專利名稱：穩(wěn)定的聚合物巰基試劑的制作方法
專利說明穩(wěn)定的聚合物巰基試劑 發(fā)明領域
本發(fā)明涉及從水溶性聚合物例如聚乙二醇得到的穩(wěn)定性巰基聚合物試劑。特別是，本發(fā)明涉及巰基聚合物試劑、其綴合物以及利用這種綴合物的方法。

背景技術：

由于近年來生物技術領域的進步，現(xiàn)在可以大規(guī)模生產治療性蛋白質及其他生物分子例如抗體和抗體片段，使這些生物分子可以在更大程度上被利用。不幸的是，未修飾形式的潛在治療性分子的臨床有效性經常會被下述因素所妨礙快速的蛋白質分解、生產、儲藏或使用的不穩(wěn)定性、或其免疫原性。

可以通過和水溶性聚合物共價連接來克服這些不足，所述水溶性聚合物例如是聚乙二醇(PEG)。例如參見，Abuchowski，A.et al.，J.Biol.Chem.252(11)3579(1977)；Davis，S.et al.，Clin.ExpImmunol.46649-652(1981)。與未PEG化的相似物相比，PEG-修飾的蛋白質的生物學性質在很多情況下已顯示出相當大的改善，所述PEG-修飾的蛋白質也稱作PEG-綴合物或PEG化的蛋白質(Herman et al.，Macromol.Chem.Phys.195203-209(1994))。由于增強了對蛋白質水解的抵抗力，聚乙二醇修飾的蛋白質已顯示出在體內具有較長的循環(huán)時間，并具有增強的熱穩(wěn)定性(Abuchowski，A.et al.，J.Biol.Chem.2523582-3586(1977)。其他生物分子例如抗體和抗體片段同樣觀察到了相似的生物效能的增強(Chapman，A.，Adv.Drug Del.Rev.54531-545(2002))。

通常適于修飾蛋白質的聚乙二醇具有活性末端基團，適于和氨基基團反應。這種活性PEGs或“聚合物試劑”包括PEG-醛(Harris，J.M.and Herati，R.S.，Polym Prepr.(Am.Chem.Soc，Div.Polym.Chem.)32(1)154-155(1991))、混合酸酐、N-羥基琥珀酰亞胺酯、羰基咪唑烷和chlorocyanurates(Heman，S.et al.，Macromol.Chem.Phys.195203-209(1994))。然而，在某些情況下，通過蛋白質氨基基團連接聚合物可能是不期望的，例如特定賴氨酸殘基的衍生化會使蛋白質失活(Suzuki，T.et al.，Biochimica et Biophysica Acta788248-255(1984))。因此，如果有其他方法用于利用其他靶向氨基酸例如半胱氨酸通過PEG達到修飾蛋白質的目的，則將是有利的。在半胱氨酸的蛋白質巰基基團上進行連接具有下述優(yōu)點由于蛋白質中半胱氨酸在數(shù)量上不如賴氨酸多，因此當綴合到這些包含巰基的氨基酸時蛋白質失活的可能性會有所降低。所述的巰基選擇性的活性聚合物例如是PCT公開文本WO 2004/063250所述的物質。

聚合的巰基衍生物，特別是PEG巰基，是一種巰基選擇性的活性聚合物。然而，很多已知的巰基聚合物對于氧化偶合具有高度敏感性，從而形成二硫化物，這是一種減少活性成分并增加清除雜質難度的降解過程。后者在利用這些材料制備生物綴合物時可能是特別大的難題。因此，如果能夠提供較已知試劑具有更強穩(wěn)定性的巰基聚合物試劑，將是非常有益的。
發(fā)明概要
在一個方面，本發(fā)明提供了一種水溶性活性聚合物，也稱之為“聚合物試劑”，其結構為 POLY-[Y-S-W]x 其中 POLY是水溶性聚合物； Y是包含至少4個碳原子的二價連接基團，由具有3-8個碳原子長度且具有取代基的飽和或不飽和碳氫主鏈組成，其取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和本文所定義的無干擾取代基，其中主鏈不同碳原子上的兩個此類烷基和/或烯基取代基可連接在一起形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基基團； S是連接到Y的sp3雜碳原子上的硫原子； X為1-25；以及 S-W是巰基、保護的巰基或巰基-活性的巰基衍生物。在一個具體實施方式
中，S-W是巰基-活性衍生物，例如鄰位-吡啶基二硫化物(OPSS)。

當x是2時，所述試劑為雙官能基聚合試劑，如下文將對此進行進一步說明；如本文所述，其可具有直鏈或“叉狀”結構。如本文所述，特別是當x是3或更大時，聚合物試劑還可具有“多支鏈”結構。在選擇性的具體實施方式
中，x為1-8、1-6或1-4；在另一個具體實施方式
中，x是1或2，或者x是1。所述聚合物試劑的POLY組分本身可以選自下述形態(tài)直鏈、支鏈、多支鏈及其組合，本文將對此作進一步說明。

在一個特定的具體實施方式
中，當POLY是直鏈聚乙二醇并且Y是直鏈烷基鏈時，POLY的分子量至少為500。

在另一個具體實施方式
中，POLY的分子量至少為1000，或者至少為2000。作為上限，POLY的分子量不得高于300,000Da。

連接基團Y的“碳氫主鏈”更優(yōu)選是能夠連接POLY和S的最短連續(xù)碳鏈。當Y的主鏈是不飽和時，其優(yōu)選是單不飽和的，即只具有一個雙或三碳-碳鍵。優(yōu)選地，包括主鏈和取代基的間隔基團Y是單不飽和的，或者更優(yōu)選地是完全飽和。在另一個具體實施方式
中，包括主鏈和取代基的間隔基團Y由飽和的部分和芳香族部分組成。

優(yōu)選地，主鏈是飽和的。例如，Y為-(CR1R2)n-形式，其中n為3-8，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，其中連接在不同碳原子上的兩個基團R1和R2可以相連接形成環(huán)烷基或芳基。在選擇性具體實施方式
中，n是3-6，n是4-6，或者n＝4，并且每一個R1和R2獨立地選自氫和低級烷基，其中低級烷基優(yōu)選甲基和乙基。

在另外選擇性具體實施方式
中，Y選自C4-C8亞烷基、C5-C8環(huán)亞烷基及其組合，其任何一個可包括一個或多個無干擾取代基。

優(yōu)選地，最多包括一個或兩個無干擾取代基，選自C3-C6環(huán)烷基、鹵素、氰基、低級烷氧基和苯基，優(yōu)選選自甲氧基、乙氧基、氟和氯。在一個具體實施方式
中，取代基不包含雜原子；也就是說，連接基團Y由碳和氫組成。

在一個優(yōu)選的具體實施方式
中，當n次重復-(CR1R2)-時，R1和R2均為氫；在另一個優(yōu)選的具體實施方式
中，除了R1在所述硫原子的鄰位碳原子上所述R1為低級烷基優(yōu)選甲基或乙基(α-支鏈)外R1和R2均為氫。在一個具體實施方式
中，α-支鏈基團是甲基。

在Y的一個具體實施方式
中，Y是-(CR1R2)n-，并且不同碳原子上的兩個基團R1和R2相連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基基團，環(huán)烷基優(yōu)選環(huán)戊基或環(huán)己基。優(yōu)選地，在這些具體實施方式
中，S連接在Y的sp3雜非環(huán)碳原子上。

如上所述，POLY可以是聚乙二醇(PEG)。這種PEG的分子量通常為148(例如三聚體加連接的氧原子)至約200至約100,000道爾頓。在選擇的具體實施方式
中，聚乙二醇的分子量為約200至約40,000道爾頓。代表性的分子量包括例如500、1000、2000、2500、3500、5000、7500、10000、15000、20000、25000、30000和40000道爾頓。公開試劑的PEG成分本身可具有選自直鏈、支鏈、多支鏈及其組合的形態(tài)，本文將對此作進一步說明。

相應地，本發(fā)明提供了一種水溶性聚合物試劑，包括如下結構 PEG-[Y-S-W]x 其中 PEG是聚乙二醇聚合物； Y是由飽和或不飽和具有取代基的碳氫主鏈組成的二價連接基團，其中所述碳氫主鏈為3-8個碳原子長度，其取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和這里定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個此類烷基和/或烯基取代基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基； S是連接到Y的sp3雜碳原子上的硫原子； x為1-25； S-W為巰基、保護的巰基或巰基-活性的巰基衍生物；以及 當PEG為直鏈，x為1，以及Y是直鏈烷基鏈時，PEG分子量至少為500。

如上文所述，當x是2時，試劑是雙官能基聚合物試劑，例如下文的詳細說明，并且如本文所述其可以具有直鏈或“叉狀”形態(tài)結構。如本文所述，特別是當x為3或更大時，聚合物試劑還可具有“多支鏈”結構。在可選擇的具體實施方式
中，x為1-8、1-6或1-4；在進一步的具體實施方式
中，x為1或2，或者x為1。公開的試劑的PEG組分其本身的結構可選自直鏈、支鏈、多支鏈及其組合，本文將對此作進一步說明。

在優(yōu)選的具體實施方式
中，PEG的分子量至少為148，至少為200，至少為500，至少為1000，或至少為2000，高達為約100,000道爾頓，包括上述各種范圍，并且其結構選自直鏈、支鏈、叉狀和多支鏈。S-W優(yōu)選為巰基-活性的巰基衍生物，更優(yōu)選鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。

連接基團Y的“碳氫主鏈”更特別定義為連接PEG和S的最短連續(xù)碳鏈。優(yōu)選地，連接基團Y的主鏈是飽和的，這樣Y為-(CR1R2)n-，其中n為3-8，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，其中不同碳原子上的兩個基團R1和R2可以相連接形成環(huán)烷基或芳基。在可選擇的具體實施方式
中，n是3-6，n是4-6，或n＝4，并且每一個R1和R2獨立地選自氫和甲基。

在進一步的可選擇具體實施方式
中，Y選自C3-C8亞烷基、C5-C8環(huán)亞烷基及其組合，如上文所述，其中任何一個可包括一個或多個無干擾取代基。優(yōu)選地，包括至少一個或兩個無干擾取代基，選自C3-C6環(huán)烷基、鹵素、氰基、低級烷氧基和苯基，優(yōu)選選自甲氧基、乙氧基、氟和氯。在一個具體實施方式
中，不存在含雜原子取代基，即連接基團Y由碳和氫組成。

如上文所述，在一個優(yōu)選的具體實施方式
中，當n次重復-(CR1R2)-時，每一個R1和R2都為氫；在另一個優(yōu)選的具體實施方式
中，除了當R1在所述硫原子鄰位的碳原子上所述R1為低級烷基優(yōu)選甲基或乙基(α-支鏈)以外，每一個R1和R2都為氫。在一個具體實施方式
中，α-支鏈基團為甲基。

在Y的具體實施方式
中，其中Y是-(CR1R2)n-并且在不同碳原子上的兩個基團R1和R2相連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基基團，該環(huán)烷基基團優(yōu)選選自環(huán)戊基或環(huán)己基。優(yōu)選地，在此具體實施方式
中S連接在Y的sp3雜非環(huán)碳原子上。

在一個舉例的式PEG-Y-S-W試劑中，Y是-(CR1R2)n-，其中每一個R1和R2是氫，n為4，S-W為鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)，PEG是以甲氧基為末端的聚乙二醇(mPEG)。mPEG的分子量優(yōu)選為5000-30000Da。在另一個舉例的試劑中，PEG和SW類似定義，n為3或4，除了R1在所述硫原子鄰位的碳原子上所述R1是甲基(即，Y是-CH2CH2CH(CH3)-或-CH2CH2CH2CH(CH3)-))以外，每一個R1和R2均為氫。

水溶性聚合物試劑可以具有多官能基結構，如下述結構式 POLY-[Y-S-W]x 其中 POLY是水溶性聚合物； x為2-25； 每一個Y都是具有至少四個碳原子的二價連接基團，由飽和或不飽和具有取代基的碳氫主鏈組成，所述碳氫主鏈含有3-10個碳原子，優(yōu)選3-8個碳原子，其取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和本文定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個這種烷基和/或烯基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基； 每一個S都是連接在Y鄰位的sp3雜碳原子上的硫原子；和 每一個S-W都獨立地是巰基、保護的巰基或巰基-活性的巰基衍生物。

優(yōu)選地，兩個或多個Y基團是相同的；兩個或多個W基團通常也是相同的。非彼即此地，特別是在雙官能基試劑(x＝2)中，兩個SW可以不相同；例如一個SW是巰基或保護的巰基，而另一個是巰基-活性衍生物，或者一個SW是巰基或巰基-活性衍生物，而另一個是保護的巰基。

如上文所述，當x為2時，聚合物試劑可以具有直鏈或“叉狀”結構。如本文所述，特別是當x為3或更大時，聚合物試劑還可為“多支鏈”結構。在可選擇的具體實施方式
中，x為2-8、2-6或2-4；在一個具體實施方式
中，x為2。公開試劑的POLY組分其本身可具有選自直鏈、支鏈、多支鏈及其組合的結構，本文將對此作進一步說明。

如上文所述，Y的主鏈優(yōu)選是飽和的，這樣每一個Y均為含有至少四個碳原子并含有-(CR1R2)n-結構的連接基，其中n為3-10，優(yōu)選3-8，并且每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，其中不同碳原子上的兩個R1和R2基團可以相連接形成環(huán)烷基或芳基。Y和POLY的更優(yōu)選具體實施方式
通常為單體試劑POLY-Y-S-W中的上述定義。

相應的以PEG為基礎的多官能基聚合物試劑具有以下結構 PEG-[Y-S-W]x 其中 PEG是聚乙二醇聚合物； x為2-25； 每一個Y均為二價連接基團，由飽和或不飽和具有取代基的碳氫主鏈組成，其包括3-10個，優(yōu)選3-8個碳原子，所述取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和本文定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個這種烷基和/或烯基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基； 每一個S都是連接在Y鄰位的sp3雜碳原子上的硫原子；并且 每一個S-W獨立地為巰基、保護的巰基或巰基-活性的巰基衍生物。

優(yōu)選地，多個Y基團是相同的；多個W基團通常也是相同的。Y的主鏈優(yōu)選是飽和的，這樣每一個Y都是具有式-(CR1R2)n-的連接基，其中n是3-10，優(yōu)選3-8，并且每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，其中不同碳原子上的R1和R2基團可以相連接形成環(huán)烷基或芳基基團。

Y和PEG更優(yōu)選的具體實施方式
是如上文對于PEG-[Y-S-W]x的定義。在可示范性的式W-S--Y-PEG-Y-S-W雙官能基試劑中，每一個Y均為-(CR1R2)n-，其中每一個R1和R2均為氫，n是4，S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)，并且每一個PEG都是以甲氧劑為末端的聚乙二醇(mPEG)。mPEG優(yōu)選分子量為1000-5000Da，例如約2000或約3400Da。在進一步的示范性試劑中，PEG和SW的定義與上文相似，n是3或4，除了R1在所述硫原子的鄰位碳原子上所述R1為甲基以外，每一個R1和R2均為氫。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種聚合物綴合物，其結構為 POLY-[Y-S-S-A]x 其中 POLY是水溶性聚合物； x為1-25； Y是由飽和或不飽和具有取代基的碳氫主鏈組成的二價連接基團，其中包含3-10個，優(yōu)選3-8個碳原子，其取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和本文定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個這種烷基和/或烯基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基基團； S-S是連接在Y的sp3雜碳原子上的二硫基；和 A是一種藥物活性分子的共價連接殘基(如本文所述)。

在可選擇的具體實施方式
中，x是1-8、1-6或1-4；在另一種具體實施方式
中，x是1或2，或者x是1。如本文所述，當x是2時，綴合物可具有直鏈或“叉狀”結構。如本文所述，特別是當x是3或更大時，該綴合物也可以具有“多支鏈”結構。綴合物的POLY組分本身可具有選自直鏈、支鏈、多支鏈及其組合的結構，本文將對此作進一步介紹。

優(yōu)選地，所有的Y基團都相同。Y的碳氫主鏈優(yōu)選是飽和的，Y結構為-(CR1R2)n-，其中n為3-10，優(yōu)選3-8，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，其中不同碳原子上的兩個R1和R2基團可以相連接形成環(huán)烷基或芳基基團。更優(yōu)選地，Y選自C3-C8亞烷基、C5-C8環(huán)亞烷基、芳基及其組合，其中任何之一都可包括一個或多個無干擾取代基。在一個具體實施方式
中，Y具有至少4個碳原子。

在其他具體實施方式
中，Y是具有-(CR1R2)n-結構的直鏈或支鏈亞烷基，其中n為3-10，并且每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基。更優(yōu)選地，n為3-8，或3-6，并且每一個R1和R2獨立地選自氫和甲基。在可選擇的具體實施方式
中，每一個R1和R2均為氫。在另一個優(yōu)選的具體實施方式
中，除了R1在所述二硫連接鍵的鄰位碳原子上所述R1為低級烷基，例如甲基或乙基以外，每一個R1和R2均為氫。

其他的具體實施方式
包括那些，其中Y是-(CR1R2)n-，其中n為3-10，優(yōu)選3-8，不同碳原子上的兩個R1和R2相連接形成環(huán)烷基或芳基，優(yōu)選環(huán)烷基例如環(huán)戊基或環(huán)己基。

優(yōu)選水溶性聚合物POLY的分子量至少為500，或至少為1000。POLY的分子量通常大于200并小于約300K道爾頓，優(yōu)選小于約200K道爾頓，更優(yōu)選小于約100K道爾頓。在一個具體實施方式
中，POLY是聚乙二醇，優(yōu)選其分子量為148至約200至約100,000道爾頓，其結構選自直鏈、支鏈、叉狀和多支鏈。在可選擇的具體實施方式
中，聚乙二醇的分子量為約200至約40,000道爾頓。通常分子量包括，例如，500、1000、2500、3500、5000、7500、10000、15000、20000、25000、30000和40000道爾頓。

連接到水溶性聚合物上的分子在其綴合形式中以A表示，A在未綴合時含有一個活性巰基基團，并且優(yōu)選選自蛋白質、肽和小分子，通常為有機小分子。

優(yōu)選綴合物本身是水溶性的。該綴合物在適當?shù)乃幬镔x形劑中或與藥物賦形劑共同使用，所述適當?shù)乃幬镔x形劑例如是用于治療應用的水性載體。

在一個相關的方面，本發(fā)明提供了一種將具有活性巰基基團的藥理活性分子傳送至主體的方法，具體為向主體使用如上文所述的綴合物和藥物可接受的載體。綴合物通常是通過將分子和本文所述的任何水溶性聚合物試劑相綴合進行制備。

本發(fā)明活性聚合物試劑中以碳氫化合物為基礎的片段Y，是疏水性的，相對于已知試劑可有效地減少這些試劑二聚作用的趨勢，所述的已知試劑中巰基例如通過二碳鍵連接在聚合物片段(或在連接部分中)的雜原子上。Y在硫原子鄰位碳原子上的分枝(α-分枝)可進一步有效地降低二聚作用。綴合物中以碳氫化合物為基礎的片段Y還可減少分裂，例如鄰近的二硫鍵在體內的酶分解，所述綴合物是利用這些試劑形成的。

本文公開的試劑被進一步表征為“無連接基”試劑，也就是說，水溶性聚合物優(yōu)選PEG直接連接在以碳氫化合物為基礎的間隔基團Y上。在活性綴合官能基即巰基或保護的巰基和聚合物之間不存在含有雜原子的連接鍵會減少得到的綴合物降解的可能性，所述連接鍵例如是酰胺、酯或氨基甲酸酯。另外，在這些試劑中存在這些連接鍵例如酰胺可能引起有害的免疫應答。通過使用這種“無連接基”試劑可以消除或極大地降低這種可能性。

如本文實施例2所示，本發(fā)明的巰基聚合物試劑比對比試劑在合成條件下更加穩(wěn)定，所述對比的試劑在親水性聚合物(PEG)和巰基之間僅有一個二碳連接基。在實施例9和對比實施例10中同樣顯示出增加的穩(wěn)定性。本發(fā)明巰基聚合物試劑的綴合行為與從已知沒有二聚化作用的聚合物試劑(以馬來酰亞胺為末端的聚合物)中觀察到的相似，例如參見實施例2。

如果閱讀了本發(fā)明下述詳細描述和附圖，本發(fā)明的這些和其他的目的及特征將會更加明顯。




圖1顯示了本發(fā)明聚合物試劑和減少的BSA之間的綴合反應以及聚合物試劑mPEG5000-馬來酰亞胺和減少的BSA之間的相應綴合反應的PAGE分析，其中如實施例1-2所述本發(fā)明聚合物試劑命名為mPEG5000-4C-OPSS第1個，標準；第2個，減少的BSA；第3個，和mPEG-MAL的綴合；第4個，和mPEG-4C-OPSS的綴合。使用普通藍安全染色劑對凝膠進行染色；和
圖2顯示了使用碘鋇染色后的圖1凝膠，用于檢測PEG。
發(fā)明詳述
定義
本文使用的下述術語具有指定的含義。如在說明書和權利要求中所述，除非上下文另有清楚地說明，單個形式“一種(a)”、“一種(an)”、“該(the)”包括復數(shù)指代物。

本文所用的“PEG”或“聚乙二醇”指的是包括任意水溶性聚(環(huán)氧乙烷)。一般來說，用于本發(fā)明的PEG含有如下兩種結構之一-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-或-O(CH2CH2O)m-，其中m通常為2至約6000，更典型4或5至約2500。廣義地說，“PEG”可以指一種包含大多數(shù)例如超過50％亞單元的聚合物，所述亞單元指的是-CH2CH2O-。優(yōu)選地，超過75％，超過95％，或者實質上所有的單體亞單元均為-CH2CH2O-。所有PEG的末端基團和結構可以變化。PEG的一個末端可包含一個封端基團，其通常是含有1-20碳原子的含碳基團，優(yōu)選選自烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)，及前述任意的取代形式。封端基團也可以是甲硅烷。封端基團在通常的合成反應條件下不容易發(fā)生化學轉化。最優(yōu)選的是烷基(烷氧基)或芳烷基(芳烷氧基)封端基團，例如甲基、乙基或苯甲基。

封端基團還可有利地含有磷脂。當聚合物有封端基團例如磷脂時，其獨特的性質(例如和相似的封端聚合物形成有機結構的能力)將賦予該聚合物。代表性的磷脂包括但不限于被稱作磷脂酰膽堿的磷脂種類。特定的磷脂包括但不限于二月桂?；字Ｄ憠A、二油酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰膽堿、behenoy1磷脂酰膽堿、花生四烯酰磷脂酰膽堿和孵磷脂。

封端基團還可有利地包括可探測性標記物。這種標記物包括但不限于熒光劑、化學發(fā)光劑、在酶標記中使用的物質、比色劑(例如，染料)、金屬離子、放射性物質等等。

PEG還可以以官能基團作為末端，所述官能基團例如下文所述，優(yōu)選其保護形式。

本發(fā)明中使用的特定PEG形式包括具有多種分子量、結構或幾何形狀的PEG(例如，支鏈、直鏈、叉狀、多支鏈)。

參考聚合物的幾何形狀和總體結構，“支鏈”指的是有2個或多個聚合物“臂”的聚合物。一種支鏈聚合物可具有2個聚合物臂、3個聚合物臂、4個聚合物臂、6個聚合物臂、8個聚合物臂或更多。高支鏈聚合物的一種特定類型是樹枝狀聚合物或樹狀物，為了達到本發(fā)明目的，其被認為是具有與支鏈聚合物相區(qū)別的結構?！胺种c”指的是一個包含一個或多個原子的分叉點，在這個點上聚合物從直鏈結構上分裂或分枝形成一個或多個附加的聚合物臂。

“樹狀物”是球形的粒徑單分散性聚合物，其中所有的鍵從中心焦點或核心成放射狀分布，伴隨有規(guī)則的分枝圖形和重復單位，其各自對于分枝點都有貢獻。樹狀物顯示出一定的樹狀性質，例如封裝核心，使其相對于其它類型的聚合物都是獨特的。

本發(fā)明所述聚合物上下文的“水溶性”或者“水溶性聚合物片段”，指的是在室溫下可溶于水的任何片段或聚合物。一般來說，相對于過濾后的相同溶液，水溶性聚合物或片段可透過至少約7 5％，更優(yōu)選至少約95％的光。以重量為基礎，水溶性聚合物或其片段因此優(yōu)選有至少約35％(重量)溶于水，更優(yōu)選至少約50％(重量)溶于水，更優(yōu)選約70％(重量)溶于水，更優(yōu)選約85％(重量)溶于水。然而，最優(yōu)選的是，水溶性聚合物或片斷約95％(重量)溶于水或完全溶于水。

除非另有說明，聚合物的“分子量”或“分子重量”指的是數(shù)均分子量。數(shù)均分子量(Mn)的定義為∑NiMi/∑Ni，其中Ni是分子重量為Mi的聚合物分子的數(shù)量(或這些分子的摩爾數(shù)量)。聚合物的數(shù)均分子量可通過滲透壓力測定法、端基滴定和依數(shù)特性進行確定。重均分子量被定義為∑NiMi2/∑NiMi，其中Ni是分子量Mi的分子數(shù)值。重均分子量可通過光散射、小角度中子散射(SANS)、X-ray散射和沉降速度進行確定。

本發(fā)明聚合物或在本發(fā)明中應用的聚合物可為多元分散系；即，聚合物的數(shù)均分子量和重均分子量不相同。然而，多元分散值通常都很低，小于約1.2，優(yōu)選小于約1.15，更優(yōu)選小于約1.10，更優(yōu)選小于約1.05，最優(yōu)選小于約1.03，最優(yōu)選小于約1.025，所述多元分散值為重均分子量(Mw和數(shù)均分子量(Mn)的比值(Mw/Mn)。

術語“反應性”或“活性”指的是一種官能團，在常規(guī)的有機合成條件下能夠很容易或者以一定速率進行反應。這與那些不能反應或者需要強催化劑或不切實際的反應條件才能反應的基團(即“無活性”或“惰性”基團)是相反的。

當反應混合物中某分子上的官能團為“不容易反應”或“惰性”時，表明該基團在能夠有效地進行所需反應的條件下在反應混合物中保持了大部分結構的完整。

“保護基團”是在特定的反應條件下能夠預防或阻斷分子上特定化學活性官能團的反應的部分。該術語還指官能團的一種保護形式。根據被保護的化學活性基團的類型以及進行反應的條件和分子上其他活性或保護基團的情況，保護基團會有所變化?？杀槐Ｗo的官能團包括，例如，羧酸基團、氨基基團、羥基基團、巰基基團、羰基基團等等。這些官能團的代表性保護形式包括對于羧酸，酯(例如p-甲氧基苯甲酯)、酰胺和肼；對于氨基，氨基甲酸酯(例如叔-丁氧基羰基或芴甲氧羰基)和酰胺；對于羥基，醚和酯；對于巰基，硫醚和硫酯；對于羰基，縮醛和縮酮等等。這些保護基團對于本領域技術人員而言是已知的，并且記載于，例如T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups inOrganic Synthesis，Third Edition，Wiley，New York，1999，該文獻在此引用作為參考。

巰基的“巰基-活性衍生物”是指能夠與其他巰基發(fā)生反應的一種巰基衍生物，優(yōu)選在溫和的溫度和中性或生理pH條件下能夠形成二硫鍵。優(yōu)選地，反應僅形成穩(wěn)定的副產物。這類衍生物的代表性例子是鄰-吡啶基二硫化物和TNB-巰基衍生物(其中TNB是5-硫-2-硝基苯甲酸)。例如參見Hermanson，Bioconjugate Techniques，AcademicPress，1996，pp 150-152。

在本文中，術語“官能團”或其任何同義詞包括其被保護形式或衍生物。相似地，術語“巰基試劑”或“巰基聚合物”包括被保護的或衍生的巰基試劑或聚合被保護的或衍生的巰基(例如聚合物-OPSS)。

“生理可分裂的”或“可水解”或“可降解”鍵是一種相對較弱的鍵，其在生理條件下與水反應(即水解)。鍵在水中的水解不僅取決于連接兩個中心原子的鍵的類型，還取決于連接在這些中心原子上的取代基。適當?shù)乃獠环€(wěn)定或弱鍵包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、縮醛、縮酮、酰氧基烷基醚、亞胺、鄰酯、肽和寡核苷酸、硫酯、硫羥酸酯、和碳酸酯。“酶可降解鍵”指的是在一種或多種酶作用下可降解的鍵。

“實質上”或“基本上”是指將近全部或完全，例如總量的95％、99％或更多。

“烷基”指的是碳氫鏈，通常為1-20個碳原子長度。這類碳氫鏈優(yōu)選但不必需是飽和的，可以是支鏈結構，或者優(yōu)選直鏈(非支鏈)。烷基基團的例子包括乙基、丙基、丁基、戊基、2-甲基丁基、2-甲基丙基(異丁基)、3-甲基戊基等等。在本文中，當碳原子數(shù)為3個或更多時，“烷基”包括環(huán)烷基?！皝喭榛敝傅氖嵌r烷基基團，例如-(CH2)x-。

“低級烷基”指的是包含1-6個碳原子的烷基，更優(yōu)選1-4個碳原子，例如甲基、乙基、n-丁基、異丙基和t-丁基。

“環(huán)烷基”指的是飽和或不飽和的環(huán)狀碳氫鏈，包括橋狀、稠和或螺旋環(huán)狀化合物，優(yōu)選含有3至約12個碳原子，更優(yōu)選3至約8個碳原子。“環(huán)亞烷基”是指二甲環(huán)烷基基團。

在本文中，“烯基”是指含有2-15個碳原子，并且至少包括一個雙鍵的支鏈或非支鏈碳氫基團，例如乙烯基、n-丙烯基、異丙烯基、n-丁烯基、異丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四烯基等等。

本文中術語“炔基”是指含有2-15個原子，并且至少含有一個三鍵的支鏈或非支鏈碳氫基團，例如乙炔基、n-丙炔基、異戊炔基、n-丁炔基、辛炔基、癸炔基等等。

“烷氧基”指的是-OR基團，其中R是烷基或取代的烷基，優(yōu)選C1-C20烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等等)，更優(yōu)選低級烷基(即C1-C6或C1-C4)。

“芳基”是指僅有一個環(huán)(例如苯基)或兩個縮環(huán)或稠環(huán)(例如萘基)的取代或不取代單價芳香基。多個芳基環(huán)也可以是不稠和的(例如，二苯基)。該術語包括雜芳基，其為在環(huán)中含有一個或多個氮原子、氧原子或硫原子的芳香環(huán)，例如呋喃基、吡咯、吡啶和吲哚。

“芳烷基”是指進一步被芳基基團取代的烷基，優(yōu)選低級(C1-C4，更優(yōu)選C1-C2)烷基，例如是苯甲基和苯乙基?！胺纪檠趸敝傅氖?OR形式的基團，其中R是芳烷基，一個例子是苯甲氧基。

“雜環(huán)”指的是這樣一種環(huán)，優(yōu)選為5-7元環(huán)，其環(huán)原子選擇性地由碳、氮、氧和硫組成。優(yōu)選地，環(huán)原子包括3-6個碳原子。芳香雜環(huán)(雜芳基)的例子如上文所述；非芳香雜環(huán)包括，例如，吡咯烷、哌啶、哌嗪和嗎啉。

“被取代”的基團或部分是指其中的氫原子被非氫原子或基團所替代，優(yōu)選是無干擾性取代基。

“無干擾取代基”是指當存在于分子中時和分子內包含的其他官能團無反應活性的基團。

這些包括但不限于低級烷基、烯基或炔基，低級烷氧基，C3-C6環(huán)烷基，鹵素例如氟、氯、溴或碘，氰基，氧代(酮)，硝基和苯基。

“殘基”是指和一個或多個分子反應后，原分子上仍保留下來的那一部分。例如，本發(fā)明聚合物綴合物中的生物活性分子殘基通常相當于生物活性分子部分但不包括由生物活性分子上的活性基團和聚合物試劑上的活性基團反應形成的共價鍵。

術語“綴合物”是指由分子例如生物活性分子和活性聚合物分子共價結合形成的實體，所述聚合物分子優(yōu)選是聚(乙二醇)。

本文中“藥物”、“生物活性分子”、“生物活性部分”、“生物活性劑”、“藥物活性試劑”和“藥物活性分子”都是指能夠影響生物有機體任何身體或生物化學性質的任何物質，其中有機體選自病毒、細菌、真菌、植物、動物和人類。特別是，在本文中生物活性分子包括能夠診斷、減輕、治療或預防人類或其他動物的疾病或者在其他方面能夠增強人類或動物身體或心理健康的任何物質。生物活性分子的例子包括但不限于肽、蛋白質、酶、小分子藥物、染料、脂質、核苷、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、細胞、病毒、脂質體、微粒和膠束。適于在本發(fā)明中應用的生物活性劑的類別包括但不限于抗生素、殺菌劑、抗病毒劑、抗炎劑、抗腫瘤劑、心血管試劑、抗焦慮藥、激素、生長因子、甾體等等。同時還包括食物、食品補充劑、營養(yǎng)素、營養(yǎng)制品、藥物、疫苗、抗體、維生素和其他有益的物質。

“藥物可接受的賦形劑”或“藥物可接受載體”指的是可包含在本發(fā)明組合物中并且對于患者不具有顯著性毒副作用的賦形劑。

本文中，“藥理學有效劑量”、“生理學有效劑量”和“治療有效劑量”是指為了在血流或靶組織中達到活性藥物和/或綴合物的理想水平而在藥物制劑中存在的聚合物-活性劑綴合物的用量。精確的劑量取決于很多因素，例如特定的活性物質、藥物制劑組分和物理性質、預期的患者群、患者因素等等，本領域技術人員根據本文提供的信息和相關文獻記載很容易能夠確定劑量。

術語“患者”是指正在發(fā)生或易于發(fā)生某種狀況的生命體，所述狀況通過使用生物活性劑或其綴合物能夠進行預防或治療，其包括人和動物。

聚合的巰基試劑
本發(fā)明的水溶性聚合物試劑包括下述結構 POLY-[Y-S-W]x 其中 POLY是水溶性聚合物片段； x為1-25； Y是包含至少4個碳原子的二價連接基團，由飽和或不飽和的含有取代基的碳氫主鏈組成，所述碳氫主鏈有3-8個碳原子，其取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和本文定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個這種烷基和/或烯基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基基團； S是連接到Y的sp3雜碳原子上的硫原子；以及 S-W是巰基(即W是H)、保護的巰基或巰基-活性衍生物。

在一個具體實施方式
中，S-W是巰基-活性衍生物，例如鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。保護的巰基包括，例如，硫醚例如S-苯甲基或S-三苯甲基醚和硫酯。

需要注意的是，硫原子S是連接在Y的sp3雜碳原子上，而不是芳環(huán)或雙鍵上。在一個具體實施方式
中，硫原子連接的碳原子有一個低級烷基取代基，例如甲基或乙基(α-支鏈)。

間隔基團Y的“主鏈”更具體地定義為連接POLY和S的最短連接碳鏈。在一個具體實施方式
中，Y的主鏈是飽和的。例如Y可以為-(CR1R2)n-，其中n為3-8，優(yōu)選3-6，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，并且-(CR1R2)n-的不同碳原子上的兩個R1和R2基團可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基基團。當Y包含環(huán)烷基基團時，其優(yōu)選為五元或六元環(huán)烷基。

在可選擇的具體實施方式
中，Y選自C3-C8亞烷基以及C3-C8亞烷基和C5-C8環(huán)亞烷基或芳基的組合，其中任何一個都可以包括一個或多個無干擾取代基。優(yōu)選地，至多一個或兩個無干擾取代基選自C3-C6環(huán)烷基、鹵素、氰基、低級烷氧基和苯基，優(yōu)選選自甲氧基、乙氧基、氟和氯。在一個具體實施方式
中，取代基不含有雜原子；也就是說，Y由碳和氫組成。

當Y的主鏈為不飽和時，其優(yōu)選是單不飽和的，即僅有一個碳碳雙鍵或三鍵。優(yōu)選地，包括主鏈和取代基的間隔基團Y是單不飽和的，或者更優(yōu)選是完全飽和的。在這種具體實施方式
中，Y可以是完全飽和的碳氫化合物。

在另一個具體實施方式
中，包括主鏈和取代基的間隔基團Y由飽和部分和芳香族部分組成，優(yōu)選飽和和芳香族碳氫化合物部分。

在此聚合物試劑中，當Y是-(CR1R2)n-且對于n次重復-(CR1R2)-每一個R1和R2均為氫時，優(yōu)選聚合物片段POLY的分子量至少為500Da，特別是POLY為直鏈PEG并且上式中x＝1的情況下。POLY的分子量還可大于500Da，大于750Da，或者大于1000Da。如上文所述，可以使用很多種較大的分子量范圍，高至約300,000Da，更常為高至約100,000Da。

當x是2時，試劑是雙官能基聚合物試劑，本文將對其作進一步說明，如本文所述，其可以為直鏈或“叉狀”結構。如本文所述，特別是當x為3或更大時，聚合物試劑也可以為“多支鏈”結構。在可選擇的具體實施方式
中，x是1-8、1-6或1-4；在進一步的具體實施方式
中，x是1或2，或者x是1。所公開試劑的POLY部分本身可具有選自直鏈、支鏈、多支鏈及其組合的結構，本文將對此作進一步說明。

在一個優(yōu)選的具體實施方式
中，水溶性聚合物片段是聚乙二醇，試劑結構為 PEG-[Y-S-W]x 其中 PEG是聚(乙二醇) Y是由飽和或不飽和具有取代基的碳氫主鏈組成的二價連接基團，主鏈含有3-8個碳原子長度，所述取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和本文定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個這種烷基和/或烯基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基基團； S是連接到Y的sp3雜碳原子上的硫原子； x為1-25；以及 S-W是巰基(即W是H)、保護的巰基或巰基-活性衍生物。

發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在水溶性聚合物片段和水溶性巰基聚合物的巰基基團之間加入一個疏水性間隔基團能夠降低分子二聚化作用形成二硫化物的趨勢。制備這些試劑以及它們與其它分子綴合的產率都相應地有所增加，下文將證明這一點。

本文所述的間隔基團以3個或更多碳原子的碳氫化合物為基礎，優(yōu)選包含至少4個碳原子，可包括支鏈碳(例如異亞丁烷基或1-甲基亞丙基鍵)。雖然被描述為“以碳氫化合物為基礎”，但間隔基團可包括數(shù)量有限的本文所述無干擾取代基。然而，優(yōu)選間隔基團由碳和氫組成。

在聚合物試劑的優(yōu)選具體實施方式
中，Y是直鏈或支鏈亞烷基，結構為-(CR1R2)n-其中n為3-8，并且每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基。優(yōu)選地，包括0-2個，更優(yōu)選包括0或1個無干擾取代基。

優(yōu)選地，n為4-8，更優(yōu)選4-6。在一個具體實施方式
中，每一個R1和R2獨立地選自氫和甲基。在一個優(yōu)選的具體實施方式
中，在n次重復的-(CR1R2)-中，每一個R1和R2均為氫；在另一個優(yōu)選的具體實施方式
中，除了R1在所述硫原子的鄰位碳(α-碳)上以外，每一個R1和R2均為氫，當R1在所述硫原子的鄰位碳(α-碳)上時，所述R1是低級烷基，優(yōu)選甲基或乙基(α-支鏈)。在一個具體實施方式
中，α-支鏈基團是甲基。

在其中Y為-(CR1R2)n-的Y的具體實施方式
中，n為4-8，不同碳原子上的兩個R1和R2基團相連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基，所述環(huán)烷基優(yōu)選是環(huán)戊基或環(huán)己基。在此具體實施方式
中，優(yōu)選硫原子連接在Y的非環(huán)碳原子上。

具有飽和主鏈的舉例性間隔基團Y的結構包括(其中曲線代表的是和POLY或S連接的鍵，例如第一個結構式代表n-亞丁烷基)

如上文所述，間隔基團的“主鏈”是將POLY連接至硫原子的最短的連續(xù)碳鏈。相應地，上述第二行每一個結構的主鏈上都有5個碳原子。另外，根據這一規(guī)定，所示最后一個結構的主鏈是飽和的，雖然間隔基團總體上來說并不飽和。

在一個舉例的聚合物試劑中，如下所述，POLY是以甲氧基為末端的聚乙二醇(mPEG)，Y是-(CH2)4-，-S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)，如下文所示，或者是SH。優(yōu)選mPEG的分子量為5000-30000Da；例如，約5000，約10000，約20000，或約30000Da。


在另一個具體實施方式
中，聚合物試劑是雙官能基，其結構為W-S-Y-POLY-Y-S-W，其中POLY、Y和S-W如上文所定義。一般來說，雖然不是必需的，該聚合物試劑是對稱的。如下文所示，該結構的一個舉例性聚合物試劑中，POLY是聚乙二醇(PEG)，每一個Y均為-(CH2)4-，每一個-S-W都是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)，如下文所示，或者是SH。優(yōu)選PEG的分子量為約1000-5000Da，例如，2000或3400Da。


聚合物試劑的其他例子包括通式PEG-[Y-S-W]x所代表的試劑，其中x是1或2，Y是-(CH2CH2CH2CH(CH3))-，S-W是SH或鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。當x是1時，PEG優(yōu)選是以甲氧基為末端的聚乙二醇(mPEG)。這類試劑如下文所示(“Me”代表甲基)

聚合物試劑的其他例子包括通式PEG-[Y-S-W]x所代表的試劑，其中x是1或2，Y是-(CH2CH2CH(CH3))-，S-W是SH或鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。當x是1時，PEG優(yōu)選是mPEG。這些試劑如下文所示

聚合物試劑的其他例子如通式PEG-[Y-S-W]x所示，其中x是1，Y是-(CH2)4-，-S-W是SH或鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)，并且PEG是以下述結構為末端的

這類試劑如下述通式所示

優(yōu)選地，連接在Y-SW上的PEG的分子量約為500Da或更少，或者約200Da或更少。其中m＝2-10，優(yōu)選2-4。在一個具體實施方式
中，m＝4。末端支鏈結構中的每一個mPEG優(yōu)選分子量為約5KDa至約20KDa；例如n＝約110至約450。每一個mPEG的分子量例如可以為5、10、15或20KDa。

本文所述試劑的特點可描述為“無連接基”巰基，其中水溶性聚合物直接連接到以碳氫化合物為基礎的間隔基團Y上。例如，聚(亞烷基)二醇中重復性亞烷基二醇單元的氧原子直接和Y相連接，其中所述重復性亞烷基二醇單元例如是PEG中的-CH2CH2O-。在活性綴合官能團即巰基或保護的巰基和聚合物之間，特別是連接鍵例如酯、氨基甲酸酯或酰胺上不含有雜原子，降低了綴合的聚合物發(fā)生降解的可能性。另外，在這些試劑中存在包含這些雜原子的連接鍵例如酰胺，會引起有害的免疫反應。本發(fā)明的“無連接基”試劑消除或極大地降低了這一可能性。

在聚合物試劑中，特別是在POLY為PEG的具體實施方式
中，優(yōu)選聚合物片段POLY的分子量為至少500Da。聚合物片段POLY的各種優(yōu)選具體實施方式
將在下文作詳細說明。優(yōu)選地，聚合物片段“POLY”是聚亞烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇可具有各種分子量，從約88至約100,000道爾頓，在上述限制范圍內。在可選擇的具體實施方式
中，聚乙二醇的重均分子量為148(例如三聚體加連接的氧原子)至約200至約40,000道爾頓。代表性的分子量包括，例如500、1000、2000、3000、3500、5000、7500、10000、15000、20000、25000、30000和40000道爾頓。通常而言，雙官能基或多官能基試劑使用的POLY或PEG片段的分子量比單官能基試劑中使用的更低。

聚合物結構可選自直鏈、支鏈、叉狀、多支鏈及其組合，下文將對其作進一步描述。

聚合物片段，POLY
用于制備本發(fā)明聚合物試劑的代表性水溶性聚合物包括聚(亞烷基二醇)例如聚(乙二醇)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羥基烷基異丁烯酰胺)、聚(羥基烷基異丁烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉、和聚(N-丙烯?；鶈徇?。POLY可以為上述任一物質的同型聚合物、交替的共聚物、任意的共聚物、阻斷共聚物、交替的三聚物、任意的三聚物或阻斷的三聚物。水溶性聚合物片段優(yōu)選為聚(乙二醇)(“PEG”)或其衍生物。

優(yōu)選地，聚合物是親水性聚合物；即，包含少于約25個丙烯氧化物亞單元或其他類似疏水性聚合物片段的聚合物。在任選的具體實施方式
中，聚合物可以不含有丙烯氧化物或類似的疏水性單元。在一種情況中，聚合物優(yōu)選不是pluronic類聚合物。然而在另一個特定的具體實施方式
中，優(yōu)選聚合物不和固相載體相連接。

聚合物片段可以為數(shù)種不同的幾何形狀任意之一，例如POLY可以是直鏈、支鏈或多支鏈。更典型地，POLY是直鏈或支鏈，例如具有2個聚合物臂。雖然本文中很多談論的焦點是用作舉例POLY的PEG，但本文中的說明和結構很容易被擴展到包含任何上述水溶性聚合物片段。

雖然本文中舉例使用和注解的水溶性聚合物僅有一個或兩個巰基官能團，但也可以使用有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個這種官能團的聚合物。有關與水溶性聚合物片段相關的巰基數(shù)目的上限，非限制性的例子包括約1至約500，1至約100，約1至約80，約1至約40，約1至約20，約1至約10。

水溶性聚合物、PEG的優(yōu)選類型包括直鏈、支鏈或多支鏈形式的聚(乙二醇)，包括封端PEG、叉狀PEG、支鏈PEG、懸掛PEG和包含一個或多個可降解鍵的PEG，所述可降解鍵分離單體亞單元，下文將對此進行詳細說明。PEG聚合物片段中重復的乙二醇單元的數(shù)量通常為約3至約4,000，約12至約3,000或者更優(yōu)選約20至約1,000。

封端PEG優(yōu)選具有封端的部分，例如烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基、取代的芳氧基。優(yōu)選的封端基團是C1-C20烷氧基例如甲氧基、乙氧基、和苯甲氧基。封端基團還可有利地包括磷脂。磷脂的例子包括磷脂酰膽堿例如二月桂酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、山萮磷脂酰膽堿、花生四烯酰磷脂酰膽堿和卵磷脂。

未硫醇化的聚合物末端可包括反應活性部分，作為封端基團的一種替代選擇，優(yōu)選為被保護形式。這種活性基團的例子包括羥基、氨基、酯、碳酸酯、醛、縮醛、醛水合物、酮、縮酮、酮水合物、烯基、丙烯酸酯、異丁烯酸酯、丙烯酰胺、砜、羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、肼、脲、馬來酰亞胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、烷氧基、苯甲氧基、甲硅烷、脂質、磷脂、生物素、和熒光黃，適當時包括其活化和被保護形式。優(yōu)選官能團例如是N-羥基琥珀酰亞胺酯、1-羥基苯并三唑碳酸酯、胺、乙烯基砜、馬來酰亞胺、N-琥珀酰亞胺碳酸酯、肼、琥珀酰亞胺丙酸酯、琥珀酰亞胺丁酸酯、琥珀酰亞胺琥珀酸酯、琥珀酰亞胺酯、縮水甘油醚、氧羰基咪唑、p-硝基苯基碳酸酯、乙醛、鄰吡啶-二硫化物和丙烯醇。

本文中描述了這些及其他的官能團，例如在下述的參考文獻中，所有的參考文獻均在此引用作為參考N-succinimidyl carbonate(U.S.Patent Nos.5,281,698 and 5,468,478)，amine(Buckmann etal.，Makromol.Chem.1821379(1981)；Zalipsky et al.，Eur.Polym.J.191177(1983))，hydrazide(Andresz et al.，Makromol.Chem.179301(1978))，succinimidyl propionate and succinimidylbutanoate(Olson et al.，in poly(ethylene glycol)Chemistry &Biological Applications，pp.170-181，Harris & Zalipsky，Eds.，ACS，Washington，DC(1997)；U.S. Patent No.5,672,662)，succinimidyl succinate(Abuchowski et al.，Cancer Biochem.Biophys.7175(1984)and Joppich et al.，Makromol.Chem.1801381(1979))，succinimidyl ester(U.S.Patent No.4,670,417)，benzotriazole carbonate(U.S.Patent No.5,650,234)，glycidylether(Pitha et al.，Eur.J.Biochem.9411(1979)；Elling et al.，Biotech.Appl.Biochem.13354(1991))，oxycarbonylimidazole(Beauchamp et al.，Anal.Biochem.13125(1983)；Tondelli et al.，J.Controlled Release 1251(1985))，p-nitrophenyl carbonate(Veronese et al.，Appl Biochem.Biotech.11141(1985)；Sartoreet al.，Appl.Biochem.Biotech.2745(1991))，aldehyde(Harriset al.，J.Polym.SC1.Chem.Ed.22341(1984)；U.S.Patent No.5,824,784；U.S.Patent 5,252,714)，maleimide(Goodson et al.，Bio/Technology 8343(1990)；Romani et al.，in Chemistry ofPeptides and Proteins 229(1984)；Kogan，Synthetic Comm.222417(1992))，orthopyridyl-disulfide(Woghiren et al.，Bioconj.Chem.4314(1993))，acrylol(Sawhney et al.，Macromolecules 26581(1993))，and vinylsulfone(U.S.Patent No.5,900,461)。

本文所述POLY的類型包括直鏈聚合物片段以及支鏈或多支鏈聚合物片段。例子包括有2、3、4、5、6、7、8或更多個支鏈的PEG分子。用于制備本發(fā)明巰基聚合物的支鏈聚合物可以在任何位置具有2-300個左右活性末端。優(yōu)選的是具有2-8個聚合物臂的支鏈或多臂PEG。在制備本發(fā)明巰基聚合物中使用的支鏈或多臂聚合物包括以式R(POLY)n表示的化合物，其中R是中心或核心分子，從其中可延伸出2個或更多個POLY臂例如PEG。變量n代表POLY臂的數(shù)量，其中每一個聚合物臂可獨立地為封端或者在末端具有羥基或其他活性基團，其中至少一個聚合物臂具有這樣的活性基團。支鏈PEG例如由R(PEG)n所代表的化合物，具有至少2個、高至約300個聚合物臂(即，n的范圍為2至約300)。優(yōu)選地，這種支鏈PEG具有2至約25個聚合物臂，更優(yōu)選2至約20個聚合物臂，更優(yōu)選2至約15個聚合物臂或更少。最優(yōu)選具有3、4、5、6、7或8個臂的多支鏈聚合物。

上文所述的支鏈PEG中優(yōu)選的核心分子是多醇。這種多醇包括具有1-10個碳原子和1-10個羥基基團的脂肪族多醇，包括乙二醇、烷二醇、烷基二醇、亞烷基烷基二醇、烷基環(huán)烷二醇、1，5-萘烷二醇、4，8-二(羥基甲基)三環(huán)癸烷、亞環(huán)烷基二醇、二羥基烷、三羥基烷、四羥基烷等等。還有，上述類別的部分或全部的醚可作為核心分子，包括二季戊四醇、三季戊四醇、六甘油等等。也可以使用環(huán)脂肪族多醇，包括直鏈或封閉環(huán)的糖以及糖醇，例如甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、白堅木醇、蘇糖醇、阿拉伯糖醇、赤藻糖醇、核糖醇、ducitol、facose、核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、醛糖、塔羅糖、tagitose、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、麥芽糖、等等。其他的脂肪族多醇包括甘油醛、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖及相關立體異構體的衍生物。其他可使用的核心多醇包括冠狀醚、環(huán)糊精、糊精及其他碳氫化合物例如淀粉和直鏈淀粉。優(yōu)選的多醇包括甘油、季戊四醇、山梨糖醇和三甲醇丙烷。

本發(fā)明巰基聚合物的多支鏈結構可表示為R-(POLY-Y-S-W)x，其中POLY、Y和S-W如上文所定義，R代表多支鏈結構的核心分子，x優(yōu)選為3至約8。每一個聚合物支鏈可獨立地是封端或在其末端具有巰基基團，其中至少一個聚合物支鏈具有巰基(或被保護的巰基)基團。適于制備此結構的多支鏈PEG可以從NektarTherapeutics(Huntsville，Alabama)獲得。

任選地，聚合物片段可具有所有的叉狀結構，例如PEG-(Y-S-W)2。根據Y的選擇，這種類型的聚合物片段可以和兩個活性試劑反應，其中這兩個活性試劑分開有精確或預定的距離。

用于制備本發(fā)明綴合物的代表型PEG可以從NektarTherapeutics(Huntsville，Alabama)購得，其中PEG具有直鏈或支鏈結構。用作說明的結構記載于Nektar 2004產品目錄中，題目為“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”，這篇文章的內容在此引用作為參考。

在本文的任何一個代表型結構中，POLY片段中可包含一個或多個可降解鍵，以在體內產生綴合物，所述綴合物比最開始使用的綴合物具有更小的POLY鏈。適當?shù)纳韺W分解鍵包括但不限于酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基醚、縮醛和縮酮。優(yōu)選這種連接鍵在儲藏和開始使用時都很穩(wěn)定。。

一般來說，POLY的分子量落入一個或多個下述范圍約100至約100,000道爾頓，約500至約80,000道爾頓，約1,000至約50,000道爾頓，約2,000至約25,000道爾頓和約5,000至約20,000道爾頓。分子量的例子包括約1,000，約5,000，約10,000，約15,000，約20,000，約25,000，約30,000和約40,000道爾頓。低分子量POLY的分子量為約250,500，750,1000，2000或5000道爾頓。代表性的巰基聚合物包括分子量為5,000，20,000和40,000道爾頓的PEG。

在本發(fā)明的特定具體實施方式
中，本文所述的巰基聚合物試劑具有下述分子量之一的PEG片段500，1000，2000，3000，5000，10,000，15,000，20,000，30,000和40,000道爾頓。

就亞單元的數(shù)量而言，在本發(fā)明中使用的PEG通常包括落在下面一個或多個范圍的一定數(shù)量的(-OCH2CH2-)亞單元12至約4000亞單元，約15至約2000亞單元，約20至約1000亞單元，約25至約750亞單元，約30至約500亞單元。

試劑的制備
方案1顯示了一種制備“無連接基”聚亞烷基氧基-巰基試劑的方法。在此反應中，在一端有封端基團的聚亞烷基二醇例如單甲氧基PEG被強堿例如NaH烷氧基化，試劑和二(鹵素烷基硫化物)結合形成聚合二醚二硫化物。然后中間體可被還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)分裂，得到聚亞烷氧基-巰基試劑。
方案1

在其他的合成路線中，如方案2所示，二(羥基烷基硫化物)作為核心材料用于環(huán)氧乙烷的聚合，形成PEG二醚二硫化物。末端被例如甲基基團所封端。然后，二硫化物被還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)分裂得到聚亞烷氧基-巰基試劑。
方案2

方案3顯示了另一種方法。在這個路線中，制得了試劑POLY-Y-OH，其中Y如上所定義。例如，這種試劑可通過如下方法制得POLY-OH例如m-PEG-OH和強堿例如NaH反應形成醇鹽，然后和鹵代烷醇例如4-溴-1-丁醇反應。末端羥基基團轉化為離去基團例如甲苯磺酸鹽或甲磺酸鹽，此化合物然后和硫脲反應，置換離去基團。然后末端硫脲陽離子鹽被堿分裂巰基，得到末端巰基。下述實施例1中對此方案作了一些變化，其中離去基團是鹵素。
方案3

在任何一個這種試劑中，可使用巰基保護基團來保護巰基，例如三苯甲基，硫醚例如烷基和苯甲基硫醚，包括單硫、二硫和氨基硫縮醛，硫酯，硫碳酸酯，硫氨基甲酸酯和sulfenyl衍生物。在儲藏期間使用保護基團還可進一步降低試劑發(fā)生二聚化作用的傾向性。如方案3所示，巰基還可轉化為鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)，其在標準儲藏條件下是穩(wěn)定的。如實施例2所示，在適當?shù)姆磻獥l件下，OPSS基團平穩(wěn)地和欲綴合到水溶性聚合物上的分子中的巰基基團反應。

優(yōu)選地，本發(fā)明聚合物試劑在惰性空氣條件下儲存，例如氬氣和氮氣。還優(yōu)選的是，本發(fā)明聚合物應最低化暴露在潮氣中。因此，優(yōu)選的儲藏條件是在干燥的氬氣或其他干燥的惰性氣體中，溫度低于約-15℃。優(yōu)選在低溫條件下進行儲藏，這是因為低溫下不期望的副反應速率會有所降低。例如，當聚合物片段是PEG時，PEG可以緩慢地與氧氣反應生成過氧化物，最終導致鏈分解，并且提高PEG試劑的多分散性?；谏鲜隼碛?，優(yōu)選將本發(fā)明聚合物儲藏在黑暗中。

聚合物綴合物
本發(fā)明還包括本文所述的巰基聚合物試劑反應生成的綴合物。通常而言，本發(fā)明聚合物試劑用于和活性試劑綴合，所述活性試劑具有至少一個巰基基團以用于反應。

本發(fā)明綴合物通常結構為POLY-[Y-S-S-A]x，其中POLY如上文所定義，在優(yōu)選的具體實施方式
中為聚乙二醇(PEG)；x為1-25，“A”代表綴合后活性試劑的殘基。在可選擇的具體實施方式
中，x是1-8，1-6或1-4；在進一步的具體實施方式
中，x是1或x是2。Y是具有至少4個碳原子并且有取代基的二價連接基團，由飽和或不飽和碳氫主鏈組成，碳氫主鏈上有3-10個，優(yōu)選3-8個碳原子，取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和本文定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個這種烷基和/或烯基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基。

在可選擇的具體實施方式
中，Y的結構為-(CR1R2)n-，其中n為3-10，優(yōu)選3-8，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基。不同碳原子上的兩個基團R1和R2可以相連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基。巰基(或被保護的巰基)的硫原子連接在Y的sp3雜碳原子上，而不是芳基環(huán)或雙鍵上。

在Y的可選擇具體實施方式
中，Y是C3-C8亞烷基，或者C3-C8亞烷基和C5-C8環(huán)亞烷基或芳基的組合，任何一種都可包括一個或多個如上文所定義的無干擾取代基。優(yōu)選地，包括0-2個，更優(yōu)選0或1個這種無干擾取代基。

在進一步的具體實施方式
中，Y是具有式-(CR1R2)n-的直鏈或支鏈亞烷基，其中n為4-8，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基。優(yōu)選地，n是4-6，每一個R1和R2獨立地選自氫和甲基。在一個具體實施方式
中，每一個R1和R2是氫，n代表-(CR1R2)-重復的次數(shù)。在另一個具體實施方式
中，除了R1在所述硫原子的鄰位碳上(α-碳)R1為低級烷基優(yōu)選甲基或乙基以外，每一個R1和R2均為氫。

在Y為-(CR1R2)n-的具體實施方式
中，其中n為4-8，不同碳原子上的兩個基團R1和R2相連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基，所述環(huán)烷基優(yōu)選是環(huán)戊基或環(huán)己基。

另一方面，本發(fā)明綴合物的結構可為POLYA-L-SS-Y-POLYB-Y′-SS-A。每一個POLY為上文所定義的水溶性聚合物片段，其中POLYB具有低分子量，例如10KDa或更低，優(yōu)選5KDa或更低，更優(yōu)選2KDa或更低，POLYA和POLYB的分子量之和至少為3KDa。POLYA的分子量通常是中等至高分子量，但這不是必需的，例如大于約2KDa，優(yōu)選5KDa或更多，更優(yōu)選10KDa或更多。

每一個Y和Y′都是上文定義Y的間隔基團，他們可以相同或不同。通常而言，Y和Y′是相同的間隔基團。L是POLYA和鄰近的二硫化物鍵之間的連接基。一般來說，這種連接基是直接的鍵或者含至多約10個原子長度的原子鏈的基團，優(yōu)選選自烷基(C-C)、烯基、醚、酯、酰胺、氨基甲酸酯和硫酯鍵。L可以但不一定是本文所述的Y的具體實施方式
。

這些綴合物通常是一系列反應的產物(具體見下文實施例8-11)，其中式W-S-S-Y-POLYB-Y′-S-S-W低分子量試劑首先和生物活性分子A-SH反應形成中間體A-S-S-Y-POLYB-Y′-S-S-W，其中S-W是巰基或者優(yōu)選是巰基-活性衍生物例如OPSS，A-SH例如是具有(或修飾后具有)游離半胱氨酸殘基的蛋白質。然后，此中間體和式POLYA-L-S-S-W(代表性的)高分子量試劑反應，生成最終綴合物。

這個方案的優(yōu)點，特別是對于具有被阻礙的巰基的生物分子而言，在于低分子量試劑相對于高分子量試劑能夠更有效地和這種被阻礙的巰基基團反應。因此高分子量聚合物可以通過此方案以更高的產率連接到A上，相對于其直接和被阻礙的巰基進行反應。

然而，如果起始試劑W-S-S-Y-POLYB-y′-S-S-W缺少如本文所述的親水性間隔基團Y，此方案可能會因為連接步驟中的低產率而失敗。這一區(qū)別在下文的比較實施例9和10中會進行說明。

一般來說，本文所述的綴合物優(yōu)選是水溶性或可分散性的，雖然巰基聚合物試劑還可以和具有活性巰基基團的固態(tài)載體或表面相綴合。

用于和本發(fā)明活性聚合物偶合的巰基基團，例如是在半胱氨酸殘基中，可以是天然產生的(即，在蛋白質或其他天然形式的分子中產生)，或者是引入的例如利用標準遺傳工程技術插入到蛋白質的天然序列中替代天然氨基酸。

當活性試劑包括很少或者僅有一個活性巰基時，得到的組合物可以有利地僅包含一種聚合物綴合物。這可用于和蛋白質綴合，蛋白質通常含有的容易綴合的巰基數(shù)量較少(和其他活性基團例如胺相比)。通過巰基基團的共價結合從而可以引起靶蛋白的更多選擇性修飾。相應地，巰基聚合物的應用可以更多的控制整個得到的聚合物綴合物，不僅是和母蛋白質結合的聚合物衍生物的數(shù)量，而且包括聚合物連接的位置。

用于綴合的分子
用于制備本發(fā)明綴合物的生物活性試劑可以是下述多種結構類別之一，包括但不限于肽、多肽、蛋白質、抗體、多糖、甾體、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、脂肪、電解質、小分子(優(yōu)選不溶性小分子)等等。優(yōu)選地，和本發(fā)明聚合物結合的活性試劑具有天然巰基或者修飾后含有至少一個適于結合的活性巰基基團。

用于和本發(fā)明聚合物巰基結合的優(yōu)選肽或蛋白質包括EPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、一致性IFN、因子VII、因子VIII、因子IX、IL-2、RemicadeTM(英夫利昔單抗)、RituxanTM(利妥昔單抗)、EnbrelTM(依那西普)、SynagisTM(帕利珠單抗)、ReoproTM(abciximab)、HerceptinTM(曲妥單抗)、tPA、CerizymeTM(伊米苷酶)、乙型肝炎病毒vaccine、rDNAse、α-1蛋白酶抑制因子、G-CSF、GM-CSF、hGH、胰島素、FSH和PTH。在可選擇的具體實施方式
中，蛋白質是G-CSF或GM-CSF。

上述代表性的生物活性劑是指包括可適用的其類似物、激動劑、拮抗劑、抑制劑、異構體及藥物可接受的鹽。對于肽和蛋白質，本發(fā)明包括合成、重組、天然、糖基化和非糖基化形式，以及其生物活性片段。上述生物活性蛋白質還包括具有一個或多個氨基酸取代(例如半胱氨酸)、刪除或類似形式的變異體，只要得到的變體蛋白質具有至少一定程度的母(天然)蛋白活性即可。

適當?shù)脑噭┻x自，例如安眠藥和鎮(zhèn)靜劑、精神興奮劑、鎮(zhèn)定劑、呼吸藥物、抗驚厥劑、肌松藥、抗麻痹藥(多巴胺拮抗劑)、鎮(zhèn)痛藥、抗炎劑、抗焦慮藥物(抗焦慮劑)、食欲抑制劑、抗偏頭痛藥、肌肉收縮藥、抗感染藥(抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、疫苗)、抗關節(jié)炎藥、抗瘧藥、止吐藥、anepileptics、支氣管擴張藥、細胞活素類、生長因子、抗癌藥、抗血栓劑、抗高血壓藥、心血管藥物、抗心律不齊藥、抗氧化劑、抗哮喘劑、激素包括避孕藥、擬交感神經藥、利尿劑、脂質調節(jié)劑、抗雄激素劑、抗寄生蟲藥、抗凝血劑、腫瘤劑、抗腫瘤劑、降血糖藥、營養(yǎng)劑和補藥、生長補藥、抗腸炎藥、疫苗、抗體、診斷用藥和造影劑。

活性試劑的其他特定例子包括但不限于門冬酰胺酶、amdoxovir(DAPD)、安肽、貝卡普勒明、降鈣素、cyanovirin、地尼白介素-毒素連接物、促紅細胞生成素(EPO)、EPO激動劑(例如有10-40個氨基酸長度的肽，并包括如WO96/40749所述的特定核心序列)、脫氧核糖核酸酶α、紅細胞生成刺激蛋白(NESP)、凝血因子例如因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XII、因子XIII、血管假性血友病因子；西利酶、cerezyme、α-葡萄糖苷酶、膠原、環(huán)孢霉素、α防御素、β防御素、exendin-4、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制因子、依降鈣素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)、纖維蛋白素原、非格司亭、生長激素人生長激素(hGH)、生長激素釋放激素(GHRH)、GRO-β、GRO-β抗體、骨結構蛋白質例如骨結構蛋白-2、骨結構蛋白-6、OP-1；酸性成纖維細胞生長因子、基本的成纖維細胞生長因子、CD-40配體、肝素、人血清清蛋白、低分子量肝素(LMWH)、干擾素類例如干擾素α、干擾素β、干擾素γ、干擾素omega、干擾素tau、一致性干擾素；白介素和白介素受體例如白介素-1受體、白介素-2、白介素-2融合蛋白質、白介素-1受體拮抗劑、白介素-3、白介素-4、白介素-4受體、白介素-6、白介素-8、白介素-12、白介素-13受體、白介素-17受體；乳鐵蛋白和乳鐵蛋白片段、促黃體激素釋放激素(LHRH)、胰島素、前-胰島素、胰島素類似物(例如，美國專利5,922,675記載的單-?；葝u素)、糊精、C-肽、生長激素抑制素、生長激素抑制素類似物包括奧曲肽、加壓素、促卵胞激素(FSH)、流感疫苗、胰島素-類似生長因子(IGF)、胰島素溴甲阿托品、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、纖溶酶原活化因子例如阿替普酶、尿激酶、瑞替普酶、鏈激酶、帕米普酶、拉諾替普酶和teneteplase；神經生長因子(NGF)、骨保護素、血小板衍生生長因子、組織生長因子、轉化生長因子-1、血管內皮生長因子、白血球抑制因子、角質化細胞因子(KGF)、神經膠質生長因子(GGF)、T細胞受體、CD分子/抗原、腫瘤壞死因子(TNF)、單核細胞趨化蛋白-1、內皮生長因子、甲狀旁腺激素(PTH)、胰高血糖素類似肽、生長激素、胸腺素α1、胸腺素α1 IIb/IIIa抑制劑、胸腺素β10、胸腺素β9、胸腺素β4、α-1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4(極晚抗原-4)、VLA-4抑制劑、bisphosponates、呼吸道合胞病毒抗體、囊性纖維化跨膜通道調節(jié)因子(CFTR)基因、脫氧核糖核酸酶(Dnase)、殺菌/滲透性增長因子(BPI)、和抗-CMV抗體。代表性的單克隆抗體包括依那西普(由人類75kD TNF受體的細胞外配體-結合部分和IgG1的Fc部分結合組成的細胞外配體二聚物融合蛋白)、阿昔單抗、afeliomomab、巴利昔單抗、巴利昔單抗、英夫利昔單抗、ibritumomabtiuexetan、米妥莫單抗、鼠單克隆抗體-CD3、碘131托西莫單抗綴合物、奧立珠單抗、利妥昔單抗和曲妥單抗(赫賽汀)。

適于和聚合物共價連接的其他試劑包括但不限于阿米斯丁、胺碘酮、氨基己酸、氨基馬尿酸鈉、氨魯米特、氨基乙酰丙酸、氨基水楊酸、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、門冬酰胺酶、蒽環(huán)類抗生素、貝沙羅汀、比卡魯胺、博來霉素、乙基酰胺、白消安、卡麥角林、卡培他濱、碳鉑、卡氮芥、chlorambucin、西司他丁鈉、順鉑、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環(huán)磷酰胺、去乙酰環(huán)丙氯地孕酮、阿糖胞苷、喜樹堿、13-順維生素A酸、所有的反式維甲酸；氮烯咪胺、更生霉素、柔紅霉素、去鐵胺、地塞米松、地塞米松、己烯雌酚、多西他奇、阿霉素、表阿霉素、磷雌氮芥、鬼臼乙叉甙、依西美坦、非索非那定、氟達拉濱、氟氫可的松、氟尿嘧啶、氟氫甲睪酮、氟他米特、吉西他濱、腎上腺素、L-Dopa、羥基脲、去甲氧基柔紅霉素、異磷酰胺、imatinib、依立替康、依曲康唑、戈舍瑞林、來曲唑、亞葉酸、左旋咪唑、賴諾普利、lovothyroxinesodium、洛莫司汀、氮芥、甲羥孕酮、甲地孕酮、美法倉、巰嘌呤、間羥胺、甲氨喋呤、甲氧氯普胺、美西律、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、納洛酮、煙堿、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉑、氨羥二磷酸二鈉、噴司他丁、pilcamycin、卟菲爾鈉、潑尼松、甲基芐肼、丙氯拉嗪、奧坦西隆、雷替曲塞、西羅莫司、鏈唑霉素、他克莫司、三苯氧胺、替莫唑胺、替尼泊苷、睪酮、四氫大麻酚、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、托泊替康、維甲酸、戊柔比星、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、多拉司瓊、格拉司瓊；福莫特羅、氟地松、醋酸亮丙瑞林、咪達唑侖、阿普唑侖、兩性霉素B、podophylotoxins、核苷抗病毒劑、芳?；辍⑹骜R曲坦；大環(huán)內酯類例如紅霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、羅紅霉素、克拉仙霉素、davercin、阿奇霉素、氟紅霉素、地紅霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麥迪霉素、吉他霉素、麥白霉素、羅他霉素、和阿齊紅霉素、和swinolide A；氟喹諾酮類例如環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、moxifloxicin、氟哌酸、氟啶酸、格雷沙星、加替沙星、洛米沙星、施怕沙星、替馬沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟羅沙星、托氟沙星、普盧利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星；氨基糖甙類例如慶大霉素、奈替霉素、草履蟲素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和鏈霉素、萬古霉素、替考拉寧、rampolanin、麥地拉寧、粘菌素、達托霉素、短桿菌肽、粘菌素甲烷磺酸鈉；polymixins例如polymixin B、卷曲霉素、桿菌肽、青霉烯類；青霉素類包括青霉素易敏感劑例如青霉素G、青霉素V；青霉素酶抑制劑例如甲氧苯青霉素、苯唑西林、鄰氯青霉素、雙氯青霉素、氟氯青霉素、萘夫西林；革蘭(氏)陰性微生物活性劑例如氨芐西林、阿莫西林、和海他西林、cillin、和galampicillin；antipseudomonal青霉素類例如羧芐青霉素、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、和哌拉西林；先鋒霉素類例如頭孢泊肟、頭孢丙烯、ceftbuten、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢菌素、頭孢匹林、頭孢氨芐、cephradrine、頭孢西丁、頭孢羥唑、頭孢唑啉、頭孢利素、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢格來星、頭孢呋新、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢曲秦、頭孢乙氰、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢尼西、頭孢哌酮、頭孢替坦、頭孢美唑、頭孢他定、氯拉卡比、和拉氧頭孢、單環(huán)β-內酰胺類例如氨曲南；和碳青霉烯類例如亞胺培南、美羅培南、pentamidine isethiouate、沙丁胺醇硫酸酯、利多卡因、奧西那林硫酸酯、倍氯米松diprepionate、去炎松乙酰胺、布地奈德縮酮、氟地松、異丙托溴銨、氟尼縮松、色甘酸鈉、和麥角胺；紫杉烷類例如紫杉醇；SN-38、和酪氨酸磷酸化抑制劑。

綴合方法
適當?shù)木Y合條件是時間、溫度、pH、試劑濃度、溶劑等足以有效地在巰基聚合物試劑和活性劑之間發(fā)生綴合。如現(xiàn)有技術已知，除此之外，特定的條件還依賴于活性劑、期望的綴合類型、反應混合物中存在的其它材料等等。在任何特定狀況中，有效綴合的充分條件可由本領域普通技術人員在本文教導下參考相關文獻和/或通過例行試驗確定。

代表性的綴合條件包括在約6至約10的pH條件下進行綴合反應，例如pH約為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10。反應將進行約5分鐘至約72小時，優(yōu)選約30分鐘至約48小時，更優(yōu)選約4小時至約24小時或更少。綴合反應的溫度通常為，但不是必需的，約0℃至約40℃；綴合反應經常在室溫或更低溫度下進行。綴合反應通常在緩沖液中進行，例如磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液或類似的系統(tǒng)。

就試劑濃度而言，通常是過量的聚合物試劑和活性劑結合。然而，在某些狀況中，優(yōu)選的是聚合物試劑上的活性基團對應于一定量的活性劑而言是化學量。聚合物試劑和活性劑的代表性比例包括摩爾比為約1∶1(聚合物試劑∶活性劑)、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1或10∶1。綴合反應一直持續(xù)到基本上不再有綴合反應發(fā)生為止，這可以通過隨著時間監(jiān)視反應進程進行確定。

反應進程可以通過下述方法進行監(jiān)視在不同的時間點從反應混合物中取出一部分，通過SDS-PAGE或MALDI-TOF質譜分析法或任何其他適當?shù)姆治龇椒ǚ治龇磻旌衔?。一旦觀察到綴合物的量不再增加或者未綴合聚合物的量保持不變，則認為反應進行完全了。一般來說，綴合反應會進行數(shù)分鐘至數(shù)小時(例如，從5分鐘至24小時或更多)。得到的產物混合物優(yōu)選但不必須被純化，以分離過量的試劑、未綴合反應物(例如活性劑)、不期望的多-綴合物，和游離或未反應的聚合物。得到的綴合物可進一步利用分析方法確定其性質，所述分析方法例如是MALDI、毛細管電泳、凝膠電泳和/或色譜法。

更優(yōu)選地，本發(fā)明巰基聚合物通常和包含巰基的活性劑在pH約6-9(例如6、6.5、7、7.5、8、8.5或9)條件下綴合，更優(yōu)選pH約7-9，更優(yōu)選pH約7-8。通常而言，使用稍微過量的聚合物試劑，例如1.5-15倍，優(yōu)選2倍-10倍摩爾過量。室溫下，反應時間通常為約15分鐘至數(shù)小時，例如8或更多小時。對于被立體結構阻礙的巰基基團，所需要的反應時間可能會特別長。

純化綴合物
選擇性地，本發(fā)明巰基聚合物和生物活性劑反應得到的綴合物被純化，以獲得/分離出不同物質例如PEG-類，或移除不期望的反應副產物。

如果希望的話，具有不同分子量的PEG綴合物可利用凝膠過濾色譜法進行分離。雖然此方法可用于分離不同分子量的PEG綴合物，但此方法通常不能有效地分離在一個蛋白質內具有不同PEG化位置的位置異構體。例如，凝膠過濾色譜法可用于分離PEG 1-聚合物、2-聚合物、3-聚合物等的混合物中的任一個，盡管每一個PEG聚合物組合物都可包含連接在蛋白質內不同活性基團上的PEG。

適于進行此類分離的凝膠過濾柱包括SuperdexTM和SephadexTM柱，可以從Amersham Biosciences購得。對于特定柱的選擇取決于希望的級分分離范圍。通常使用無胺基緩沖液例如磷酸鹽、醋酸鹽等進行洗脫。收集到的級分可以利用多種不同的方法進行分析，例如(i)OD在280nm用于蛋白質含量分析，(ii)BSA蛋白質分析，(iii)碘試驗，用于PEG含量分析(Sims，G.E.C.et al.，Anal.Biochem，107，60-63，1980)，或者任選地，(iv)通過在SDS PAGE凝膠中流動，然后利用碘化鋇進行染色。

位置異構體可通過反相色譜法例如RP-HPLC C18柱(Amersham Biosciences or Vydac)進行分離，或者利用離子交換柱通過離子交換色譜法進行分離，所述離子交換柱例如是從AmershamBiosciences購得的SepharoseTM離子交換柱。上述任一種方法都可用于分離具有相同分子量(位置異構體)的PEG-活性分子異構體。

根據得到的PEG-綴合物的預期用途，在綴合以及任選的附加分離步驟之后，可濃縮綴合物混合物，無菌過濾，在低溫約-20℃至約-80℃條件下儲存。任選地，低壓凍干綴合物，有或沒有殘留的緩沖液，以凍干粉末形式進行儲存。在某些情況下，優(yōu)選更換用于綴合的緩沖液例如醋酸鈉成為揮發(fā)性緩沖液例如碳酸銨或醋酸銨，這些物質在凍干時很容易被移除，因此凍干蛋白質綴合物粉末制劑中沒有殘留的緩沖液。任選地，利用制劑緩沖液進行緩沖液更換步驟，這樣凍干綴合物的形式適于重構成制劑緩沖液，并最終適于對哺乳動物使用。

藥物組合物
本發(fā)明還包括藥物制劑，其中包括本文所述的綴合物以及藥物賦形劑。一般來說，綴合物本身為固態(tài)形式(例如沉淀物或凍干粉)或液體形式，其可以和適當?shù)乃幬镔x形劑組合，所述藥物賦形劑可為固體或液體形式。

代表性的賦形劑包括但不限于碳氫化合物、無機鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩沖液、酸、堿及其組合。

賦形劑可以是碳氫化合物例如糖、衍生糖例如糖醇、糖醛酸、酯化糖和/或糖聚合物。特定的碳氫化合物賦形劑包括，例如單糖例如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、等等；二糖例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等等；多糖例如綿白糖、松三糖、糊精-麥芽糖復合劑、葡聚糖、淀粉等等；以及糖醇例如甘露醇、木糖醇、maltitol、拉克替醇、木糖醇、山梨糖醇(山梨醇)、pyranosyl山梨糖醇、肌醇等等。

賦形劑還可包括無機鹽或緩沖液例如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉及其組合。

制劑中還可包括抗微生物劑，以預防或制止微生物生長。適于本發(fā)明的抗微生物劑的非限制性例子包括苯扎氯銨、芐索氯銨、苯甲基醇、西吡氯銨、氯丁醇、苯酚、苯乙基醇、硝酸苯汞、thimersol、及其組合。

制劑中還可使用抗氧化劑，抗氧化劑用于預防氧化，因而預防制劑的綴合物或其它組份發(fā)生變質。本發(fā)明中應用的適當抗氧化劑包括，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥基茴香醚、丁羥基甲苯、次磷酸、單硫代甘油、沒食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、甲醛次硫酸鈉、焦亞硫酸鈉及其組合。

表面活性劑可作為賦形劑存在。代表性的表面活性劑包括聚山梨酯例如“土溫20”和“土溫80”，Pluronics例如F68和F88(這兩種化學物質均可從BASF，Mount Olive，New Jersey購得)；疏水山梨醇酯；脂質例如磷脂例如卵磷脂及其他磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺(優(yōu)選非脂質體形式)，脂肪酸和脂肪酯。甾體例如膽固醇；和螯合劑例如EDTA、鋅及其他適當?shù)年栯x子。

制劑中也可使用酸或堿作為賦形劑。可使用的酸的非限制性例子選自鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富馬酸及其組合。適當?shù)膲A的例子包括但不限于氫氧化鈉、醋酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、醋酸銨、醋酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、富馬酸鉀及其組合。

藥物制劑包括所有的制劑類型，特別是適于注射的制劑例如可復溶的粉末以及混懸液和溶液。組合物中綴合物(即，活性劑和本文所述聚合物形成的綴合物)的用量根據多種因素而變化，但當組合物被放置在單位劑量容器(例如玻璃瓶)中時其最好為治療有效劑量。另外，可將藥物制劑放置在注射器中。治療有效劑量可以通過實驗加以確定，具體為逐漸增加綴合物的使用量，重復給藥，直至確定能夠達到理想的臨床效果的用量。

組合物中各個賦形劑的用量根據賦形劑活性和組合物的特定需求而有所不同。典型地，任何一種賦形劑的最佳用量可通過例行試驗確定，即制備包含不同賦形劑量(從低到高)的組合物，檢查穩(wěn)定性及其他參數(shù)，然后確定能夠達到最佳效果而不產生顯著負作用的用量范圍。

然而，通常而言，賦形劑的用量為組合物重量的約1％至約99％重量，優(yōu)選約5％-98％重量，更優(yōu)選約15-95％重量，最優(yōu)選濃度小于30％重量。

上述藥物賦形劑及其他賦形劑均記載于″RemingtonTheScience & Practice of Pharmacy″，19th ed.，Williams & Williams，(1995)，the″Physician′s Desk Reference″，52nd ed.，MedicalEconomics，Montvale，NJ(1998)，and Kibbe，A.H.，Handbook ofPharmaceutical Excipients，3rd Edition，American PharmaceuticalAssociation，Washington，D.C.，2000。

非必要地，本發(fā)明藥物制劑通常通過注射給藥，因此通常在立即使用前轉為液體溶液或混懸液。藥物制劑也可以為其他形式例如糖漿劑、乳膏、軟膏、片劑、粉末等等。給藥的其他方式還包括，例如肺、直腸、經皮、經粘膜、口服、鞘內、皮下、動脈內給藥等等。

如上文所述，綴合物可以通過靜脈注射在胃腸外注射給藥，或者比較不優(yōu)選地肌肉注射或皮下注射。胃腸外給藥的適當制劑類型除其他之外包括即時注射溶液、干粉末、注射混懸液、干不溶性組合物、乳劑和液體濃縮液，其中所述干粉末在使用之前和溶劑混合，所述干不溶性組合物在使用之前和載體混合，所述液體濃縮液在使用之前進行稀釋。

給藥方法
本發(fā)明還提供了一種對患者使用本文所述綴合物的方法，所述患者對于使用綴合物進行治療很敏感。該方法通常包括通過注射施用治療有效量的綴合物(優(yōu)選作為藥物制劑的一部分加以提供)。給藥方法可用于治療能夠通過使用特定綴合物緩解或預防的任何狀況。本領域普通技術人員可以確定特定綴合物可以有效地治療哪些狀況。使用的實際劑量根據個體的年齡、體重、身體狀況以及被治療狀況的嚴重程度、主治醫(yī)生的意見和使用的綴合物而有所不同。治療有效劑量對于本領域技術人員而言是已知的，和/或記載于相關參考文件和文獻中。通常而言，治療有效劑量的范圍是約0.001mg-100mg，優(yōu)選0.01mg/天-75mg/天，更優(yōu)選0.10mg/天-50mg/天。

任何給定綴合物(同樣，優(yōu)選作為藥物制劑的一部分加以提供)的單位劑量可以以各種給藥方案進行給藥，其取決于臨床醫(yī)師的判斷，患者的需要等等。特定的給藥方案對于本領域普通技術人員而言是已知的，或者可以根據常規(guī)方法進行試驗加以確定。代表性的給藥方案包括，但不限于，每天給藥5次，每天給藥4次，每天給藥3次，每天2次，每天1次，每周3次，每周2次，每周1次，每月2次，每月1次及其組合。一旦達到臨床效果，就可以停止給藥。

如有需要，可通過使用生理學可裂解的和/或酶降解的鍵實現(xiàn)綴合物的水溶性聚合物部分在體內的裂解，所述的鍵例如是聚合物主鏈中的氨基甲酸酯、酰胺、碳酸酯或含酯的鍵。這樣，可以通過選擇聚合物分子大小和提供所需清除性質的官能團類型對綴合物(通過裂解水溶性聚合物部分)的清除進行調節(jié)。本領域普通技術人員可以確定聚合物的適當分子大小以及裂解鍵。例如，本領域普通技術人員利用常規(guī)試驗即可確定適當?shù)姆肿哟笮『土呀怄I，具體為首先制備多種具有不同聚合物重量和裂解鍵的聚合物衍生物，然后通過對患者使用聚合物衍生物并定期采集血樣和/或尿樣繪制清除曲線(例如通過定期血樣或尿樣)。一旦繪制出一系列針對每一個測試綴合物的清除曲線，就能夠確定適當?shù)木Y合物。
實施例
下述實施例用于舉例說明，但絕非是限制本發(fā)明的保護范圍。一方面，在合成和綴合期間，實施例舉例說明本發(fā)明巰基聚合物增強的穩(wěn)定性。

使用由Bruker生產的400MHz分光計獲得1H NMR數(shù)據。

所述的PEG試劑從Nektar Therapeutics，Huntsville，AL獲得。
實施例1 制備mPEG-(CH2)4-鄰吡啶基二硫化物(mPEG-4C-OPSS) I.mPEG5000-丁基溴化物
共沸干燥mPEG5000(20.0g，0.004mol)(NOF公司)在甲苯(200ml)中的溶液，餾出50ml甲苯。加入氫化鈉(0.8g，60％分散在液體石蠟中，0.020mol)，混合物在60℃氬氣環(huán)境下攪拌1小時。加入1，4-二溴丁烷(9.0g，0.0417mol)，混合物在75℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。過濾混合物，減壓濃縮，將殘留物與850ml冷乙醚混合。濾出沉淀物，減壓干燥。產率為17.4g。NMR(d6-DMSO)1.60ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，1.84ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主鏈)。
II.mPEG5000-丁烷巰醇
向mPEG5000-丁基溴化物(2.0g，0.0004mol)的無水乙醇(20ml)溶液中，加入硫脲(0.31g，0.0041mol)，混合物在78℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在1％NaOH(21ml)水溶液中。溶液加熱至85℃，在氬氣環(huán)境下攪拌2.5小時。將溶液冷卻至35℃，然后使用10％磷酸將pH調至3。加入NaCl(6g)，二氯甲烷萃取產物。萃取液使用無水硫酸鈉進行干燥，利用冷乙醚沉淀產物。產率為1.8g。NMR(CDCl3)1.35ppm(t，-CH2-SH，1H)，1.69ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-SH，4H)，2.55ppm(m，-CH2-SH，2H)，2.69ppm(t，-CH2-S-S-CH2-，4H，1.2mol％)3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主鏈)。碘量分析顯示產物包含94％巰基。上述NMR數(shù)據表明產物包含非常少量(NMR測定為1.2mol％)的二硫化物-連接二聚物，由巰基氧化形成。無需對硫醇進行進一步純化。

相反，由mPEG5000-甲磺酸鹽和硫脲根據相似方法制備的mPEG5000-乙烷巰醇(即在PEG和巰基之間僅有兩個碳原子的相應試劑)類似制劑，產物中含有約15mol％包含二巰基基團的二硫化物-連接的二聚物，(例如參見WO 2004/063250)。這個水平的二聚物就需要進一步的純化或者進行另外的化學處理以將二聚物轉換成理想的PEG-巰基。
III.mPEG5000-4C-OPSS
向mPEG5000-丁烷巰醇(2.0g，0.0004mol)的無水甲醇(40ml)溶液中，加入2，2′-二吡啶基二硫化物(0.18g，0.00082mol)，混合物在室溫和氬氣環(huán)境中攪拌4小時。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在二氯甲烷(5ml)中，使用50ml冷乙醚沉淀產物。產率為1.7g。NMR(CDCl3)1.68ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，1.76ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，2.82ppm(t，-CH2-S-，2H)，3.38ppm(s，-OCH3，3H)，3.52ppm(s，PEG主鏈)，7.12，7.68，7.75，& 8.47ppm(4m，吡啶基質子，4H)。
實施例2 制備PEG2000-二-((CH2)4-鄰吡啶基二硫化物)(PEG-二-(4C-OPSS)，2KDa)

PEG2000-二-丁基溴化物
共沸干燥PEG2000(20.0g，0.020當量)(NOF公司)在甲苯(150ml)中的溶液，餾出50ml甲苯。加入氫化鈉(6.0g，60％分散在液體石蠟中，0.150mol)，混合物在60℃氬氣環(huán)境下攪拌1小時。加入1，4-二溴丁烷(34.55g，1.600mol)，混合物在75℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。過濾混合物，減壓濃縮，將殘留物與850ml冷乙醚混合。濾出沉淀物，減壓干燥。產率為17.0g。NMR(d6-DMSO)1.60ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，1.84ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，3.51ppm(s，PEG主鏈)；取代96.3％。

PEG2000-二(丁烷巰醇)
向PEG2000-二(丁基溴化物)(10.0g，0.0100當量)的無水乙醇(100ml)溶液中，加入硫脲(7.68g，99％，0.100mol)，混合物在78℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在3.3％NaOH(180ml)水溶液中。溶液加熱至85℃，在氬氣環(huán)境下攪拌2.5小時。將溶液冷卻至35℃，然后加入60ml去離子水，使用10％磷酸將pH調至3。使用50ml醋酸乙酯洗滌溶液，二氯甲烷萃取。萃取液使用無水硫酸鈉進行干燥，然后減壓蒸餾移除溶劑。粗產品利用異丙醇進行重結晶，真空干燥。產率為7.8g。NMR(CDCl3)1.35ppm(t，-CH2-SH，1H)，1.69ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-SH，4H)，2.55ppm(m，-CH2-SH，2H)，2.69ppm(t，-CH2-S-S-CH2-，4H，1.9mol％)，3.64ppm(s，PEG主鏈)。

上述NMR數(shù)據表明產物包含非常少量(NMR測定為1.9mol％)的二硫化物-連接二聚物，其由巰基氧化形成。無需對硫醇進行進一步純化。

相反，由PEG2000-二-甲磺酸鹽和硫脲根據相似方法制備的PEG2000-乙烷巰醇(即在PEG和巰基之間僅有兩個碳原子的相應試劑)，產物中含有約41mol％包含二巰基基團的二硫化物-連接的二聚物。

PEG2000-二-(4C-OPSS)
向2，2′-二吡啶基二硫化醇(0.89g，0.0040mol)的無水甲醇(40ml)溶液中，加入PEG2000-二-丁烷巰醇(2.0g，0.0020當量)，混合物在室溫和氬氣環(huán)境中攪拌3小時。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在二氯甲烷(5ml)中，使用50ml冷乙醚沉淀產物。將沉淀物重復上述操作，得到1.0g固體產物。NMR(CDCl3)1.68ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，1.76ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，2.82ppm(t，-CH2-S-，2H)，3.64ppm(s，PEG主鏈)，7.12，7.68，7.75，& 8.47ppm(4m，吡啶基Hs，4H)。
實施例3 制備mPEG10,000(CH2)4-鄰吡啶基二硫化物(mPEG-4C-OPSS，10KDa)
mPEG10,000-丁基溴化物
共沸干燥mPEG10,000(20.0g，0.002mol)(NOF公司)在甲苯(200ml)中的溶液，餾出50ml甲苯。加入氫化鈉(0.8g，60％分散在液體石蠟中，0.0200mol)，混合物在60℃氬氣環(huán)境下攪拌1小時。加入1，4-二溴丁烷(4.8g，0.0222mol)，混合物在75℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。過濾混合物，減壓濃縮，將殘留物與850ml冷乙醚混合。濾出沉淀物，減壓干燥。產率為18.5g。NMR(d6-DMSO)1.60ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，1.84ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主鏈)取代97.5％。

mPEG10,000-丁烷巰醇
向mPEG10,000-丁基溴化物(10.0g，0.0010mol)的無水乙醇(100ml)溶液中，加入硫脲(0.77g，99％，0.0100mol)，混合物在78℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在1.0％NaOH(90ml)水溶液中。溶液加熱至85℃，在氬氣環(huán)境下加熱3小時。將溶液冷卻至室溫，然后加入NaCl(10g)，使用10％磷酸將pH調至3。二氯甲烷萃取產物。萃取液使用無水硫酸鈉進行干燥，減壓蒸餾移除溶劑。將粗產品溶解在少量的二氯甲烷中，使用乙醚進行沉淀，真空干燥。產率為9.0g。NMR(CDCl3)1.35ppm(t，-CH2-SH，1H)，1.69ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-SH，4H)，2.55ppm(m，-CH2-SH，2H)，2.69ppm(t，-CH2-S-S-CH2-，4H，4.8mol％)，3.38ppm(s，-OCH3，3H)，3.64ppm(s，PEG主鏈)。上述NMR數(shù)據表明產物包含相對少量(NMR測定為4.8mol％)的二硫化物-連接二聚物，其由巰基氧化形成。無需對硫醇進行進一步純化。

mPEG10,000-4C-OPSS
向2，2′-二吡啶基二硫化物(0.10g，0.00045mol)的無水甲醇(40ml)溶液中，加入mPEG10,000-丁烷巰基(2.0g，0.00020當量)，混合物在室溫和氬氣環(huán)境中攪拌3小時。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在二氯甲烷(5ml)中，使用50ml冷乙醚沉淀產物。干燥，得到1.8g白色固體粉末。NMR(CDCl3)1.68ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，1.76ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，2.82ppm(t，-CH2-S-，2H)，3.38ppm(s，-OCH3，3H)，3.64ppm(s，PEG主鏈)，7.12，7.68，7.75，& 8.47ppm(4m，吡啶基質子，4H)。

實施例4和5說明了高分子量相應試劑的制備。
實施例4 制備mPEG20,000-(CH2)4-鄰吡啶基二硫化物(mPEG-4C-OPSS，20KDa)
mPEG20,000-丁基溴化物
共沸干燥mPEG20,000(20.0g，0.0010mol)(NOF公司)在甲苯(200ml)中的溶液，餾出50ml甲苯。加入氫化鈉(0.4g，60％分散在液體石蠟中，0.0100mol)，混合物在60℃氬氣環(huán)境下攪拌1小時。加入1，4-二溴丁烷(2.4g，0.0111mol)，混合物在75℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。過濾混合物，減壓濃縮，將殘留物與850ml冷乙醚混合。濾出沉淀物，減壓干燥。產率為18.2g。NMR(d6-DMSO)1.60ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，1.84ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主鏈)；取代98.0％。

mPEG20,000-丁烷巰醇
向mPEG20,000-丁基溴化物(10.0g，0.5mmol)的無水乙醇(100ml)溶液中，加入硫脲(0.39g，99％，0.0051mol)，混合物在78℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在1.0％NaOH(90ml)水溶液中。溶液加熱至85℃，在氬氣環(huán)境下加熱3小時。將溶液冷卻至室溫，然后加入NaCl(10g)，使用10％磷酸將pH調至3。二氯甲烷萃取產物。萃取液使用無水硫酸鈉進行干燥，減壓蒸餾移除溶劑。將粗產品溶解在少量的二氯甲烷中，使用乙醚進行沉淀，真空干燥。產率為8.2g。NMR(CDCl3)1.35ppm(t，-CH2-SH，1H)，1.69ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-SH，4H)，2.55ppm(m，-CH2-SH，2H)，2.69ppm(t，-CH2-S-S-CH2-，4H，3.4mol％)，3.38ppm(s，-OCH3，3H)，3.64ppm(s，PEG主鏈)。上述NMR數(shù)據表明產物包含非常少量(NMR測定為3.4mol％)的二硫化物-連接二聚物，其由巰基氧化形成。無需對硫醇進行進一步純化。

mPEG20,000-4C-OPSS
向2，2′-二吡啶基二硫化物(0.05g，0.00023mol)的無水甲醇(40ml)溶液中，加入mPEG20,000-丁烷巰基(2.0g，0.00010當量)，混合物在室溫和氬氣環(huán)境中攪拌3小時。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在二氯甲烷(5ml)中，使用50ml冷乙醚沉淀產物。得到1.9g白色固體粉末。NMR(CDCl3)1.68ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，1.76ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，2.82ppm(t，-CH2-S-，2H)，3.38ppm(s，-OCH3，3H)，3.64ppm(s，PEG主鏈)，7.12，7.68，7.75，& 8.47ppm(4m，吡啶基質子，4H)。
實施例5 制備mPEG30,000-(CH2)4-鄰吡啶基二硫化物(mPEG-4C-OPSS，30KDa)
mPEG30,000-丁基溴化物
共沸干燥mPEG30,000(20.0g，0.00067mol)(NOF公司)在甲苯(150ml)中的溶液，餾出50ml甲苯。加入氫化鈉(0.3g，60％分散在液體石蠟中，0.00750mol)，混合物在60℃氬氣環(huán)境下攪拌1小時。加入1，4-二溴丁烷(2.17g，0.0100mol)，混合物在75℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。過濾混合物，減壓濃縮，將殘留物與850ml冷乙醚混合。濾出沉淀物，減壓干燥。產率為15.3g。NMR(d6-DMSO)1.60ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，1.84ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-Br，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主鏈)；取代96.0％。

mPEG30,000-丁烷巰醇
向mPEG30,000-丁基溴化物(10.0g，0.00033mol)的無水乙醇(100ml)溶液中，加入硫脲(0.2 6g，99％，0.00338mol)，混合物在78℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在1.0％NaOH(90ml)水溶液中。溶液加熱至85℃，在氬氣環(huán)境下加熱2.5小時。將溶液冷卻至室溫，然后加入NaCl(10g)，使用10％磷酸將pH調至3。二氯甲烷萃取產物。萃取液使用無水硫酸鈉進行干燥，減壓蒸餾移除溶劑。將粗產品溶解在少量的二氯甲烷中，使用乙醚進行沉淀，真空干燥。產率為9.4g.NMR(CDCl3)1.35ppm(t，-CH2-SH，1H)，1.69ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-SH，4H)，2.55ppm(m，-CH2-SH，2H)，2.69ppm(t，-CH2-S-S-CH2-，4H，3.8mol％)，3.38ppm(s，-OCH3，3H)，3.64ppm(s，PEG主鏈)。上述NMR數(shù)據表明產物包含非常少量(NMR測定為3.8mol％)的二硫化物-連接二聚物，其由巰基氧化形成。無需對硫醇進行進一步純化。

mPEG30,000-4C-OPSS
向2，2′-二吡啶基二硫化物(0.05g，0.00023mol)的無水甲醇(60ml)溶液中，加入mPEG30,000-丁烷硫醇(3.0g，0.00010當量)，混合物在室溫和氬氣環(huán)境中攪拌3小時。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶解在二氯甲烷(8ml)中，使用60ml冷乙醚沉淀產物。得到2.9g白色固體粉末。NMR(CDCl3)1.68ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，1.76ppm(m，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，2H)，2.82ppm(t，-CH2-S-，2H)，3.38ppm(s，-OCH3，3H)，3.64ppm(s，PEG主鏈)，7.12，7.68，7.75，& 8.47ppm(4m，吡啶基質子，4H)。
實施例6 BSA和mPEG5000-4C-OPSS以及mPEG5000-MAL的綴合(MAL＝馬來酰亞胺)(比較實施例)還原BSA(二硫化物鍵裂解)
將3.1mg BSA樣品加入到包含3.1mL 1x PBS并且pH為7.5的5mL ReactiVialTM中。將溶液放在攪拌器中，中等速率攪拌。在攪拌狀態(tài)下，向溶液中加入4.62mg二巰基蘇糖醇(DTT)樣品，室溫下反應2小時，使樣品還原完全。

將反應混合物放在350mL有10,000MW PES膜的AmiconStirCell中，以去除DTT。向350ml體積中加入緩沖液(1x PBS pH7.5)，攪拌以防止發(fā)生沉降。向裝置中增加壓力(60psi)，直至體積減小至＜10mL。然后向350ml體積中再次加入PBS，然后將此過程重復兩次。冷凍1ml等分液用于標準(凝膠，HPLC等)，剩下的體積用于綴合步驟。

綴合
從步驟A得到的還原BSA(4mL)和實施例1所述的2.35mg(10x過量)mPEG5k-4C-OPSS在攪拌盤上的5ml ReactiVial中混合，所述攪拌盤為中間設置。使用步驟A的還原BSA(4mL)和2.35mg(10x過量)mPEG5K-MAL可以制備相似的反應混合物。(mPEG-MAL可從NektarTherapeutics，Huntsville，AL獲得，馬來酰亞胺通過環(huán)N原子和mPEG的末端-OCH2CH2-相連接)玻璃瓶在室溫下放置60小時。

分析
根據下述條件，將置于10％Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen)中。

4x LDS樣品緩沖液(Invitrogen)10μL/樣品
反應樣品30μL/樣品
1x MES電泳緩沖液(Invitrogen)600mL
多標記蛋白質標準樣品(Invitrogen)7μL
藍色安全染料(Invitrogen)50mL
填充樣品(a+b) 30μL
電壓200V
安培400mA
時間36分鐘
圖1顯示了使用藍色安全染料染色的最終凝膠。
圖2顯示了另外用碘化鋇染色的相同凝膠，用于檢測PEG。

圖2的凝膠顯示出的各種分子量和相對強度如下表所示 a通過BaI得到的假設值(為了檢測PEG)
PEG5K-MAL-BSA綴合反應生成了39.8％單PEG聚合物(58440MW)，mPEG5K-4C-OPSS-BSA綴合反應生成了42.2％單PEG聚合物。相應地，本發(fā)明巰基聚合物試劑的綴合強于從對比聚合物試劑(以馬來酰亞胺為末端的聚合物)觀察到的結果，這表明PEG-OPSS的顯著二聚化作用沒有發(fā)生，其中所述PEG-OPSS對于以mPEG-乙烷硫醇為基礎的相應試劑具有代表性。
實施例7 粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和mPEG10,000-(CH2)4-鄰吡啶基二硫化物(mPEG10,000-4C-OPSS)的PEG化作用
mPEG10,000-(CH2)4-鄰吡啶基二硫化物(mPEG10,000-4C-OPSS)
將50倍過量的(相對于原G-CSF溶液被測量的部分中G-CSF的量)實施例3制備的mPEG10,000-(CH2)4-鄰吡啶基二硫化物(mPEG10,000-4C-OPSS)溶于二甲基亞砜(DMSO)中，得到10％試劑溶液。將10％試劑溶液快速加入到原G-CSF溶液(在磷酸鈉緩沖液中為0.4mg/ml，pH 7.0)等分液中，混合均勻?？紤]到mPEG-OPSS試劑和游離(即，其中不包括蛋白質內的-二硫化物鍵)半胱氨酸殘基在G-CSF的17位點結合，將反應溶液放置在RotoMix(Type 48200，Thermolyne，DubuqueIA)上以在37℃時促進綴合反應。30分鐘后，向反應溶液中再加入50倍過量的mPEG10,000-4C-OPSS，然后在37℃混合30分鐘，再在室溫下混合2小時，因而形成mPEG10,000-G-CSF綴合物溶液。

利用SDS-PAGE和RP-HPLC確定mPEG10,000-G-CSF綴合物溶液的性質。PEG化反應產生了36％的mPEG10,000-G-CSF綴合物(在G-CSF的半胱氨酸殘基上的單PEG化綴合物)。利用陽離子交換色譜法純化綴合物。

可以采用相同的方法使用其他分子量的mPEG-4C-OPSS制備其他綴合物。

下文所述的實施例8-10，采用下述方法(如下文方案所示)制備，在該方法中具有相對低分子量的聚合物試劑(方案中的PEGB)先結合到用于綴合的部分(A)上，然后較高分子量聚合物試劑(方案中的PEGA)再連接到綴合物的聚合部分上，所述聚合部分是由低分子量試劑和綴合部分連接形成的。利用此方法，使有效地修飾被阻礙的位置變成可能。在下述實施例中，被阻礙的位置是指包含被部分包埋的游離巰基的G-CSF半胱氨酸殘基。

實施例8a G-CSF和PEG2,000-二-((CH2)4-鄰吡啶基二硫化物)及mPEG20,000-丁烷硫醇的PEG化作用
PEG2,000-二-((CH2)4-鄰吡啶基二硫化物) (PEG2,000-二-(4C-OPSS)
mPEG20,000-丁烷硫醇 (mPEG20K-4C-SH)
在此實施例中，雙官能度PEG-二-(4C-OPSS)試劑通過二硫鍵插入立體被阻礙的游離巰醇中，然后mPEG20K-丁烷硫醇和PEG2,000-二-(4C-OPSS)試劑的游離殘基通過另一個二硫鍵發(fā)生結合反應。

將實施例2制備的儲存在-20℃氬氣條件下的PEG2,000-二-(4C-OPSS)加熱至室溫。將50倍過量(相對于原G-CSF溶液中被測量部分中的G-CSF的量)的試劑溶解在DMSO中，得到10％的溶液。將此10％試劑溶液快速加入到原G-CSF溶液中(在磷酸鈉緩沖液中為0.4mg/ml，pH7.0)，混合均勻。將反應溶液放置在RotoMix(48200型，Thermolyne，Dubuque IA)上，先在37℃混合1小時，然后在室溫下混合2小時。反應完全后，再次使用pH7.0的磷酸鈉緩沖液透析反應溶液，以移除過量的游離PEG2,000-二-(4C-OPSS)
然后，將50倍過量(相對于G-CSF)實施例4B制備的mPEG20,000-丁烷硫醇加入到中間體綴合物的透析溶液中，先在室溫下混合1小時，然后4℃過夜，因而生成mPEG20,000-PEG2,000-GCSF綴合物。利用SDS-PAGE和RP-HPLC確定產物的性質。

此方法可使用具有其他分子量的PEG-二-(4C-OPSS)和mPEG-4C-SH用于制備其他綴合物，同樣其中的PEG-二-(4C-OPSS)試劑優(yōu)選為相對低分子量。
實施例8b G-CSF和PEG2,000-二-((CH2)4-鄰吡啶基二硫化物)及mPEG30,000-丁烷硫醇的PEG化作用
使用相應量的PEG2,000-二-((CH2)4-鄰吡啶基二硫化物)和mPEG30,000-丁烷硫醇重復實施例8a的操作步驟，得到相應的mPEG30,000-PEG2,000-GCSF綴合物。

使用具有其他分子量的PEG-二-(4C-OPSS)和mPEG-4C-SH通過類似的方法可得到其他綴合物。

下述實施例9-10各不相同，其中實施例9中的低分子量PEG包括本發(fā)明所述的具有四個碳原子的親水鍵，而實施例10的低分子量PEG僅包括兩個碳原子的連接基?？梢钥闯?，本發(fā)明的連接基可以顯著地提高綴合物的產率。
實施例9 G-CSF和PEG2,000-二-((CH2)4-鄰吡啶基二硫化物)及支鏈PEG240,000-硫醇的PEG化作用
PEG2,000-二-((CH2)4-鄰吡啶基二硫化物)
PEG240,000-硫醇
同樣地，此實施例應用的方法為開始時，具有相對低分子量的聚合物試劑(在此實施例中，為PEG2,000-二-(4C-OPSS))和G-CSF部分連接，然后相對高分子量聚合物試劑(在此實施例中，為支鏈PEG240,000-硫醇)和PEG2,000-二-(4C-OPSS)試劑的殘基通過另一個二硫化物鍵相結合。

將實施例2制備的儲存在-20℃氬氣環(huán)境下的PEG2,000-二-(4C-OPSS)加熱至室溫。將50倍過量(相對于相對于原G-CSF溶液中被測量部分中的G-CSF的量)的熱PEG2,000-二-(4C-OPSS)溶解在DMSO中，形成10％試劑溶液。10％試劑溶液快速加入到原G-CSF溶液中(在磷酸鈉緩沖液中為0.4mg/ml，pH7.0)，混合均勻。將反應溶液放置在RotoMix(48200型，Thermolyne，Dubuque IA)上，先在37℃混合1小時，然后在室溫下混合2小時。反應完全后，再次使用pH 7.0的磷酸鈉緩沖液透析反應溶液，以移除過量的游離PEG2,000-二-(4C-OPSS)。

然后，將75倍量(相對于G-CSF)的PEG240,000-硫醇(NektarTherapeutics)加入到透析的綴合物溶液中，先在室溫下混合3小時，然后4℃過夜，因而生成PEG240,000-PEG2,000-G-CSF綴合物.利用SDS-PAGE和RP-HPLC確定產物的性質。綴合物的終產率為35％。
實施例10(比較例) G-CSF和PEG2,000-二-((CH2)-鄰吡啶基二硫化物)及PEG240,000-硫醇的PEG化作用
PEG2,000-二-((CH2)2-鄰吡啶基二硫化物)
PEG240,000-硫醇
實施例10的反應過程基本上是相同的，其中使用具有兩個碳原子而不是四個碳原子的連接基低分子量PEG硫醇試劑。

相應地，將儲存在-20℃氬氣條件下的從NektarTherapeutics購得的PEG2,000-二-(2C-OPSS)加熱至室溫。50倍量(相對于相對于原G-CSF溶液中被測量部分中的G-CSF的量)的試劑溶于DMSO中形成10％溶液。將此溶液快速加入到原G-CSF溶液中(在磷酸鈉緩沖液中為0.4mg/ml，pH7.0)，混合均勻。將反應溶液放置在RotoMix(48200型，Thermolyne，Dubuque IA)上，先在37℃混合1小時，然后在室溫下混合2小時。反應完全后，再次使用pH 7.0的磷酸鈉緩沖液透析反應溶液，以移除過量的游離PEG2,000-二-(2C-OPSS)。

然后，將70倍量(相對于G-CSF)的支鏈PEG240,000-硫醇(Nektar Therapeutics)加入到透析的綴合物溶液中，先在室溫下混合3小時，然后4℃過夜。然而，SDS-PAGE和RP-HPLC分析顯示沒有檢測到任何PEG240,000-PEG2,000-G-CSF綴合物。

證據表明，亞乙基(C2)-連接的PEG-OPSS試劑經還原裂解可有效地在試劑和靶蛋白反應之前破壞試劑。亞丁基(C4)-連接的試劑對于這種裂解具有更高的穩(wěn)定性，因而能夠得到更高產率的綴合物。
實施例11 制備mPEG5000-CH2-CH2-CH2-CH(CH3)-鄰吡啶基二硫化物(mPEG-(α-甲基)4C-OPSS，5KDa)
1-甲基-4-溴-1-丁醇

將2-甲基四氫呋喃(10.14g，0.0834mol)溶解在氯仿(72ml)中，然后加入四乙胺溴化物(18.4g，0.0876mol)。然后在15分鐘內逐滴加入三氟二乙基乙醚硼(11.12ml，0.0876mol)，室溫下攪拌此溶液過夜。將溶液冷卻至0-5℃，使用飽和NaHCO3(80ml)水溶液洗滌。分離有機層，用水(80ml)和飽和NaCl(80ml)水溶液洗滌，無水Na2SO4干燥。蒸餾出溶劑，得到9.5g淡黃色粘稠液體。

NMR(d6-DMSO)1.04ppm(d，-CH3-，3H)，1.43ppm(b，-CH2-CH(CH3)-OH，2H)，1.84ppm(m，-CH2-CH2-CH(CH3)-OH，2H)，3.53ppm(t，-CH2Br，2H)，3.60ppm(m，-CH2-CH(CH3)-OH，1H)，4.41ppm(bs，-OH，1H)。

1-溴-4-甲基-4-苯甲氧基丁烷

向冷卻到0℃的1-甲基-4-溴-1-丁醇(9.0g，0.05384mol)和苯甲基2，2，2-三氯乙酰亞胺酯(16.3g)在無水環(huán)己烷(100ml)和無水二氯甲烷(50ml)的溶液中，加入三氟甲基磺酸(1.0ml)，混合物在室溫氬氣條件下攪拌過夜。過濾混合物，使用飽和NaHCO3(250ml)溶液和去離子水(250ml)洗滌，無水Na2SO4干燥。減壓蒸餾移除溶劑，真空蒸餾粗產品(9.2g)，得到7.2g無色粘稠液體。

NMR(d6-DMSO)1.14ppm(d，-CH3-，3H)，1.57ppm(m，-CH2-CH(CH3)-OH，2H)，1.88ppm(m，-CH2-CH2-CH(CH3)-OH，2H)，3.53ppm(bm，-CH2Br，2H and-CH2-CH(CH3)-OH，1H)，4.46ppm(m，-CH2-苯甲基，2H)，7.32ppm(m，C6H5-，苯甲基，5H)。

mPEG5000-4-甲基-4-苯甲氧基丁烷

向共沸干燥的mPEG5000(20.0g，0.004摩爾)(NOF公司)在無水甲苯(200ml)的溶液中，加入1.0M的叔丁烷氧基鉀在叔-丁醇(16.0ml，0.0160摩爾)和1-溴-4-甲基-4-苯甲氧基丁烷(3.10g，0.012摩爾)中的溶液。70℃氮氣條件下，攪拌反應混合物20小時。過濾得到的混合物，真空濃縮至干燥。將粗產品溶解在30ml二氯甲烷中，0-5℃下使用500ml異丙醇進行沉淀。真空過濾收集終產物，真空干燥過夜。產率17.4g。

NMR(d6-DMSO)1.14ppm(d，-CH3，3H)，1.57ppm(m，-CH2-CH(CH3)-OH，2H)，1.88ppm(m，-CH2-CH2-CH(CH3)-OH，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，聚合物主鏈)，4.46ppm(m，-CH2-苯甲基，2H)，7.32ppm(m，C6H5-，苯甲基，5H)。

mPEG5000-4-甲基-4-丁醇

將mPEG5000-4-甲基-4-苯甲氧基丁烷(15.0g，0.00300摩爾)、乙醇(150ml)和鈀(活性碳上10％，1.5g)的混合物在45psi氫氣環(huán)境下進行氫化作用，過夜。過濾混合物，減壓蒸餾移除溶劑。將粗產品溶解在二氯甲烷(25ml)中，0-5℃下利用400ml異丙醇進行沉淀。濾除產物，減壓干燥。產率13.1g。

NMR(d6-DMSO)1.14ppm(d，-CH3，3H)，1.57ppm(m，-CH2-CH(CH3)-OH，2H)，1.88ppm(m，-CH2-CH2-CH(CH3)-OH，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，聚合物主鏈)，4.45ppm(bs，-OH，1H)。

mPEG5000-4-甲基-4-甲基磺酰丁烷
共沸干燥mPEG5000-4-甲基-4-丁醇(10.0g，0.0020摩爾)在甲苯(100ml)中的溶液，減壓餾出甲苯。將干燥的mPEG5000-4-甲基-4-丁醇溶于無水甲苯(100ml)和無水二氯甲烷(20ml)的混合物中，加入三乙胺(0.9ml，0.0030摩爾)和甲基磺酰氯(0.45ml，0.0026摩爾)，混合物在室溫氮氣環(huán)境中攪拌過夜。減壓蒸餾移除溶劑。將殘留物溶于二氯甲烷(15ml)中，加入250ml異丙醇。過濾沉淀，真空干燥，得到8.9g白色固體粉末。

NMR(d6-DMSO)1.40ppm(d，-CH3，3H)，1.57ppm(m，-CH2-CH(CH3)-甲磺酸鹽，2H)，1.88ppm(m，-CH2-CH2-CH(CH3)-甲磺酸鹽，2H)，3.17ppm(s，-CH3，甲磺酸鹽，3H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，聚合物主鏈)，4.00ppm(m，-CH-甲磺酸鹽，1H)。

mPEG5000-4-甲基-4-丁烷硫醇

向mPEG5000-4-甲基-4-甲基磺酰丁烷(8.0g，0.0016mol)在無水乙醇(80ml)的溶液中，加入硫脲(1.24g，0.0163mol)，混合物在78℃氬氣環(huán)境下攪拌過夜。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶于1％NaOH(84ml)水溶液中。氬氣條件下，溶液加熱至85℃，加熱2.5小時。在溶液冷卻至35℃后，使用10％磷酸將pH調節(jié)為3。加入NaCl(24g)，使用二氯甲烷萃取產物。萃取液用無水硫酸鈉干燥，冷乙醚沉淀出產物。產率為7.3g。

NMR(CDCl3)1.24ppm(d，-CH3，3H)，1.38ppm(m，-CH2-CH(CH3)-SH，2H)，1.54ppm(d，-CH-SH，1H)，1.88ppm(m，-CH2-CH2-CH(CH3)-SH，2H)，2.83ppm(m，-CH2-CH(CH3)-SH，1H)，2.05ppm(m，-CH2-CH(CH3)-S-S-CH(CH3)-CH2-，4H，0.7mol％)，3.38ppm(s，-OCH3，3H)，3.64ppm(s，PEG主鏈)。

上述NMR數(shù)據表明產物包含非常少量(NMR測定為0.7mol％)的二硫化物-連接二聚物，其由巰基氧化形成。無需對硫醇進行進一步純化。

mPEG5000-CH2-CH2-CH2-CH(CH3)OPSS

向mPEG5000-4-甲基-4-丁烷硫醇(2.0g，0.0004mol)在無水甲醇(40ml)的溶液中，加入2，2′-二吡啶基二硫化物(0.18g，0.00082mol)，混合物在室溫氬氣條件下攪拌4個小時。減壓蒸餾移除溶劑，將殘留物溶于二氯甲烷(5ml)，使用50ml冷乙醚沉淀出產物。產率為1.7g。

NMR(CDCl3)1.34ppm(d，-CH3，3H)，1.68ppm(m，-CH2-CH2-CH(CH3)-SH，2H)，1.88ppm(m，-CH2-CH2-CH(CH3)-SH，2H)，3.38ppm(s，-OCH3，3H)，3.64ppm(s，PEG主鏈)，7.12，7.68，7.75，& 8.47ppm(4m，吡啶基質子，4H)。
權利要求
1.一種包括下述結構的水溶性聚合物試劑
POLY-[Y-S-W]x
其中
POLY是水溶性聚合物；
Y是包含至少4個碳原子的二價連接基團，由具有3-8個碳原子且具有取代基的飽和或不飽和碳氫主鏈組成，其取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，其中主鏈不同碳原子上的兩個此類烷基和/或烯基取代基可連接在一起形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基基團；
S是連接到Y的sp3雜碳原子上的硫原子；
S-W是巰基、保護的巰基或巰基-活性的巰基衍生物；
X為1-25；以及
當POLY為直鏈聚乙二醇，x為1，以及Y是直鏈烷基鏈時，POLY分子量至少為500。
2.如權利要求1所述的試劑，其中Y為-(CR1R2)n-，其中n為3-8，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，其中不同碳原子上的R1和R2基團可相連接形成環(huán)烷基或芳基基團。
3.如權利要求1所述的試劑，其中x是1或2。
4.如權利要求1所述的試劑，其中POLY是聚乙二醇。
5.如權利要求1所述的試劑，其中S-W是巰基-活性的巰基衍生物。
6.如權利要求5所述的試劑，其中S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
7.如權利要求4所述的試劑，其中所述聚乙二醇的分子量為148至約100,000道爾頓，其形態(tài)選自直鏈、支鏈、叉狀和多支鏈。
8.如權利要求1所述的試劑，其中Y選自C4-C8亞烷基、C5-C8環(huán)亞烷基及其組合。
9.如權利要求2所述的試劑，其中n是3-6，每一個R1和R2獨立地選自氫和甲基。
10.如權利要求2所述的試劑，其中除了R1在所述硫原子的鄰位碳原子上，所述R1為低級烷基以外，每一個R1和R2均為氫。
11.如權利要求10所述的試劑，其中所述低級烷基是甲基或乙基。
12.如權利要求11所述的試劑，其中所述低級烷基是甲基。
13.如權利要求2所述的試劑，其中不同碳原子上的R1和R2基團相連接形成環(huán)烷基或芳基基團。
14.如權利要求13所述的試劑，其中Y包括環(huán)戊基或環(huán)己基。
15.如權利要求1所述的試劑，其中所述無干擾取代基選自C3-C6環(huán)烷基、鹵素、氰基、低級烷氧基和苯基。
16.一種包括下式結構的水溶性聚合物試劑
PEG-[Y-S-W]x
其中
Y是由飽和或不飽和碳氫主鏈組成的具有取代基的二價連接基團，其中所述碳氫主鏈為3-8個碳原子長度，其取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和本文定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個此類烷基和/或烯基取代基可連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基；
S是連接到Y的sp3雜碳原子上的硫原子；
S-W為巰基、保護的巰基或巰基-活性的巰基衍生物；
x為1-25；以及
當PEG為直鏈，x為1，以及Y是直鏈烷基鏈時，PEG分子量至少為500。
17.如權利要求16所述的試劑，其中Y為式-(CR1R2)n-，其中n為3-8，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，其中不同碳原子上的R1和R2基團可連接形成環(huán)烷基或芳基基團。
18.如權利要求16所述的試劑，其中x是1或2。
19.如權利要求16所述的試劑，其中S-W是巰基-活性的巰基衍生物。
20.如權利要求19所述的試劑，其中S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
21.如權利要求16所述的試劑，其中所述聚乙二醇的分子量為148至約100,000道爾頓，其形態(tài)選自直鏈、支鏈、叉狀和多支鏈。
22.如權利要求16所述的試劑，其中Y選自C3-C8亞烷基、C5-C8環(huán)亞烷基及其組合。
23.如權利要求17所述的試劑，其中n是3-6，每一個R1和R2獨立地選自氫和甲基。
24.如權利要求17所述的試劑，其中除了R1在所述硫原子的鄰位碳原子上所述R1為低級烷基以外，每一個R1和R2均為氫。
25.如權利要求24所述的試劑，其中所述低級烷基是甲基或乙基。
26.如權利要求25所述的試劑，其中所述低級烷基是甲基。
27.如權利要求26所述的試劑，其中x是1或2，n是4，S-W是SH或鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
28.如權利要求27所述的試劑，其中x是1，PEG是以甲氧基為末端的聚乙二醇(mPEG)。
29.如權利要求27所述的試劑，其中x是2。
30.如權利要求28所述的試劑，其中S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
31.如權利要求29所述的試劑，其中S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
32.如權利要求23所述的試劑，其中每一個R1和R2是氫。
33.如權利要求32所述的試劑，其中x是1或2，n是4，S-W是SH或鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
34.如權利要求33所述的試劑，其中x是1，PEG是以甲氧基為末端的聚乙二醇(mPEG)。
35.如權利要求33所述的試劑，其中x是2。
36.如權利要求34所述的試劑，其中-S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
37.如權利要求35所述的試劑，其中-S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
38.如權利要求16所述的試劑，其中x是1或2，Y是-(CH2CH2CH(CH3))-，S-W是SH或鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
39.如權利要求38所述的試劑，其中x是1，PEG是以甲氧基為末端的聚乙二醇(mPEG)。
40.如權利要求38所述的試劑，其中x是2。
41.如權利要求39所述的試劑，其中-S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
42.如權利要求40所述的試劑，其中-S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
43.如權利要求16所述的試劑，其中x是1，Y是-(CH2)4-，-S-W是SH或鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)，并且PEG以下式為末端
44.如權利要求43所述的試劑，其中-S-W是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
45.如權利要求43所述的試劑，其中PEG的分子量為約500Da或更少。
46.如權利要求45所述的試劑，其中PEG的分子量為約200Da或更少。
47.如權利要求43所述的試劑，其中末端結構中每一個mPEG的分子量為約5KDa至約20KDa。
48.一種包含下式結構的水溶性聚合物試劑
POLY-[Y-S-W]x
其中
POLY是水溶性聚合物；
Y是具有至少四個碳原子的二價連接基團，由飽和或不飽和具有取代基的碳氫主鏈組成，所述碳氫主鏈含有3-10個碳原子，所述取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基；其中在主鏈不同碳原子上的兩個這種烷基和/或烯基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基；
S是連接在Y的sp3雜碳原子上的硫原子；和
X為2-25；和
S-W是巰基、保護的巰基或巰基-活性的巰基衍生物。
49.如權利要求48所述的試劑，其中每一個Y是具有式-(CR1R2)n-的直鏈或支鏈亞烷基，其中n是3-10，每一個R1和R2獨立地選自氫和低級烷基。
50.如權利要求49所述的試劑，其中n為3-8。
51.如權利要求49所述的試劑，其中每一個R1和R2是氫。
52.如權利要求49所述的試劑，其中對于至少一個Y而言，除了R1在所述硫原子的鄰位碳原子上所述R1為低級烷基以外，每一個R1和R2均為氫。
53.如權利要求52所述的試劑，其中x是2。
54.一種包含下式結構的水溶性聚合物試劑
PEG-[Y-S-W]x
其中
Y是由飽和或不飽和碳氫主鏈組成的具有取代基的二價連接基團，其中所述碳氫主鏈為3-10個碳原子長度，所述取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和這里定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個此類烷基和/或烯基取代基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基；
S是連接到Y的sp3雜碳原子上的硫原子；
x為2-25；和
S-W為巰基、保護的巰基或巰基-活性的巰基衍生物。
55.如權利要求54所述的試劑，其中x是2。
56.如權利要求54所述的試劑，其中每一個Y均為-(CR1R2)n-，其中n是3-10，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基和低級烯基。
57.如權利要求56所述的試劑，其中n為3-8。
58.如權利要求57所述的試劑，其中每一個R1和R2獨立地選自氫和甲基。
59.如權利要求58所述的試劑，其中每一個R1和R2均為氫。
60.如權利要求56所述的試劑，其中對于至少一個Y而言，除了R1在所述硫原子的鄰位碳原子上所述R1為低級烷基以外，每一個R1和R2均為氫。
61.如權利要求60所述的試劑，其中所述低級烷基是甲基或乙基。
62.如權利要求59所述的試劑，其中對于每一個Y，n都是4。
63.如權利要求59所述的試劑，其中每一個-S-W都是鄰-吡啶基二硫化物(OPSS)。
64.如權利要求63所述的試劑，其中PEG的分子量為1000-5000Da。
65.一種包含下式結構的聚合物綴合物
POLY-[Y-S-S-A]x
其中
POLY是水溶性聚合物；
Y是由飽和或不飽和具有取代基的碳氫主鏈組成的連接基團，其中所述碳氫主鏈為3-10個碳原子長度，所述取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和這里定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個此類烷基和/或烯基取代基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基；
S-S是連接到Y的sp3雜碳原子上的二硫基團；和
A是藥物活性分子的共價連接殘基；和
x為1-25。
66.如權利要求65所述的綴合物，其中所述綴合物是水溶性的。
67.如權利要求65所述的綴合物，其中Y是-(CR1R2)n-，其中n是3-10，每一個R1和R2獨立地選自氫、烷基、烯基和無干擾取代基。
68.如權利要求67所述的綴合物，其中n為3-8。
69.如權利要求66所述的綴合物，其中x是1或2。
70.如權利要求66所述的綴合物，其中Y含有至少四個碳原子。
71.如權利要求65所述的綴合物，其中POLY是聚乙二醇。
72.如權利要求71所述的綴合物，其中所述聚乙二醇的分子量為148至約100,000道爾頓，其形態(tài)選自直鏈、支鏈、叉狀和多支鏈。
73.如權利要求66所述的綴合物，其中Y是具有式-(CR1R2)n-結構的直鏈或支鏈亞烷基，每一個R1和R2獨立地選自氫和低級烷基。
74.如權利要求73所述的綴合物，其中每一個R1和R2獨立地選自氫和甲基。
75.如權利要求74所述的綴合物，其中每一個R1和R2均為氫。
76.如權利要求73所述的綴合物，其中除了R1在所述硫原子的鄰位碳原子上所述R1為低級烷基以外，每一個R1和R2均為氫。
77.如權利要求66所述的綴合物，其中Y是-(CR1R2)n-，不同碳原子上的兩個基因R1和R2相連接形成環(huán)烷基或芳基。
78.如權利要求65所述的綴合物，其中所述分子在其未綴合形式具有活性巰基基團，且選自蛋白質、肽和小分子。
79.如權利要求65所述的綴合物，其包括下述結構
A-S-S-Y-POLY-Y-S-S-A。
80.如權利要求79所述的綴合物，其中Y基團是相同的。
81.如權利要求65所述的綴合物，和藥物賦形劑相混合。
82.如權利要求81所述的綴合物，其中所述賦形劑是水性載體。
83.一種包括下式結構的聚合物綴合物
POLYA-L-S-S-Y-POLYB-Y-S-S-A
其中
每一個POLYA和POLYB均為水溶性聚合物片段，其中POLYB的分子量為10KDa或更低，POLYA和POLYB的分子量之和至少為3KDa；每一個Y獨立地是由飽和或不飽和具有取代基的碳氫主鏈組成的二價連接基團，所述碳氫主鏈為3-10個碳原子長度，取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和這里定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個這種烷基和/或烯基取代基可以連接形成環(huán)烷基，環(huán)烯基或芳基；
L是是連接基團；
每一個S-S都是連接在相鄰Y的SP3雜碳原子上的二硫基；和
A是藥物活性分子的共價連接殘基。
84.如權利要求83所述的綴合物，其中每一個Y獨立地是-(CR1R2)n--，其中n是3-10，每一個R1和R2獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和無干擾取代基，其中不同碳原子上的R1和R2基團可以連接形成環(huán)烷基或芳基基團。
85.如權利要求84所述的綴合物，其中n為3-8。
86.如權利要求83所述的綴合物，其中POLYA的分子量至少為5KDa。
87.如權利要求84所述的綴合物，其中兩個Y基團是相同的。
88.如權利要求84所述的綴合物，其中每一個Y是具有式-(CR1R2)n-的直鏈或支鏈亞烷基，其中n為3-8，每一個R1和R2獨立地選自氫和低級烷基。
89.一種向個體傳遞藥物活性分子的方法，所述方法包括對個體施用包含在藥物可接受載體內的具有下式結構的綴合物
POLY-[Y-S-S-A]x
其中
POLY是水溶性聚合物；
Y是由飽和或不飽和具有取代基的碳氫主鏈組成的二價連接基團，其中碳氫主鏈為3-10個碳原子長度，所述取代基獨立地選自氫、低級烷基、低級烯基和這里定義的無干擾取代基，其中在主鏈不同碳原子上的兩個這種烷基和/或烯基可以連接形成環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基；
S-S是連接在Y的sp3雜碳原子上的二硫基團；
x是1-25；和
A是所述藥物活性分子的共價連接殘基，其中所述分子具有未綴合形式的活性巰基基團。
90.如權利要求89所述的方法，其中x是1或2。
91.如權利要求90所述的方法，其中POLY是聚乙二醇(PEG)。
92.如權利要求90所述的方法，其中所述載體是水性載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含POLY-[Y-S-W]x結構的水溶性聚合物試劑，其中POLY是水溶性聚合物；Y是以碳氫化合物為基礎的間隔基團，x為1-25，以及S-W是巰基、被保護的巰基或巰基-活性衍生物。優(yōu)選地，水溶性聚合物是PEG聚合物。本發(fā)明還公開了這種聚合物試劑和藥物相關分子的綴合物，以及其制劑和應用的方法。
文檔編號C07D213/70GK101111267SQ200580047507
公開日2008年1月23日 申請日期2005年12月21日 優(yōu)先權日2004年12月21日
發(fā)明者A·科茲洛夫斯基, S·麥克曼努斯 申請人:尼克塔治療亞拉巴馬公司