專利名稱：：顯示cd63表面表達(dá)的細(xì)胞毒性介導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及癌癥的診斷和治療，特別涉及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的介導(dǎo)；最特別涉及癌癥調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)(任選與一種或多種化療劑聯(lián)合使用)的用途，作為啟動(dòng)細(xì)胞毒性反應(yīng)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合測(cè)定。
背景技術(shù)：
：癌癥中的CD63:CD63是四次跨膜蛋白超家族(tetraspanin)的III型膜蛋白，所述四次跨膜蛋白超家族的20個(gè)現(xiàn)有成員的特點(diǎn)是具有四個(gè)跨膜片段。幾個(gè)工作組使用針對(duì)活化的血小板、粒細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞的全細(xì)胞制品產(chǎn)生的抗體，各自獨(dú)立鑒定了CD63。其同族糖蛋白抗原的各自cDNA的克隆，發(fā)現(xiàn)所述不同抗原為同一種分子。隨后，第六屆國(guó)際白細(xì)胞分型研討會(huì)(TheSixthInternationalWorkshoponLeukocyteTyping,1996)將這些抗體分類為CD63抗體。在1996年的研討會(huì)之前，已知CD63有多個(gè)名稱(黑素瘤1抗原、眼黑素瘤相關(guān)抗原、黑素瘤相關(guān)抗原ME491、溶酶體相關(guān)膜糖蛋白3、granul叩hysin、黑色素相關(guān)抗原MLA1)，這些命名往往與導(dǎo)致其部分表征和鑒定的抗體有關(guān)。因此，CD63也被命名為ME491抗原(MAbME491)、神經(jīng)腺(neuroglandular)抗原(MAbLS59、LS62、LS76、LSI13、LS140和LS152XPltgp40(MAbH5C6、H4F8和H5D2)、人類髓質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞抗原(MAb12F12)、骨祖細(xì)胞特異性標(biāo)志物(MAbHOP-26)和整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(MAb6Hl)。發(fā)現(xiàn)與人體CD63交叉反應(yīng)的其他抗體有8-lH、8-2A(與ME491交叉反應(yīng))、NKI/C-3和NKI/black-13(Vannegoor和Rumke，1986;Demetrick等，1992;Wang等，1992)。首先使用MAbME491(針對(duì)人體黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生的許多抗體的一種)從黑素瘤cDNA文庫(kù)克隆了CD63。人體黑素瘤活組織檢查研究中表明MAbME491的反應(yīng)性表現(xiàn)出與黑素瘤進(jìn)程反相相關(guān)。ME491抗體的反應(yīng)性在正常黑色素細(xì)胞中是低的，在黑素瘤進(jìn)程早期(包括發(fā)育不良痣和輻射狀生長(zhǎng)期(RGP)腫瘤)較高，并在更晚期的黑素瘤腫瘤(例如在垂直生長(zhǎng)期(VGP)和轉(zhuǎn)移性腫瘤中的那些)中降低或甚至沒(méi)有。使用MAb2.28(針對(duì)活化血小板產(chǎn)生)在人血小板中發(fā)現(xiàn)并部分表征了CD63，MAb2.28檢測(cè)到了活化依賴性的血小板膜53kDa糖蛋白。該分子還與未活化血小板內(nèi)部顆粒的膜相關(guān)聯(lián)。同一研究中，MAb2.28還標(biāo)記了巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)部顆粒，在所述細(xì)胞中，MAb2.28與抗體共定位至蛋白酶D(己知的溶酶體區(qū)室標(biāo)志物)。使用抗體群集和克隆表達(dá)繼續(xù)研究，鑒定了被該抗體識(shí)別為CD63的抗原，并進(jìn)一步證實(shí)了其在溶酶體區(qū)室中的存在，在那里其與區(qū)室特異性標(biāo)志物L(fēng)AMP1和LAMP2被共定位。該分子的克隆將其鑒定為CD63，并使其包括于四次跨膜蛋白超家族。在許多不同組織和細(xì)胞類型中檢測(cè)到了CD63的表達(dá)。在細(xì)胞水平上，發(fā)現(xiàn)其與質(zhì)膜相關(guān)聯(lián)，并且還與細(xì)胞內(nèi)晚期內(nèi)體的囊狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。某些情況下，細(xì)胞活化導(dǎo)致經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備CD63的動(dòng)員而增加的表面表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)CD63與MHC-II類分子共定位(且生理上相關(guān)聯(lián))于B淋巴細(xì)胞中，特別是內(nèi)體中、參與外運(yùn)MHC-n類復(fù)合體至表面的外體中和分泌的小泡中。發(fā)現(xiàn)CD63在許多細(xì)胞類型(包括B和T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、乳腺癌和黑素瘤細(xì)胞)中與四次跨膜蛋白超家族的其他成員相互作甩所述其他成員例如CDaCD81、CD11(整聯(lián)蛋白鏈aw,L,x)、CD18(整聯(lián)蛋白鏈卩2)、CD49c(VLA-3或整聯(lián)蛋白鏈a3)、CD49d(整聯(lián)蛋白鏈《4)、CD49f(VLA-6或整聯(lián)蛋白鏈as)和CD29(整聯(lián)蛋白鏈卩,)。還不清楚CD63在腫瘤性疾病中的作用。盡管幾個(gè)相互獨(dú)立的工作組最初發(fā)現(xiàn)CD63參與各種事件，例如血小板和中性粒細(xì)胞活化、MHC-II類抗原呈遞、整聯(lián)蛋白依賴性細(xì)胞粘附和游動(dòng)性以及某些類型癌癥中的腫瘤進(jìn)程，但其功能還有待完全闡明。雖然目前證據(jù)支持CD63在多種細(xì)胞生理事件中的作用，但還不清楚這些功能是否相互獨(dú)立，或者是否存在涉及CD63的潛在的共同細(xì)胞學(xué)機(jī)制。幾個(gè)工作組已經(jīng)考察了CD63和某些類型腫瘤(特別是黑素瘤)進(jìn)程之間的關(guān)聯(lián)。除MabME491之外，還研發(fā)了許多其他的抗CD63單克隆抗體(以下簡(jiǎn)稱單克隆抗體)，用于來(lái)自不同進(jìn)程階段腫瘤患者的腫瘤樣品的免疫組織化學(xué)(IHC)染色。發(fā)現(xiàn)被作者解釋為最可能反映減少的CD63表達(dá)的減少的染色與晚期進(jìn)程和腫瘤的轉(zhuǎn)移特征相關(guān)聯(lián)。更近期的研究也描述了幾個(gè)四次跨膜蛋白超家族成員(包括CD63)明顯下降的表達(dá)水平(mRNA定量之后)與幾種乳腺癌衍生細(xì)胞系體外侵襲之間的顯著關(guān)聯(lián)。另一研究通過(guò)差異展示在經(jīng)受了雌激素消除的培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞中鑒定了CD63。這表明CD63表達(dá)可以受激素水平的調(diào)節(jié)，而且改變的CD63豐度和/或功能也可能與乳腺腫瘤進(jìn)程有關(guān)。相反，使用抗CD63單克隆抗體MAbFC-5.01的研究揭示其反應(yīng)性表位變異表達(dá)于不同的正常組織。盡管發(fā)現(xiàn)該抗體識(shí)別了CD63，但其沒(méi)有區(qū)分早期和包括轉(zhuǎn)移性黑素瘤的更晚期黑色素(不同于MAbME491)，這表明CD63抗原存在于這些更晚期的腫瘤，但其表位有一些可能在不同時(shí)期的腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)被掩蔽了?？赡軞w因于CD63核心多肽的改變的翻譯后修飾，或者歸因于CD63與其他分子的相互作用，其可能已經(jīng)影響了用于抗體識(shí)別和結(jié)合的特異性表位的可用性。這些研究結(jié)果支持了Si和Hersey(1993)所報(bào)道的發(fā)現(xiàn)，即使用抗CD63單克隆抗體NKI-C3的染色沒(méi)有區(qū)分來(lái)自不同進(jìn)程時(shí)期(例如初期、輻射狀生長(zhǎng)期、垂直生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)移性黑素瘤)的黑素瘤的組織切片。在其他研究中(Adachi等，1998;Huang等，1998)，盡管通過(guò)PCR定量對(duì)來(lái)自乳腺和非小細(xì)胞性肺癌的mRNA的分析揭示了兩個(gè)四次跨膜分子超家族成員(CD9和CD82)的表達(dá)水平和腫瘤進(jìn)程和患者預(yù)后之間存在顯著關(guān)聯(lián)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CD63的這種關(guān)聯(lián)，因?yàn)槠湓谒袠悠分械谋磉_(dá)是相似的。這些明顯矛盾的結(jié)果表明，缺乏有力和一致的數(shù)據(jù)能夠明確證明CD63與癌癥之間的關(guān)聯(lián)。到目前為止，近乎沒(méi)有體內(nèi)研究嘗試建立CD63與該分子最終的腫瘤抑制劑功能之間的聯(lián)系。其中一項(xiàng)研究中，當(dāng)與親本非CD63過(guò)表達(dá)細(xì)胞相比較，經(jīng)皮下和腹腔注射入無(wú)胸腺小鼠的人CD63過(guò)表達(dá)的H-ras轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞顯示了降低的惡性/腫瘤原性表型，如減小的腫瘤大小和轉(zhuǎn)移潛力以及增加的存活時(shí)間所表明的。這表明人CD63在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的存在可能抑制其惡性行為。更近期地，使用表達(dá)人CD63并被開(kāi)發(fā)以誘導(dǎo)針對(duì)CD63耐受性的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究表明在用融合至痘苗病毒的人CD63免疫后，可以抑制注射的人CD63-MHC-1類分子(H-2Kh)共轉(zhuǎn)染的小鼠黑素瘤細(xì)胞系的腫瘤生長(zhǎng)，并可以增加存活。作者表明這種治療作用是T淋巴細(xì)胞依賴性的，并且內(nèi)源性抗CD63抗體似乎并未參與這種保護(hù)作用，因?yàn)槟[瘤生長(zhǎng)的抑制作用僅在動(dòng)物用CD63-MHC-1類分子共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(而不是CD63單獨(dú)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)注射時(shí)發(fā)生。這一解釋得到下述事實(shí)的支持在預(yù)先使用純化人CD63免疫并顯示已經(jīng)產(chǎn)生抗CD63抗體的野生型動(dòng)物中，沒(méi)有針對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)性作用。Radford等(1995年)描述的使用經(jīng)人CD63轉(zhuǎn)染的KM3細(xì)胞系(最初認(rèn)為是人類來(lái)源，后來(lái)鑒定為鼠譜系)的研究表明盡管各種轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的體外生長(zhǎng)率并無(wú)顯著差異，但是當(dāng)皮內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞至無(wú)胸腺小鼠時(shí)，與未轉(zhuǎn)染的KM3親代細(xì)胞相比較，該蛋白的表達(dá)減少了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移潛力。這些發(fā)現(xiàn)表明了CD63比其他已知腫瘤抑制基因突出的影響體內(nèi)和體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)率的潛在作用。此外，在體外測(cè)定中發(fā)現(xiàn)通過(guò)減少細(xì)胞隨機(jī)游動(dòng)性而對(duì)相同細(xì)胞具有功能性作用的抗CD63單克隆抗體ME491(Radford等，1997)的添加沒(méi)有影響其體外生長(zhǎng)速度。該研究還描述了如下發(fā)現(xiàn)CD63可以促進(jìn)相應(yīng)于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)衍生的化學(xué)引誘物(例如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、膠原和玻璃粘連蛋白)的遷移，盡管針對(duì)整聯(lián)蛋白的抗體不能阻滯這些作用，但該作用可以由^型整聯(lián)蛋白的功能性參與來(lái)調(diào)節(jié)。然而，玻璃粘連蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)(已知為整聯(lián)蛋白a恭的配體)的作用與CD63轉(zhuǎn)染細(xì)胞上其他ECM組分(例如層粘連蛋白、纖維連接蛋白合膠原)所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的作用之間存在拮抗效應(yīng)。這表明在特定條件下，存在ECM時(shí)，CD63的表達(dá)可以導(dǎo)致降低的遷移，并且其可能依賴于粘附與游動(dòng)性之間的精細(xì)平衡。另一研究中，抗CD63單克隆抗體(MAb710F)提高了經(jīng)PMA處理的HL-60細(xì)胞的粘附和散布，而另一抗CD63單克隆抗體(Mab2.28)促進(jìn)了類似的作用，但是僅作用于小很多比例的細(xì)胞，而且僅當(dāng)以大的多量添加時(shí)。這些結(jié)果顯示盡管已經(jīng)研發(fā)了多種抗CD63抗體，但是它們的功能作用可以是非常不同的。四次跨膜蛋白超家族還可以參與細(xì)胞增殖。0ren等(1990年)描述了識(shí)別CD81(TAPA-1)的小鼠MAb5A6對(duì)淋巴細(xì)胞系的抗增殖作用。另一研究中，人類T淋巴細(xì)胞的CD37與抗體的連接阻滯了CD37誘導(dǎo)的增殖。更近期地，使用CD37表達(dá)缺陷(CD37敲除)的動(dòng)物模型的研究揭示在相應(yīng)于刀豆蛋白A活化和CD3/T細(xì)胞受體接合中，來(lái)自該動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞與來(lái)自野生型動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞相比較是高度增殖的。因此提出在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中的功能作用可能是四次跨膜蛋白超家族的共同特性。使用肝胚細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌細(xì)胞的近期研究顯示，這些細(xì)胞與抗CD81單克隆抗體的接合導(dǎo)致Erk/MAP激酶途徑的活化。已經(jīng)顯示該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖事件。在平行研究中，經(jīng)轉(zhuǎn)染的過(guò)表達(dá)人CD81的細(xì)胞系相對(duì)于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞顯示出增加的增殖。因此，可獲得的證據(jù)已經(jīng)指出了四次跨膜蛋白超家族(一般而言)和CD63(具體而言)在與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、粘附/游動(dòng)性相關(guān)的事件中的作用。目前，這兩類細(xì)胞事件是重點(diǎn)研究的目標(biāo)，因其在腫瘤進(jìn)程和轉(zhuǎn)移中起重要作用。目前為止，還沒(méi)有特異性靶向CD63表達(dá)細(xì)胞的抗CD63抗休或者其它試劑被報(bào)道并顯示同時(shí)影響腫瘤細(xì)胞的體外和體內(nèi)生長(zhǎng)特性和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)物模型的存活時(shí)間。氨基酸序列測(cè)定和分析沒(méi)有揭示四次跨膜蛋白超家族與其它蛋白質(zhì)家族之間的同源性，或具有任何以前經(jīng)鑒定的功能模塊，也沒(méi)有顯示任何之前已知的酶活性。因此，很難考察該蛋白質(zhì)家族在調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用。然而，使用導(dǎo)致細(xì)胞生理改變的四次跨膜蛋白超家族特異性試劑(其緊密依賴于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié))所生成的證據(jù)表明四次跨膜蛋白超家族具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)性質(zhì)。CD63在生理和/或功能上均顯示出與許多分子的關(guān)聯(lián)，所述分子本身是參與產(chǎn)生次級(jí)信使信號(hào)的酶或者與這類酶在生理和/或功能上有關(guān)聯(lián)。設(shè)計(jì)以剖析中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用(其為炎癥反應(yīng)的起始步驟之一)的控制機(jī)制的實(shí)驗(yàn)揭示使用幾種抗CD63單克隆抗體(AHN-16、AHN-16.1、AHN-16.2、AHN-16.3和AHN-16.5)對(duì)中性粒細(xì)胞的預(yù)處理促進(jìn)了其對(duì)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞層的粘附。而且，該作用強(qiáng)烈依賴于鈣離子(Ca2+)的存在，鈣離子是公知的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)劑并且限于細(xì)胞暴露于刺激性抗體過(guò)程的特定時(shí)期。經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)暴露于抗體之后，中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附對(duì)后來(lái)添加的鈣離子變得不敏感，從而表明了動(dòng)態(tài)和臨時(shí)調(diào)節(jié)的(短暫的)事件。另外，發(fā)現(xiàn)CD63與CD11/CD18復(fù)合體物理相互作用，并且特異性靶向該復(fù)合體的試劑介導(dǎo)了調(diào)節(jié)信號(hào)。在該研究中還發(fā)現(xiàn)，CD63與包括了酪氨酸激酶Lck和Hck的復(fù)合體有物理關(guān)聯(lián)或者是其部分。所述酶是一類蛋白質(zhì)的成員，其在特異性細(xì)胞表面受體活化后的介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)信號(hào)中起重要作用，并且是導(dǎo)致細(xì)胞特異性生理變化的信號(hào)傳導(dǎo)途徑級(jí)聯(lián)的部分。另一項(xiàng)研究也表明，四次跨膜蛋白超家族(包括CD63)與單克隆抗體的共連接可以增強(qiáng)黏著斑激酶(FAK)的磷酸化或活性，所述黏著斑激酶是由MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞對(duì)膠原底物的粘附所誘導(dǎo)的。這指出CD63(和其它四次跨膜蛋白超家族成員)直接參與調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑?？膳c表面CD63的出現(xiàn)和經(jīng)由抗CD63單克隆抗體MAb710F的連接功能上交叉的信號(hào)傳導(dǎo)途徑是那些依賴于蛋白激酶C(PKC)磷酸化的調(diào)節(jié)的途徑，所述蛋白激酶C是另一公知的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)劑。在該上下文中，經(jīng)由MAb710F的髓質(zhì)樣細(xì)胞系的粘附和形態(tài)改變的增強(qiáng)依賴于豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)對(duì)所述細(xì)胞的預(yù)處迅但PKC的短暫參與并沒(méi)有能夠得到最終證實(shí)。然而，獨(dú)立工作組的后期研究證明了PMA誘導(dǎo)的HL-60分化是PKC活性依賴性的，因?yàn)镽o31-8220分子(該酶的特異性抑制劑)阻滯了PMA的作用。支持CD63以及其它四次跨膜蛋白超家族成員與信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步證據(jù)產(chǎn)生于下述研究該研究描述了CD63(和CD53)分子與酪氨酸磷酸化激酶活性之間的物理關(guān)聯(lián)，或直接關(guān)聯(lián)或作為超分子復(fù)合體的部分。在該研究中，利用抗CD63抗體分離的免疫沉淀復(fù)合體顯示與酪氨酸磷酸酶活性有關(guān)，但CD53不同，其顯示與與酪氨酸磷酸酶CD45有關(guān)，不可能鑒定CD63相關(guān)的磷酸酶。更近期還發(fā)現(xiàn)幾個(gè)四次跨膜蛋白超家族的成員與磷脂酰肌醇4-激酶(11型PI4-K)有關(guān)聯(lián)(Berditchevski等，1997)。這種相互作用表現(xiàn)的非常特異性，因?yàn)閮H僅在CD9、CD63、CD81、CD151和A15/TALLA中得到了證實(shí)，在CD37、CD52、CD82或NAG-2中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。另外，由于每個(gè)含有PI-4激酶的復(fù)合體限于單個(gè)四次跨膜蛋白超家族成員，所以四次跨膜蛋白超家族成員和PI4-K之間的作用相互間是唯一的。特別的，不同于其它四次跨膜蛋白超家族成員，發(fā)現(xiàn)CD63—PI-4激酶復(fù)合體幾乎完全位于脂膜筏樣(lipidraft-like)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。這一發(fā)現(xiàn)表明，與PI-4的相互作用的CD63部分可能已經(jīng)參與了有關(guān)于或依賴于磷酸肌醇的生物合成途徑的特異性細(xì)胞內(nèi)事件(Claas，C，等，2001)，磷酸肌醇生物合成途徑除了作為次級(jí)信號(hào)傳導(dǎo)分子外的功能外，還公知參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)(內(nèi)吞和胞吐)以及細(xì)胞骨架的重組(Martin，T。，1998)。到目前為止發(fā)現(xiàn)的和CD63直接相關(guān)的所有酶在調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的直接和重要的參與提供了進(jìn)一歩的證據(jù)，支持了CD63作為調(diào)節(jié)劑或作為這些酶活性下游的效應(yīng)分子與調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)聯(lián)。闡明導(dǎo)致腫瘤進(jìn)程的機(jī)制是非常困難和復(fù)雜的工作，經(jīng)常被很多明顯的相互矛盾的發(fā)現(xiàn)所掩蓋，因此很少能夠把那些發(fā)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)化成有效的療法。從有關(guān)CD63與腫瘤進(jìn)程以及轉(zhuǎn)移和與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之間關(guān)聯(lián)的目前已知的來(lái)看，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)改變CD63的功能是可能的。對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的抗原特異性試劑的開(kāi)發(fā)作為潛在的治療或診斷工具將是極其有益的，所述試劑結(jié)合表達(dá)識(shí)別抗原的細(xì)胞，并且通過(guò)自身或與其它分子結(jié)合而具有細(xì)胞或體內(nèi)的生理學(xué)活性，以便這些試劑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、進(jìn)程和轉(zhuǎn)移，且對(duì)正常人體細(xì)胞群無(wú)顯著的損傷作用。作為癌癥治療的單克隆抗體:每一患有癌癥的個(gè)體都是獨(dú)特的，跟其身份一樣，每個(gè)人所患的癌癥都不同于其它癌癥。盡管如此，現(xiàn)有療法都是在同樣的時(shí)期、以同樣的方式來(lái)治療患有同種癌癥的患者。至少30%的患者的一線治療是失敗的，從而增加了額外的療程以及治療失敗、病毒轉(zhuǎn)移和最終死亡的可能性。治療的優(yōu)選方法將是針對(duì)特定個(gè)體的個(gè)性化治療。目前唯一的個(gè)性化治療方法是手術(shù)?；瘜W(xué)治療和放射治療無(wú)法針對(duì)患者具體情況，而在大多數(shù)情況下單靠手術(shù)不足以治愈癌癥。隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，開(kāi)發(fā)個(gè)性化治療方法的可能性變得更加現(xiàn)實(shí)，因?yàn)槊總€(gè)抗體能夠針對(duì)單一的抗原表位。而且，也可以生產(chǎn)針對(duì)多個(gè)相關(guān)抗原表位的組合抗體，所述多個(gè)相關(guān)抗原表位唯一確定了某一特定個(gè)體的腫瘤。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著差別是癌細(xì)胞含有對(duì)變異細(xì)胞來(lái)說(shuō)具有特異性的抗原，科技界長(zhǎng)期認(rèn)為通過(guò)與癌抗原特異性結(jié)合，單克隆抗體能夠被設(shè)計(jì)來(lái)特異靶向變異細(xì)胞；因此產(chǎn)生了這樣的觀點(diǎn)單克隆抗體能夠作為"神奇子彈(MagicBullets)"來(lái)消滅癌細(xì)胞。然而，現(xiàn)在普遍認(rèn)為沒(méi)有一個(gè)單克隆抗體能夠用于所有的癌癥，單克隆抗體可以作為一類被開(kāi)發(fā)為目標(biāo)癌癥的療法。依照本發(fā)明方法分離的單克隆抗體己經(jīng)顯示出通過(guò)對(duì)患者有益的方式(如通過(guò)降低腫瘤負(fù)荷)來(lái)調(diào)節(jié)癌癥過(guò)程，在本文將被稱為癌癥調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)或"抗癌"抗體。目前，癌癥的治療手段很少。已有的癌癥治療方法己經(jīng)對(duì)全球的癌癥存活率有所改善。然而，對(duì)于特定個(gè)體而言，這些改善的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與他們的個(gè)人狀況巧是必然相關(guān)的。因此，如果有一種方法學(xué)能夠使醫(yī)師單獨(dú)處理同類腫瘤患者的每個(gè)腫瘤，將使每個(gè)患者可以用適合自己的獨(dú)特方法進(jìn)行治療。理論上，這種治療過(guò)程將提高治愈率，產(chǎn)生更好的結(jié)果，從而滿足人們長(zhǎng)期感受到的需要。過(guò)去，多克隆抗體已經(jīng)被應(yīng)用于人類癌癥的治療，但只取得了有限的成功。己經(jīng)用人血漿來(lái)治療淋巴瘤和白血病，但是很少獲得持久的改善或應(yīng)答。而且，缺乏重現(xiàn)性，也沒(méi)有比化療多出額外的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)體瘤(如乳癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌)也已經(jīng)采用人血液、猩猩血清、人血清和馬血清來(lái)治療，但是相應(yīng)的結(jié)果是不確定的和無(wú)效的。有很多用單克隆抗體治療實(shí)體瘤的臨床實(shí)驗(yàn)。在20世紀(jì)80年代，對(duì)人乳腺癌進(jìn)行了至少4次利用抗體針對(duì)特異抗原或基于組織選擇性的臨床實(shí)驗(yàn)，在至少47例患者中只產(chǎn)生了l例應(yīng)答者。直至1998年，才有l(wèi)次成功的臨床實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)聯(lián)合使用了人源化的抗Her2/neu抗體(HERCEPT工N)和順鉑(順鉬)。在這次實(shí)驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了37例患者的反應(yīng)，其中約1/4患者具有部分緩解率(partialresponserate),還有1/4患者疾病進(jìn)展輕微或穩(wěn)定。應(yīng)答者中的中位月中瘤進(jìn)禾呈時(shí)間(mediantimetoprogression)為8.4個(gè)月，中位緩角軍其月(medianresponseduration)為5.3個(gè)月。Herc印tin于1998年被批準(zhǔn)一線用藥，與Taxol⑧結(jié)合使用。臨床研究結(jié)果顯示了中位腫瘤進(jìn)程時(shí)間的增加，接受抗體治療+Taxol的患者(6.9個(gè)月)與只接受了Taxol⑧治療的患者(3,0個(gè)月)相比較。中位存活時(shí)間也有所增加，HERCEPTIN+Taxol治療方式為22個(gè)月，Taxol⑧單獨(dú)治療為18個(gè)月。另外，抗體+Taxol聯(lián)合治療組與Taxol⑧單獨(dú)治療組相比，完全應(yīng)答者(8%:2%)和部分應(yīng)答者(34%:15%)的數(shù)目都有所增加。但是，采用抗體+Taxol治療相比于Taxol⑧單獨(dú)治療，導(dǎo)致了較高的心臟毒發(fā)病率(13%:1%)。在臨床實(shí)驗(yàn)中，Her2/neu的表達(dá)水平(通過(guò)免疫組織化學(xué)方法測(cè)定)預(yù)示了對(duì)Herc印tin治療的響應(yīng)。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，只有那些過(guò)量表達(dá)Her2/neu的患者(在病理評(píng)分級(jí)指示為2-3+)從抗體治療中獲益。大約25%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者過(guò)量表達(dá)Her2/neu而能夠用Herc印tin治療；那些沒(méi)有過(guò)量表達(dá)的患者將不會(huì)獲益，不能用抗體治療。對(duì)Herc印tin治療的選擇代表了一種選擇患者的方法，所選患者適合于以疾病分子標(biāo)志識(shí)別為基礎(chǔ)的治療，該方法作為診斷測(cè)驗(yàn)已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)。但是，還遠(yuǎn)未滿足乳腺癌患者的需求。甚至是那些能夠從Herx印tin治療獲益的患者，依然需要化療并因此依然不得不面對(duì)(至少在某種程度上)這種療法的副反應(yīng)。研究結(jié)腸直腸癌的臨床實(shí)驗(yàn)涉及同時(shí)抗糖蛋白和糖脂類靶的抗體。對(duì)腺癌有一定特異性的抗體，如17-1A，已經(jīng)進(jìn)行了超過(guò)60例患者的2期臨床實(shí)驗(yàn)，其中僅有1例患者有部分反應(yīng)。在其他應(yīng)用17-1A的實(shí)驗(yàn)中，使用了附加的環(huán)磷酰胺，52例受試患者中僅有1例完全反應(yīng)和2例輕微反應(yīng)。其它涉及17-1A的實(shí)驗(yàn)得到了類似的結(jié)果。目前為止，17-1A的3期臨床實(shí)驗(yàn)沒(méi)有證明其作為輔助療法對(duì)III期結(jié)腸癌的改善效能。使用首次批準(zhǔn)用于影像的人源化鼠單克隆抗體也沒(méi)有產(chǎn)生腫瘤消退。只有近期，在應(yīng)用單克隆抗體的結(jié)腸癌臨床研究中得到了一些正面的結(jié)果。2004年，ERBITUX被批準(zhǔn)用于表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的二線治療，這些患者對(duì)基于依立替康(irinotecan)的化療是耐受的。雙臂II期臨床研究和單臂研究的結(jié)果表明，ERBITUX與依立替康結(jié)合使用的緩解率分別為23%和15%,中位腫瘤進(jìn)程時(shí)間分別為4.1個(gè)月和6.5個(gè)月。同樣的雙臂II期臨床研究和另外一個(gè)單臂研究表明，ERBITUX單獨(dú)治療的緩解率分別為11%和9%，中位總瘤進(jìn)程時(shí)間分別為1.5個(gè)月和4.2個(gè)月。因此ERBITUX與依立替康結(jié)合治療在瑞士和美閨以及ERB工TUX單獨(dú)治療。在美國(guó)，ERBITUX單獨(dú)治療已經(jīng)被批準(zhǔn)作為那些在依立替康一線治療中失敗的結(jié)腸癌患者的二線治療。因此，與Herc印tin一樣，ERBITUX治療在瑞士只被批準(zhǔn)作為單克隆抗體和化療的聯(lián)合使用。另外，在瑞士和美國(guó)，ERBITUX治療都是被批準(zhǔn)用于患者的二線療法。在2004年，AVASTIN(阿瓦斯汀)也被批準(zhǔn)與靜注5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療結(jié)合使用，作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的一線治療。ni期臨床研究結(jié)果表明了患者中位存活時(shí)間的延長(zhǎng)，AVASTIN+5-氟尿嘧啶治療與5-氟尿嘧啶單獨(dú)治療相比較(分別為20個(gè)月和16個(gè)月)。然而，還是與Herc印tin和ERBITUX—樣，AVASTIN治療只被批準(zhǔn)作為單克隆抗體和化療的結(jié)合使用。對(duì)于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌前列腺癌、胃癌和肝細(xì)胞癌的較差結(jié)果依然繼續(xù)著。在n期臨床實(shí)驗(yàn)中，得到了近期對(duì)于非小細(xì)胞癌最有希望的結(jié)果，其中治療涉及了與細(xì)胞殺傷藥物阿霉素交聯(lián)的單克隆抗體(SGN-15;doxBR96，抗Sialyl-LeX)，與化學(xué)療劑Taxotere結(jié)合使用。Taxotere是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于肺癌二線治療的化學(xué)療劑。最初數(shù)據(jù)表明比單獨(dú)使用Taxotere具有提高的總存活。該研究的62例受試患者中，三分之二接受了SGN-15和Tax。tere結(jié)合應(yīng)用，而留下三分之一接受單獨(dú)的Taxotere。接受SGN-15和Taxotere結(jié)合應(yīng)用的患者的中位總存活時(shí)間為7.3個(gè)月，而接受單獨(dú)Taxotere的患者為5.9個(gè)月。對(duì)于接受SGN-15+Taxotere的患者在1年和18個(gè)月時(shí)的總存活分別為29%和18%，相比較的接受單獨(dú)Taxotere的患者分別為24%和8%。為該藥計(jì)劃了進(jìn)行了進(jìn)一歩的臨床試驗(yàn)。在潛伏期，使用單克隆抗體治療黑色瘤的效果有限。到目前為止，這些抗體中很少有達(dá)到臨床試驗(yàn)的階段，沒(méi)有一個(gè)單克隆抗體被批準(zhǔn)，也沒(méi)有證據(jù)表明單克隆抗體在III期臨床試驗(yàn)中有令人滿意的效果。在與疾病發(fā)病明確有關(guān)的30000個(gè)已知基因的產(chǎn)物中，缺少相關(guān)變點(diǎn)的識(shí)別而阻礙了治療疾病新藥的發(fā)現(xiàn)。在腫瘤學(xué)研究中，潛在的藥物耙點(diǎn)經(jīng)常被容易的選出，因?yàn)樗鼈冊(cè)谀[瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)。然后，將上述被識(shí)別的靶點(diǎn)與大量化合物進(jìn)行相互作用篩選。對(duì)于可能的抗體治療，這些候選化合物一般通過(guò)單克隆抗體生成的傳統(tǒng)方法而獲得，根據(jù)Kohler和Milstein制定的基本原理(1975，Nature,256，495-497，Kohler和Milstein)。脾細(xì)胞從抗原免疫小鼠中被收集(如全細(xì)胞、細(xì)胞組分、純化的抗原)并與永生化雜交瘤配偶體融合。所得到的雜交瘤經(jīng)過(guò)篩選，獲得能分泌與靶點(diǎn)最有效結(jié)合的抗體的雜交瘤。許多導(dǎo)向抗癌細(xì)胞的治療性和診斷性抗體(包括HERCEPHN和RITUXIMAB)已經(jīng)通過(guò)這些方法而被生成并基于它們與靶點(diǎn)的親和力和特異性而被選擇。這種方法的缺點(diǎn)有兩方面。第一，對(duì)具體癌癥過(guò)程的組織缺乏了解和方法的過(guò)分簡(jiǎn)單，選擇適合用于治療或診斷抗體結(jié)合的耙點(diǎn)受到限制，如高表達(dá)確認(rèn)的靶點(diǎn)的選擇。第二，和受體有最大親和力結(jié)合的藥物模型的假設(shè)非?？赡芗ぐl(fā)或排除所述情況的信號(hào)。盡管治療腸癌和乳腺癌取得了一些進(jìn)展，但是有效的抗體治療的確認(rèn)和進(jìn)展，無(wú)論是單試劑或組合試劑，對(duì)于各種類型的癌癥是不夠的?，F(xiàn)有技術(shù)US05296348教導(dǎo)了用于選擇特異性針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面內(nèi)化抗原的單克隆抗體的方法，和用于鑒定對(duì)細(xì)胞代謝具有抗轉(zhuǎn)錄和/或抗復(fù)制作用的單克隆抗體的方法。作為離子，顯示ME491抗體在W9、麗35和麗983黑素瘤細(xì)胞以及SW948結(jié)直腸癌細(xì)胞中內(nèi)化。此外，顯示ME491降低了SW948細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖。專利申請(qǐng)US20030211498A1(及其相關(guān)申請(qǐng)W00175177A3、W00175177A2、AU0153140A5)公開(kāi)了一種使用與卵巢腫瘤標(biāo)志多肽結(jié)合的抗體來(lái)抑制卵巢腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的方法，所述多肽由選自包括CD63抗原的-個(gè)組的卵巢腫瘤標(biāo)志物基因所編碼。利用卵巢癌進(jìn)行了基因表達(dá)系列分析，來(lái)鑒定導(dǎo)致將CD63識(shí)別為候選物的卵巢腫瘤標(biāo)志物基因。專利申請(qǐng)W002055551A1(及其相關(guān)申請(qǐng)CN1364803A)公開(kāi)了新的多肽，即人CD63抗原56.87。專利CN1326962A公開(kāi)了新的多肽，即人CD63抗原14.63。專利申請(qǐng)CN1326951A公開(kāi)了新的多肽，即人CD63抗原15.07。專利CN1351054A公開(kāi)了新的多肽，即人CD63抗原11.11。這些專利和專利申請(qǐng)均鑒定了CD63抗原和抗體，但未公開(kāi)本發(fā)明的分離的單克隆抗體，或者本發(fā)明的分離的單克隆抗體的應(yīng)用。編碼ME491多肽抗原的基因被克隆并于1988年2月18日受到用于公開(kāi)的序列(CanRes48:2955，1988年6月1日)；編碼CD63的基因被克隆并于1991年2月公開(kāi)了序列(JBC266(5):3239-3245，1991)，并且所述公開(kāi)清楚表明了ME491與CD63的同一性。W02004041170.89(序列IDNo.:89，優(yōu)選權(quán)申請(qǐng)日2004年6月29日)、W02003068268-A2(序列IDNo.:1，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2003年2月13日(2003W0-EP001461);其他優(yōu)選權(quán)日2002年2月14日(2002GB-00003480))、W02003057160-A29(序列IDNo.:40，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2002年12月30日(2002WO-US041798);其他優(yōu)先權(quán)日2002年1月2日(2002US-0345444P))都公開(kāi)了與CD63具有100%序列同源性的多肽。W02003016475-A2(序列工DNo.:9787&12101，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2002年8月14日(2002W0-US025765);其他優(yōu)先權(quán)日2001年8月14日(2001US-0312147P)公開(kāi)了與包括CD63的238個(gè)氨基酸的237個(gè)氨基酸具有100%序列同源性的多肽。W02003070902-A2(序列IDNo.:27，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)?jiān)?2003年2月18日(2003WO-US004902);其他優(yōu)先權(quán)日2002年2月20曰(2002US-0358279P))公開(kāi)了與包括CD63的238個(gè)氨基酸的224個(gè)氨基酸具有94%的序列同源性的多肽。EP1033401—A2(序列IDNo.:4168&4913,優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2000年2月21日(2000EP-00200610);其他優(yōu)先權(quán)日1999年2月26日(99US-0122487P))分別公開(kāi)了與包括CD63的238個(gè)氨基酸的205個(gè)氨基酸和94個(gè)氨基酸具有100%的序列同源性的多肽。W0200257303-A2(HumanpreyproteinforShigellaospG#26，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2002年l月11日(2002W0-EP000777);其他優(yōu)先權(quán)日2001年l月12日(2001US-0261130P))公開(kāi)了與包括CD63的238個(gè)氨基酸的130個(gè)氨基酸具有100%序列同源性的多肽。W0200055180-A2(序列IDNo.:756，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2000年3月8日(2000WO-US005918);其他優(yōu)先權(quán)日1999年3月12曰(99US-0124270P))公開(kāi)了與包括CD63的238個(gè)氨基酸的127個(gè)氨基酸具有99%序列同源性的多肽。W0200200677-A1(序列IDNo.:3203,優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日:2001年7月7日(2001WO-US018569);其他優(yōu)先權(quán)日07-JUN-2000(2000US-0209467P))公開(kāi)了與包括CD63的238個(gè)氨基酸的132個(gè)氨基酸具有97%序列同源性的多肽。W09966027-A1(來(lái)自人類CD63蛋白的大細(xì)胞外環(huán)序列(LargeextracellularloopsequencefromhumanCD63protein)，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日1999年6月15日(99WO-US013480);其他優(yōu)先權(quán)日1998年6月15日(98US-0089226P))公開(kāi)了與包括CD63的238個(gè)氨基酸的99個(gè)氨基酸具有100%序列同源性的多肽。W0200270539-A2(序列IDNo.:1207，優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)日2002年3月5日(2002W0-US005095);其他優(yōu)先權(quán)日2001年3月5曰(2001US-00799451))公開(kāi)了與包括CD63的238個(gè)氨基酸的102個(gè)氨基酸具有86%序列同源性的多肽。EP1033401-A2(序列IDNo.:4169，2000年12月2曰(2000EP-00200610);其他優(yōu)先權(quán)日1999年2月26日(99US-0122487P))公開(kāi)了與包括CD63的238個(gè)氨基酸的74個(gè)氨基酸具有100%序列同源性的多肽。這些專利申請(qǐng)鑒定了與CD63抗原具有不同的序列同源性的多肽。在大多數(shù)情況下，這些申請(qǐng)還公開(kāi)了相應(yīng)多肽及其同系物的抗體和抗體衍生物，但沒(méi)有公開(kāi)本發(fā)明的分離的單克隆抗體，或者本發(fā)明的分離的單克隆抗體的應(yīng)用。重要的是，所有上述申請(qǐng)都在編碼CD63的多核苷酸公開(kāi)之后提交的
發(fā)明內(nèi)容概述本發(fā)明人之前已經(jīng)被授予題為"個(gè)體化患者特異性抗癌抗體(IndividualizedPatientSpecificAnti-CancerAntibodies)"的美國(guó)專利6，180,357，涉及用于選擇用于治療癌癥的個(gè)體化的抗癌抗體的方法。為本文目的，術(shù)語(yǔ)"抗體"和"單克隆抗體"(mAb)可互換使用，并指由雜交瘤(例如小鼠或人類)生成的完整的免疫球蛋白、免疫交聯(lián)物以及從所述免疫球蛋白衍生的適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍灼魏椭亟M蛋白，例如嵌合的和人源化的免疫球蛋白、F(ab')和F(ab')2片段、單鏈抗體、重組免疫球蛋白可變區(qū)(Fv)、融合蛋白等?，F(xiàn)有技術(shù)公認(rèn)在多肽中的一些氨基酸序列可以變化，而沒(méi)有對(duì)所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能沒(méi)有顯著影響。在抗體的分子重排中，骨架區(qū)的核酸或氨基酸序列的修飾一般可以是耐受的。這些包括但不限于置換(優(yōu)選為保守置換)、刪除或添加。進(jìn)一步地，在本發(fā)明范圍內(nèi)的是將標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)治療模式(例如放射性同位素)與本發(fā)明的CDMAB相結(jié)合，從而集中所述化學(xué)療法的用途。CDMAB還可以與毒素、細(xì)胞毒部分、酶(例如生物素結(jié)合酶)或造血細(xì)胞結(jié)合，從而形成抗體結(jié)本申請(qǐng)使用如'357專利中教導(dǎo)的用于生成患者特異性抗癌抗體的方法用于分離編碼癌癥調(diào)節(jié)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系?？梢葬槍?duì)一種腫瘤而特別制備這些抗體，從而使癌癥治療個(gè)體化成為可能。在本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容中，具有殺滅細(xì)胞(細(xì)胞毒素的)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的)性能的抗癌抗體將在下文中被稱為細(xì)胞毒。這些抗體能夠用于幫助癌癥分期和診斷，也可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。不同于根據(jù)傳統(tǒng)藥物開(kāi)發(fā)方式生成的抗體，通過(guò)該方法生成的抗體可以靶向之前未顯示與惡性組織的生長(zhǎng)和/或存活整合的分子和途徑。進(jìn)一步地，這些抗體的結(jié)合親和力適合于可能對(duì)較強(qiáng)親和力相互作用不順從的細(xì)胞毒事件的啟動(dòng)要求。個(gè)性化抗癌治療的前景將給患者的治療方式帶來(lái)變化?？赡艿呐R床情境是在一種腫瘤出現(xiàn)時(shí)就取樣并入庫(kù)。通過(guò)該樣品，能夠通過(guò)已有的癌癥調(diào)節(jié)抗體庫(kù)對(duì)該腫瘤進(jìn)行分類?；颊邔⒈怀Ｒ?guī)分期，但可用的抗體可以對(duì)患者進(jìn)一步分期?？梢杂靡延械目贵w立即對(duì)患者進(jìn)行治療，和/或腫瘤特異性抗體庫(kù)可以使用本發(fā)明公開(kāi)的方法或者使用噬菌體展示庫(kù)并結(jié)合本發(fā)明公開(kāi)的篩選方法來(lái)生成。生成的所有抗體將被添加入抗癌抗體庫(kù)，因?yàn)槠渌哪[瘤細(xì)胞可能具有與被治療的腫瘤相同的抗原表位。根據(jù)該方法生成的抗體可以用于治療任何數(shù)量的、患有與這些抗體結(jié)合的癌癥的患者。大致使用美國(guó)專利6,180,357的方法，以及如美國(guó)專利6，657，048中和S.N.10/348，231、S.N.10/603，006和S.N.10/810,751中所描述的(其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)，通過(guò)使用來(lái)自患者肺(H460-22-1)或乳腺(7BD-33-11A和1A245.6)腫瘤活組織檢查的細(xì)胞免疫小鼠后而獲得小鼠單克隆抗體，H460-22-1、1A245.6和7BD-33-IIA。在不同組織來(lái)源的廣泛人類細(xì)胞系的細(xì)胞表面表達(dá)了H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗原。乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(MB-231)和黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058在體外對(duì)H460-22-1的細(xì)胞毒作用是敏感的。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和and前列腺癌細(xì)胞系PC-3在體外對(duì)1A245.6和7BD-33-11A的細(xì)胞毒作用是敏感的。H460-22-1在體內(nèi)針對(duì)該癌適應(yīng)癥的抗腫瘤活性進(jìn)一歩擴(kuò)充了H460-22-1針對(duì)培養(yǎng)物中乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果。在乳腺癌體內(nèi)模型中，由于免疫缺陷小鼠因缺乏某些免疫細(xì)胞而不能排斥人類腫瘤細(xì)胞，所以在免疫缺陷小鼠頸背皮下植入人類MB-231細(xì)胞。臨床前的移植腫瘤模型被認(rèn)為是治療效果的有效預(yù)測(cè)器。'小鼠中的異種移植物長(zhǎng)成實(shí)體瘤，發(fā)展了基質(zhì)、中心性壞死和新生血管。乳腺腫瘤細(xì)胞MB-231已經(jīng)被評(píng)價(jià)為免疫缺陷小鼠的體內(nèi)異種移植模型。MB-231腫瘤的良好植入或"成活率"以及所述腫瘤對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療劑的敏感性已經(jīng)使其成為合適的模型。親本細(xì)胞系及細(xì)胞系的變種已經(jīng)用于異種移植模型中，來(lái)評(píng)價(jià)廣泛的治療劑。在人類乳腺癌的預(yù)防性體內(nèi)模型中，H460-22-1在腫瘤細(xì)胞植入前一天給入小鼠隨后每周注射一次持續(xù)7周。治療期l可H460-22-1治療在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面比同種型對(duì)照明顯有效&<0.001)，所述同種型對(duì)照在結(jié)構(gòu)和大小上與H460-22-1相同，但不能結(jié)合MB-231細(xì)胞。在治療期末，給入H460-22-1的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)只有對(duì)照組的17.7%。在治療后的隨訪期間，H460-22-1的治療效果依然持續(xù)，治療組的平均腫瘤體積繼續(xù)明顯小于對(duì)照組，直到檢測(cè)期結(jié)束。使用存活率作為抗體效力的量度，對(duì)照組在治療后第74至81天之間達(dá)到50%的死亡率。相反，H460-22-l治療組在研究結(jié)束時(shí)的死亡率還沒(méi)有達(dá)到50%。H460-22-1與同種型對(duì)照治療組之間的這種差異是顯著的(P〈0.0015)。這些數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照治療組相比，H460-22-l治療組帶來(lái)了存活益處。H460-22-l治療顯示出是安全的，因?yàn)槠錄](méi)有誘導(dǎo)任何毒性體征，包括體重降低或臨床不良應(yīng)激。因此，H460-22-1治療是有效的，因?yàn)榕c對(duì)照治療組相比，其在完備的人類乳腺癌模型中延緩了腫瘤生長(zhǎng)并提高了存活率。這些結(jié)果還是可重現(xiàn)的，因?yàn)樵诹硪辉擃愌芯恐邪l(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，表明其對(duì)癌癥患者治療的關(guān)聯(lián)和益處。除了預(yù)防性的乳腺癌體內(nèi)腫瘤模型外，H460-22-l在體內(nèi)腫瘤模型中表現(xiàn)出抗MB-231細(xì)胞的抗腫瘤活性。在該異種移植腫瘤模型中，MB-231.乳腺癌細(xì)胞經(jīng)皮下植入免疫缺陷鼠，以便所述腫瘤在抗體治療前達(dá)到臨界大小。將H460-22-1治療與標(biāo)準(zhǔn)化療藥物順鉑相比較顯示順鉑和H460-22-1治療組的平均腫瘤體積顯著(p<0,001)小于同種型對(duì)照抗體治療組。H460-22-1治療介導(dǎo)的腫瘤抑制約為順鉑化學(xué)療法介導(dǎo)的腫瘤抑制的三分之二，但沒(méi)有使用順鉑時(shí)觀察到的顯著的體重降低(P〈0.003)和臨床應(yīng)激。H460-22-1的抗腫瘤活性及其最小化的毒性使其成為一種引人注目的抗癌治療劑。在治療后期，與同種型對(duì)照抗體組相比較，H460-22-1通過(guò)延緩腫瘤生長(zhǎng)而保持腫瘤抑制。在治療后31天，與同種型對(duì)照組比較，H460-22-1通過(guò)減少42%的腫瘤生長(zhǎng)而限制了腫瘤大小，相當(dāng)于對(duì)照組在治療結(jié)束時(shí)觀察到的48%的減少。在完備的乳腺癌腫瘤模型中，這些結(jié)果表明了H460-22-l保持腫瘤抑制至超過(guò)治療期的潛力，并證明了所述抗體在哺乳動(dòng)物中減少腫瘤負(fù)荷并提高存活率的能力。在體內(nèi)針對(duì)乳腺和前列腺癌適應(yīng)癥的抗腫瘤活性進(jìn)一歩擴(kuò)充了1A245.6和7BD-33-11A針對(duì)培養(yǎng)物中乳腺和前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果(如在S.N.10/348,231、S.N.10/891,866、S.N.10/603,006和S.N.10/810，751中所公開(kāi)的，其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)。臨床前的移植腫瘤模型被認(rèn)為是治療效果的有效預(yù)測(cè)器。參考S.N.10/348,231、S.N.10/891,866、S.N.10/603,006和S.N.10/810，751(其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)，7BD-33-11A和1A245.6在預(yù)防性的人乳腺癌體內(nèi)模型中防止了腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤負(fù)荷。監(jiān)測(cè)持續(xù)治療后300天。7BD-33-llA從未產(chǎn)生腫瘤，并且在移植后的9個(gè)月內(nèi)7BD-33-11A治療組的87.5%依然存活。相反，同種型對(duì)照組在第72天(治療后23天)100%死亡。1A245.6治療鼠在治療后151天達(dá)到100%死亡，所述天數(shù)比同種型對(duì)照治療組長(zhǎng)超過(guò)6倍。因此，1A245.6以及更大程度上的7BD-33-IIA在乳腺癌模型中提高了存活率并防止了腫瘤生長(zhǎng)(從而延緩了疾病進(jìn)程)。同時(shí)，如S,N,10/348,231、S.N.10/603，006、S.N.10/810,751和S.N.10/891,866(其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)中描述的，7BD-33-11A和1A245.6在完備的人乳腺癌體內(nèi)模型中抑制了腫瘤生長(zhǎng)并降低了腫瘤負(fù)荷。到第80天(治療后23天)，7BD-33-IIA治療鼠的平均腫瘤體積比同種型對(duì)照組低83%(p=0.001)。在該天，1A245.6治療減少了35%的平均腫瘤體積，但是，所述減少在該實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有達(dá)到顯著性(P二O.135)。使用存活率作為抗體效力的量度，估計(jì)在治療后約60無(wú)7BD-33-11A治療組中的死亡風(fēng)險(xiǎn)為同種型對(duì)照組的約16%(p=0.0006)。對(duì)照組在治療后50天100%死亡。相反，1A245.6治療鼠存活至治療后100無(wú)7BD-33-11A治療組的60%在治療后130天依然存活。這些數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照治療組相比，1A245.6和7BD-33-11A治療都帶來(lái)了存活益處并減少了腫瘤負(fù)荷。1A245.6和7BD-33-11A治療顯示出是安全的，因?yàn)槠錄](méi)有誘導(dǎo)任何毒性體征，包括體重降低或臨床不良應(yīng)激。因此，1A245.6和7BD-33-11A治療是有效的，因?yàn)榕c對(duì)照治療組相比，其都在完備的人類乳腺癌模型中延緩了腫瘤生長(zhǎng)并提高了存活率。在S.N.10/810,751中描述的研究中(其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)，在兩個(gè)不同的完備的乳腺癌異種移植模型中確定了與化學(xué)治療藥物(順?shù)N)治療單獨(dú)或聯(lián)合比較的7BD-33-11A的作用。在MB-231模型中第83天(治療后20天)，與緩沖液對(duì)照治療的動(dòng)物相比較，7BD-33-IIA治療導(dǎo)致了83%的腫瘤生長(zhǎng)減少&=0.002)。與對(duì)照比較，單獨(dú)順鉑治療導(dǎo)致77%的腫瘤體積減少，而順鉑與7BD-33-11A聯(lián)合治療相比對(duì)照導(dǎo)致了88%的腫瘤體積減少(p二O.006)。在MDA-MB-468(MB-468)模型中第62天(治療后12天)，與7BD-33-11A聯(lián)合的順鉑治療觀察到最大腫瘤生長(zhǎng)減少(97%，p=0.001)。與緩沖液對(duì)照相比較，單獨(dú)順鉑治療產(chǎn)生了95%的腫瘤生長(zhǎng)減少，而單獨(dú)7BD-33-11A治療顯示了37%的減少&=0.046)。在MB-231和MB-468模型中，以體重為量度，與順鉑治療相比較，7BD-33-11A治療導(dǎo)致了較大的動(dòng)物健康。這些結(jié)果表明，與單獨(dú)順鉑治療相比較，7BD-33-llA治療在MB-231模型中具有較大的效力，并在兩個(gè)乳腺癌模型中比順鉑更好的耐受，具有較少副反應(yīng)(例如體重減輕)。為確定7BD-33-11A治療在各種劑量下的作用，在預(yù)防性乳腺癌異種移植模型中進(jìn)行了劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(如S.N.10/810,751中描述的，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)。在第55天(治療后5天)，相對(duì)于同種型對(duì)照治療組，0。2mg/kg的治療組防止了85%的腫瘤生長(zhǎng)。還是在第55天，2mg/kg和20mg/kg治療組都沒(méi)有發(fā)生腫瘤。在第125天(治療后75天)獲得了類似的結(jié)果，其中20mg/kg治療組依然沒(méi)有發(fā)生腫瘤，而2mg/kg治療組具有了一些初期腫瘤生長(zhǎng)。7BD-33-11A治療還表現(xiàn)了存活益處。同種型對(duì)照組的所有小鼠在第104天(治療后54天)死亡，而0.2mg/kg7BD-33-11A治療組存活至第197天(治療后147天)。使用2mg/kg和20mg/kg7BD-33-11A治療組觀察到了甚至更大的存活益處；2.0mg/kg治療組只有50%在第290天死亡(治療后240天)，而20mg/kg治療組在第290天還沒(méi)有死亡。因此，全部三種劑量的7BD-33-IIA治療顯示了顯著的腫瘤生長(zhǎng)減少和增加的益處，且最高劑量表現(xiàn)出了最大程度的效力。除了在完備的體內(nèi)乳腺癌腫瘤模型中的有益效果，7BD-33-11A和1A245.6治療在預(yù)防性體內(nèi)前列腺癌模型中也具有針對(duì)PC-3細(xì)胞的抗腫瘤活性(描述于S.N.10/603，006和S.N.10/810,751中，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)。7BD-33-11A和1A245.6治療比同種型對(duì)照抗體在治療期后不久更有效抑制腫瘤生長(zhǎng)(P分別為0.001和0.017)。在治療期末，給入7BD-33-11A或1A245.6的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)分別為同種型對(duì)照的僅31%和50%。對(duì)于PC-3SCID異種移植模型，體重可以用作疾病進(jìn)展的替代指示劑。在第52天，與同種型對(duì)照相比，7BD-33-11A和1A245.6治療分別顯著(P分別為0,002和0.004)防止了54%和25%的體重減輕。監(jiān)測(cè)小鼠治療后的存活率。在治療后ll天，同種型和緩沖液對(duì)照鼠達(dá)到了100%的死亡率。相反，7BD-33-IIA和1A245.6在治療后38天達(dá)到100%死亡率，時(shí)間比對(duì)照組長(zhǎng)3倍。因此，7BD-33-11A和1A245.6是有效的，因?yàn)榕c同種型對(duì)照治療組相比較，7BD-33-11A和1A245.6治療在完備的人前列腺癌模型中都延緩了腫瘤生長(zhǎng)、防止了體重減輕并延長(zhǎng)了存活。除了預(yù)防性體內(nèi)前列腺癌腫瘤模型以外，7BD--33-11A在完備的體內(nèi)腫瘤模型中表現(xiàn)了針對(duì)PC-3細(xì)胞的抗腫瘤活性(描述于S.N.10/603,006和S.N.10/810，751中，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)。7BD-33-11A治療再次與同種型對(duì)照相比較。顯示在進(jìn)行治療后，7BD-33-11A治療組的平均腫瘤體積顯著(p〈0.024)小于同種型對(duì)照治療組。與同種型對(duì)照組相比較，7BD-33-11A治療介導(dǎo)的腫瘤抑制為36%。除了在乳腺癌和前列腺癌的體內(nèi)腫瘤模型中的有益效果，7BD-33-11A治療在預(yù)防性體內(nèi)胰腺癌模型中還具有針對(duì)BxPC-3細(xì)胞的抗腫瘤活性。在治療期后不久，7BD-33-11A治療比緩沖液對(duì)照抗體更有效抑制腫瘤生長(zhǎng)(71%，p=0.0009)。另外，與緩沖液對(duì)照治療組相比，7BD-33-11A治療帶來(lái)了存活益處。在7BD-33-11A治療組中，40%的小鼠在緩沖液對(duì)照組小鼠全部死亡后2周內(nèi)依然存活。除了在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌的體內(nèi)腫瘤模型中的有益效果，7BD-33-11A治療在兩個(gè)獨(dú)立的預(yù)防性體內(nèi)黑素瘤模型中還具有針對(duì)A2058和A375細(xì)胞的抗腫瘤活性。在A2058和A375模型中，7BD-33-11A治療都比緩沖液對(duì)照更有效抑制了腫瘤生長(zhǎng)(分別為72%，p=0.011和63%，p=0.。006)。7BD-33-11A在黑素瘤中以及在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌模型中的抗腫瘤活性使其成為引人注目的抗腫瘤治療劑。為確定7BD-33-11A在體內(nèi)表現(xiàn)的效力是否全部或部分歸因于ADCC活性，在NODSCID和SCID鼠中完備的腫瘤模型中都檢測(cè)了7BD-33-11A針對(duì)MB-231細(xì)胞的抗腫瘤活性。NODSCID在天然殺傷(NK)細(xì)胞中有功能性缺陷并缺乏循環(huán)補(bǔ)體和功能上未成熟的巨噬細(xì)胞群，而SCID鼠同時(shí)具有補(bǔ)體和強(qiáng)有力的NK細(xì)胞活性。7BD-33-11A是小鼠IgG2a單克隆抗體，并因此在體內(nèi)有ADCC活性。同時(shí)比較了7BD-33-11A的抗腫瘤活性與緩沖液對(duì)照和H460-22-1(基于其同種型，不應(yīng)該通過(guò)ADCC表現(xiàn)其活性的鼠IgGl單克隆抗體)。在第54天(最終治療后4天)，在SCID治療組中，7BD-33-11A和H460-22-1治療鼠發(fā)生的腫瘤的平均腫瘤體積分別僅為緩沖液對(duì)照鼠的1.9%和3.6%。相反，在NODSCID治療組中，還是在第54天(最終治療后4天)，7BD-33-11A治療鼠的腫瘤生長(zhǎng)的平均腫瘤體積為緩沖液對(duì)照鼠的67%。H460-22-1治療鼠表現(xiàn)出與SCID鼠中類似的效果；腫瘤生長(zhǎng)的平均腫瘤體積為緩沖液對(duì)照治療鼠的1.4%。因此，7BD-33-11A的體內(nèi)活性似乎部分歸因于ADCC活性，而H460-22-1的抗腫瘤作用似乎不依賴于ADCC。為驗(yàn)證H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A表位作為藥物靶，測(cè)定了其靶抗原在正常人類組織中的表達(dá)。如在S.N.10/603,006和S.N.10/810,751(其通過(guò)引用結(jié)合入本文)中部分討論和描述的，確定了7BD-33-IIA、H460-22-l和1A245.6對(duì)正常人組織的結(jié)合。通過(guò)IHC染色，多數(shù)組織未能表達(dá)7BD-33-llA抗原，包括重要的組織，例如腎、心臟和肺。7BD-33-llA染色了唾液腺、肝、胰腺、胃、十二指腸，并強(qiáng)染色了扁桃體。組織染色的結(jié)果表明7BD-33-11A顯示了對(duì)各種細(xì)胞類型的受限制的結(jié)合，但具有對(duì)侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的結(jié)合。對(duì)于H460-22-1和1A245.6，更廣泛的組織被陽(yáng)性染色。對(duì)于大多數(shù)情況，染色被限制于上皮或侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。然而，在心肌和肝細(xì)胞上都觀察到了陽(yáng)性染色。7BD-33-IIA、H460-22-1和1A245.6都同時(shí)展示了細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色模式。如S.N.10/810,751中所討論和描述的(其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)，7BD-33-11A與可商業(yè)獲得的抗CD63抗體(RFAC4和H5C6)進(jìn)行了比較。來(lái)自正常人組織染色的結(jié)果表明，7BD-33-11A再次顯示了對(duì)各種細(xì)胞類型的受限制的結(jié)合，但具有對(duì)侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的結(jié)合。相互比較，RFAC4和H5C6抗體顯示了類似的染色模式。然而，RFAC4和H5C6的染色模式都非常不同于使用7BD-33-IIA所觀察到的模式。特別地，與更廣泛正常組織結(jié)合的RFAC4和H5C6抗體通常在其中7BD-33-11A也是陽(yáng)性的組織中具有較高的染色強(qiáng)度，并且不僅結(jié)合至侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，還結(jié)合至多數(shù)組織的上皮細(xì)胞。H460-22-l、腦5'6和7BD-33-11A抗原的定位以及其在人群(例如在乳腺癌患者中)中流行的確定在評(píng)價(jià)這些抗體的治療用途和設(shè)計(jì)臨床實(shí)驗(yàn)中是重要的。為描述H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗原在癌癥患者的乳腺腫瘤中的表達(dá)，篩選了來(lái)自98名個(gè)體乳腺癌患者的腫瘤組織樣品的7BD-33-IIA抗原的表達(dá)(來(lái)自50名患者的結(jié)果之前已經(jīng)在S.N.10/603，006和S.N.10/810，751中描述，其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)，并且篩選了來(lái)自50名患者的腫瘤組織樣品的1A245.6和H460-22-1抗原(討論于S.N.10/603,006，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)。這些研究的結(jié)果顯示，37%的組織樣品對(duì)7BD-33-11A抗原的染色呈陽(yáng)性?；颊邩悠分械?BD-33-11A的表達(dá)顯示了對(duì)癌細(xì)胞的特異性，因?yàn)槿旧幌拗朴趷盒约?xì)胞。另外，7BD-33-llA染色了來(lái)自乳腺癌患者的20個(gè)正常組織樣品中的0個(gè)。另一方面，H460-22-l和1A245.6分別染色了92%和98%的乳腺癌組織樣品。H46。-22-1和1A245.6還染色了來(lái)自乳腺癌患者的10個(gè)正常組織樣品中的9個(gè)。然而，該染色一般比使用乳腺癌組織樣品觀察到的染色弱的多，并一般限制于侵潤(rùn)性成纖維細(xì)胞。7BD-33-llA、H460-22-l和1A245.6抗原的乳腺腫瘤表達(dá)表現(xiàn)出定位于惡性細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，使CD63成為治療上引人注目的靶。如S.N.10/810,751中所討論和描述的(其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文>7BD-33-11A與RFAC4和H5C6以及與抗Her2抗體(c-erbB-2)進(jìn)行了比較。目前研究的結(jié)果類似于之前的結(jié)果，并顯示36%的腫瘤組織樣品對(duì)7BD-33-11A抗原染色呈陽(yáng)性，而94%和85%的乳腺腫瘤組織分別對(duì)H5C6和RFAC4表位呈陽(yáng)性?；颊邩悠分?BD-33-11A的表達(dá)表現(xiàn)出對(duì)癌細(xì)胞的特異性，因?yàn)槿旧拗朴趷盒约?xì)胞。另外，7BD-33-11A染色了來(lái)自乳腺癌患者的10個(gè)正常組織樣品中的0個(gè)，而H460-22-i和1A245.6都染色了8個(gè)正常乳腺癌組織樣品中的7個(gè)。與c-erbB-2比較，7BD_33-11A顯示了完全不同的染色特征，其中半數(shù)對(duì)7BD-33-11A抗原呈陽(yáng)性的乳腺腫瘤組織樣品對(duì)Her2表達(dá)呈陰性，表明7BD-33-IIA靶向不能用現(xiàn)有抗體療法治療的患者群。在對(duì)7BD-33-11A和Her2都呈陽(yáng)性的乳腺腫瘤組織切片之間存在染色強(qiáng)度的差別。c-erbB-2抗體還陽(yáng)性染色了一個(gè)正常乳腺組織切片。如S.N.10/603，006和S.N.10/810,751(其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)中部分討論的，基于雌激素和黃體酮受體的乳腺腫瘤表達(dá)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了7BD-33-llA、H460-22-1和1A245.6的表達(dá)，雌激素和黃體酮在乳腺腫瘤的發(fā)展、治療和預(yù)后中起重要作用。1A245.6抗原的表達(dá)與雌激素或黃體酮受體的表達(dá)之間沒(méi)有明顯相關(guān)。在缺乏雌激素受體并存在黃體酮受體和7BD33-11A抗原表達(dá)之間以及同時(shí)存在雌激素和黃體酮受體與H460-22-l抗原表達(dá)之間存在輕微相關(guān)。當(dāng)基于癌癥進(jìn)展期或程度來(lái)分析腫瘤時(shí)，結(jié)果表明對(duì)于7BD-33-11A和H460-22-l而言，都是較高腫瘤期具有較大陽(yáng)性表達(dá)的趨勢(shì)。使用RFAC4獲得了類似的結(jié)果。H5C6還顯示了使用雌激素或黃體酮受體表達(dá)的輕度相關(guān)，但與腫瘤期沒(méi)有明顯相關(guān)，然而，結(jié)論受小體積樣品的限制。7BD-33-11A抗原的定位及其在前列腺癌患者中的流行在評(píng)價(jià)7BD-33-UA免疫治療對(duì)前列腺癌患者的益處和設(shè)計(jì)有效臨床實(shí)驗(yàn)中是重要的。為描述7BD-33-11A抗原在來(lái)自癌癥患者的前列腺腫瘤中的表達(dá)，篩選了來(lái)自51名個(gè)體前列腺癌患者的腫瘤組織樣品的7BD-33-IIA抗原的表達(dá)(如S.N.10/810，751中描述和討論的，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)。該研究結(jié)果顯示，88%的組織樣品對(duì)7BD-33-IIA抗原染色呈陽(yáng)性。盡管7BD-33-IIA也高強(qiáng)度染色了正常組織切片，但與正常樣品比較，在腫瘤組織樣品中存在更高程度的膜染色。有一個(gè)胚橫紋肌肉瘤組織樣品沒(méi)有染色7BD-33-11A抗原。在受試的小體積樣品中，腫瘤期和7BD-33-llA抗原存在之間沒(méi)有顯示直接相關(guān)。7BD-33-11A抗原的定位及其在在黑素瘤癌癥患者中的流行在評(píng)價(jià)7BD-33-11A免疫治療對(duì)黑素瘤患者的益處和設(shè)計(jì)有效臨床實(shí)驗(yàn)巾是重要的。為描述7BD-33-IIA抗原在來(lái)自癌癥患者的黑素瘤中的表達(dá)，篩選了來(lái)自39名個(gè)黑素瘤患者的腫瘤組織樣品的7BD-33-11A抗原的表達(dá)。該研究結(jié)果顯示，90%的組織樣品對(duì)7BD-33-11A抗原染色呈陽(yáng)性。在該小樣品中，腫瘤期和7BD-33-IIA抗原的存在之間沒(méi)有顯示直接相關(guān)。為進(jìn)一步擴(kuò)充7BD-33-IIA、H460-22-1和1A245.6的潛在治療益處，還測(cè)定了各種人類癌組織中的抗原的定位(如在S.N.10/603，006中對(duì)1A245.6和7BD33-11A描述和在S.N.10/810,751中引用的，其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)。除了乳腺癌和前列腺癌，集中癌癥類型表達(dá)了7BD-33-IIA抗原。陽(yáng)性人類癌癥類型包括皮膚(1/2)、肺謂、肝(2/3)、胃(4/5)、甲狀腺(2/2)、子宮(4/4)和腎(3/3)。一些癌癥沒(méi)有表達(dá)所述抗原；這些包括卵巢(0/3)、睪丸(0/1、腦(0/2)和淋巴結(jié)(0/2)。關(guān)于H460-22-1和1A245.6，與正常人類組織陣列一樣，來(lái)自各種人類組織類型的多種癌被陽(yáng)性染色。在皮膚、肺、肝、子宮、腎、胃和膀胱的惡性細(xì)胞上觀察到了較大的染色。與人類乳腺、前列腺和黑素瘤癌組織一樣，7BD-33-IIA、H460-22-1和1A245.6的定位同時(shí)發(fā)生于這些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。因此，除了H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗體在體外結(jié)合至癌細(xì)胞系外，有證據(jù)表明抗原在人類中表達(dá)，并表達(dá)于多種類型的癌上。如S.N.10/810,751中對(duì)7BD-33-llA的描述(其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)和本文對(duì)1A245.6和H460-22-1的描述，生物化學(xué)數(shù)據(jù)也表明由H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A識(shí)別的抗原是CD63。這也得到了研究支持，所述研究表明反應(yīng)性針對(duì)CD63的單克隆抗體RFAC4識(shí)別了通過(guò)免疫沉淀結(jié)合至7BD-33-IIA、H460-22-1或1A245.6的蛋白質(zhì)。另外，細(xì)菌表達(dá)研究闡明，H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A結(jié)合至CD63的細(xì)胞外環(huán)2。還通過(guò)構(gòu)型依賴性區(qū)分了7BD-33-llA、H460-22-1和1A245,6表位。這些工HC和生物化學(xué)結(jié)果證明，H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A結(jié)合至CD63抗原。因此，優(yōu)勢(shì)證據(jù)表明，H460-22-1、1A245.6和7BD-33-llA通過(guò)存在于CD63上的獨(dú)特構(gòu)型表位的連接而介導(dǎo)抗癌作用。為本發(fā)明目的，所述表位定義為"CD63抗原性部分"，其特征為與由雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-llA、1A245.6、H460-22-l編碼的單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段或其抗體結(jié)合物相結(jié)合的能力?？傮w上，該數(shù)據(jù)說(shuō)明H460-22-l、1A245.6和7BD-33-11A抗原是癌癥相關(guān)抗原并在人類中表達(dá)，并且是病理相關(guān)的癌靶。進(jìn)一步地，該數(shù)據(jù)也證明了H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A抗體與人類癌組織的結(jié)合，并能夠適當(dāng)用于可以是診斷、治療預(yù)測(cè)或預(yù)后性的測(cè)定。另外，該抗原的細(xì)胞膜定位因該抗原在多數(shù)非惡性細(xì)胞中表達(dá)的相對(duì)頻率而指示了細(xì)胞的癌癥狀態(tài)，該發(fā)現(xiàn)允許該抗原、其基因或衍生物、其蛋白質(zhì)或其變體用于可以是診斷、治療預(yù)測(cè)或預(yù)后性的測(cè)定。本發(fā)明描述了H460-22-l、7BD-33-llA和1A245.6的開(kāi)發(fā)和用途，通過(guò)美國(guó)專利6,180,357中描述的方法而被開(kāi)發(fā)，并通過(guò)其在細(xì)胞毒性測(cè)定、動(dòng)物模型中非完備和完備的腫瘤生長(zhǎng)以及在癌癥患者中延長(zhǎng)存活時(shí)間的作用而被鑒定。本發(fā)明代表了癌癥治療領(lǐng)域的進(jìn)步，因?yàn)槠涫状蚊枋隽颂禺愋越Y(jié)合至存在于靶分子CD63上的一種或多種表位并在體外也具有抗惡性腫瘤細(xì)胞但非正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性質(zhì)的試劑，并且其還在人類癌癥體內(nèi)模型中直接介導(dǎo)了腫瘤生長(zhǎng)的抑制和存活的延長(zhǎng)。這相對(duì)于其他之前描述的抗CD63抗體是進(jìn)歩的，因?yàn)檫€沒(méi)有抗CD63抗體顯示出具有類似的性質(zhì)。其還提供了領(lǐng)域內(nèi)的進(jìn)步，因?yàn)槠涫状吻宄C明了CD63直接參與某些類型的腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展相關(guān)事件。其也代表了癌癥治療中的進(jìn)步，因?yàn)槠渚哂性谌祟惢颊咧斜憩F(xiàn)類似抗癌性質(zhì)的潛力。另一進(jìn)步是抗癌癥抗體文庫(kù)中加入這些抗體將提高靶向腫瘤(表達(dá)不同的抗原標(biāo)志物)的可能性，通過(guò)確定不同抗癌抗體的適當(dāng)組合，以尋求最有效的靶向和抑制腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展。總之，本發(fā)明教導(dǎo)了使用7BD-33-IIA抗原作為治療劑的靶，其在施用時(shí)可減少哺乳動(dòng)物中表達(dá)所述抗原的癌的腫瘤負(fù)荷，并且還能導(dǎo)致受治哺乳動(dòng)物延長(zhǎng)的存活。本發(fā)明還教導(dǎo)了使用CDMAb(H460-22-1、7BD-33-IIA和1A245.6)及其衍生物及其抗原結(jié)合片段來(lái)靶向其抗原，以減少哺乳動(dòng)物中表達(dá)所述抗原的腫瘤負(fù)荷，并延長(zhǎng)患有表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物的存活。進(jìn)一步地，本發(fā)明還教導(dǎo)了在癌細(xì)胞中檢測(cè)H460-22-1、7BD-33-11A和1A245.6抗原的用途，其可用于患有表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物的診斷、治療預(yù)測(cè)和預(yù)后。如果患者的初期治療沒(méi)有效果或發(fā)生了轉(zhuǎn)移，則可以重復(fù)腫瘤特異抗體生成過(guò)程來(lái)進(jìn)行治療。而且，抗癌抗體可以和患者的紅細(xì)胞結(jié)合并再次注入來(lái)治療病灶轉(zhuǎn)移。目前對(duì)轉(zhuǎn)移癌癥的有效治療很少，轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著糟糕的出院率而導(dǎo)致死亡。不過(guò)，轉(zhuǎn)移的腫瘤通常有較好的血管生成，通過(guò)紅細(xì)胞進(jìn)行的抗癌抗體的輸送具有將抗體聚集在腫瘤位置的作用。甚至在轉(zhuǎn)移前，大多數(shù)癌細(xì)胞依靠宿主血液供應(yīng)來(lái)存活，而與紅細(xì)胞結(jié)合的抗癌抗體同樣能有效抵抗原位腫瘤。或者，抗體可以和其它造血細(xì)胞結(jié)合，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，等等。有五類抗體，每類抗體具有一種其重鏈所賦予的功能。通常認(rèn)為通過(guò)裸抗體的癌細(xì)胞殺傷作用由抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)來(lái)介導(dǎo)。例如，鼠lgM和IgG2a抗體能夠通過(guò)與補(bǔ)體系統(tǒng)中的C-l組分結(jié)合來(lái)激活人類補(bǔ)體，從而激活補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑，這能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞溶解。對(duì)于人類抗體，最有效的補(bǔ)體激活抗體通常是IgM和IgGl。鼠同種型抗體IgG2a和IgG3在俘獲具有Fc受體的細(xì)胞毒性細(xì)胞過(guò)程中起作用，導(dǎo)致由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用。人類同種型抗體IgGl和IgG3都介導(dǎo)ADCC?？贵w介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷作用的另一種可能的機(jī)制是可以通過(guò)利用抗體催化功能，來(lái)水解細(xì)胞膜與其結(jié)合的糖蛋白或糖脂之間的化學(xué)鍵，即所謂的催化抗體。還有兩種被普遍接受的抗體調(diào)節(jié)癌細(xì)胞殺傷的機(jī)理。第一種是利用抗體作為疫苗來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的特定癌抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。第二種是利用抗體來(lái)靶向生長(zhǎng)受體并干擾其功能或下調(diào)該受體以使其功能喪失。腫瘤藥物的臨床應(yīng)用基于該藥物在可接受的危險(xiǎn)評(píng)估之下的受益。在癌癥的治療中，存活率通常是最重要的受益目標(biāo)，但是除了延長(zhǎng)壽命外，還有一些其它公認(rèn)的受益。這些對(duì)存活沒(méi)有負(fù)面影響的其它受益包括癥狀的減輕、防止負(fù)面影響、延長(zhǎng)復(fù)發(fā)周期或無(wú)瘤存活時(shí)間和延長(zhǎng)疾病進(jìn)程。這些標(biāo)準(zhǔn)被普遍接受，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)等管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)產(chǎn)生這些受益的藥物(Hirschfeld等.CriticalReviewsinOncology/Hematology42:137-1432002)。除了這些標(biāo)準(zhǔn)外，人們充分認(rèn)識(shí)到還有其他特征可以預(yù)示這些受益類型。部分的，美國(guó)FDA的快速審批程序確認(rèn)了有替代特征可能預(yù)測(cè)患者的受益。到2003年末，有16個(gè)藥物被批準(zhǔn)進(jìn)入這個(gè)程序，其中四個(gè)已經(jīng)進(jìn)入全面審批，即，隨訪研究證明了替代特征所預(yù)示的直接的患者受益。確定實(shí)體瘤藥物療效的一個(gè)重要指標(biāo)是通過(guò)測(cè)試治療效果來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤負(fù)荷(Therasse等.JournaloftheNationalCancerInstitute92(3):205-2162000)。這種評(píng)價(jià)的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))已經(jīng)由實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)工作組頒布，該工作組由國(guó)際癌癥專家組成。和參照REC工ST標(biāo)準(zhǔn)的客觀療效所顯示的一樣，與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組相比，對(duì)實(shí)體瘤有確切療效的藥物易于最終產(chǎn)生直接的患者受益。在臨床前條件下，腫瘤負(fù)荷通常更容易被評(píng)估和記錄。因?yàn)榕R床前研究可以被轉(zhuǎn)化為臨床條件，所以在臨床前模型中產(chǎn)生存活延長(zhǎng)的藥物具有最大的、所期望的臨床效用。與產(chǎn)生對(duì)臨床治療有益反應(yīng)相類似，在臨床前條件下降低腫瘤負(fù)荷的藥物也可能對(duì)疾病具有顯著的直接影響。盡管延長(zhǎng)生命是癌癥藥物治療最重要的目標(biāo)，但是還有其他受益具有臨床效用，顯然，腫瘤負(fù)荷的降低也能夠?qū)е轮苯拥氖芤娌⒕哂信R床效果(Eckhardt等.DevelopmentalTherapeutics:革巴向化合物的臨床實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)白勺成功與失敗(SuccessesandFailuresofClinicalTrialDesignsofTargetedCompounds);ASC0EducationalBook,第39"屆年會(huì)，2003，第209-219頁(yè))。因此，本發(fā)明的目的是利用從特定個(gè)體衍生的細(xì)胞生成癌癥調(diào)節(jié)抗體的方法，該抗體對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性而同時(shí)對(duì)非癌細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒，為了分離雜交瘤細(xì)胞系和該雜交瘤細(xì)胞系編碼的相應(yīng)的分離的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供癌癥調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明另一個(gè)目的是生成CDMAB，其細(xì)胞毒通過(guò)ADCC介導(dǎo)。本發(fā)明另一個(gè)目的是生成CDMAB，其細(xì)胞毒通過(guò)CDC介導(dǎo)。本發(fā)明另一個(gè)目的是生成CDMAB其細(xì)胞毒是其催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解的能力的功能。本發(fā)明另一個(gè)目的是生成CDMAB，該CDMAB在癌癥的診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)的結(jié)合試驗(yàn)中是有用的。本發(fā)明其它的目的和優(yōu)點(diǎn)將從通過(guò)描述和實(shí)施例方式的下述描述而變得顯而易見(jiàn)，其中提出了本發(fā)明的某些實(shí)施方案。專利或申請(qǐng)文件含有至少一幅彩色附圖。具有彩色附圖的專利或?qū)＠暾?qǐng)公布的副本將在要求和付給必要費(fèi)用后由當(dāng)局提供。圖l.7BD-33-IIA(板A)或同種型對(duì)照(板B)探針的MDA-MB-231全細(xì)胞溶解產(chǎn)物(泳道1)或細(xì)胞膜(泳道2和3)的Western印跡。分子量標(biāo)記顯示于左邊。圖2.使用7BD-33-11A探針的MDA-MB-23i膜的Western印跡。泳道l:膜在還原條件下的跑板。泳道2:膜在非還原條件下的跑板。分子量標(biāo)記顯示于左邊。圖3針對(duì)7BD-33-11A至MDA-MB-231膜的結(jié)合的去糖基化作用。MDA-MB-231膜經(jīng)受下述物質(zhì)處理糖肽酶F(PNGaseF;泳道1)，0-聚糖酶(泳道2)，唾液酸酶(泳道3)，PNGaseF、0-聚糖酶和唾液酸酶的組合(泳道4)，PNGaseF、0-聚糖酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和葡萄糖胺酶的組合(泳道5)或緩沖液對(duì)照(泳道6)。分子量標(biāo)記顯示于左邊。圖4.與7BD-33-11A免疫沉淀的MDA-MB-231膜蛋白的SDS-PAGE(板A)和Western印跡(板B)。泳道A:同種型對(duì)照免疫沉淀蛋白質(zhì)，泳道B:7BD-33-11A免疫沉淀蛋白質(zhì)和泳道TM:總MDA-MB-231膜蛋白。矩形盒描繪了SDS-PAGE中泳道B和Western印跡中泳道TM的相同條帶。分子量顯示于左邊。圖5.Profound檢索概要表。圖6.MASCOT檢索概要表。圖7a:使用探針7BD-33-IIA(板A)、抗CD63(克隆RFAC4，板B)、IgG2a同種型對(duì)照(板C)和IgGl同種型對(duì)照(板D)的蛋白質(zhì)Western印跡(板A)。泳道A:總MDA-MB-231膜蛋白；泳道B:7BD-33-11A免疫沉淀的蛋白質(zhì)；泳道C:抗CD63(RFAC4)免疫沉淀的蛋白質(zhì)；泳道D:IgG2a同種型對(duì)照免疫沉淀的蛋白質(zhì)；和泳道E:IgGl同種型對(duì)照免疫沉淀的蛋白質(zhì)。分子量標(biāo)記顯示于左邊。圖7b:使用探針7BD-33-llA(板A)、抗CD63(克隆H5C6，板B)、IgG2a同種型對(duì)照(板C)和IgGl同種型對(duì)照(板D)的蛋白質(zhì)Western印跡。泳道A:總MDA-MB-231膜蛋白；泳道B:7BD-33-11A免疫沉淀的蛋白質(zhì)泳道G抗CD63(H5C6)免疫沉淀的蛋白質(zhì)泳道DIgG2a同種型對(duì)照免疫沉淀的蛋白質(zhì)；和泳道E:IgGl同種型對(duì)照免疫沉淀的蛋白質(zhì)。分子量標(biāo)記顯示于左邊。圖8.使用探針7BD-33-IIA(板A)、抗CD63(克隆RFAC4,板B)、抗CD63(克隆H5C6，板C)、IgG2a同種型對(duì)照(板D)和IgGl同種型對(duì)照(板E)的蛋白質(zhì)Western印跡。泳道1-5含有7BD-33-11A免疫沉淀的蛋白質(zhì)，且泳道6-10含有IgG2a同種型對(duì)照免疫沉淀的蛋白質(zhì)。泳道1禾[l6:沒(méi)有NaCl，泳道2和7:150mMNaCl，泳道3和8:500mMNaCl，泳道4和9:2000mMNaCl，以及泳道5和10:R工PA緩沖液。圖9.使用探針7BD-33-11A(板A)、抗CD63(克隆RFAC4,板B)、抗CD63(克隆H5C6，板C)、IgG2a同種型對(duì)照(板D)和CoomassieColloidalBlue蛋白質(zhì)染色(板E)的蛋白質(zhì)Western印跡。泳道1:單獨(dú)的非誘導(dǎo)的載體，泳道2:非誘導(dǎo)的GST-EC1，泳道3:非誘導(dǎo)的GST-EC2，泳道4:單獨(dú)的誘導(dǎo)載體，泳道5:誘導(dǎo)的GST-EC1和泳道6:誘導(dǎo)的GST-EC2。分子量標(biāo)記顯示于左邊。圖10.使用探針I(yè)gGl和IgG2a同種型對(duì)照、抗CD44(克隆H460-16-2)、抗CD63(RFAC4)、1A245.6和H460-22-l的蛋白質(zhì)Western印跡。泳道1:全細(xì)胞膜組分(泳道1)，泳道2:與H460-16_2免疫沉淀的物質(zhì)，泳道3:與7BD-33-IIA免疫沉淀的物質(zhì)，泳道4:與H460-22-l免疫沉淀的物質(zhì)泳道5t與1A245.6免疫沉淀的物質(zhì)泳道6:與IgG2a同種型對(duì)照免疫沉淀的物質(zhì)，和泳道7:與IgGl同種型對(duì)照免疫沉淀的物質(zhì)。分子量標(biāo)記顯示于左邊。圖11.使用探針I(yè)gGl和IgG2a同種型對(duì)照、抗CD44(克隆H460-16-2)、抗CD63(RFAC4)、1A245.6和H460-22-1的蛋白質(zhì)Western印跡。泳道1:單獨(dú)的非誘導(dǎo)的GST載體，泳道2:非誘導(dǎo)的GST-EC1，泳道3:非誘導(dǎo)的GST-EC2，泳道4:單獨(dú)的誘導(dǎo)的GST載體，泳道5:誘導(dǎo)的GST-EC1，泳道6:誘導(dǎo)的GST-EC2。分子量標(biāo)記顯示于左邊。圖12.導(dǎo)向幾種癌細(xì)胞系和非癌細(xì)胞的7BD-33-llA、同種型對(duì)照和抗EGFR的代表性FACS直方圖。圖13.導(dǎo)向幾種癌細(xì)胞系和非癌細(xì)胞的1A245.6、同種型對(duì)照和抗EGFR的代表性FACS直方圖。圖14,導(dǎo)向幾種癌細(xì)胞系和非癌細(xì)胞的H460-22-1、同種型對(duì)照和抗EGFR的代表性FACS直方圖。圖15,正常人心臟。A.7BD-33-IIA。正常人腦。B.畫(huà)5.6。C.H460-22-1。正常人心臟。D.陽(yáng)性對(duì)照。正常人腦。E.陽(yáng)性對(duì)照。放大200倍。圖16.正常人胃腔。A.7BD-33-11AoB.H460-22-1。C.1A245.6。D.陰性同種型對(duì)照。放大200倍。圖17.結(jié)合至人乳腺癌腫瘤(侵潤(rùn)性導(dǎo)管癌)的A.7BD-33-IIA，B.1A245.6和C.H460-22-1的代表性顯微照片。D.陰性同種型對(duì)照。放大200倍。圖18.結(jié)合至人正常乳腺組織的7BD-33-IIA，B.陽(yáng)性對(duì)照的代表性顯微照片。放大200倍。圖19.顯示了使用7BD-33-11A(A)、同種型陰性對(duì)照(B)、抗CD63(RFAC4)抗體或抗CD63(H5C6)抗體(D)在來(lái)自人乳腺癌組織陣列的侵潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織切片上獲得的結(jié)合模式的代表性顯微照片。與RFAC4或H5C6抗體相比較7BD-33-11A顯示了對(duì)腫瘤細(xì)胞較弱的陽(yáng)性染色。放大200倍。圖20.顯示了使用7BD-33-11A(A)或抗Her2(c-erbB-2)抗體(B)在來(lái)自人乳腺癌組織陣列的侵潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織切片上獲得的結(jié)合模式的代表性顯微照片。與顯示了陰性染色的抗Her2抗體相比較，7BD-33-11A顯示了對(duì)腫瘤細(xì)胞強(qiáng)的陽(yáng)性染色。放大200倍。圖21.顯示了使用7BD-33-llA在來(lái)自人前列腺癌組織陣列的前列腺腺癌(A)或正常前列腺(B)的組織切片上獲得的結(jié)合模式的代表性顯微照片。7BD-33-11A顯示了對(duì)腺癌組織切片中腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)陽(yáng)性膜染色。7BD-33-11A同時(shí)顯示了正常前列腺組織切片中腺狀上皮的膜和細(xì)胞質(zhì)染色。放大200倍。圖22.原發(fā)性惡性黑素瘤。A.7BD-33-11A(黑色箭頭指示腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性染色，且綠色箭頭指示間質(zhì)的染色缺乏)。B.陰性同種型對(duì)照。放大400倍。圖23,腎細(xì)胞癌。A.7BD-33-11A。B,1A245.6。CM60-22-1。D.陰性同種型對(duì)照。放大200倍。圖24.H460-22-1、同種型對(duì)照或緩沖液對(duì)照在預(yù)防性MDA-MB-231乳腺癌模型中對(duì)體重的影響。圖25.H460-22-1、同種型對(duì)照或緩沖液對(duì)照在預(yù)防性MDA-MB-231乳腺癌模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。陰影線指示抗體施用的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均+/-SEM。圖26.H460-22-l、同種型對(duì)照或緩沖液對(duì)照在預(yù)防性MDA-MB-231乳腺癌模型中對(duì)存活的影響。陰影線指示抗體施用的時(shí)期。圖27.H460-22-1、同種型對(duì)照或順鉑在預(yù)防性MDA-MB-231乳腺癌模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。陰影線指示抗體施用的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均+/_SEM。圖28.H460-22-l、同種型對(duì)照或順鉑在完備的MDA-MB-231乳腺癌模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制(%T/C)的影響。陰影線指示抗體施用的時(shí)期。圖29.H460-22-1、同種型對(duì)照或順鉑在完備的MDA-MB-231乳腺癌模型中對(duì)體重的影響。圖30.7BD-33-11A或緩沖液對(duì)照在預(yù)防性A2058黑素瘤癌癥模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。陰影線指示抗體施用的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均+/-SEM。圖31.7BD-33-11A或緩沖液對(duì)照在預(yù)防性A2058黑素瘤癌癥模型中對(duì)體重的影響。圖32.7BD-33-11A或緩沖液對(duì)照在完備的A2058黑素瘤癌癥模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均+/-SEM。圖33.7BD-33-11A或緩沖液對(duì)照在完備的A2058黑素瘤癌癥模型中對(duì)體重的影響。圖34。7BD-33-11A或緩沖液對(duì)照在預(yù)防性A375黑素瘤癌癥模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。陰影線指示抗體施用的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均+/-SEM。圖35。7BD-33-11A或緩沖液對(duì)照在預(yù)防性A375黑素瘤癌癥模型中對(duì)體重的影響。圖36.AR7BD-33-11A和達(dá)卡巴嗪(單獨(dú)和結(jié)合)在完備的A375黑素瘤癌癥模型中的作用。AR7BD-3311A和磷酸緩沖鹽(對(duì)照)以20mg/kg腹腔注射，每周3次，持續(xù)3周。達(dá)卡巴嗪以90mg/kg(該模型中的l/2最大耐受劑量)腹腔注射，每天1次，持續(xù)連續(xù)5天。顯示了組的中等腫瘤生長(zhǎng)和存活(Kaplan-Meier曲線)曲線。圖37.7BD-33-11A或緩沖液對(duì)照在預(yù)防性BxPC-3胰腺癌模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。陰影線指示抗體施用的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均+/-SEM。圖38.7BD-33-11A或緩沖液對(duì)照在預(yù)防性BxPC-3胰腺癌模型中對(duì)體重的影響。圖39.7BD-33-IIA、H460-22-1或緩沖液對(duì)照在MDA-MB-231乳腺SCID或N0D/SCID癌癥模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。具體實(shí)施方式實(shí)施例1通過(guò)Western免疫印跡鑒定7BD_33_11A結(jié)合蛋白如S.N.10/810,751(其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)中描述和討論的，為鑒定由抗體7BD-33-llA識(shí)別的抗原，細(xì)胞膜制品經(jīng)受十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),并轉(zhuǎn)膜。后者使用抗體7BD-33-11A探針檢測(cè)，以使由該抗體檢測(cè)的蛋白質(zhì)顯影。1.0.全細(xì)胞溶解產(chǎn)物和全細(xì)胞膜組分制品1.1.全細(xì)胞溶解產(chǎn)物的制備之前通過(guò)FACS的工作證明了抗體7BD-33-11A對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(MB-231)的結(jié)合。結(jié)果，從該細(xì)胞系獲得的全細(xì)胞膜制品和全細(xì)胞溶解產(chǎn)物用于抗原鑒定和表征。來(lái)自MB-231細(xì)胞的總細(xì)胞溶解產(chǎn)物制備如下MB-231細(xì)胞片狀沉淀(1.5g)重懸于2mL裂解緩沖液，所述緩沖液含有20mMTris(pH7.4)、150mMNaCl、10/0(v/v)TritonX-100、0.02%(w/v)疊氮化鈉、2mM原釩酸鈉、50mM氟化鈉和蛋白酶抑制劑雞尾酒(RocheDiagnostics;Manheim，Germany)。所述片狀沉淀經(jīng)玻璃勻化器均質(zhì)化并攪拌下于4。C保溫1小時(shí)。然后將樣品于4。C離心(20，000g)15分鐘，以除去不溶于洗滌劑的物質(zhì)。收集上清夜，分成小份，-8CTC冷凍。通過(guò)BCA(二金雞寧酸)測(cè)定法(Pierce;Rockford，IL.)測(cè)定細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)濃度。1.2.全細(xì)胞膜組分的制備MB-231乳腺癌細(xì)胞的鋪滿培養(yǎng)物制備全細(xì)胞膜。從細(xì)胞堆除去培養(yǎng)基，使用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞。使用離解緩沖液細(xì)胞離解緩沖液(Gibco-BRL;GrandIsland,NY)在臺(tái)式振蕩器上于37'C離解細(xì)胞20分鐘。收集細(xì)胞4"C下900g離心10分鐘。離心后，重懸于PBS并再次于4'C下900g離心10分鐘來(lái)洗漆細(xì)胞片狀沉淀。然后將片狀沉淀保存于-8(TC待用。為制備細(xì)胞膜，細(xì)胞片狀沉淀經(jīng)融化并以每克細(xì)胞3raL緩沖液的比例重懸于均勻化緩沖液(每50mL含有1片完全蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche;LavalQC))。使用polytron勻化器在冰上對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行均勻化，以裂解細(xì)胞。細(xì)胞勻漿在4。C下15，000g離心10分鐘，以除去核顆粒。收集上清液，分入離心管中，然后在4。C下75，600g離心90分鐘。小心去除上清夜，各細(xì)胞膜片狀沉淀重懸于約5mL的均勻化緩沖液。合并來(lái)自所有離心管的細(xì)胞膜片狀沉淀，再次分開(kāi)，并在4。C下75,600g離心90分鐘。小心去除上清夜，稱重片狀沉淀。含有1%TritonX-100的均勻化緩沖液以每克細(xì)胞膜片狀沉淀3mL緩沖液的比例添加至所述片狀沉淀。通過(guò)在臺(tái)式振蕩器上以300rpm振蕩溶解細(xì)胞膜，冰上持續(xù)1小時(shí)。細(xì)胞膜懸浮液在75，600g離心至片狀不溶性物質(zhì)。小心從所述離心管移出含有溶解的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的上清液，檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，并保存于-8(TC。2.0—維SDS-PAGE和Western免疫印記通過(guò)一維SDS-PAGEMB-231(IDSDS-PAGE)從細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分和全細(xì)胞溶解產(chǎn)物分離了蛋白質(zhì)，積層膠和分離膠分別為5%和10%。通過(guò)電印記至PVDF膜(Millipore;Billerica,MA)上，蛋白質(zhì)4'C下轉(zhuǎn)移過(guò)夜。通過(guò)評(píng)價(jià)預(yù)先染色的分子量標(biāo)記轉(zhuǎn)移至所述膜上來(lái)測(cè)定完全轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后，使用于TBST中的5%(w/v)脫脂乳室溫下(RT)封閉所述膜1小時(shí)，然后如下探針檢測(cè)兩個(gè)復(fù)制的印記一個(gè)印記使用抗體7BD-33-11A(5g/mL，于5%脫脂乳的TBST中)探針檢測(cè)，復(fù)制印記使用IgG2a同種型對(duì)照(5g/mL，于5%脫脂乳的TBST中)探針檢測(cè)。在TBST中洗滌印記3次持續(xù)10分種，然后使用辣根HRP-結(jié)合的山羊抗鼠IgG(Fc)(Bio-RadLaboratories;Hercules,CA)室溫培養(yǎng)1小時(shí)。各自使用TBST洗滌3次10分種后按照生產(chǎn)商的說(shuō)明使用TMB過(guò)氧化物酶底物試劑盒(VectorLaboratories;Burlingame，CA)顯景;所述印記。水洗所述印記并使用凝膠記錄系統(tǒng)獲得影像(圖l和2)(Bio-Rad;Hercules,CA)。印記在相同的照相機(jī)焦距、孔徑和圖像采集時(shí)間條件下成像。圖1中，7BD-33-11A明顯結(jié)合至20-80kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，在含有全細(xì)胞溶解產(chǎn)物和全細(xì)胞膜組分的泳道中檢測(cè)了其活性。同種型對(duì)照沒(méi)有結(jié)合至MB-231溶解產(chǎn)物或細(xì)胞膜組分中的任何蛋白質(zhì)，表明對(duì)于7BD-33-11A的結(jié)合是特異性的。圖2說(shuō)明了樣品減少對(duì)7BD-33-11A結(jié)合、Western印跡的影響。只有當(dāng)樣品在非還原條件下(泳道2)制備時(shí)才檢測(cè)該抗體的反應(yīng)性。還原劑(例如DTT或P-巰基乙醇)完全消除了結(jié)合(泳道1)，表明7BD-33-11A的識(shí)別和對(duì)其天然蛋白質(zhì)上表位的結(jié)合依賴于二硫鍵的存在。為確定抗原的分散性質(zhì)(如Western免疫印記所檢測(cè)的)是否歸因于異種糖基化，使用幾種糖苷酶(糖肽酶F、o-聚糖酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和葡萄糖胺酶)處理了全細(xì)胞膜組分，所述糖苷酶除去了特異性糖類基團(tuán)。在處理后，所述樣品進(jìn)行IDSDS-PAGE和Western印記。預(yù)期，如果一些所述酶除去了貢獻(xiàn)了顯著量的由抗體7BD-33-IIA識(shí)別的抗原質(zhì)量的一部分糖類，則可能通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)該差異。圖3顯示，來(lái)自MB-231細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分的糖苷酶處理減少了被識(shí)別抗原的質(zhì)量。這表明7BD-33-llA抗體所識(shí)別的抗原由至少一種糖蛋白組成?？乖蝿?dòng)性的顯著改變僅發(fā)生在幾種酶一起使用時(shí)的事實(shí)表明，至少一些糖類部分由復(fù)合N聯(lián)糖類組成。盡管使用糖苷酶對(duì)膜的處理導(dǎo)致分子量改變，但其沒(méi)有降低結(jié)合的強(qiáng)度。這表明抗體主要結(jié)合至糖蛋白的多肽部分。實(shí)施例2由7BD-33-11A結(jié)合的抗原的鑒定本實(shí)施例具體的數(shù)據(jù)之前已經(jīng)在S.N.10/810,751中描述，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文。1.0來(lái)自MB-231全細(xì)胞膜組分的抗原的免疫沉淀使用適當(dāng)體積的1X裂解緩沖液(50mMTrispH7.4，150mMNaCl，1%TritonX-100，0.02%跳,2mM原釩酸鈉，50mM氟化鈉，和蛋白酶抑制劑雞尾酒(RocheDiagnostics,Manheim，Germany))并使用適當(dāng)體積的2XR工PA緩沖液(50mMTrispH7.4，150mMNaCl，1.0%牛膽酸鈉，0.2%SDS，1%TritonX-100和0.02%NaN3)稀釋全細(xì)胞膜提取物(5mg全蛋白)至1mg/mL最終蛋白質(zhì)濃度，以獲得最終1XRIPA緩沖液的濃度。所述提取物預(yù)先經(jīng)蛋白質(zhì)G-Sepharose珠(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)于4°C下清潔2小時(shí)。移出全細(xì)胞膜提取物并添加BSA原液(IOmg/mL)至0.5mg/mL的最終BSA濃度。在提取物被預(yù)先清潔的同時(shí)，使用1mL的0.5mg/mL的BSA通過(guò)在4°C下保溫來(lái)封閉抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)G-S印harose珠(60g抗體化學(xué)交聯(lián)至30^1蛋白質(zhì)GS印harose)，也持續(xù)2小時(shí)。封閉后，抗體結(jié)合的珠經(jīng)lxRIPA緩沖液洗滌兩次，持續(xù)5分鐘。然后將抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)G-S印harose珠添加至含有全細(xì)胞膜提取物的BSA，在end-over-end振蕩器上于4。C下保溫3小時(shí)。經(jīng)fC下20，000g離心10秒鐘后，移出并棄掉未結(jié)合的組分，所述珠洗滌3次，持續(xù)5分鐘，每洗滌歩驟使用1mL的RIPA緩沖液。然后所述珠用1.5mL的PBS沖洗一次。使用7BD-33-11A結(jié)合的蛋白質(zhì)GS印harose進(jìn)行如上所述免疫沉淀(IP)，其與其中蛋白質(zhì)G—Sepharose珠與IgG2a同禾中型對(duì)照(BDBiosciences,SanDiego，CA)化學(xué)交聯(lián)的類似IP平行進(jìn)行。該步驟的進(jìn)行實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)至免疫復(fù)合體的非特異性結(jié)合的評(píng)價(jià)。經(jīng)完全排出PBS后，所述珠于4(^1非還原樣品緩沖液中煮沸，樣品通過(guò)1DSDS-PAGE分析，隨后一部分膠進(jìn)行Western免疫印跡，使用CoomassieColloidalBlue染色剩余部分的膠。4(^1，部分(8pl)上樣至SDS-PAGE用于Western印跡，剩余部分(32pl)上樣至同樣膠的分離泳道，用于CoomassieColloidalBlue的蛋白質(zhì)染色。指定用于蛋白質(zhì)染色的凝膠部分使用CoomassieColloidalBlue染料浸泡過(guò)夜。指定用于Western印跡的凝膠部分在320mA下轉(zhuǎn)膜2小時(shí)至PVDF膜，使用去離子水沖^先使用5%乳的TBST室溫下封閉1小時(shí)，然后使用7BD-33-llA(于5%乳的TBST溶液中)4。C保溫過(guò)夜。印跡在TBST中洗滌3次，持續(xù)10分鐘，并使用HRP-結(jié)合的Fc-特異性山羊抗鼠IgG(1:5000)在5%乳的TBST中室溫保溫1小時(shí)。然后印跡經(jīng)洗滌3次持續(xù)10分鐘，并使用TMB過(guò)氧化物酶底物試劑盒根據(jù)包裝說(shuō)明書(shū)顯影。如圖4中所顯示的，Western免疫印跡和CoomassieColloidalBlue染色的凝膠凝膠成一排，使用分子量標(biāo)記作為參考。使用CoomassieColloidalBlue染色的主條帶和與Western印跡上7BD-33-11A反應(yīng)的主條帶成一排。這部分在圖4中突出顯示(矩形插入物)。2.0肽作圖，和通過(guò)質(zhì)譜的抗原鑒定通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，然后將與Western印跡上最強(qiáng)烈反應(yīng)性成一排的CoomassieColloidalBlue染色凝膠上的條帶切出，并使用可商業(yè)獲得的試劑盒(Pierce,Rockford，IL)進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消H消化液的小份在SELDI-T0FCiphergenPBSIIc讀數(shù)器(CiphergenBiosystemsInc.,Freemont，CA)上進(jìn)行質(zhì)譜分析。簡(jiǎn)言之，小份消化液被人工點(diǎn)斑于H4芯片(CiphergenBiosystemsInc.，F(xiàn)reemont,CA)上。干燥后，小份CHCA基質(zhì)(a-氰基4-羥基cinnaminicacid;CiphergenBiosystemsInc.,Freemont,CA)添加至所述芯片的同一斑點(diǎn)上，并使之干燥。然后在PBSIIc讀數(shù)器上分析樣品。來(lái)自同種型對(duì)照泳道和空白凝膠區(qū)上平行區(qū)域的類似大小的條帶使用來(lái)自7BD-33-11AIP的凝膠填料并排處理，以實(shí)現(xiàn)通過(guò)消化7BD-33-11A免疫沉淀的抗原而生成的獨(dú)特肽片段的測(cè)定。使用PROFOUND(可公開(kāi)訪問(wèn)的在線工具，用于使用來(lái)自質(zhì)譜的信息來(lái)檢索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù))檢索獨(dú)特肽片段的質(zhì)量。然后在QSTAR(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity'CA)上對(duì)來(lái)自7BD-33-11AIP消化液的樣品中的獨(dú)特肽進(jìn)行MS/MS分析，所述QSTAR配備了能夠?qū)崿F(xiàn)之前在PBSI工c讀數(shù)器上分析的相同樣品的分析的界面。然后使用MASCOT(可公開(kāi)訪問(wèn)的在線工具，用于使用來(lái)自MS/MS譜的信息來(lái)檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù))分析MS/MS數(shù)據(jù)。圖5是從ProFound檢索得到的表的概要。表明為推定候選的蛋白(具有顯著程度的置信度)的唯一蛋白是CD63。圖6是MASC0T檢索得到的表的概要。經(jīng)鑒定具有高度概率的唯一蛋白質(zhì)是CD63，支持了之前通過(guò)肽圖指紋的推測(cè)鑒定。3.07BD-33-11A抗原ID確認(rèn)通過(guò)測(cè)定已知的抗人類CD63單克隆抗體RFAC4(CymbusBiotechnologyLTD,Hants,UK)andH5C6(BDBiosciences,SanDiego，CA)是否會(huì)與7BD-33-11A免疫沉淀的蛋白質(zhì)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行7BD-33-11A的推定抗原的ID確認(rèn)，反之亦然。通過(guò)來(lái)自誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)細(xì)菌的總?cè)芙猱a(chǎn)物的免疫印跡進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，所述細(xì)菌經(jīng)人類CD63的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)化。通過(guò)IDSDS-PAGE及隨后的Western免疫印跡分析了使用單克隆抗體7BD-33-11ARFAC《H5C6以及使用IgG2a禾口IgGl(BDBiosciences:SanDiego,CA)同種型對(duì)照從MB-231全細(xì)胞膜制備的免疫沉淀物。在復(fù)制凝膠上分析來(lái)自各免疫復(fù)合體樣品的相等部分體積。在電印跡至PVDF膜上后，來(lái)自復(fù)制凝膠的印跡使用單克隆抗體7BD-33-11A、RFAC4、H5C6和IgG2a和IgGl同種型對(duì)照進(jìn)行平行探針檢測(cè)。圖7a描述了交叉IP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中通過(guò)Western免疫印跡分析了由各自測(cè)試單克隆抗體7BD-33-11A和RFAC4所免疫沉淀的物質(zhì)。圖7b顯示了交叉IP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中通過(guò)Western免疫印跡分析了由各自測(cè)試單克隆抗體7BD-33-11A和H5C6所免疫沉淀的物質(zhì)。單克隆抗體7BD-33-llA、RFAC4和H5C5各自與7BD-33-11A免疫沉淀的類似抗原交叉反應(yīng)另外在Western印跡上7BD-33-11A與20-80kDa范圍內(nèi)的RFAC4和H5C6免疫沉淀的類似抗原交叉反應(yīng)，但不與使用同種型對(duì)照抗體制備的免疫復(fù)合體交叉反應(yīng)。使用同種型對(duì)照抗體探針檢測(cè)的斑點(diǎn)是完全陰性的。該數(shù)據(jù)表明7BD-33-11A抗體所識(shí)別的表位包含在CD63抗原內(nèi)。為確定交叉反應(yīng)性是否可歸因于被所有抗體識(shí)別的相同分子，或者其是否歸因于具有類似質(zhì)量的相互作用分子的存在，在增加的緩沖液嚴(yán)緊性條件下(50mMTrispH7.4，1%TritonX-100，和變化的NaCl濃度0、150、500和2000線以及使用上述但含有500mMNaCl的R工PA緩沖液)進(jìn)行了與抗體7BD-33-11A的免疫沉淀。然后通過(guò)Western免疫印跡使用單克隆抗體7BD-33-IIA、H5C6和RFAC4以及使用同種型對(duì)照IgG2a和IgGl探針檢測(cè)所生成的免疫復(fù)合體。圖8顯示了變化的IP條件的嚴(yán)緊性對(duì)免疫復(fù)合體的生成沒(méi)有任何可測(cè)的影響，這表明被抗體7BD-33-11A識(shí)別的分子也被抗體CD63抗體識(shí)別，并且反之亦然。為進(jìn)一步確認(rèn)7BD-33-11A直接結(jié)合至人CD63抗原，通過(guò)Western免疫印跡評(píng)價(jià)了其對(duì)大腸桿菌(Ecoh')溶解產(chǎn)物的反應(yīng)性所述大腸桿菌表達(dá)了含有人類CD63細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(環(huán)EC1和EC2)的重組融合多肽。為此研究，通過(guò)將適當(dāng)?shù)腸DNA片段亞克隆入細(xì)菌表達(dá)載體PGEX-4T-2(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)中而產(chǎn)生了CD63的細(xì)胞外環(huán)(分別為環(huán)1和環(huán)2-EC1和EC2)的GST融合構(gòu)建物。使用全長(zhǎng)人類cDNA作為模板通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(PCR)獲得了編碼所述環(huán)的cDNA片段(克隆MGC-8339，美國(guó)典型菌禾中保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)Manassas,VA)。使用下述PCR引物獲得了編碼EC1環(huán)的cDNA:5'引物(EC1—5，)，5，GCCGTGGGATCCGGGGCACAGCTTGTCCTG3'和i3，引物(EC1—3，)，5'GATGACGAATTCTCACAGAGAGCCAGGGGTAGC3,。使用下述PCR引物獲得了編碼EC2環(huán)的cDNA:5，引物(EC2—5，)，5'GGCTATGGATCCAGAGATAAGGTGATG3，禾口3，引物(EC2_3，)，5'TACCAGAATTCAATTTTTCCTCAGCCAGCC3，。PCR反應(yīng)條件如下2!iL的5'引物(25pmol/^L)，2的3，引物(25pmol，)，0.2jiL的模板DNA(pOTB-CD63,0.76mg/mL)，禾口45.8pL的PCRS叩erMixHighFidelity(Invitrogen,Burlington,ON)。PCR反應(yīng)如下進(jìn)行94°C、5分鐘，隨后30個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)94"C解鏈30秒、55。C退火30秒和72"C延伸1分鐘。亞克隆后，將構(gòu)建物(包括單獨(dú)PGEX-4T-2載體的陰性對(duì)照(沒(méi)有cDNA片段亞克隆入所述載體))轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(株BL-21)。培養(yǎng)來(lái)自各轉(zhuǎn)化的單個(gè)的氨芐西林抗性菌落，并測(cè)序各自的插入cDNA。確認(rèn)所述cDNA序列正確之后，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)各克隆，并通過(guò)添加1mM工PTG(異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷)(Gibco-BRL;Rockville，MD)誘導(dǎo)了GST融合構(gòu)建物的表達(dá)。2小時(shí)的培養(yǎng)后，細(xì)菌培養(yǎng)物在室溫下2000g離心5分鐘。棄掉上清液，并在非還原性SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸細(xì)菌的片狀沉淀。然后如之前所述，通過(guò)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺層積膠和分離膠分別為5%和12%)和Western免疫印跡分析所述樣品。使用7BD-33-11A、H5C6、RFAC4或使用IgG2a同種型對(duì)照探針檢測(cè)印跡膜。圖9描述的結(jié)果表明，7BD-33-11A特異性識(shí)別人類CD63的環(huán)2(氨基酸108-202)(7BD-33-11A探針檢測(cè)的印跡的泳道6)，并不識(shí)別環(huán)1(氨基酸34-52)。兩個(gè)良好表征的抗人類CD63抗體(RFAC4和H5C6)也僅在表達(dá)EC2融合多肽的誘導(dǎo)的大腸桿菌的溶解產(chǎn)物上識(shí)別了類似大小的條帶，該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一歩確認(rèn)了針對(duì)細(xì)菌溶解產(chǎn)物的抗體特異性。所有上述結(jié)果表明，7BD-33-11A識(shí)別并直接結(jié)合至人類CD63，并特異性結(jié)合至包含氨基酸108-202的細(xì)胞外區(qū)域。1A245.6和H460-22-l結(jié)合的抗原的鑒定1.0來(lái)自MB-231全細(xì)胞膜組分的抗原的免疫沉淀使用適當(dāng)體積的1X裂解緩沖液(50mMTrispH7.4，150mMNaCl,1%TritonX-100，0.02%Na化，2mM原釩酸鈉，50mM氟化鈉，和蛋白酶抑制劑雞尾酒(RocheDiagnostics,Manheim，Germany))并使用適當(dāng)體積的2XRIPA緩沖液(50mMTrispH7.4，150mMNaCl，1.0%牛膽酸鈉，0.2%SDS，1%TritonX-100和0,02%NaN3)稀釋全細(xì)胞膜提取物(lmg全蛋白)，以獲得最終1XRIPA緩沖液的濃度。所述提取物預(yù)先經(jīng)蛋白質(zhì)G-S印harose珠(AmershamBiosciences,Uppsala，Sweden)于4匸下清潔2小時(shí)。移出全細(xì)胞膜提取物并添加BSA原液(IOmg/mL)至.5mg/mL的最終BSA濃度。在提取物被預(yù)先清潔的同時(shí)，使用1mL的0.5mg/mL的BSA通過(guò)在4。C下保溫來(lái)封閉抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)G-S印harose珠(60g抗體化學(xué)交聯(lián)至30pl蛋白質(zhì)GS印harose)，也持續(xù)2小時(shí)。封閉后，抗體結(jié)合的珠經(jīng)lxRIPA緩沖液洗滌兩次，持續(xù)5分鐘。然后將抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)G-S印harose珠添加至含有全細(xì)胞膜提取物的BSA，在end-over-end振蕩器上于4。C下保溫3小時(shí)。經(jīng)4。C下20，000g離心10秒鐘后，移出并棄掉未結(jié)合的組分，所述珠洗滌3次，持續(xù)5分鐘，每洗滌步驟使用1mL的RIPA緩沖液。然后所述珠用1.5mL的PBS沖洗一次。使用蛋白質(zhì)GS印harose結(jié)合的單克隆抗體7BD-33-11A、1A245.6、H460-22-1、IgGl同種型對(duì)照、IgG2a同種型對(duì)照和H460-16-2(后者是已知特異性識(shí)別CD44的良好表征的抗體)平行進(jìn)行免疫沉淀(IP)。經(jīng)完全排出PBS后，所述珠于40^1非還原樣品緩沖液中煮沸，樣品通過(guò)1DSDS-PAGE以及隨后的Western免疫印跡分析。復(fù)制膠在320mA下轉(zhuǎn)膜2小時(shí)至PVDF膜。然后所述膜用去離子水沖洗，使用5%乳的TBST室溫下封閉1小時(shí)。然后復(fù)制膜使用單克隆抗體RFAC4(抗CD63)、1A245.6、H460-22-1、H460-16-2以及使用同種型對(duì)照IgGl和IgG2a于5%乳的TBST中4°C保溫過(guò)夜。印跡在TBST中洗漆3次，持續(xù)10分鐘，并使用服P-結(jié)合的Fc-特異性山羊抗鼠IgG(1:5000稀釋)在5%乳的TBST中室溫保溫1小時(shí)。然后印跡經(jīng)洗滌3次持續(xù)10分鐘，并根據(jù)有關(guān)HRP的TMB底物標(biāo)準(zhǔn)程序顯影。如圖10中顯示的，使用抗體RFAC4(抗CD63)、1A245.6和H460-22-1探針檢測(cè)的印跡顯示了同樣的反應(yīng)性模式。所有三個(gè)抗體與抗體7BD-33-IIA、H460-22—l禾口1A245.6(分別為泳道3、4和5)免疫沉淀的物質(zhì)交叉反應(yīng)，所述物質(zhì)反應(yīng)性特征為表觀分子量范圍從20至80kDa。在使用未分級(jí)的全細(xì)胞膜清潔劑提取物上樣的泳道(泳道l)上也觀察到了類似的反應(yīng)性。另外，這些抗體沒(méi)有一個(gè)與被抗CD44抗體H460-16-2(泳道2)免疫沉淀的物質(zhì)交叉反應(yīng)，后者沒(méi)有識(shí)別被不同于H460-16-2的抗體(泳道3、4和5)免疫沉淀的物質(zhì)。在使用同種型對(duì)照抗體探針檢測(cè)的復(fù)制印跡上沒(méi)有檢測(cè)到非特異性的交叉反應(yīng)性。因此，這些結(jié)果強(qiáng)烈表明抗體1A245.6和H460-22-1識(shí)別了與抗體RFAC4和7BD-33-11A一樣的抗原分子CD63。2.01A245.6和H460-22-l抗原ID確認(rèn)為確認(rèn)1A245.6和H460-22-1直接結(jié)合至人CD63抗原，通過(guò)Western免疫印跡評(píng)價(jià)了其對(duì)大腸桿菌溶解產(chǎn)物的反應(yīng)'想所述大腸桿菌表達(dá)了含有人類CD63細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(環(huán)EC1和EC2)的重組融合多肽。為此研究，通過(guò)將適當(dāng)?shù)腸DNA片段亞克隆入細(xì)菌表達(dá)載體PGEX-4T-2(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)中而產(chǎn)生了CD63的細(xì)胞外環(huán)(分別為環(huán)1和環(huán)2-EC1和EC2)的GST融合構(gòu)建物。使用全長(zhǎng)人類cDNA作為模板通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(PCR)獲得了編碼所述環(huán)的cDNA片段(克隆MGC-8339，美國(guó)典型菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)Manassas,VA)。使用卩述PCR引物獲得了編碼ECl環(huán)的cDNA:5'引物(ECl—5，),5'GCCGTGGGATCCGGGGCACAGCTTGTCCTG3，和3，引物(ECl—3，)，5，GATGACGAATTCTCACAGAGAGCCAGGGGTAGC3,。使用下述PCR引物獲得了編碼EC2環(huán)的cDNA:5，引物(EC2—5')，5'GGCTATGGATCCAGAGATAAGGTGATG3，禾口3'引物(EC2—3')，5'TACCAGAATTCAATTTTTCCTCAGCCAGCC3'。PCR反應(yīng)條件如下2的5'引物(25pmol/fiL)，2|iL的3'引物(25pmol/VL)，0.2(jL的模板DNA(p0TB-CD63,0.76mg/mL)，禾口45.8pL的PCRSuperMixHighFidelity(Invitrogen)。PCR反應(yīng)如下進(jìn)行94°C、5分鐘，隨后30個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)94'C解鏈30秒、55"C退火30秒和72"C延伸1分鐘。亞克隆后，將構(gòu)建物(包括單獨(dú)PGEX-4T-2載體的陰性對(duì)照(沒(méi)有cDNA片段亞克隆入所述載體))轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(株BL-21)。培養(yǎng)來(lái)自各轉(zhuǎn)化的單個(gè)的氨芐西林抗性菌落，并測(cè)序各自的插入cDNA。確認(rèn)所述cDNA序列正確之后，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)各克隆，并通過(guò)添加1mMIPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)(Gibco-BRL;Rockville，MD)誘導(dǎo)了GST融合構(gòu)建物的表達(dá)。2小時(shí)的培養(yǎng)后，細(xì)菌培養(yǎng)物在室溫下2000g離心5分鐘。棄掉上清液，并在非還原性SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸細(xì)菌的片狀沉淀。然后如之前所述，通過(guò)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺層積膠和分離膠分別為5%和12%)和Western免疫印跡分析所述樣品。使用1A245.6、H460-22-1、RFAC4、H460-16-2以及IgGl和IgG2a同種型對(duì)照探針檢測(cè)印跡膜。所有抗體使用濃度為5pg/mL圖11描述的結(jié)果表吸1A245.6和H460-22-1特異識(shí)別人類CD63的環(huán)2(氨基酸108-202)(1A245.6和H460-22-l探針檢測(cè)的印跡的泳道6)，并不識(shí)別環(huán)l(氨基酸34-52)，單獨(dú)的GST載體也不識(shí)別。良好表征的抗人類CD63抗體(RFAC4)也僅在表達(dá)GST-EC2融合多肽的大腸桿菌的溶解產(chǎn)物上識(shí)別了類似大小的條帶，該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一歩確認(rèn)了針對(duì)細(xì)菌溶解產(chǎn)物的抗體特異性。另外，識(shí)別人類CD44(H460-16-2)的抗體沒(méi)有識(shí)別該實(shí)驗(yàn)中表達(dá)的任何重組蛋白質(zhì)。所有上述結(jié)果表明，1A245,6和H460-22-1識(shí)別并直接結(jié)合至人類CD6a并特異性結(jié)合至包含氨基酸108-202的細(xì)胞外區(qū)i4實(shí)施例4如S.N.10/348，231、S.N.10/603，006、S.N.10/810，751和S.N.10/891,866(其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)中有關(guān)雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-llA和1A245.6以及本文有關(guān)雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1所描述的，所述三個(gè)雜交瘤克隆都根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBlvd.，Manassas,VA20110-2209)，H460-22-1保藏日為2002年9月4日，保藏號(hào)為PTA-4622;1A245.6和7BD-33-11A保藏日為2003年1月8日，保藏號(hào)分別為PTA-4889和PTA-4890。根據(jù)37CFR1.808，保藏人保證所有對(duì)公眾獲取所述保藏物質(zhì)的限制將在專利授權(quán)時(shí)永久取消。抗體生成通過(guò)在CL-1000搖瓶(BDBiosciences,Oakville，ON)培養(yǎng)雜交瘤(每周兩次收集并再接種)而生成了H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A單克隆抗體。使用ProteinGS印harose4FastFlow(AmershamBiosciences,Baied，Urf6，QC)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)抗體純化程序純化了抗體。如之前S.N.10/348,231、S.N.10/603，006、S.N.10/810，751禾口S.N.10/891,866(其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)中有關(guān)雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-IIA和1A245.6所描述的以及本文有關(guān)雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1所描述的，所述三個(gè)抗體再細(xì)胞毒性測(cè)定中與許多陽(yáng)性(抗Fas(E0S9.1，IgM，k，20微克/mL，eBioscience,SanDiego，CA)、抗Her2/neu(IgGl，k，10微克/mL，InterMedico,Markham，0N)、抗EGFR(C225，IgGl,k,5微克/mL,Cedarlane，Hornby,ON)、放線菌酮(100微摩爾，Sigma，Oakville,ON)、NaN3(0,1%，Sigma，Oakville,ON))和陰性(107.3(抗TNP，IgGl，k，20微克/mL，BDBiosciences,Oakville,ON)、G155-178(抗TNP，IgG2a，k，20微克/mL，BDBiosciences,Oakville,ON)、MPC-11(抗原特異性未知，IgG2b,k，20微克/mL)，J606(抗果聚糖，IgG3，k，20微克/mL)，IgG緩沖液(2%))對(duì)照相比較(表l和2)。測(cè)試了乳腺癌(MB-231，MB-468，MCF-7)、結(jié)腸癌(HT-29，SW1116,SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR)、前列腺癌(PC-3)、黑素瘤(A2058,A357和A549)和非癌(Hs578.Bst，CCD27sk，Hs888Lu)細(xì)胞系(全部來(lái)自ATCC，Manassas，VA)。從MolecularProbes(Eugene,OR)獲得存活/死亡細(xì)胞毒性測(cè)定法。所述測(cè)定根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，且具有下述改變。細(xì)胞在檢測(cè)前以預(yù)定的適當(dāng)密度鋪板。2天后，純化的抗體或?qū)φ障♂屓肱囵B(yǎng)基，然后將100轉(zhuǎn)移至細(xì)胞板并于5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)5無(wú)然后倒空所述板并吸干。含有MgCL和CaCl2的室溫DPBS經(jīng)由多孔道擠壓瓶分散入各板孔，輕打三次，倒空并然后吸千。稀釋于含有MgCL和CaCl2的DPBS的50pL鈣熒光素染料被添加至各板孔并在37XTF于5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘。在Perkin-ElmerHTS7000熒光讀板器中讀板，并在MicrosoftExcel中分析數(shù)據(jù)，結(jié)果制成表1和2。數(shù)據(jù)表示了四次實(shí)驗(yàn)(重復(fù)三次測(cè)試)的平均，并以下述方式定性表示4/4實(shí)驗(yàn)大于閾值細(xì)胞毒性(+++)，3/4實(shí)驗(yàn)大于閾值細(xì)胞毒性(++)，2/4實(shí)驗(yàn)大于閾值細(xì)胞毒性(+)。表l中未標(biāo)記的細(xì)胞表示不一致的或作用小于閾值細(xì)胞毒性。7BD-33~11A抗體選擇性地在乳腺和前列腺腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)了細(xì)胞毒性，而對(duì)非轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞沒(méi)有毒性。7BD-33-11A和1A245.6對(duì)前列腺癌細(xì)胞系表現(xiàn)出比對(duì)照抗Fas或抗EGFR抗體更大的殺傷。H460-22-1對(duì)MB-231細(xì)胞系表現(xiàn)出比抗Fas或抗EGFR更大的殺傷?；瘜W(xué)毒性劑誘導(dǎo)了其預(yù)期細(xì)胞毒性，而被包括用于比較的許多其他抗體也如預(yù)期的進(jìn)行了給定的生物細(xì)胞測(cè)定限制?？傊?，顯示了7BD-33-11A、1A245.6和H460-22-l抗體對(duì)許多癌細(xì)胞類型具有細(xì)胞毒活性。這些抗體的活性是選擇性的，因?yàn)椴⒎撬械陌┘?xì)胞類型是敏感的。進(jìn)一步地，所述抗體表現(xiàn)出功能特異性，因?yàn)槠錄](méi)有對(duì)非癌細(xì)胞類型產(chǎn)生細(xì)胞毒性，這在治療環(huán)境中是重要的因素。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACS，參考S.N.10/348，231、S.N.10/603,006和S.N.10/810,751，其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)評(píng)價(jià)了7BD-33-llA對(duì)上述名單的癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞系以及對(duì)下述其他癌細(xì)胞系的結(jié)合結(jié)腸(L0V0)、胰臟(BxPC-3)、卵巢(ES-2，0CC-1)和前列腺(DU-145)，以及下述其他正常細(xì)胞系(CCD-112)。還通過(guò)FACS評(píng)價(jià)了1A245.6(參考S.N.10/348，231、S.N.10/603,006、S.N.10/810，751和S.N.10/891,866,其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)和H460-22-1對(duì)上述名單的癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞系的結(jié)合。通過(guò)開(kāi)始使用DPBS(不含&++和》^++)洗滌細(xì)胞單層，使細(xì)胞準(zhǔn)備好用于FACS。然后使用細(xì)胞離解緩沖液(INVITROGEN，Burlington,ON)使細(xì)胞從其37。C細(xì)胞培養(yǎng)板上移出。經(jīng)離心和收集后，細(xì)胞重懸于4。C的Dulbecco，s磷酸緩沖鹽水(含有MgCl2、CaCl2和2%或259&的胎牛血清(FBS))(洗滌介質(zhì))并計(jì)數(shù)，稀釋至適當(dāng)細(xì)胞密度離心以沉淀所述細(xì)胞并重懸于含有20pg/mL的7BD-33-11A或?qū)φ湛贵w(同種型對(duì)照或抗EGFR)的染色介質(zhì)(含有MgCL和CaCl2+/—2%FBS的DPBS),冰上30分鐘。在添加AlexaFluor488結(jié)合的二次抗體之前，使用洗滌介質(zhì)洗滌細(xì)胞一次。然后將AlexaFluor488結(jié)合的二次抗體添加至染色介質(zhì)，持續(xù)20至30分鐘。然后最后洗滌一次細(xì)胞，并重懸于含有1pg/mL碘化丙啶或1.5%多聚甲醛的染色介質(zhì)中。通過(guò)使用CellQuest軟件(BDBiosciences)在FACScan上掃描樣品評(píng)價(jià)了細(xì)胞的流式細(xì)胞采集。通過(guò)調(diào)節(jié)FSC和SSC檢測(cè)器上電壓和幅度獲得而設(shè)置了前散射(FSC)和側(cè)散射(SSC)。通過(guò)使用純化的同種型對(duì)照抗體并隨后AlexaFluor488結(jié)合的二次抗體染色細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)三種熒光通路的檢測(cè)器(FL1、FL2和FL3)，以便細(xì)胞具有一致的峰，且中位熒光強(qiáng)度約1-5單位。通過(guò)門控FSC和碘化丙啶排除(當(dāng)使用時(shí))獲得了活細(xì)胞。對(duì)于每個(gè)樣品，獲得了約10，000個(gè)活細(xì)胞用于分析，結(jié)果表示于表3、4和5。表3、4和5分別列出了7BD-33-llA、1A245.6和H460-22-l高于同種型對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度倍增，并定性表示為5(_);5至50(+);50至100(++);高于IOO(+++)并且在括號(hào)內(nèi)，染色細(xì)胞的百分比。7BD-33-11A、1A245.6和H460-22-1抗體的代表性直方圖分別匯編為圖12、13和14。7BD-33-11A表現(xiàn)了對(duì)乳腺(MB-231和MCF-7)、結(jié)腸(HT-29、SW1116和SW520)、肺、卵巢、胰臟和前列腺(PC-3)來(lái)源的癌細(xì)胞系的相似結(jié)合，以及對(duì)乳腺(MB-468)、結(jié)腸(L0V0)和前列腺(DU-145)癌細(xì)胞系之一的不同結(jié)合。1A245.6表現(xiàn)了對(duì)乳腺(MB-231、MB-468和MCF-7)、結(jié)腸(SW1116和SW520)、肺、卵巢和前列腺來(lái)源的癌細(xì)胞系的相似結(jié)合，以及對(duì)結(jié)腸(HF29)癌細(xì)胞系之一的不同結(jié)合。H460-22-l表現(xiàn)了對(duì)受試癌細(xì)胞系的相似結(jié)合。還存在7BD-33-IIA、1A245.6和H460-22-1對(duì)非癌細(xì)胞的結(jié)合，然而，所述結(jié)合沒(méi)有產(chǎn)生細(xì)胞毒性。這進(jìn)一步證明了結(jié)合不必然預(yù)示其同族抗原的抗體連接的結(jié)果，并且是非顯而易見(jiàn)的發(fā)現(xiàn)。這表明不同細(xì)胞中的抗體連接環(huán)境決定了細(xì)胞毒性，而非僅僅抗體結(jié)合。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>實(shí)施例5正常人組織染色進(jìn)行了工HC研究來(lái)表征7BD-33-IIA、H460-22-1和1A245.6抗原在人體內(nèi)的分布。之前已經(jīng)討論了關(guān)于7BD-33-11A(S,N.10/603,006、S.N,10/810，751，其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)和1A245.6(S.N.10/603，006，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)的這些數(shù)據(jù)。之前進(jìn)行了IHC優(yōu)化研究，以確定進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的條件。如上所述生成并純化了7BD-33-llA、H460-22-1和1A245.6單克隆抗體。組織切片通過(guò)在烘箱中58"C干燥1小時(shí)而被去石蠟化，并各自在染色缸(Coplinjars)中通過(guò)浸入二甲苯5次(持續(xù)4分鐘)而脫蠟。通過(guò)一系列分級(jí)乙醇洗滌液(100%_75%)處理后，所述切片在水中重新水合。載玻片浸入10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6)(Dako，Toronto,Ontario),然后各自在高、中和低功率設(shè)置下微波5分鐘，最后浸入冷的PBS。然后將載玻片浸入3%的過(guò)氧化氫溶液6分鐘，PBS洗滌三次，每次5分鐘，干燥，用Universal封閉溶液(Dako，Toronto,Ontario)室溫處理5分鐘。7BD-33-11A、1A245.6、H460-22-l、單克隆鼠抗波形蛋白(Dako，Toronto,Ontario)或同種型對(duì)照抗體(導(dǎo)向黑曲霉(As/er^7A/sm>er)葡萄糖氧化酶，一種在哺乳動(dòng)物組織中既不存在也不可誘導(dǎo)的酶；Dako,Toronto,Ontario)稀釋于抗體稀釋緩沖液(Dako，Toronto,Ontario)至其工作濃度(各抗體為5|ig/mL)并在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。所述載玻片經(jīng)PBS洗滌3次每次5分鐘。使用所提供的服P結(jié)合的二次抗體(DakoEnvisionSystem,Toronto,Ontario)室溫檢測(cè)/顯像原發(fā)性抗體的免疫反應(yīng)性30分鐘。該步驟后，使用PBS洗滌載玻片3次，每次5分鐘，并通過(guò)添加用于免疫過(guò)氧化物酶染色的DAB(3，3'-二氨基聯(lián)苯四氫氯化物，Dako，Toronto,Ontario)色原體底物溶液室溫下進(jìn)行顏色反應(yīng)10分鐘。自來(lái)水洗滌載玻片終止了顯色反應(yīng)。使用Meyer'sHematoxylin(SigmaDiagnostics,Oakville,ON)復(fù)染之后，所述載玻片使用分級(jí)乙醇(75-100%)脫水，并使用二甲苯清潔。使用封固劑(DakoFaramount，Toronto,Ontario)封蓋了載玻片。使用Axiovert200(ZeissCanada,Toronto,ON)顯微鏡檢查載玻片，并且使用NorthernEclipseImagingSoftware(Mississauga，0N)獲得并儲(chǔ)存了數(shù)字圖像。組織病理學(xué)家對(duì)結(jié)果進(jìn)行審閱、評(píng)分和解釋。使用人正常器官組織陣列(Imgenex，SanDiego,CA)進(jìn)行了抗體對(duì)59種正常人組織的結(jié)合。表6總結(jié)了正常人組織陣列的7BD-33-llA、H460-22-1和1A245.6的染色結(jié)果。根據(jù)表，有3類組織染色。一組組織是完全陰性的。對(duì)于7BD-33-IIA，這些組織包括正常的皮膚、腦、卵巢、胸腺、小腸、食管、心臟(圖15A)、膽囊和淋巴結(jié)。對(duì)于H460-22-l，完全陰性的組織包括皮下脂肪和腦(圖15C)。對(duì)于1A245.6，完全陰性的組織包括皮膚、皮下脂肪、食管和腦(圖15B)。第二組包括了表現(xiàn)出陽(yáng)性染色的組織。對(duì)于7BD-33-IIA，這些包括肝和胰腺。使用該抗體，扁桃體具有最強(qiáng)的染色。對(duì)于H460-22-1，陽(yáng)性染色發(fā)生于肝、心臟、睪丸、甲狀腺、腎上腺和子宮肌層。類似于H460-22-1，1A245.6陽(yáng)性染色發(fā)生于肝、心臟、睪丸、甲狀腺、腎上腺和子宮肌層。與7BD-33-11A—樣，H460-22-1和1A245.6對(duì)扁桃體的染色最^i第三組組織包括其中在組織切片中為陽(yáng)性的組織，但不限于侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞，例如胃，對(duì)于7BD-33-IIA、1A245.6和H460-22-1(分別為圖16A和B和C)。應(yīng)該注意，7BD-33-IIA抗原不存在于幾種重要器官的細(xì)胞上，包括腎、心(圖15A)和肺?？傊cH460-22-l和1A245.6相比較，7BD-33-11A結(jié)合至正常人組織的較小亞型且在陽(yáng)性組織中的結(jié)合為弱至中等H460-22-1和1A245.6染色雖然更廣泛，但通常在強(qiáng)度上為弱至中等。這些結(jié)果表明，7BD-33-11A的抗原不廣泛表達(dá)于正常組織上，且所述抗體將特異性結(jié)合至有限數(shù)目的人類組織。另外，H460-22-l和1A245.6的抗原除了存在于心臟和肝中以外，限于上皮細(xì)胞和侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。表6:H460-22-1、1A245.6和7BD-33-llA在正常人組織陣列上的IHC概要<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>縮寫(xiě)NR:切片不是代表性的，CS:切片是完全脫去的，*:切片最初在基底層著色，切片具有外源細(xì)胞質(zhì)背景染色，胃腔(非胃體)，僅卵巢間質(zhì)如10/810，751中描述和討論的(其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)，因?yàn)?BD-33-llA抗原如前通過(guò)生物化學(xué)方法確定為CD6a所以研究比較了7BD-33-11A與兩種導(dǎo)向CD63(RFAC4和H5C6)的抗體。使用人類正常器官組織陣列(Clinomics，Watervliet，NY)進(jìn)行了抗體對(duì)24種正常人組織的結(jié)合。所有原發(fā)性抗體(7BD-33-11A;RFAC4(CymbusBiotechnologyLtd.,Hants,UK)和H5C6抗CD63(BDPharMingen，Oakville，ON);和鼠IgGl陰性對(duì)照(Dako，Toronto,ON))稀釋于抗體稀釋緩沖液(Dako,Toronto,ON)至濃度為5|ig/mL(在之前的優(yōu)化步驟發(fā)現(xiàn)是最佳濃度)。通過(guò)生產(chǎn)商已知陰性對(duì)照抗體對(duì)于所有哺乳動(dòng)物組織都是陰性的。有關(guān)IHC的程序如上所述。組織切片通過(guò)在烘箱中58。C干燥1小時(shí)而被去石蠟化，并各自在染色缸中通過(guò)浸入二甲苯5次(持續(xù)4分鐘)而脫蠟。通過(guò)一系列分級(jí)乙醇洗滌液(100%_75%)處理后，所述切片在水中重新水合。載玻片浸入10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6)(Dako，Toronto,Ontario),然后各自在高、中和低功率設(shè)置下微波5分鐘，最后浸入冷的PBS。然后將載玻片浸入3%的過(guò)氧化氫溶液6分鐘，PBS洗滌三次，每次5分鐘，干燥，用Universal封閉溶液(Dako，Toronto,Ontario)室溫處理5分鐘。7BD-33-11A、1A245.6、H460-22-1、單克隆鼠抗波形蛋白(Dako，Toronto,Ontario)或同種型對(duì)照抗體(導(dǎo)向黑曲霉葡萄糖氧化酶，一種在哺乳動(dòng)物組織中既不存在也不可誘導(dǎo)的酶；Dako，Toronto,Ontario)稀釋于抗體稀釋緩沖液(Dako，Toronto,Ontario)至其工作濃度(各抗體為5嗎/mL)并在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。所述載玻片經(jīng)PBS洗滌3次，每次5分鐘。使用所提供的服P結(jié)合的二次抗體(DakoEnvisionSystem,Toronto,Ontario)室溫檢測(cè)/顯像原發(fā)性抗體的免疫反應(yīng)性30分鐘。該步驟后，使用PBS洗滌載玻片3次，每次5分鐘，并通過(guò)添加用于免疫過(guò)氧化物酶染色的DAB(3，3'-二氨基聯(lián)苯四氫氯化物，Dako，Toronto,Ontario)色原體底物溶液室溫下進(jìn)行顏色反應(yīng)10分鐘。自來(lái)水洗滌載玻片終止了顯色反應(yīng)。使用Meyer'sHematoxylin(SigmaDiagnostics,0akville，0N)復(fù)染之后，所述載玻片使用分級(jí)乙醇(75-100%)脫水，并使用二甲苯清潔。使用封固劑(DakoFaramount，Toronto,Ontario)封蓋了載玻片。使用Axiovert200(ZeissCanada,Toronto,ON)顯微鏡檢査載玻片，并且使用NorthernEclipse成像軟件(Mississauga，ON)獲得并儲(chǔ)存了數(shù)字圖像。組織病理學(xué)家對(duì)結(jié)果進(jìn)行審閱、評(píng)分和解釋。表7顯示了正常人組織測(cè)試陣列的7BD-33-11A和RFAC4和H5C6抗CD63染色結(jié)果的概要。使用7BD-33-11A的組織染色類似于之前描述(S.N.10/603,006，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)。應(yīng)該再次注意，7BD-33-IIA顯示了對(duì)各種細(xì)胞類型的限制結(jié)合，但結(jié)合至侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。相互比較，RFAC4和H5C6抗體顯示了類似的染色模式。然而，RFAC4和H5C6的染色模式非常不同于7BD-33-llA所觀察到的染色模式。特別地，RFAC4和H5C6抗體都結(jié)合至廣泛的正常組織，通常在其中7BD-33-llA也是陽(yáng)性的組織中具有更高的染色強(qiáng)度，并不僅結(jié)合至侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，還結(jié)合至多數(shù)組織中的上皮細(xì)胞。對(duì)7BD-33-11A呈陽(yáng)性的組織對(duì)RFAC4或H5C6抗CD63抗體也呈陽(yáng)性。對(duì)7BD-33-11A呈陰性的組織一般對(duì)RFAC4或H5C6不呈陰性。這些結(jié)果表明7BD-33-11A結(jié)合至由RFAC4或H5C6抗CD63抗體識(shí)別的組織的較小亞型，并且在組織中的染色強(qiáng)度也常常是較小。這些結(jié)果顯示7BD-33-11A的表位不是廣泛表達(dá)于正常組織上，并且所述抗體特異性結(jié)合至有限數(shù)目的人類組織。這也支持了7BD-33-IIA導(dǎo)向CD63表位的生化證據(jù)，盡管不同于用于這些IHC研究的RFAC4或H5C6抗體所識(shí)別的表位。表7:人類正常組織上斷AC4和H5C6抗CD63與7BD-33-llA的IHC的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實(shí)施例6人類乳腺腫瘤組織染色如S.N.10/603，006、S.N.10/810，751(其各自內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)中部分描述和討論的，進(jìn)行了IHC研究以確定7BD-33-llA、H460-22-1和1A245.6抗原與人類乳腺癌之間的癌關(guān)聯(lián)，以及抗體是否可能識(shí)別人類癌。比較了波形蛋白(陽(yáng)性對(duì)照)或抗黑曲霉葡萄糖氧化酶抗體(一種在哺乳動(dòng)物組織中既不存在也不可誘導(dǎo)的酶)(陰性對(duì)照)。使用全部3種抗體染色了來(lái)自50名乳腺癌患者的乳腺癌組織陣列和來(lái)自乳腺癌患者的非瘤乳腺組織的IO個(gè)樣品(ImgenexCorporation,SanDiego,CA)。提供了每名患者的年齡、性別和診斷。遵循了實(shí)施例5的IHC程序。所有抗體的在5Hg/mL的工作濃度下使用。表8a提供了該陣列的7BD-33-IIA、H460-22-l和1A245.6抗體染色的概要。使用7BD-33-11A檢測(cè)了另外48個(gè)乳腺癌(ImgenexCorporation)和9個(gè)正常乳腺組織樣品(顯示于表8b)。7BD-33-11A染色的全部98個(gè)切片的匯總結(jié)果參考表11?？傮w上，98名受試患者的37%對(duì)7BD-33-11A抗原呈陽(yáng)性(圖17A)，而50名受試患者分別有92。％和98%對(duì)H460-22-l和1A245.6呈陽(yáng)性(分別為圖17C和B)。對(duì)于7BD-33-IIA，來(lái)自乳腺癌患者的19個(gè)正常乳腺組織樣品中有0個(gè)呈陽(yáng)性(圖18A)。相反，對(duì)于H460-22-1和1A245.6,10個(gè)正常乳腺組織樣品中有9個(gè)呈陽(yáng)性。然而，多數(shù)情況下，染色是歸因于侵潤(rùn)性成纖維細(xì)胞(分別為圖18C和B)。如表ll中所示，存在7BD-33-11A對(duì)雌激素受體陰性乳腺癌、黃體酮陽(yáng)性乳腺癌和晚期乳腺癌的較高結(jié)合趨勢(shì)(T3&T4)。關(guān)于1A245.6，雌激素和黃體酮受體狀態(tài)之間明顯沒(méi)有關(guān)聯(lián)，但組織染色的強(qiáng)度確實(shí)表現(xiàn)出與較高的腫瘤期相關(guān)(表9)。稍高數(shù)目的H460-22-1陽(yáng)性組織也是雌激素和黃體酮受體陽(yáng)性的，并且趨勢(shì)5是較高的腫瘤期具有較高的陽(yáng)性表達(dá)(表10)。7BD-33-llA、H460-22-1和1A2425.6染色對(duì)于癌細(xì)胞是特異性的，染色同時(shí)發(fā)生在細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。7BD-33-llA、H460-22-l和1A245.6的染色模式顯示在患者樣品中，抗體對(duì)于惡性細(xì)胞是高度特異性的，并且各自的抗原存在于細(xì)胞膜上，從而使其成為引人注目的藥物靶。表8a:H460-22-1、1A245.6和7BD-33-11A在50個(gè)人乳腺腫瘤和10個(gè)正常組織切片上的IHC概要<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>縮寫(xiě)M:線粒體染色，C:細(xì)胞質(zhì)染色表8b:有關(guān)7BD-33-11A的48個(gè)人類乳腺癌腫瘤和9個(gè)正常組織切片的IHC概要<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表9<table>complextableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表10<table>complextableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>如S.N.10/810,751(其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)中描述和討論的使用7BD-33-11A和RFAC4和H5C6抗CD63和c-erbB-2抗Her2(A0485，DakoCytomation，Mississagua，ON)抗體進(jìn)行了比較。使用了來(lái)自50名乳腺癌患者的組織陣列和來(lái)自乳腺癌患者的非瘤乳腺組織的10個(gè)樣品(ImgenexCorporation,SanDiego，CA)。提供了每名患者的下述信息年齡、性別、美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)腫瘤期、淋巴結(jié)、雌激素受體(ER)和孕酮受體(PR)狀態(tài)。遵循實(shí)施例5的IHC程序。除了抗Her2抗體使用1.5jxg/mL濃度以外，所有抗體的在5ng/mL的工作濃度下使用。表11、12^13和14分別提供了乳腺癌組織陣列的7BD-33-IIA、RFAC4和H5C6抗CD63抗體的染色?？傮w上，50名受試患者的36%對(duì)7BD-33-11A抗原呈陽(yáng)性，而分別有85和94%對(duì)RFAC4和H5C6抗CD63抗體呈陽(yáng)性。在7BD-33-11A和RFAC4orH5C6抗CD63抗體染色相同組織時(shí)，97%的樣品使用RFAC4和H5C6抗CD63具有比7BD-33-11A更高強(qiáng)度的染色(圖19)。對(duì)于7BD-33-11A,來(lái)自乳腺癌患者的10個(gè)正常乳腺組織樣品中有0個(gè)呈陽(yáng)性(圖18A)。對(duì)于RFAC4和H5C6抗CD63抗原，來(lái)自乳腺癌患者的8個(gè)正常乳腺組織樣品中有7個(gè)呈陽(yáng)性(兩個(gè)樣品不是代表性的)。如上所述，雌激素或黃體酮受體表達(dá)與7BD-33-llA抗原表達(dá)之間具有輕微的關(guān)聯(lián)；具有任一受體表達(dá)的組織具有稍髙的7BD-33-llA抗原表達(dá)。當(dāng)腫瘤根據(jù)其時(shí)期或所述癌癥進(jìn)展程度而被分析時(shí)，結(jié)果表明對(duì)于7BD-33-11A的趨勢(shì)是較高腫瘤期具有更大的陽(yáng)性反應(yīng)。使用RFAC4獲得了類似的結(jié)果。H5C6也顯示出與雌激素或黃體酮受體表達(dá)之間非常輕微的關(guān)聯(lián)，但與腫瘤期沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián)。然而，對(duì)于全部三種抗體，結(jié)果受限于小尺寸樣品。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>表13有^H5C6的人類乳K腫痛IHC概要7BD-33-IIA染色特異性針對(duì)癌細(xì)胞(與正常細(xì)胞相比較)，其中基質(zhì)細(xì)胞明顯為陰性，而成片惡性細(xì)胞呈陽(yáng)性。使用7BD-33-IIA抗原觀察到的細(xì)胞定位模式限于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。使用抗CD63抗體、RFAC4和H5C6在乳腺腫瘤組織樣品上獲得了類似的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色結(jié)果。另外，這些抗體都在正常乳腺組織樣品上顯示了該染色定位模式，而7BD-33-11為陰性。與c-erbB-2抗Her2相比較，7BD-33-11A顯示了完全不同的染色特征，其中18個(gè)乳腺腫瘤組織樣品中有9個(gè)對(duì)7BD-33-11A抗原呈陽(yáng)性、對(duì)Her2表達(dá)呈陰性，表明未滿足對(duì)于乳腺癌患者的靶向治療需求(表15，圖20)。對(duì)7BD-33-llA和Her2都呈陽(yáng)性的乳腺腫瘤組織切片之間染色強(qiáng)度也存在差別；一些對(duì)7BD-33-11A抗原呈高陽(yáng)性的乳腺腫瘤組織切片對(duì)Her2僅呈輕度陽(yáng)性，且反之依然，表明7BD-33-llA將治療性靶向不同類的乳腺癌患者。c-erbB-2抗體也陽(yáng)性染色了一個(gè)正常乳腺組織切片。這些結(jié)果表明7BD-33-IIA抗原可以被約三分之二的乳腺癌患者所表達(dá)，其中半數(shù)對(duì)Her2抗原呈完全陰性。該染色模式顯示，在患者樣品中，抗體對(duì)惡性細(xì)胞是高度特異性的，且7BD-33-IIA抗原存在于細(xì)胞膜上，從而使其成為引人注目的藥物靶。7BD-33-llA的染色與RFAC4或H5C6抗CD63抗體相比盡管類似，但更多的限制再次說(shuō)明7BD-33-11A表位是CD63上更加限制性的表位。RFAC4和H5C6與CD63抗與7BD-33-llA在人類腫癯和正常乳腺組織上的IHC比較縮寫(xiě)冊(cè):樣品不是代表性的；F:切片是折S的.<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>縮寫(xiě)NR:樣品不是代表性的，F(xiàn):切片是折疊的。c-erbB抗Her2與7BD"33-IIA在人類腫疳和正常乳腺組織上的IHC比較<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>實(shí)施例7人類前列腺組織染色為確定7BD-33-llA抗原是否在除了乳腺癌以外的其他人類癌組織上表達(dá)，使用7BD-33-11A探針檢測(cè)了人類前列腺腫瘤組織陣列(S.N.10/810,751，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文；ImgenexCorporation,SanDiego,CA)。使用了與實(shí)施例5所描述的相同的染色程序。波形蛋白用作陽(yáng)性對(duì)照抗體，且使用了與有關(guān)人類乳腺腫瘤組織陣列所描述的同樣的陰性對(duì)照抗體。所有抗體在5^/mL的工作濃度下使用。如表16中所描述的，7BD-33-11A染色了88%的人類前列腺癌。盡管7BD-33-11A同樣以高強(qiáng)度染色了正常組織切片，但與正常組織相比較，腫瘤組織樣品存在更高程度的細(xì)胞膜染色。有一個(gè)胚橫紋肌肉瘤組織樣品沒(méi)有染色7BD-33-11A抗原。還顯示腫瘤期與7BD-33-11A抗原的存在之間沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)。然而，結(jié)果受限于小尺寸樣品。再次，使用7BD-33-llA，在前列腺腫瘤組織樣品上同時(shí)觀察到了細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色。然而，相對(duì)于乳腺腫瘤組織樣品，細(xì)胞膜染色程度有所提高(圖21)。對(duì)于正常前列腺組織樣品，沒(méi)有觀察到細(xì)胞膜染色程度的這種提高。表16有關(guān)7BD"33-11A的人類前列腺腫瘤IHC概要<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>因此，7BD-33-11A抗原似乎沒(méi)有單獨(dú)發(fā)現(xiàn)于乳腺癌細(xì)胞膜上，而是也發(fā)現(xiàn)于前列腺癌細(xì)胞膜上。這些結(jié)果表明，7BD-33-IIA具有作為包括乳腺的腫瘤類型的治療藥物的潛力。實(shí)施例8人類黑素瘤組織染色為確定7BD-33-IIA抗原是否在除了乳腺和前列腺癌以外的其他人類癌組織上表達(dá)，使用7BD-33-llA探針檢測(cè)了人類黑素瘤組織陣列(TristarTechnologyGroup,LLC,Bethesda，MD)。除了AEC取代DAB作為色原體使用，使用了與實(shí)施例5所描述的相同的染色程序。RFAC4和NKI/C3用作陽(yáng)性對(duì)照抗體，且使用了與有關(guān)人類乳腺腫瘤組織陣列所描述的同樣的陰性對(duì)照抗體。除了使用0.4pg/mL的NKI/C3，所有抗體在5|ig/mL的工作濃度下使用。如表17中所描述的7BD-33-IIA染色了90%的人類黑素瘤癌(圖22)。在有限數(shù)目的受試樣品中，還顯示腫瘤期與7BD-33-11A抗原的存在之間沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)。再次，使用7BD-33-IIA，在黑素瘤組織樣品上同時(shí)觀察到了細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色。表17有關(guān)7BD-33-11A的人類黑素瘤腫瘤IHC概要<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>實(shí)施例9人類腫瘤組織染色如S.N.10/603,006(其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合入本文)中部分描述和討論的，為確定7BD-33-11A、H460-22-1或1A245.6抗原是否表達(dá)于除乳腺癌以外的其他人類癌組織上，在多種人類腫瘤組織陣列(工mgenex,SanDiego,CA)上單獨(dú)檢測(cè)了所述抗體。提供了每名患者的下列信息年齡、性別、器官和診斷。使用了與實(shí)施例5所描述的相同的染色程序。波形蛋白用作陽(yáng)性對(duì)照抗體，且使用了與有關(guān)人類乳腺腫瘤組織陣列所描述的同樣的陰性對(duì)照抗體。所有抗體在5嗎/mL的工作濃度下使用。如表18中描述的，7BD-33-llA染色了許多不同的人類癌(包括乳腺)。下述腫瘤類型對(duì)7BD-33-IIA呈陽(yáng)性皮膚(1V2)、肺(3/4)、肝(2/3)、胃(4/5)、甲狀腺(2/2)、前列腺(1/1)、子宮(4/4)和腎(3/3)(圖23A)。幾種其他腫瘤類型也偶爾染色為陽(yáng)性。其他腫瘤組織對(duì)7BD-33-llA表達(dá)呈陰性卵巢(0/3)、睪丸(0/1)、腦(0/2)和淋巴結(jié)(0/2)。相反，H460-22-l和1A245.6染色了受試的每種組織類型。然而染色強(qiáng)度不同，在皮膚、肺、肝、子宮、腎腎(分別為圖23B和C)、胃和膀胱的惡性細(xì)胞上看到一些最強(qiáng)的染色。如使用乳腺和前列腺(僅7BD-33-11A)癌所看到的，7BD-33-11A、H460-22-1和1A245.6染色定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。因此，顯示7BD-33-IIA、H460-22-1和1A245.6抗原不僅發(fā)現(xiàn)于乳腺、前列腺和黑素瘤癌的細(xì)胞膜上，而且發(fā)現(xiàn)于非常多的腫瘤類型的細(xì)胞膜上。這些結(jié)果表明7BD-33-llA、H460-22-1和1A245.6具有作為除了乳腺和前列腺癌以外的廣泛多種腫瘤類型的治療藥物的潛力。表18:有關(guān)H460-22-l、1A245.6和7BD-33-llA在人類多腫瘤組織陣列上的IHC概要<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>縮寫(xiě)NR:切片不是代表性的，CS:切片完全脫落，M:線粒體染色，C:細(xì)胞質(zhì)染色。AR7BD-33-ARH460-22-1和AR1A245.6對(duì)短尾猴和獼猴正常組織的結(jié)合為評(píng)價(jià)非人靈長(zhǎng)類物種中的抗原表達(dá)，通過(guò)在2種靈長(zhǎng)類物種的正常組織上的IHC測(cè)試了AR7BD-33-IIA、ARH460-22-1、1A245.6和H5C6(可商業(yè)獲得的抗CD63)抗體結(jié)合。從BioChain，Hayward,CA獲得了短尾猴和獼猴的正常組織陣列，并根據(jù)實(shí)施例5中描述的程序染色。還測(cè)試了陽(yáng)性(抗肌動(dòng)蛋白抗體)和陰性對(duì)照。陣列由下述9種代表性器官的切片組成心臟、腦、腎、肝、肺、脾、小腸、骨骼肌和胰腺。AR7BD-33-11A抗體結(jié)合是有限的，并與人類組織觀察到的一致。如表19和20中所示，抗體沒(méi)有結(jié)合至心臟、腦或骨骼肌，并在其他受試組織中顯示了弱到中度結(jié)合，而在肺巨噬細(xì)胞和胰臟組織中觀察到強(qiáng)結(jié)合。兩種非人靈長(zhǎng)類物種間的結(jié)合是類似的，且具有兩個(gè)限制(caveats)。在獼猴小腸切片中，存在較少成纖維細(xì)胞的模糊結(jié)合，然而，相應(yīng)的短尾猴切片不是代表性的，并因此不能被評(píng)價(jià)。使用獼猴樣品的AR7BD-33-11A至肝和腎切片的結(jié)合比短尾猴樣品強(qiáng)。表19:短尾猴組織切片的AR7BD-33-11A的IHC染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>最終切片評(píng)分取決于細(xì)胞的最強(qiáng)染色強(qiáng)度，如下陰性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，強(qiáng)染色(+++)。細(xì)胞定位細(xì)胞膜(M)，細(xì)胞質(zhì)(C)，分散(D)，顆粒狀(G)，散在的局部(SF)。約％染色的細(xì)胞〈10%(1-9%)'10%,〈50%(11-49%)，50%,〉50%(51-100%)。*僅脂肪組織表20:獼猴組織切片的AR7BD-33-11A的IHC的染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>最終切片評(píng)分取決于細(xì)胞的最強(qiáng)染色強(qiáng)度，如下:陰性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+),中度染色(++),強(qiáng)染色(+++)。細(xì)胞定位細(xì)胞膜(M)，細(xì)胞質(zhì)(C)，分散(D)，顆粒狀(G)，散在的局部(SF)。約％染色的細(xì)胞〈10%(1-9%),10%'<50%(11-49%)，50%，>50%(51-100%)。*僅脂肪組織ARH460-22-1至靈長(zhǎng)類物種的結(jié)合也與人類組織觀察到的一致。如表21和22中所看到的，除了在短尾猴腦樣品中看到模糊的結(jié)合而在相應(yīng)的獼猴切片中為陰性以外，這兩種非人靈長(zhǎng)類物種的ARH460-22-l結(jié)合是類似的。表21.短尾猴組織切片的ARH460-22-1的IHC的染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>最終切片評(píng)分取決于細(xì)胞的最強(qiáng)染色強(qiáng)度，如下:陰性染色(-)，模糊染色(+/-),弱染色(+)，中度染色(++),強(qiáng)染色(+++)。細(xì)胞定位細(xì)胞膜(M)，細(xì)胞質(zhì)(C),分散(D),顆粒狀(G),散在的局部(SF)。約％染色的細(xì)胞<10%(1-9%),10%，<50%(11-49%),50%，>50%(51-100%)。*僅脂肪組織表22:獼猴組織切片的ARH460-22-l的IHC的染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>最終切片評(píng)分取決于細(xì)胞的最強(qiáng)染色強(qiáng)度，如下:陰性染色(-),模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，強(qiáng)染色(+++)。細(xì)胞定位細(xì)胞膜(M),細(xì)胞質(zhì)(C),分散(D)，顆粒狀(G)，散在的局部(SF)。約％染色的細(xì)胞<10%(1-9%),10%,<50%(11-49%)，50%，〉50%(51-100%)。*僅脂肪組織AR1A245。6至靈長(zhǎng)類物種的結(jié)合也與人類組織觀察到的一致。如表23和24中所看到的，這兩種物種的AR1A245.6組織結(jié)合是類似的，除了骨骼肌(獼猴中為陰性，短尾猴中為模糊的)，心肌(在獼猴中比在短尾猴中強(qiáng))和腦(在短尾猴中比在獼猴中強(qiáng))。表23.短尾猴組織切片的AR1A245.6的IHC的染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>最終切片評(píng)分取決于細(xì)胞的最強(qiáng)染色強(qiáng)度，如下:陰性染色(-)，模糊染色(+/-),弱染色(+)，中度染色(++)，強(qiáng)染色(+++)。細(xì)胞定位細(xì)胞膜(M),細(xì)胞質(zhì)(C),分散(D),顆粒狀(G)，散在的局部(SF)。約％染色的細(xì)胞<10%(1-9%),10%,<50%(11-49%),50%，〉50%(51-100%)。*僅脂肪組織表24:獼猴組織切片的AR1A245.6的IHC的染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>最終切片評(píng)分取決于細(xì)胞的最強(qiáng)染色強(qiáng)度，如下:陰性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+)，中度染色(++)，強(qiáng)染色(+++)。細(xì)胞定位細(xì)胞膜(M)，細(xì)胞質(zhì)(C)，分散(D),顆粒狀(G)，散在的局部(SF)。約％染色的細(xì)胞〈10%(1-9%),10%，〈50%(11-49%),50%，〉50%(51-100%)。*僅脂肪組織如使用人類組織觀察到的，H5C6結(jié)合(表25和26中所描述的)表現(xiàn)出與H460-22-1和AR1A245.6的結(jié)合相類似的結(jié)合模式，比AR7BD-33-llA結(jié)合了更廣泛的組織。對(duì)于全部四種抗CD63抗體，細(xì)胞定位主要是細(xì)胞質(zhì)，且具有顆粒狀染色模式。表25.短尾猴組織切片的H5C6的IHC的染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>最終切片評(píng)分取決于細(xì)胞的最強(qiáng)染色強(qiáng)度，如下陰性染色(-)，模糊染色(+/-),弱染色(+)，中度染色(++),強(qiáng)染色(+++)。細(xì)胞定位細(xì)胞膜(M),細(xì)胞質(zhì)(C),分散(D)，顆粒狀(G)，散在的局部(SF)。約％染色的細(xì)胞:<10%(1-9%)'10%,<50%(11-49%),50%,>50%(51-100%)。*僅脂肪組織表26:獼猴組織切片的H5C6的IHC的染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>最終切片評(píng)分取決于細(xì)胞的最強(qiáng)染色強(qiáng)度，如下:陰性染色(-)，模糊染色(+/-)，弱染色(+),中度染色(++)，強(qiáng)染色(+++)。細(xì)胞定位細(xì)胞膜(M)，細(xì)胞質(zhì)(C),分散(D),顆粒狀(G)，散在的局部(SF)。約％染色的細(xì)胞〈10%(1-9%)，10%,<50%(11-49%),50%，〉50%(51-100%)。*僅脂肪組織這些數(shù)據(jù)證明:H460-22-l、AR1A245.6、AR7BD-33-11A和H5C6的抗原在人和短尾猴和獼猴中類似地表達(dá)，且這些非人靈長(zhǎng)類物中表現(xiàn)了體內(nèi)模型的潛力，以研究H460-22-l、1A245.6或AR7BD-33-11A給藥的安全性和藥物動(dòng)力學(xué)。實(shí)施例11體內(nèi)MDA-MB-231預(yù)防性腫瘤實(shí)驗(yàn)參考圖24和25中顯示的數(shù)據(jù)，4至8周大的雌性SCID鼠經(jīng)頸背皮下注射而被植入5百萬(wàn)MB-231人乳腺癌細(xì)胞(于100pL鹽水中)。將所述鼠隨機(jī)分為3個(gè)治療組，每組10只。在植入前一天，腹腔內(nèi)注入稀釋后體積為300(iL的20mg/kg的H460-22-1測(cè)試抗體、抗體緩沖液或同種型對(duì)照抗體(已知不結(jié)合MB-231細(xì)胞)，所述稀釋使用含有2.7mMKC1、1mMKH2P04137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋劑從原液濃度稀釋。然后以同樣方式每周注射一次所述抗體，持續(xù)7周。使用測(cè)徑器大約每7天測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)，持續(xù)至10周或直至個(gè)體動(dòng)物達(dá)到加拿大動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)(CCAC)的極限或第120天。在研究的持續(xù)過(guò)程中記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都根據(jù)CCAC指南進(jìn)行安樂(lè)死。該研究中顯示的數(shù)據(jù)是縱向數(shù)據(jù)組的通常實(shí)例。通常，在該數(shù)據(jù)組中，時(shí)間點(diǎn)間具有高度關(guān)聯(lián)，并且較近的時(shí)間點(diǎn)間觀察到較高關(guān)聯(lián)。因此，重復(fù)測(cè)量的方差分析(R印.ANOVA)用以確定治療間差異，并且當(dāng)存在差異時(shí)使用共方差分析方法來(lái)確定時(shí)間點(diǎn)。當(dāng)各時(shí)間點(diǎn)的組間差異可能不僅歸因于組而可能歸因于之前時(shí)間點(diǎn)時(shí)，后者是適當(dāng)?shù)姆椒?。在整個(gè)研究中，沒(méi)有臨床毒性癥狀。每周測(cè)量的體重是健康狀況和未能成長(zhǎng)的表征。圖24表示了研究期間3組鼠的平均體重。各組的體重隨時(shí)間增加。R印.ANOVA表明組間沒(méi)有顯著差異，且同種型對(duì)照、抗體緩沖液或H460-22-1治療組的平均曲線沒(méi)有隨時(shí)間點(diǎn)改變。使用R.印.ANOVA用于整個(gè)實(shí)驗(yàn)，下述結(jié)果是顯著的。R印.ANOVA方法表明，不僅各組的平均是差異的(P〈0.001)，而且平均曲線的形狀也彼此不同。如圖25中可看見(jiàn)的，治療組H460-22-l似乎具有比其他組更好的效果。另外，同種型對(duì)照治療組和抗體緩沖液治療組之間的差異不是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。根據(jù)共方差分析，在第18天首次出現(xiàn)顯著差異，其中同種型和緩沖液治療組不同于H460-22-1治療組。在第53天(在停止治療后首次測(cè)量腫瘤體積)，H460-22-1治療組的腫瘤體積是抗體對(duì)照治療組的17.7%(P〈0。0001)，從而表明了預(yù)防腫瘤負(fù)荷的效力。H460-22-1治療還具有相應(yīng)的存活益處(圖26)。提高的存活率是有價(jià)值的效力指標(biāo)。所有3組治療后都隨訪70天。這些數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照治療組相比較，測(cè)試抗體的治療帶來(lái)了存活益處。對(duì)照組在植入后第74-81天間達(dá)到50%死亡率。相反，H460-22-1治療組在研究結(jié)束時(shí)(植入后120天)還未達(dá)到50%的死亡率。同種型對(duì)照治療組在植入后第102天達(dá)到100%死亡率。相反，H460-22-1治療的動(dòng)物在研究結(jié)束時(shí)顯示了60%的存活率?？傊诠J(rèn)的人類癌癥模型中，H460-22-1抗體治療與對(duì)照抗體相比，預(yù)防了腫瘤負(fù)荷并提高了存活率。這些結(jié)果表明了該抗體(H460-22-l)作為療法在其他哺乳動(dòng)物(包括人)中潛在的藥理學(xué)和藥學(xué)益處。實(shí)施例12體內(nèi)MDA-MB-231建立的腫瘤實(shí)驗(yàn)5至6周大的雌性SCID鼠經(jīng)頸背皮下注射而被植入5百萬(wàn)MB-231人乳腺癌細(xì)胞(于IOOpL鹽水中)。使用測(cè)徑器每周測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)當(dāng)大部分隊(duì)列在植入后34天達(dá)到100mm3(范圍70-130mm3)的腫瘤體積時(shí)，12只小鼠被隨機(jī)分成三個(gè)治療組。靜脈注入稀釋后體積為150(iL的15mg/kg/劑量的H460-22-1或同種型對(duì)照抗體(已知不結(jié)合MB-231細(xì)胞)，所述稀釋使用含有2.7mMKCl、1mMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋劑從原液濃度稀釋;腹腔內(nèi)注入300jaL的9mg/kg/劑量(稀釋于鹽水中)順鉑。然后以同樣方式每周注射3次所述抗體，總共10劑量，直至植入后第48天。每四天注入1次順鉑，至3劑量。使用測(cè)徑器約每7天測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)，持續(xù)研究期間或直至個(gè)體動(dòng)物達(dá)到CCAC的極限。在在研究的持續(xù)過(guò)程中記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都根據(jù)CCAC指南進(jìn)行安樂(lè)死。在隨機(jī)時(shí)間點(diǎn)，各組中的平均腫瘤體積和標(biāo)準(zhǔn)偏差是相似的同種型對(duì)照(97,60+/-18.33);H460-22-1(94.06+/-17.77);順鉬(98.00+/-18。93)。如圖27中所示，在3周治療期結(jié)束時(shí)，抗體H460-22-l能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。3組間的平均腫瘤體積的比較顯示了組間差異是非常顯著的(表27)。表27:治療結(jié)束時(shí)的平均腫瘤體積比較<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>通過(guò)計(jì)算T/C比值(治療的中位腫瘤體積[T]為同種型對(duì)照的中位腫瘤體積[C]的百分比)評(píng)價(jià)了效力的進(jìn)一步估計(jì)，所述T/C比值反應(yīng)生長(zhǎng)抑制。H460-22-1抗體獲得了等于對(duì)照的48%的中位腫瘤體積(圖28)。圖27進(jìn)一步顯示，再與同種型對(duì)照相比較時(shí)，H460-22-l治療導(dǎo)致了顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制，且所述抑制是以最大耐受劑量(MTD)給入的順鉑的腫瘤生長(zhǎng)抑制的2/3，但沒(méi)有順鉑的伴隨毒性或死亡。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周記錄的體重被作為評(píng)價(jià)安全性和毒性的指標(biāo)。如表28中所描述和圖29中所顯示的，使用同種型對(duì)照或H460-22-l治療的組在體重上差異最小。相反，在治療期間，順鉑組中觀察到了顯著的(p〈0.003)惡病質(zhì)。該組中，體重減輕達(dá)最初體重的19.2%，發(fā)生了其他臨床不良應(yīng)激(例如歸因于脫水和昏睡的毛皮皺折)。與順鉑治療組中觀察到的2例死亡相比，H460-22-1治療組中沒(méi)有死亡。表28:治療結(jié)束時(shí)的體重改變和腫瘤生長(zhǎng)抑制(Q/。T/C)<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>林腹腔注入的劑量，每周1次，持續(xù)3劑量總之，在SCID鼠中建立的乳腺癌腫瘤異種移植模型中，H460-22-1比同種型對(duì)照抗體顯著更有效抑制了腫瘤生長(zhǎng)在3周的治療期間，H460-22-l獲得了比對(duì)照少50。/。的中位T/C腫瘤。另外，H460-22-1導(dǎo)致的抑制為在MTD下給入的順鉑的三分之二，但沒(méi)有使用化學(xué)治療藥物觀察到的毒性體征或死亡。因此，在公認(rèn)的人類疾病模型中，與對(duì)照抗體相比較，使用H460-22-1的治療顯著降低了己建立腫瘤的腫瘤負(fù)荷，表明了該抗體在其他哺乳動(dòng)物(包括人)中用于治療的藥理和藥學(xué)益處。實(shí)施例13體內(nèi)A2058預(yù)防性腫瘤實(shí)驗(yàn)參考圖30和31中顯示的數(shù)據(jù)，4至8周大的雌性SCID鼠經(jīng)頸背皮下注射而被植入75萬(wàn)A2058人黑素瘤癌細(xì)胞(于100鹽水中)。將所述鼠隨機(jī)分為2個(gè)治療組，每組5只。在植入后一天，腹腔內(nèi)注入稀釋后體積為300|iL的20mg/kg的7BD-33-11A測(cè)試抗體或緩沖液對(duì)照，所述稀釋使用含有2.7mMKCl、1.mMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋劑從原液濃度稀釋。然后以同樣方式每周注射--次所述抗體或緩沖液對(duì)照，持續(xù)7周。使用測(cè)徑器大約每7天測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)，持續(xù)至10周或直至個(gè)體動(dòng)物達(dá)到加拿大動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)(CCAC)的極限。在研究的持續(xù)過(guò)程中記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都根據(jù)CCAC指南進(jìn)行安樂(lè)死。與緩沖液對(duì)照治療相比，7BD-33-11A治療導(dǎo)致了減少的腫瘤生長(zhǎng)(圖31)。在第55天(治療結(jié)束后5天)，7BD-33-11A治療組的平均腫瘤體積是緩沖液對(duì)照的28%^=0.0112，未配對(duì)的t-檢驗(yàn))。如體重測(cè)定的沒(méi)有臨床毒性體征(圖30)。還是在第55無(wú)7BD-33-11A治療組與緩沖液對(duì)照治療組的平均體重之間沒(méi)有顯著差異(p=0.3351，未配對(duì)的t-檢驗(yàn))。因此，7BD-33-IIA治療顯得安全，并在人類癌癥體內(nèi)模型中表現(xiàn)出治療乳腺、前列腺和現(xiàn)在的黑素瘤中的效力。實(shí)施例14體內(nèi)A2058建立的腫瘤實(shí)驗(yàn)參考圖32和33中所示的數(shù)據(jù)，4至8周大的雌性SCID鼠經(jīng)頸背皮下注射而被植入5Xl(f百萬(wàn)A2058人黑素瘤癌細(xì)胞(于IOO鹽水中)。當(dāng)腫瘤達(dá)到約75mm3時(shí)，將所述鼠隨機(jī)分為2個(gè)治療組，每組7只。各測(cè)試組小鼠使用在載體對(duì)照緩沖液(不含CaCl2和MgCl2的磷酸緩沖鹽水)中稀釋至300pL的15mg/kgAR7BD-33-11A治療，每周3次，共10劑量。對(duì)照組小鼠根據(jù)相同的計(jì)劃接受單獨(dú)的載體對(duì)照緩沖液。使用測(cè)徑器大約每7天測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)，持續(xù)研究期間或直至個(gè)體動(dòng)物達(dá)到CCAC的極限。在在研究的持續(xù)過(guò)程中記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都根據(jù)CCAC指南進(jìn)行安樂(lè)死。存活不是研究終點(diǎn)。腫瘤生長(zhǎng)在AR7BD-33-11A治療組中得到了顯著抑制。該組中的平均腫瘤體積為對(duì)照組測(cè)量的30.87%(p〈0443)(圖32)。2組記錄的平均體重沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖33)。因此，7BD-33-llA治療顯得安全，并在已建立的人類癌癥體內(nèi)模型中表現(xiàn)出治療乳腺和現(xiàn)在的黑素瘤的效力。實(shí)施例15體內(nèi)A375預(yù)防性腫瘤實(shí)驗(yàn)參考圖34和35中顯示的數(shù)據(jù)，4至8周大的雌性SCID鼠經(jīng)頸背皮下注射而被植入1百萬(wàn)A375人黑素瘤癌細(xì)胞(于100鹽水中)。將所述鼠隨機(jī)分為2個(gè)治療組，每組5只。在植入后一天，腹腔內(nèi)注入稀釋后體積為300nL的20mg/kg的7BD-33-11A測(cè)試抗體或緩沖液對(duì)照，所述稀釋使用含有2.7mMKCl、lmMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋劑從原液濃度稀釋。然后以同樣方式每周注射一次所述抗體或緩沖液對(duì)照，持續(xù)7周。使用測(cè)徑器大約每7天測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)，持續(xù)至10周或直至個(gè)體動(dòng)物達(dá)到加拿大動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)(CCAC)的極限。在研究的持續(xù)過(guò)程中記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都根據(jù)CCAC指南進(jìn)行安樂(lè)死。與緩沖液對(duì)照治療相比，7BD-33-11A治療導(dǎo)致了減少的腫瘤生長(zhǎng)(圖34)。在第41天(治療結(jié)束后9天)，7BD-33-11A治療組的平均腫瘤體積是緩沖液對(duì)照的37X(p二0.0006，未配對(duì)的t-檢驗(yàn))。如體重測(cè)定的，沒(méi)有臨床毒性體征(圖35)。還是在第41天7BD-33-11A治療組與緩沖液對(duì)照治療組的平均體重之間沒(méi)有顯著差異(p=0.5656，未配對(duì)的t-檢驗(yàn))。另外，與緩沖液對(duì)照鼠相比較，7BD-33-11A治療延長(zhǎng)了存活。所有緩沖液對(duì)照鼠由于在第41天(治療結(jié)束前9天)達(dá)到CCAC極限而被安樂(lè)死，而所有7BD-33-11A治療鼠在第55天(治療結(jié)束后5天)依然存活。因此，7BD-33-IIA治療再次顯示安全，并在人類癌癥體內(nèi)模型中表現(xiàn)出治療乳腺、前列腺和現(xiàn)在的黑素瘤中的效力。實(shí)施例16體內(nèi)A375建立的腫瘤實(shí)驗(yàn)在已建立的黑素瘤體內(nèi)模型中，已經(jīng)單獨(dú)和結(jié)合達(dá)卡巴嗪測(cè)試了AR7BD-33-llA。參考圖36中顯示的數(shù)據(jù)，保留在無(wú)胸腺裸鼠中的A375黑素瘤系衍生的1mm3腫瘤片段被皮下植入測(cè)試小鼠(來(lái)自CharlesRiver的無(wú)胸腺裸鼠，研究第1天為14-15周大)的拱側(cè)翼。每周監(jiān)測(cè)2次腫瘤，然后當(dāng)腫瘤達(dá)到80-120咖3時(shí)每周監(jiān)測(cè)1次。動(dòng)物被分類成腫瘤體積為62.5-144.0mm3的治療組和平均腫瘤體積為101.0-102.2咖3的組。每周3次腹腔內(nèi)注射20mg/kg的AR7BD-3311A，持續(xù)3周；并且每周一次腹腔內(nèi)注射90mg/kg(該模型中的1/2最大耐受劑量)達(dá)卡巴嗪，持續(xù)連續(xù)5天。對(duì)照組接受0.2mL/20g體重的磷酸緩沖鹽水、AR7BD-33-11A載體，每周3次，持續(xù)3周。治療在具有已建立的n02腿3)黑素瘤的10只裸鼠的組中開(kāi)始于第l天。每周測(cè)量2次腫瘤大小，直至腫瘤達(dá)到2，OOO-mm3的極限體積。一旦小鼠達(dá)到該極限，則被安樂(lè)死。該研究在第87天結(jié)束。Logrank檢測(cè)確定了藥物治療組和載體治療組的至極限的時(shí)間(TTE)值之間是否存在顯著差異(P〈0.05)。研究期間記錄了動(dòng)物的體重，并經(jīng)常檢查小鼠任何不良的藥物相關(guān)負(fù)作用的明顯體征。載體治療產(chǎn)生了約15.8的中位TTE。一對(duì)照鼠在研究期結(jié)束時(shí)沒(méi)有可測(cè)腫瘤，表明了每組一個(gè)不令人滿意的腫瘤植入背景，一對(duì)照鼠死于非治療相關(guān)原因。在對(duì)照組中觀察到可忽略的最大平均體重減輕(〈5%)。達(dá)卡巴嗪?jiǎn)我化煼óa(chǎn)生了35.1天的中位TTE，與對(duì)照鼠相比，相當(dāng)于122%的腫瘤生長(zhǎng)延緩。然而，該降低是不顯著的，該組中沒(méi)有小鼠存活至第87天。三只小鼠死于非治療相關(guān)的原因；兩只排出的小鼠經(jīng)歷了完全的腫瘤反應(yīng)。該組中在第7天觀察到的最大平均體重減輕為5.2%。使用AR7BD-33-11單一療法觀察到不顯著的腫瘤生長(zhǎng)延緩和可忽略的最大平均體重減輕(〈5%)。在AR7BD-33-11A/達(dá)卡巴嗪聯(lián)合治療組中，觀察到中位TTE為39,l天，相當(dāng)于顯著的147。/。的腫瘤生長(zhǎng)延緩(P〈0.01)。所述聯(lián)合治療產(chǎn)生3例部分反應(yīng)和2例完全反應(yīng)，且87天存活者的三分之二在研究結(jié)束時(shí)保持沒(méi)有腫瘤。一只小鼠死于非治療相關(guān)原因。該組中在第7天觀察到的最大平均體重減輕為3.1%。在研究的任何組中沒(méi)有觀察到毒性死亡?？傊M管AR7BD-33-11A單獨(dú)治療沒(méi)有影響該模型中的A375黑素瘤生長(zhǎng)，但其提高了達(dá)卡巴嗪半數(shù)最大耐受劑量的效力，產(chǎn)生了顯著活性、存活率增加和增加數(shù)目的退行反應(yīng)。重要的是，AR7BD-33-11A的加入沒(méi)有調(diào)節(jié)達(dá)卡巴嗪毒性。這些結(jié)果表明，AR7BD-33-11A可用以提高其他潛在更毒性的抗癌劑的效力，使需要的藥物劑量減少，而同時(shí)保持腫瘤反應(yīng)和毒性水平。實(shí)施例17體內(nèi)BxPC-3預(yù)防性腫瘤實(shí)驗(yàn)參考圖37和38中顯示的數(shù)據(jù)，4至8周大的雌性SCID鼠經(jīng)頸背皮下注射而被植入5百萬(wàn)BxPCH3人黑素瘤癌細(xì)胞(于100jiL鹽水中)。將所述鼠隨機(jī)分為2個(gè)治療組，每組5只。在植入后一天，腹腔內(nèi)注入稀釋后體積為300)iL的20mg/kg的7BD-33-11A測(cè)試抗體或緩沖液對(duì)照，所述稀釋使用含有2.7mMKCl、1mMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋劑從原液濃度稀釋。然后以同樣方式每周注射一次所述抗體或緩沖液對(duì)照，持續(xù)7周。使用測(cè)徑器大約每7天測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)，持續(xù)至10周或直至個(gè)體動(dòng)物達(dá)到加拿大動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)(CCAC)的極限。在研究的持續(xù)過(guò)程中記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都根據(jù)CCAC指南進(jìn)行安樂(lè)死。與緩沖液對(duì)照治療相比，7BD-33-11A治療導(dǎo)致了減少的腫瘤生長(zhǎng)(圖37)。在第55天(治療結(jié)束后5天)，7BD-33-11A治療組的平均腫瘤體積是緩沖液對(duì)照的29%&=0.0009，未配對(duì)的t-檢驗(yàn))。如體重測(cè)定的，沒(méi)有臨床毒性體征(圖38)。還是在第55天7BD-33-11A治療組與緩沖液對(duì)照治療組的平均體重之間沒(méi)有顯著差異(p=0.5358，未配對(duì)的t-檢驗(yàn))。另外，與緩沖液對(duì)照鼠相比較，7BD-33-11A治療延長(zhǎng)了存活。所有緩沖液對(duì)照鼠由于在第55天(治療結(jié)束前5天)達(dá)到CCAC極限而被安樂(lè)死，而80%的7BD-33-11A治療鼠在第70天(治療結(jié)束后20天)依然存活。因此，7BD-33-IIA治療再次顯示安全，并在人類癌癥體內(nèi)模型中表現(xiàn)出治療乳腺、前列腺和現(xiàn)在的黑素瘤中的效力。實(shí)施例18NODSCID與SCID的體內(nèi)預(yù)防性腫瘤實(shí)驗(yàn)參考圖39中顯示的數(shù)據(jù)，4至6周大的雌性NODSCID和SCID鼠經(jīng)頸背皮下注射而被植入5百萬(wàn)MB-231人乳腺癌細(xì)胞(于100鹽水中)。將所述鼠隨機(jī)分為3個(gè)治療組，每組10只。在植入后一天，腹腔內(nèi)注入稀釋后體積為300(iL的20mg/kg的H460-22-1測(cè)試抗體、0.2mg/kg的7BD-33-IIA測(cè)試或抗體緩沖液，所述稀釋使用含有2.7mMKC1、1mMKH2P04、137mMNaCl禾P20mM*2朋04的稀釋劑從原液濃度稀釋。然后以同樣方式每周注射一次所述抗體，持續(xù)7周。使用測(cè)徑器大約每7天測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)，持續(xù)至10周或直至個(gè)體動(dòng)物達(dá)到加拿大動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)(CCAC)的極限或第120天。在研究的持續(xù)過(guò)程中記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都根據(jù)CCAC指南進(jìn)行安樂(lè)死。在整個(gè)研究中，沒(méi)有臨床毒性癥狀。每周測(cè)量的體重是健康狀況和未能成長(zhǎng)的表征。各組的體重隨時(shí)間增加。如圖19中所描述的，在第54天(最終治療后4天)，在SCID治療組中，7BD-33-11A和H460-22-1治療鼠生成的腫瘤分別僅為緩沖液對(duì)照治療鼠平均腫瘤體積的1.9%和3.6%。相反，在NODSC工D治療組中，還是在第54天(最終治療后4天)，7BD-33-IIA治療鼠的腫瘤生長(zhǎng)為緩沖液對(duì)照治療鼠平均腫瘤體積的67%。盡管與緩沖液對(duì)照相比，NODSCID鼠中平均體重依然是降低的(p《.0710，未配對(duì)的t-檢驗(yàn))，但是與SC工D鼠中觀察到的相比，效力還是降低的。H460-22-1治療鼠表現(xiàn)出與SCID鼠中類似的效果；腫瘤生長(zhǎng)為緩沖液對(duì)照治療鼠平均腫瘤體積的1,4%。因此，7BD-33-11A的體內(nèi)活性似乎部分歸因于ADCC活性，而H460-22-1的抗腫瘤作用似乎不依賴于ADCC。另外，與緩沖液對(duì)照鼠相比較，7BD-33-11A治療延長(zhǎng)了存活。所有緩沖液對(duì)照鼠由于在第55天(治療結(jié)束前5天)達(dá)到CCAC極限而被安樂(lè)死，而80%的7BD-33-11A治療鼠在第70天(治療結(jié)束后20天)依然存活。因此，7BD-33-llA治療再次顯示安全，并在人類癌癥體內(nèi)模型中表現(xiàn)出治療乳腺、前列腺和現(xiàn)在的黑素瘤中的效力。優(yōu)勢(shì)證據(jù)表吸7BD-33-11A通過(guò)存在于CD63細(xì)胞外環(huán)2上的表位的連接而介導(dǎo)抗癌作用。在實(shí)施例2中已經(jīng)顯示，7BD-33-IIA抗體可用以免疫沉淀來(lái)自表達(dá)細(xì)胞(例如MDA-MB-231細(xì)胞)的同族抗原。進(jìn)一步地，可以顯示，7BD-33-IIA抗體可使用(但不限于)FACS、細(xì)胞ELISA或IHC描述的技術(shù)而用于檢測(cè)表達(dá)CD63抗原性部分(與其特異性結(jié)合)的細(xì)胞和/或組織。因此，使用FACS、細(xì)胞ELISA或IHC可以顯示，免疫沉淀的7BD-33-llA抗原可以抑制7BD-33-11A結(jié)合至這類細(xì)胞或組織。進(jìn)---歩地與7BD-33-IIA抗體一樣使用相同類型的測(cè)定fe其他抗CD63抗體可用以免疫沉淀和分離其他形式的CD63抗原，并且所述抗原可用以抑制這些抗體至表達(dá)所述抗原的細(xì)胞或組織的結(jié)合。實(shí)施例19通過(guò)BIAcore分析測(cè)定7BD33-11A、ARH460-22-1和AR1A245.6的抗原結(jié)合親和力通過(guò)BIAcore分析測(cè)定了7BD33-11凡ARH460-22-1和AR1A245.6的抗原結(jié)合親和力。全部實(shí)驗(yàn)使用Hanks緩沖鹽水作為電泳緩沖液(20mMHepespH7.4，150mMNaCl,3.4mMEDTA，0.005%吐溫20)在流速5pl/分鐘下進(jìn)行。首先使用標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)程序固定抗谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)抗體。簡(jiǎn)要地，通過(guò)注射35pl含有0.05MN-羥基琥珀酰亞胺和0.2M1-乙基-3-(3-二甲胺基丙胺)carbodimide的水混合物、隨后濃度為30(ig/ml的抗GST抗體(于10mM醋酸鈉中，pH5.0)來(lái)活化CM5傳感器芯片，直至捕獲50,000RU至100，000RU。最后，注射30的1,0M乙醇胺-HC1(pH8.5)來(lái)封閉傳感器芯片表面上的任何活化位點(diǎn)。然后注射25pl的5嗎/ml的GST-EC2(GST的重組融合多J力且具有CD63的完整C末端結(jié)構(gòu)域)，隨后注射25-50pl的測(cè)試抗體。通過(guò)10^1的20mM甘氨酸(pH2.2)的兩次脈沖完成了傳感器芯片表面再生，用于隨后的注射。以范圍從12.5至200nM的濃度連續(xù)注射測(cè)試抗體。作為對(duì)照，各抗體濃度注射在表面上，其中GST替代GST-EC2被捕獲。根據(jù)測(cè)量的穩(wěn)定狀態(tài)結(jié)合水平計(jì)算不同抗體對(duì)EC2結(jié)構(gòu)域的親和力。對(duì)于各感應(yīng)譜，報(bào)告點(diǎn)取在抗體注射前20秒(在平衡或Req的共振單位)。對(duì)于各抗體濃度，抗體注射在GST-EC2上所獲得的Req減去抗體注射在GST表面時(shí)所獲得的Req。根據(jù)Req/Conc.與Reqplot斜線計(jì)算的結(jié)合常數(shù)(KA)顯示于表29。也顯示于表29中的離解常數(shù)(KD)被計(jì)算為KA的倒數(shù)。表29:通過(guò)BIAcore分析的7BD33-11A、ARH460-22-1和<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>*數(shù)據(jù)是平均的且是至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SEM。本說(shuō)明書(shū)提到的所有專利和公布都是本發(fā)明所述領(lǐng)域技術(shù)人員的預(yù)示水平。所有專利和公布通過(guò)引用結(jié)合入本文，至如同各單個(gè)公布通過(guò)引用特別和單獨(dú)結(jié)合入的程度。應(yīng)該理解，雖然描述了本發(fā)明的某種形式，但不限于本文描述和顯示的部分特定形式或安排。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以做出各種變化且不脫離本發(fā)明的范圍，不認(rèn)為本發(fā)明限于本說(shuō)明書(shū)所顯示和描述的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，本發(fā)明適以實(shí)施所述目的并獲得所述結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及本文那些固有優(yōu)點(diǎn)。本文描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物相關(guān)化合物、方法、程序和技術(shù)是目前代表性的優(yōu)選實(shí)施方案，并意欲示例并不意欲對(duì)范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到其改變或其他用途，其包括在本發(fā)明的精神之內(nèi)并由所附權(quán)利要求書(shū)所限定。盡管通過(guò)特別優(yōu)選的實(shí)施方案己經(jīng)描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解，所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)該不當(dāng)?shù)叵抻谶@樣的特定實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的用于實(shí)施本發(fā)明的期望模式的各種調(diào)整將在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種能夠特異性結(jié)合至人類CD63的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與可獲自雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1的單克隆抗體相同的人類CD63表位反應(yīng)，所述雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1的ATCC保藏號(hào)為PTA-4622。2.—種能夠特異性結(jié)合至人類CD63的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與可獲自雜交瘤細(xì)胞系1A245.6的單克隆抗體相同的人類CD63表位反應(yīng)，所述雜交瘤細(xì)胞系1A245.6的ATCC保藏號(hào)為PTA-4889。3.—種能夠特異性結(jié)合至人類CD63的單克隆抗體其中所述單克隆抗體與可獲自雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-11A的單克隆抗體相同的人類CD63表位反應(yīng)，所述雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-11A的ATCC保藏號(hào)為PTA-4890。4.一種單克隆抗體，其識(shí)別的表位與選自下述組的雜交瘤所生成的單克隆抗體所識(shí)別的表位相同保藏號(hào)為PTA-4622的雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1、保藏號(hào)為PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6和保藏號(hào)為PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-llA。5.單克隆抗體用于減少表達(dá)CD63抗原的人類癌癥中腫瘤負(fù)荷的用途，包括提供至少一種單克隆抗體，所述單克隆抗體識(shí)別的表位與選自下述組的雜交瘤所生成的單克隆抗體所識(shí)別的表位相同保藏號(hào)為PTA-4622的雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1、保藏號(hào)為PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6和保藏號(hào)為PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-11A;其中所述表位的結(jié)合有效減少腫瘤負(fù)荷。6.單克隆抗體用于治療表達(dá)人類CD63抗原的人類癌性腫瘤的用途，包括提供至少一種單克隆抗體，所述單克隆抗休識(shí)別的表位與選fi下述組的雜交瘤所生成的單克隆抗體所識(shí)別的表位相同保藏號(hào)為PTA-4622的雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1、保藏號(hào)為PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6和保藏號(hào)為PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-11A;結(jié)合至少一種化學(xué)療劑；從而減少腫瘤負(fù)荷。7.—種測(cè)定表達(dá)CD63表位的細(xì)胞在靈長(zhǎng)類組織樣品中存在的結(jié)合測(cè)定法，包括提供來(lái)自所述靈長(zhǎng)類的組織樣品；提供至少一種單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，所述單克隆抗體或抗原結(jié)合片段識(shí)別的表位與選自下述組的雜交瘤所生成的單克隆抗體所識(shí)別的表位相同保藏號(hào)為PTA-4622的雜交瘤細(xì)胞系H460-22-l、保藏號(hào)為PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6和保藏號(hào)為PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-llA，所述克隆以保藏號(hào)PTA-4890保藏于ATCC;將所述至少一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述靈長(zhǎng)類組織樣品相接觸；和測(cè)定所述至少一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述靈長(zhǎng)類組織樣品的結(jié)合；從而指示所述細(xì)胞在所述組織樣品中的存在。8.—種測(cè)定表達(dá)CD63表位的癌細(xì)胞在選自人類腫瘤的組織樣品中存在的結(jié)合測(cè)定法，包括提供來(lái)自所述人類的組織樣品；提供至少一種單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，所述單克隆抗體或抗原結(jié)合片段識(shí)別的表位與選自下述組的雜交瘤所生成的單克隆抗體所識(shí)別的表位相同保藏號(hào)為PTA-4622的雜交瘤細(xì)胞系H460-22-l、保藏號(hào)為PTA-4889的雜交瘤細(xì)胞系1A245.6和保藏號(hào)為PTA-4890的雜交瘤細(xì)胞系7BD-33-11A，所述克隆以保藏號(hào)PTA-4890保藏于ATCC;將所述至少一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品相接觸；和測(cè)定所述至少一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品的結(jié)合；從而指示所述癌細(xì)胞在所述組織樣品中的存在。全文摘要本發(fā)明涉及癌癥的診斷和治療，特別涉及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的介導(dǎo)；最特別涉及任選與一種或多種化療劑聯(lián)合使用的癌癥調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)的用途，作為啟動(dòng)細(xì)胞毒性反應(yīng)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合測(cè)定。文檔編號(hào)C07K16/28GK101189266SQ200580048929公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2005年12月30日優(yōu)先權(quán)日2005年1月3日發(fā)明者大衛(wèi)·S·F·楊,海倫·P·芬德利,蘇姍·E·哈恩,路易斯·A·G·達(dá)克魯茲申請(qǐng)人:阿里烏斯研究公司