硼酸[O-(N-琥珀酰亞胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲。在0℃下攪拌反應(yīng)，在6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)升溫至室溫。粗反應(yīng)混合物的LC/MS表明有產(chǎn)物形成，將反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。殘余物在制備型HPLC上用含0.1％三氟乙酸的水-乙腈梯度系統(tǒng)進(jìn)行純化。合并含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得94.14％(21.0mg)產(chǎn)物。MS(EI)797.3(M+H)，648.3，399.2，324.7，HRMSC44H57N6O8計(jì)算值797.4233，實(shí)測(cè)值797.4237.，[α]D20＝+44.06°(C＝1.0，CH2Cl2)。見(jiàn)圖7。
實(shí)施例12從吡啶基環(huán)出發(fā)的茚地那韋-BSA綴合物(6A)將0.23g牛血清白蛋白(BSA)于2.4mL 50mM磷酸鉀(pH7.5)中的溶液在冰浴中冷卻。向溶液中滴加4.25mL mL DMSO，使反應(yīng)混合物維持在低于室溫。向此蛋白質(zhì)溶液滴加15mg(0.016mmol)茚地那韋衍生物(5)的1.5mL無(wú)水DMF溶液。讓反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。將所產(chǎn)生的綴合物放入透析管(截留分子量10,000)，室溫下在1L的70％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(pH 7.5，3次換液，每次至少3小時(shí))、1L的50％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))、1L的30％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))、1L的10％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))中透析，然后在40℃下用50mM磷酸鉀(pH7.5)換液6次(每次1L，每次至少6小時(shí))。蛋白質(zhì)濃度用Biorad考馬斯藍(lán)蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)出為12mg/mL。共獲得18mL綴合物。見(jiàn)圖7。
實(shí)施例13從吡啶基環(huán)出發(fā)的茚地那韋-KLH綴合物(6B)將54mg匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)于1.5mL 50mM磷酸鉀(pH7.5)中的溶液在冰浴中冷卻。向反應(yīng)混合物溶液中滴加4.7mL DMSO，并使反應(yīng)溫度維持在低于室溫。然后向該蛋白質(zhì)溶液滴加16.7mg(0.018mmol)5的670μL DMF溶液。讓混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將所產(chǎn)生的綴合物放入透析管(截留分子量10,000)，室溫下在1L的70％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(pH 7.5，3次換液，每次至少3小時(shí))、1L的50％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))、1L的30％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))、1L的10％DMSO的50mM磷酸鉀溶液(至少3小時(shí))中透析。蛋白質(zhì)濃度用Biorad考馬斯藍(lán)蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)出為11mg/mL?？衫玫馁嚢彼嵝揎棾潭韧ㄟ^(guò)TNBS方法測(cè)出為46％。見(jiàn)圖7。
實(shí)施例14M6-茚地那韋代謝物(2)向裝配上磁力攪拌棒的燒瓶加入0.30g(0.4214mmol)硫酸茚地那韋(1)、30ml甲醇接著是40mg 20wt％Pd(OH)2/C催化劑。真空除去反應(yīng)容器中的空氣，并引入1atm氫氣。然后在室溫下攪拌反應(yīng)16小時(shí)。屆時(shí)粗物料的LC/MS證實(shí)反應(yīng)完成。然后將粗物料濾過(guò)CELITE墊，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，真空干燥，得99％(0.2187g)產(chǎn)物。MP＝147℃，TLC(硅膠)Rf＝0.35(MeOH)，MS(EI)523.3(M+H)，HRMS計(jì)算值C30H42N4O4523.3279，實(shí)測(cè)值523.3282，[α]D20＝+13.32°(C＝1.036，CH2Cl2)。
實(shí)施例15N-(2(R)-羥基-1(S)-茚滿基)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-羥基-5-[1-[4-(4-苯甲酸甲基)-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(14)向裝配上磁力攪拌棒的燒瓶加入無(wú)水CH2Cl2中的70mg(0.1346mmol)茚地那韋M6(2)，接著加入24mg(0.16mmol)4-羧基苯甲醛和16.8mg(0.26mmol)氰基硼氫化鈉。接著將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1天。然后用水將其猝滅，用3×20ml CH2Cl2萃取。合并有機(jī)相，用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑。然后將粗混合物在硅膠柱上用1∶1己烷∶乙酸乙酯洗脫進(jìn)行純化，得80％(71mg)。MS(m/z)＝657.3(M+H)。見(jiàn)圖9。
實(shí)施例164-{3-叔丁基氨基甲酰基-4-[2-羥基-4-(2-羥基-茚滿-1-基氨基甲?；?-5-苯基戊基]-哌嗪-1-基甲基}苯甲酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(15)給50-ml圓底燒瓶(之前在真空下用空氣加熱槍干燥過(guò))裝配上磁力攪拌棒和連接有氬氣入口的隔板。給燒瓶一并裝入20mg(0.03mmol)14、5ml無(wú)水THF、12μl Et3N接著是19.9mg(0.06mmol)四氟硼酸[O-(N-琥珀酰亞胺基-N，N，N′，N′-四甲基脲。將反應(yīng)在0℃下攪拌升溫至室溫，讓反應(yīng)在該溫度下攪拌6小時(shí)。將反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，在制備型HPLC上純化，得到所需產(chǎn)物。見(jiàn)圖9。
實(shí)施例17N-(2(R)-羥基-1(S)-茚滿基)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-羥基-5-[1-[4-丁酸]])-2(S)-(N-叔丁基氨基甲酰基)哌嗪基]]戊酰胺(16)
向裝配上磁力攪拌棒和隔板的燒瓶加入0.1g(0.19mmol)茚地那韋M6(2)、10ml無(wú)水CH2Cl2接著是0.012g(0.19mmol)氰基硼氫化鈉和0.025g(0.23mmol)琥珀半醛(15％重量水溶液)。在室溫下攪拌反應(yīng)過(guò)夜。然后將反應(yīng)用20ml去離子水猝滅，用3N HCl酸化，用3×20ml二乙醚萃取。合并有機(jī)相，用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑。然后將其在制備型HPLC上用含0.1％三氟乙酸的水-乙腈梯度系統(tǒng)進(jìn)行純化。合并含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得68mg(42％)收率。MS(m/z)＝609.3(M+H)，477.3，133.1。見(jiàn)圖10。
實(shí)施例184-{3-叔丁基氨基甲酰基-4-[2-羥基-4-(2-羥基-茚滿-1-基氨基甲?；?-5-苯基戊基]-哌嗪-1-基}-丁酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(17)給50ml無(wú)水圓底燒瓶裝配上磁力攪拌棒和連接有氬氣入口的隔膜。給燒瓶一并裝入0.032mmol(20mg)16、5ml無(wú)水THF、12μl Et3N接著是0.06mmol(19.9mg)四氟硼酸[O-(N-琥珀酰亞胺基-N，N，N′，N′-四甲基脲。在0℃下攪拌反應(yīng)，在6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)逐漸升溫至室溫。將反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，在制備型HPLC上純化，得到所需的活性酯17。見(jiàn)圖10。
實(shí)施例19N-(2(R)-羥基-1(S)-茚滿基)-2(R)-(苯基甲基)-4(S)-羥基-5-[1-[4-(2-吡啶甲酸甲酯基甲基)]]-2(S)-(N-叔丁基氨基甲?；?哌嗪基]]戊酰胺(18)向裝配上磁力攪拌棒和隔板的燒瓶加入50mg(0.095mmol)茚地那韋M6(2)、4-ml無(wú)水DMF、15μl無(wú)水Et3N接著是0.024g(0.10mmol)2-溴甲基吡啶-6-甲酸甲酯。在室溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí)，通過(guò)LC/MS監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。然后在高真空上除去溶劑，在制備型HPLC上純化物料。合并含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得24.7mg(38％)產(chǎn)物。MS(m/z)＝694.3(M+Na)，672.3(M+H)，540.3，336.7，133.1。見(jiàn)圖11。
實(shí)施例206-{3-叔丁基氨基甲酰基-4-[2-羥基-4-(2-羥基-茚滿-1-基氨基甲?；?-5-苯基戊基-哌嗪-1-基甲基}-吡啶-2-甲酸(19)向含有25mg(0.037mmol)18的燒瓶中加入3mL甲醇和3ml 1NNaOH水溶液。在室溫下攪拌反應(yīng)1天。LC/MS證實(shí)產(chǎn)物形成完全。將反應(yīng)混合物減壓濃縮，通過(guò)制備型HPLC梯度運(yùn)行含0.1％三氟乙酸的乙腈-水溶劑系統(tǒng)對(duì)殘余物進(jìn)行純化。合并含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得所需的產(chǎn)物19。見(jiàn)圖11。
實(shí)施例216-{3-叔丁基氨基甲?；?4-[2-羥基-4-(2-羥基-茚滿-1-基氨基甲?；?-5-苯基戊基]-哌嗪-1-基甲基}-吡啶-2-甲酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(20)給50-ml無(wú)水圓底燒瓶裝配上磁力攪拌棒和連接有氬氣入口的隔膜。給燒瓶一并裝入20mg(0.030mmol)茚地那韋酸19、5ml無(wú)水THF、12μl Et3N接著是19.9mg(0.06mmol)四氟硼酸[O-(N-琥珀酰亞胺基-N，N，N′，N′-四甲基脲。在0℃下攪拌反應(yīng)，逐漸升溫至室溫。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌6小時(shí)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。殘余物在制備型HPLC上用含0.1％三氟乙酸的乙腈-水溶劑系統(tǒng)以梯度運(yùn)行進(jìn)行純化。合并含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得所需的產(chǎn)物20。見(jiàn)圖11。
實(shí)施例225-{3-叔丁基氨基甲?；?4-[2-羥基-4-(2-羥基-茚滿-1-基氨基甲?；?-5-苯基戊基]-哌嗪-1-甲基}-吡啶-2-甲酸乙酯(21)向裝配上磁力攪拌棒和隔板的圓底燒瓶加入無(wú)水CH2Cl2中70mg(0.13mmol)茚地那韋M6(2)，接著加入0.16mmol(26mg)5-甲酰-2-吡啶甲酸乙酯(US 4,526,787)和16.8mg(0.26mmol)氰基硼氫化鈉。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1天。將反應(yīng)混合物用是猝滅，用3×20mlCH2Cl2萃取。合并有機(jī)相，用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑。然后將粗混合物在硅膠柱上進(jìn)行純化，得到所需產(chǎn)物。見(jiàn)圖12。
實(shí)施例235-{3-叔丁基氨基甲酰基-4-[2-羥基-4-(2-羥基-茚滿-1-基氨基甲?；?-5-苯基戊基]-哌嗪-1-基甲基}-吡啶-2-甲酸(22)向含有25mg(0.037mmol)21的燒瓶中加入3mL甲醇和3ml 1NNaOH水溶液。在室溫下攪拌反應(yīng)1天。LC/MS證實(shí)產(chǎn)物形成完全。將反應(yīng)混合物減壓濃縮，通過(guò)制備型HPLC梯度運(yùn)行含0.1％三氟乙酸的乙腈-水溶劑系統(tǒng)對(duì)殘余物進(jìn)行純化。收集含產(chǎn)物的級(jí)分，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，凍干，得到所需的產(chǎn)物。見(jiàn)圖12。
實(shí)施例245-{3-叔丁基氨基甲酰基-4-[2-羥基-4-(2-羥基-茚滿-1-基氨基甲?；?-5-苯基戊基]-哌嗪-1-基甲基}-吡啶-2-甲酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(23)向20mg(0.030mmol)22的5ml無(wú)水THF溶液中加入12μl Et3N接著是19.9mg(0.06mmol)四氟硼酸[O-(N-琥珀酰亞胺基-N，N，N′，N′-四甲基脲。在0℃下攪拌反應(yīng)，升溫至室溫。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌6小時(shí)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。殘余物在制備型HPLC上梯度運(yùn)行含0.1％三氟乙酸的乙腈-水溶劑系統(tǒng)進(jìn)行純化。合并含產(chǎn)物的級(jí)分，凍干，得到所需的產(chǎn)物。見(jiàn)圖12。
實(shí)施例25免疫測(cè)定模式的原理本文描述的茚地那韋測(cè)定模式是均勻微顆粒免疫測(cè)定。它是用以檢測(cè)血清中的茚地那韋的兩試劑系統(tǒng)。微顆粒在溶液(KTMS)中的動(dòng)力學(xué)相互作用已用Roche Diagnostics/Hitachi系列的自動(dòng)分析儀測(cè)量。在這個(gè)技術(shù)中，已將茚地那韋抗體共價(jià)偶聯(lián)到微顆粒上，藥物衍生物連接到大分子(氨基葡聚糖)。藥物綴合物和血清樣品中的任何茚地那韋之間發(fā)生與微顆粒上的有限數(shù)量特異性茚地那韋抗體結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)。微顆粒在溶液中的動(dòng)力學(xué)相互作用由藥物綴合物與微顆粒上的抗體的結(jié)合引起，受樣品中茚地那韋的存在所抑制。
茚地那韋抗體按US 2004/40127689描述從茚地那韋免疫原制備。
實(shí)施例26從茚滿環(huán)出發(fā)的茚地那韋-氨基葡聚糖綴合物(13C)氨基葡聚糖(分子量40,000)按照US 6,653,456描述的方法制備。用TNBS測(cè)定發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物每摩爾氨基葡聚糖含有5.7摩爾氨基。
用此氨基葡聚糖制備茚地那韋-氨基葡聚糖綴合物(從茚滿環(huán)出發(fā))。在室溫下向20mg氨基葡聚糖加入1mL DMSO。讓混合物在室溫下攪拌至所有的氨基葡聚糖都溶于溶液中。向反應(yīng)混合物加入13μL(0.092mmol)三乙胺。將8.87mg(0.010mmol)茚地那韋衍生物12溶于0.44mL無(wú)水DMSO中，滴加到攪拌下的氨基葡聚糖溶液中。讓混合物在室溫下攪拌48小時(shí)，轉(zhuǎn)移到SPECTRA/POR透析管(截留分子量3500)中，在室溫下按照以下程序(1L體積，每次至少8小時(shí))進(jìn)行透析(每次透析用1L體積)80％DMSO、60％DMSO、40％DMSO和20％DMSO于去離子水中，接著是去離子水。
從透析管取出溶液，凍干，得15mg茚地那韋-葡聚糖綴合物，為白色粉末。見(jiàn)圖6。
實(shí)施例27從吡啶環(huán)出發(fā)的茚地那韋-氨基葡聚糖綴合物(6C)用此氨基葡聚糖制備茚地那韋-氨基葡聚糖綴合物(從吡啶環(huán)出發(fā))。在室溫下向20mg氨基葡聚糖加入1mL DMSO。讓混合物在室溫下攪拌至所有的氨基葡聚糖都溶于溶液中。向反應(yīng)混合物加入13μL(0.092mmol)三乙胺。將9.86mg(0.011mmol)茚地那韋衍生物5溶于0.44mL無(wú)水DMSO中，滴加到攪拌下的氨基葡聚糖溶液中。讓混合物在室溫下攪拌48小時(shí)，轉(zhuǎn)移到SPECTRA/POR透析管(截留分子量3500)中，在室溫下按照以下程序(1L體積，每次至少8小時(shí))進(jìn)行透析(每次透析用1L體積)80％DMSO、60％DMSO、40％DMSO和20％DMSO于去離子水中，接著是去離子水。從透析管取出溶液，凍干，得15mg茚地那韋-葡聚糖綴合物，為白色粉末。見(jiàn)圖7。
實(shí)施例28茚地那韋乳膠試劑的制備將10％(w/v)固體羧酸酯修飾的乳膠微顆粒(Seradyn)用去離子水稀釋成1％(w/v)固體。在4℃、32,600×g下離心懸浮液1小時(shí)。保留沉淀，通過(guò)超聲處理重新懸浮。將1％乳膠懸浮液如上所述用5體積當(dāng)量的去離子水接著是5體積當(dāng)量的洗滌緩沖液(50mM 2-(N-嗎啉代)-乙磺酸(MES)，pH5.5)進(jìn)行離心洗滌。將乳膠微顆粒在4℃下保存。在Roche Cobas Mira上測(cè)定乳膠濃度，用50mM MES緩沖液(pH5.5)調(diào)至1％(w/v)。
將洗滌過(guò)的1％(w/v)乳膠用10當(dāng)量的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和10當(dāng)量的Sulpho NHS(于50mM MES，pH 5.5中)和50mg/mL EDC溶液(于去離子水中)進(jìn)行活化。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。
在4℃下以3200×g離心反應(yīng)混合物，將乳膠沉淀重新懸浮于50mM MOPS(pH6.4)中。在Roche Cobas Mira上測(cè)定乳膠濃度，將乳膠懸浮液調(diào)至1％(w/v)。
將每一抗體負(fù)荷下的所需量的茚地那韋單克隆抗體(0.2mg單克隆抗體/1％乳膠(分別為M2.35.2和M1.158.8)(參考US 200440127689)加入到1％(w/v)乳膠中，室溫下攪拌乳膠混合物2小時(shí)。
通過(guò)加入50mg/mL BSA(于50mM MOPS，pH6.4中)并在室溫下攪拌過(guò)夜，將乳膠混合物進(jìn)行后封閉。
在4℃下以32,600×g離心反應(yīng)混合物，將乳膠沉淀重新懸浮于儲(chǔ)存緩沖液(50mM MOPS，0.1％BSA，0.09％NaN3，pH7.2)中。此為試劑R2。
如上所述用乳膠儲(chǔ)存緩沖液將乳膠離心洗滌三次。在Roche CobasMira上測(cè)量乳膠懸浮液的單分散性。將乳膠懸浮液濃度調(diào)至1.5％，于4℃下保存。
實(shí)施例29茚地那韋校準(zhǔn)曲線將硫酸茚地那韋溶于50％乙醇中，制成1mg/mL儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)備兩組校準(zhǔn)血清和對(duì)照。低組校準(zhǔn)血清在Roche TDM血清中從茚地那韋儲(chǔ)備溶液制備，濃度為0.25、0.325、0.75、1.5和3μg/mL茚地那韋。高組校準(zhǔn)血清摻入茚地那韋，濃度為0、0.75、1.5、3和12μg/mL茚地那韋。
將0.2mg/mL茚地那韋氨基葡聚糖綴合物(13C或6C)溶于180mMPIPES緩沖液(pH 7.2，含0.1％聚丙烯酸和0.1％TWEEN 20)中制備綴合物試劑(試劑R1)。乳膠試劑R2的制備已如上所述。
用Hitachi 917 自動(dòng)分析儀(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis)，用120μL第一工作試劑(R1)和160μL第二工作試劑(R2)及15μL樣品體積，測(cè)量波長(zhǎng)600nm處的吸光度變化，來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
權(quán)利要求
1.一種下式的化合物 其中Y＝O或S，m＝0或1，X＝CH2或NH，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺、硫內(nèi)酯、重氮基團(tuán)和醛的活化官能度。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中A為活性酯。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中Y＝O，m＝1，L包含3個(gè)碳原子，X為NH，A為活性酯。
4.一種化合物
5.一種下式的化合物 其中Y＝O或S，m＝0或1，X＝CH2或NH，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還包含最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖、合成聚合物和非同位素標(biāo)記，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中Q為選自牛血清白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、美洲鱟血藍(lán)蛋白、牛甲狀腺球蛋白和氨基葡聚糖的多肽或多糖。
7.權(quán)利要求5的化合物，其中Y＝O，m＝1，X為NH，L包含4個(gè)碳原子，Q選自牛血清白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白和氨基葡聚糖。
8.一種化合物 其中Q選自牛血清白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白和氨基葡聚糖。
9.一種下式的化合物 其中L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺、硫內(nèi)酯、重氮基團(tuán)和醛的活化官能度。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中A為活性酯。
11.權(quán)利要求10的化合物，其中L包含3個(gè)碳原子。
12.一種化合物
13.一種下式的化合物 其中L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還包含最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖、合成聚合物和非同位素標(biāo)記，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中Q為選自牛血清白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、美洲鱟血藍(lán)蛋白、牛甲狀腺球蛋白和氨基葡聚糖的多肽或多糖。
15.權(quán)利要求13的化合物，其中L包含4個(gè)碳原子。
16.一種化合物 其中Q選自牛血清白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白和氨基葡聚糖。
17.一種下式的化合物 其中X為N或C，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺、硫內(nèi)酯、重氮基團(tuán)和醛的活化官能度。
18.一種下式的化合物
19.一種下式的化合物
20.一種下式的化合物
21.一種下式的化合物 其中X為N或C，L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還包含最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖、合成聚合物和非同位素標(biāo)記，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字。
22.一種下式的化合物 其中L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和0-20個(gè)雜原子的脂族連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，A為選自活性酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫醇、亞氨基酯、酸酐、馬來(lái)酰亞胺、硫內(nèi)酯、重氮基團(tuán)和醛的活化官能度。
23.一種下式的化合物
24.一種下式的化合物 其中L為包含0-40個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和還包含0-20個(gè)雜原子的脂族連接基團(tuán)，條件是不超過(guò)兩個(gè)雜原子可依次連接在一起，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖、合成聚合物和非同位素標(biāo)記，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字。
25.一種合成茚地那韋M6的方法，所述方法包括使硫酸茚地那韋在氫氣和鈀催化劑存在下反應(yīng)從而形成茚地那韋M6的步驟。
26.一種測(cè)定樣品中的茚地那韋的測(cè)定方法，所述方法包括以下步驟使懷疑含有茚地那韋的樣品與茚地那韋特異性抗體和包含茚地那韋類似物和非同位素信號(hào)產(chǎn)生部分的綴合物混合在一起，其中當(dāng)所述抗體結(jié)合樣品中的茚地那韋時(shí)有信號(hào)產(chǎn)生，所述綴合物具有下式 其中Y＝O或S，m＝0或1，X＝CH2或NH，L為包含0-20個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，Z為選自xx、xx和xx的部分，測(cè)量所產(chǎn)生的信號(hào)量，將所測(cè)量到的信號(hào)與樣品中茚地那韋的存在或數(shù)量建立關(guān)聯(lián)。
27.一種測(cè)定樣品中的茚地那韋的測(cè)定方法，所述方法包括以下步驟使懷疑含有茚地那韋的樣品與茚地那韋特異性抗體和包含茚地那韋類似物和非同位素信號(hào)產(chǎn)生部分的綴合物混合在一起，其中當(dāng)所述抗體結(jié)合樣品中的茚地那韋時(shí)有信號(hào)產(chǎn)生，所述綴合物具有下式 其中L為包含0-20個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖和合成聚合物，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字，測(cè)量所產(chǎn)生的信號(hào)量，將所測(cè)量到的信號(hào)與樣品中茚地那韋的存在或數(shù)量建立關(guān)聯(lián)。
28.一種測(cè)定樣品中的茚地那韋的測(cè)定方法，所述方法包括以下步驟使懷疑含有茚地那韋的樣品與茚地那韋特異性抗體和包含茚地那韋類似物和非同位素信號(hào)產(chǎn)生部分的綴合物混合在一起，其中當(dāng)所述抗體結(jié)合樣品中的茚地那韋時(shí)有信號(hào)產(chǎn)生，所述綴合物具有下式 其中L為包含0-20個(gè)以飽和或不飽和直鏈或支鏈排列的碳原子和含有最多兩個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子的連接基團(tuán)，Z為選自-CONH-、-NHCO-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-OCONH-、-NHOCO-、-S-、-NH(C＝NH)-、-N＝N-、-NH-和 的部分，Q選自多肽、多糖和合成聚合物，對(duì)于每50千道爾頓分子量的Q，n為1-50的數(shù)字，測(cè)量所產(chǎn)生的信號(hào)量，將所測(cè)量到的信號(hào)與樣品中茚地那韋的存在或數(shù)量建立關(guān)聯(lián)。
29.一種抗體，所述抗體響應(yīng)具有權(quán)利要求5、13、21和24中任一項(xiàng)的式的化合物而產(chǎn)生。
30.免疫原用于產(chǎn)生權(quán)利要求29的抗茚地那韋抗體的用途。
31.一種產(chǎn)生權(quán)利要求29的抗體的方法，所述抗體用于測(cè)定生物樣品中的茚地那韋。
全文摘要
公開(kāi)了用于產(chǎn)生抗體的茚地那韋衍生物和綴合物以及用于檢測(cè)生物樣品中的茚地那韋的標(biāo)記綴合物。所述衍生物從茚地那韋的茚滿環(huán)羥基或吡啶環(huán)氮出發(fā)合成。還公開(kāi)了用鈀催化劑和氫氣從茚地那韋一步合成茚地那韋主要代謝物(M6)。茚地那韋M6用合適的官能團(tuán)延伸以合成各種茚地那韋類似物。這些衍生物用于開(kāi)發(fā)茚地那韋免疫原、抗體和標(biāo)記綴合物，以開(kāi)發(fā)茚地那韋免疫測(cè)定法。
文檔編號(hào)C07K16/44GK101094841SQ200580045889
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
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