專利名稱：東北野生大豆編碼dreb轉(zhuǎn)錄因子基因及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因材料，本發(fā)明還涉及這種基因的克隆方法。
背景技術(shù)：
低溫、干旱和鹽堿等逆境條件嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，是制約我國(guó)東北地區(qū)乃至全國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重大問(wèn)題。提高作物的耐低溫、干旱和鹽堿能力以及充分利用鹽堿地資源開(kāi)拓耕地面積是解決糧食安全的重要途徑。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，為進(jìn)行抗逆分子育種研究提供了重要手段。進(jìn)行抗逆分子育種要求有豐富的基因資源。近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在克隆植物滲透脅迫相關(guān)基因方面取得了一些進(jìn)展，為分子育種提供了豐富的抗逆基因資源。
DREB(Dehydration Responsive Element Binding protein)轉(zhuǎn)錄因子是目前滲透脅迫分子生物學(xué)研究較為熱點(diǎn)的蛋白因子。以模式植物擬南芥和水稻為材料，在基因分離、結(jié)構(gòu)分析、功能鑒定等方面都做了很多研究，大量的研究表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)滲透脅迫反應(yīng)中起到非常重要的調(diào)控作用。而在抗逆性強(qiáng)的東北野生大豆方面尚未見(jiàn)報(bào)道。從野生資源中可望獲得在滲透脅迫過(guò)程中起關(guān)鍵作用的基因，將為植物抗?jié)B透脅迫基因工程提供了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種在植物抗?jié)B透脅迫過(guò)程中起關(guān)鍵作用的基因。
本發(fā)明基因的基本特征該基因包括1179bp的開(kāi)放讀碼框，編碼392個(gè)氨基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子；在GsDREB內(nèi)部具有轉(zhuǎn)錄因子特有的與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域DREBP/AP2，其保守的氨基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個(gè)平行的β-折疊和一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，可以與DNA的GCC-BOX結(jié)合，N端具有6個(gè)氨基酸的核定位序列(SRKRKS)。
它的序列及推測(cè)的氨基酸序列為1 TTTCATTGAGTACTGTGTGGCGAAGTTTGTGTCTTGGATTTTGTGGAC GGTGCTTAT1 M G A Y61 GATCAAGTTTCTCTTAAGCCATTGGATTCTTCTAGAAAGAGGAAAAGTAGGAGCAGAGGG5 D Q V S L K P L D S R S R G121GATGGGTCCAAATCTGTGGCTGAGACTATTGCAAAGTGGAAGGAATACAATGAGCATCTT25 D G S K S V A E T I A K W K E Y N E H L181TATTCTGGCAAAGATGATAGTAGAACAACTCGTAAGGCGCCGGCTAAAGGTTCGAAGAAA45 Y S G K D D S R T T R K A P A K G S K K
241GGGTGCATGAAAGGGAAGGGAGGACCTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGG65 G C M K G K G G P Q N S Q C 301CAGAGGACATGGGGGAAATGGGTTGGTGAGATTAGGGAACCCAATAGAGGAAGCAGGCTT85 361TGGTTGGGTACCTTCTCTTCTGCCCAGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGA105 421GCTATGTATGGTCCTTGTGCACGCCTCAATTTTCCCGAAATCACAGATTATCCTTCTGTT125 E I T D Y P S V481AAGGAATCGTTGAAGGACTCTTCGATGGCTGCATCGTCGTCTTGTTCTTCGGCAGCAACT145 K E S L K D S S M A A S S S C S S A A T541GCAGCATCTGACACTACTACTACAACATCGAACCAATCGGAGGTTTGTGCTGTTGAGGAT165 A A S D T T T T T S N Q S E V C A V E D601GTTATCGAGAAACCTGCGAATGTGAATGATAAGTTTAATGATTGTCATAAGGCTTACGTA185 V I E K P A N V N D K F N D C H K A Y V661TCTGCCTCACCAACTAGTAGAATGAAGCAAGAGCCTAGGGATGAGGCTGTGGACCACATG205 S A S P T S R M K Q E P R D E A V D H M721GACACAGGGGCTGGGGAAATTCAAGATGTCGGACTAGAAGGAACACATGATACTGGGCAG225 D T G A G E I Q D V G L E G T H D T G Q781GTTGCAGAGAATGTAAATAAAGATCAGATGGATTTGTCATGGATTGATGGCCTTGACTTT245 V A E N V N K D Q M D L S W I D G L D F841ATTGACGATTACTTGAAGAGCCTTTCCGCGGATGAGTTATTTCAGGTGGACGAACTTTTG265 I D D Y L K S L S A D E L F Q V D E L L901GGGCTTATAGATAATAACCCAATCGATAACTCTGTGTTGATGCAAGGTTTGGATTTTGGA285 G L I D N N P I D N S V L M Q G L D F G961CAAATGGGTTTTCCTGGAGATGGTAATCCTCAGGTTGACGATACTCCTTCAAGCTTTATT305 Q M G F P G D G N P Q V D D T P S S F I1021 TATCAGTTGCAAAATCCAGATGCCAAGTTGTTAGGAAGTTTGCCCCATATGGAGCAGACA325 Y Q L Q N P D A K L L G S L P H M E Q T1081 CCATCAGGTGTTGATTATGGATTAGATTTCTTGAAAACAGTGGAGCCAGGGGACTATAAT
345 P S G V D Y G L D F L K T V E P G D Y N1141 GGTGGAGGGGAAGAACCACCATTTCTTAATTTGGATGATGATCTAAACCATGATTCAAAT365 G G G E E P P F L N L D D D L N H D S N1201 GGCATGCAAGCAAGGAAGGGTGGC AGAAGGCTACGTGTATCTGCTTCATTTTCAACT385 G M Q A R K G G *1261 GGTTCTAGCGTCTGCTGGTAATCTGTCTCTTGGGCTGTTGTCCCCTTTTTAGCTATATAA1321 TAGGCGCATAAGAGGAATACCCCTATACAACTAATACAAG本發(fā)明的基因是采用這樣的方法來(lái)克隆的根據(jù)擬南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2(AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的多序列比對(duì)結(jié)果，在DREBP/AP2的β-折疊區(qū)和α-螺旋區(qū)設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)并引物。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用降落PCR的方法，獲得到191bp的片段，命名為GsAP2。引物序列為GsAP2 UPgg(A/T/C)AAA Tgg gT(T/A/g)(g/T)(C/g)(A/T/C)gAGsAP2 DOWN gg(g/A)AA(g/A)TT(g/A)Ag(A/T/g)(A/C)(g/T)A gC以獲得的GsAP2序列為靶序列，采用3’RACE和5’RACE方法分別對(duì)其3’和5’末端未知的序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下Primers Sequences(5‘→3’)PCRAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACA A(17) 3’RACEAUAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT AC 3’/5’RACEAAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACg ggI Igg gII ggg IIg5’RACEGsDREB 3GSP1 gAg gAg TTA ggC AgA ggA CAC g 3’RACEGsDREB 3GSP2 gCA ggC TTT ggT Tgg gTA C 3’RACEGsDREB 3GSP3 gCT gCT CTT gCC TAT gAT gAA G 3’RACEGsDREB 5GSP1 AAg gAT AgC ACA Agg ACC ATA C 5’RACEGsDREB 5GSP2 TgC TTC CTC TAT Tgg gCT CC 5’RACEGsDREB 5GSP3 CgT gTC CTC TgC CTA ACT CCT C 5’RACE經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得1162bp 3’端序列和482bp 5’端序列它們與191bp的保守區(qū)分別具有106bp和45bp的重疊區(qū)域；將5’RACE序列、3’RACE序列和GsAP2序列拼接，獲得1622bp的拼接序列；在拼接的兩端序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法進(jìn)行全長(zhǎng)基因擴(kuò)增，結(jié)果獲得了1360bp全長(zhǎng)cDNA序列，該基因被命名為GsDREB。全長(zhǎng)基因PCR擴(kuò)增的引物序列如下GsDREB UP CACggA TCCAgT TTg ATT gAg TAC TgT gTgGsDREB DOWNggCgAg CTCCTT gTA TTA gTT gTA TAg ggg利用DNA、氨基酸序列分析軟件分析基因序列，在序列水平上推測(cè)基因的功能。該基因包括1179bp的開(kāi)放讀碼框，編碼392個(gè)氨基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子，說(shuō)明基因的完整性；分析其氨基酸序列，在GsDREB內(nèi)部具有轉(zhuǎn)錄因子特有的與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域DREBP/AP2，其保守的氨基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個(gè)平行的β-折疊和一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，可以與DNA的GCC-BOX結(jié)合，N端具有6個(gè)氨基酸的核定位序列(SRKRKS)。這些分析結(jié)果暗示著該基因編碼一類轉(zhuǎn)錄因子，并且具有轉(zhuǎn)錄因子所具有的結(jié)構(gòu)特征。
本發(fā)明從東北野生大豆中克隆的GsDREB基因，其氨基酸序列中含有轉(zhuǎn)錄因子所特有的核定位序列、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及C-端酸性活性區(qū)等。序列決定功能，因此該基因具有轉(zhuǎn)錄因子的活性，在植物抗?jié)B透脅迫過(guò)程中起調(diào)控作用。并且該基因來(lái)源于野生大豆，與大豆親緣關(guān)系很近，外源基因遺傳轉(zhuǎn)化大豆可以穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，因此該研究為大豆抗?jié)B透脅迫基因工程提供新的基因資源；同時(shí)對(duì)于理解滲透脅迫分子生物學(xué)機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。


圖1是DREBP/AP2結(jié)構(gòu)域PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果；圖2是GsDREB全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增結(jié)果；圖3是克隆片段GsDREB氨基酸序列在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源性檢索結(jié)果具體實(shí)施方式
下面舉例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述DREB屬于DREBP亞家族，在序列上具有保守的AP2結(jié)構(gòu)域，而與EREBP家族的其它亞家族的氨基酸序列有差別。根據(jù)擬南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2(AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的多序列比對(duì)結(jié)果，在DREBP/AP2的β-折疊區(qū)和α-螺旋區(qū)設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)并引物。采用RT-PCR的方法，獲得到191bp的片段。圖1是其結(jié)構(gòu)域PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果，其中M2000Mark；1，3，5，7第一輪PCR的結(jié)果，退火溫度分別為44.8℃，49.1℃，53.3℃，56.6℃；2，4，6，8為第二輪PCR的結(jié)果，退火溫度為44℃。PCR擴(kuò)增的簡(jiǎn)并引物序列為GsAP2 UPgg(A/T/C)AAATgggT(T/A/g)(g/T)(C/g)(A/T/C)gAGsAP2 DOWN gg(g/A)AA(g/A)TT(g/A)Ag(A/T/g)(A/C)(g/T)AgC克隆，測(cè)序，序列分析。其氨基酸序列，具有DREBP/AP2區(qū)域保守的氨基酸序列，命名為GsAP2。與GsAP2相似性最高的是擬南芥DREB2A和水稻的DREB-likeproteine，均達(dá)到82％。證明所獲得的片段即為野生大豆DREB的保守區(qū)-DREBP/AP2。GsAP2的序列及推測(cè)的氨基酸序列為(灰框的氨基酸為保守的氨基酸殘基為DREBP/AP2結(jié)構(gòu)域保守氨基酸，單線的氨基酸序列構(gòu)成β-折疊結(jié)構(gòu)，雙線的區(qū)域?yàn)棣?螺旋結(jié)構(gòu))1 ACTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGGCAGAGGACACGGGGGAAATGGGTT1 T Q N S Q C N Y 61GGTGAGATTAGGGAGCCCAATAGAGGAAGCAGGCTTTGGTTGGGTACCTTCTCTTCTCAG21 121 CCGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGAGCTATGTATGGTCCTTGTGCTATC41 C A I181 CTTAACTTTCC61 L N F為了獲得DREB基因的全長(zhǎng)的序列，我們以獲得的GsAP2序列為靶序列，采用3’RACE和5’RACE方法分別對(duì)其3’和5’末端未知的序列進(jìn)行擴(kuò)增。RACE-PCR擴(kuò)增的引物序列如下Primers Sequences(5‘→3’) PCRAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACA A(17) 3’RACEAUAPggC CAC gCg TCg ACT AgT AC3’/5’RACEAAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACg ggI Igg gII ggg IIg 5’RACEGsDREB 3GSP1gAg gAg TTA ggC AgA ggA CAC g 3’RACEGsDREB 3GSP2gCA ggC TTT ggT Tgg gTA C 3’RACEGsDREB 3GSP3gCT gCT CTT gCC TAT gAT gAA G 3’RACEGsDREB 5GSP1AAg gAT AgC ACA Agg ACC ATA C 5’RACEGsDREB 5GSP2TgC TTC CTC TAT Tgg gCT CC5’RACEGsDREB 5GSP3CgT gTC CTC TgC CTA ACT CCT C 5’RACE經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得1162bp 3’端序列和482bp 5’端序列；它們與191bp的保守區(qū)分別具有106bp和45bp的重疊區(qū)域；將5’RACE序列、3’RACE序列和GsAP2序列拼接，獲得1622bp的拼接序列；在拼接的兩端序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法進(jìn)行全長(zhǎng)基因擴(kuò)增，結(jié)果獲得了1360bp全長(zhǎng)cDNA序列，該基因被命名為GsDREB。圖2是全長(zhǎng)基因PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果，其中M2000Mark；1，2，3，4不同退火溫度下擴(kuò)增的結(jié)果，退火溫度分別為52℃、54℃、56℃、58℃，目的片段的長(zhǎng)度為1.3kb。全長(zhǎng)基因PCR擴(kuò)增的引物序列如下GsDREB UP CACggA TCCAgT TTg ATT gAg TAC TgT gTgGsDREB DOWNggCgAg CTCCTT gTA TTA gTT gTA TAg ggg利用DNA、氨基酸序列分析軟件分析基因序列，在序列水平上推測(cè)基因的功能。該基因包括1179bp的開(kāi)放讀碼框，編碼392個(gè)氨基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子，說(shuō)明基因的完整性；分析其氨基酸序列，在GsDREB內(nèi)部具有轉(zhuǎn)錄因子特有的與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域DREBP/AP2，其保守的氨基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個(gè)平行的β-折疊和一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，可以與DNA的GCC-BOX結(jié)合，N端具有6個(gè)氨基酸的核定位序列(SRKRKS)。這些分析結(jié)果暗示著該基因編碼一類轉(zhuǎn)錄因子，并且具有轉(zhuǎn)錄因子所具有的結(jié)構(gòu)特征。圖3是克隆片段GsDREB氨基酸序列在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源性檢索結(jié)果。
基因的全長(zhǎng)DNA序列及推測(cè)的氨基酸序列為1 TTTCATTGAGTACTGTGTGGCGAAGTTTGTGTCTTGGATTTTGTGGAC GGTGCTTAT1 M G A Y61GATCAAGTTTCTCTTAAGCCATTGGATTCTTCTAGAAAGAGGAAAAGTAGGAGCAGAGGG5 D Q V S L K P L D S R S R G121 GATGGGTCCAAATCTGTGGCTGAGACTATTGCAAAGTGGAAGGAATACAATGAGCATCTT25 D G S K S V A E T I A K W K E Y N E H L181 TATTCTGGCAAAGATGATAGTAGAACAACTCGTAAGGCGCCGGCTAAAGGTTCGAAGAAA45 Y S G K D D S R T T R K A P A K G S K K241 GGGTGCATGAAAGGGAAGGGAGGACCTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGG65 G C M K G K G G P Q N S Q C 301 CAGAGGACATGGGGGAAATGGGTTGGTGAGATTAGGGAACCCAATAGAGGAAGCAGGCTT85 361 TGGTTGGGTACCTTCTCTTCTGCCCAGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGA105 421 GCTATGTATGGTCCTTGTGCACGCCTCAATTTTCCCGAAATCACAGATTATCCTTCTGTT125 E I T D Y P S V
481AAGGAATCGTTGAAGGACTCTTCGATGGCTGCATCGTCGTCTTGTTCTTCGGCAGCAACT145 K E S L K D S S M A A S S S C S S A A T541GCAGCATCTGACACTACTACTACAACATCGAACCAATCGGAGGTTTGTGCTGTTGAGGAT165 A A S D T T T T T S N Q S E V C A V E D601GTTATCGAGAAACCTGCGAATGTGAATGATAAGTTTAATGATTGTCATAAGGCTTACGTA185 V I E K P A N V N D K F N D C H K A Y V661TCTGCCTCACCAACTAGTAGAATGAAGCAAGAGCCTAGGGATGAGGCTGTGGACCACATG205 S A S P T S R M K Q E P R D E A V D H M721GACACAGGGGCTGGGGAAATTCAAGATGTCGGACTAGAAGGAACACATGATACTGGGCAG225 D T G A G E I Q D V G L E G T H D T G Q781GTTGCAGAGAATGTAAATAAAGATCAGATGGATTTGTCATGGATTGATGGCCTTGACTTT245 V A E N V N K D Q M D L S W I D G L D F841ATTGACGATTACTTGAAGAGCCTTTCCGCGGATGAGTTATTTCAGGTGGACGAACTTTTG265 I D D Y L K S L S A D E L F Q V D E L L901GGGCTTATAGATAATAACCCAATCGATAACTCTGTGTTGATGCAAGGTTTGGATTTTGGA285 G L I D N N P I D N S V L M Q G L D F G961CAAATGGGTTTTCCTGGAGATGGTAATCCTCAGGTTGACGATACTCCTTCAAGCTTTATT305 Q M G F P G D G N P Q V D D T P S S F I1021 TATCAGTTGCAAAATCCAGATGCCAAGTTGTTAGGAAGTTTGCCCCATATGGAGCAGACA325 Y Q L Q N P D A K L L G S L P H M E Q T1081 CCATCAGGTGTTGATTATGGATTAGATTTCTTGAAAACAGTGGAGCCAGGGGACTATAAT345 P S G V D Y G L D F L K T V E P G D Y N1141 GGTGGAGGGGAAGAACCACCATTTCTTAATTTGGATGATGATCTAAACCATGATTCAAAT365 G G G E E P P F L N L D D D L N H D S N1201 GGCATGCAAGCAAGGAAGGGTGGC AGAAGGCTACGTGTATCTGCTTCATTTTCAACT385 G M Q A R K G G *1261 GGTTCTAGCGTCTGCTGGTAATCTGTCTCTTGGGCTGTTGTCCCCTTTTTAGCTATATAA1321 TAGGCGCATAAGAGGAATACCCCTATACAACTAATACAAG
權(quán)利要求
1.東北野生大豆編碼DREB轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征是該基因包括1179bp的開(kāi)放讀碼框，編碼392個(gè)氨基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子；在GsDREB內(nèi)部具有轉(zhuǎn)錄因子特有的與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域DREBP/AP2，其保守的氨基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個(gè)平行的β-折疊和一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，可以與DNA的GCC-BOX結(jié)合，N端具有6個(gè)氨基酸的核定位序列(SRKRKS)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東北野生大豆編碼DREB轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征是其序列及推測(cè)的氨基酸序列為1 TTTCATTGAGTACTGTGTGGCGAAGTTTGTGTCTTGGATTTTGTGGAC GGTGCTTAT1 MG A Y61GATCAAGTTTCTCTTAAGCCATTGGATTCTTCTAGAAAGAGGAAAAGTAGGAGCAGAGGG5 D Q V S L K P L D S R S R G121 GATGGGTCCAAATCTGTGGCTGAGACTATTGCAAAGTGGAAGGAATACAATGAGCATCTT25 D G S K S V A E T I A K W K E Y N E H L181 TATTCTGGCAAAGATGATAGTAGAACAACTCGTAAGGCGCCGGCTAAAGGTTCGAAGAAA45 Y S G K D D S R T T R K A P A K G S K K241 GGGTGCATGAAAGGGAAGGGAGGACCTCAAAATTCTCAGTGTAACTACAGAGGAGTTAGG65 G C M K G K G G P Q N S Q C 301 CAGAGGACATGGGGGAAATGGGTTGGTGAGATTAGGGAACCCAATAGAGGAAGCAGGCTT85 361 TGGTTGGGTACCTTCTCTTCTGCCCAGGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCTAGA105 421 GCTATGTATGGTCCTTGTGCACGCCTCAATTTTCCCGAAATCACAGATTATCCTTCTGTT125 E I T D Y P S V481 AAGGAATCGTTGAAGGACTCTTCGATGGCTGCATCGTCGTCTTGTTCTTCGGCAGCAACT145K E S L K D S S M A A S S S C S S A A T541 GCAGCATCTGACACTACTACTACAACATCGAACCAATCGGAGGTTTGTGCTGTTGAGGAT165A A S D T T T T T S N Q S E V C A V E D601 GTTATCGAGAAACCTGCGAATGTGAATGATAAGTTTAATGATTGTCATAAGGCTTACGTA185V I E K P A N V N D K F N D C H K A Y V661 TCTGCCTCACCAACTAGTAGAATGAAGCAAGAGCCTAGGGATGAGGCTGTGGACCACATG205S A S P T S R M K Q E P R D E A V D H M721 GACACAGGGGCTGGGGAAATTCAAGATGTCGGACTAGAAGGAACACATGATACTGGGCAG225D T G A G E I Q D V G L E G T H D T G Q781 GTTGCAGAGAATGTAAATAAAGATCAGATGGATTTGTCATGGATTGATGGCCTTGACTTT245 V A E N V N K D Q M D L S W I D G L D F841 ATTGACGATTACTTGAAGAGCCTTTCCGCGGATGAGTTATTTCAGGTGGACGAACTTTTG265I D D Y L K S L S A D E L F Q V D E L L901 GGGCTTATAGATAATAACCCAATCGATAACTCTGTGTTGATGCAAGGTTTGGATTTTGGA285G L I D N N P I D N S V L M Q G L D F G961 CAAATGGGTTTTCCTGGAGATGGTAATCCTCAGGTTGACGATACTCCTTCAAGCTTTATT305Q M G F P G D G N P Q V D D T P S S F I1021 TATCAGTTGCAAAATCCAGATGCCAAGTTGTTAGGAAGTTTGCCCCATATGGAGCAGACA325Y Q L Q N P D A K L L G S L P H M E Q T1081 CCATCAGGTGTTGATTATGGATTAGATTTCTTGAAAACAGTGGAGCCAGGGGACTATAAT345P S G V D Y G L D F L K T V E P G D Y N1141 GGTGGAGGGGAAGAACCACCATTTCTTAATTTGGATGATGATCTAAACCATGATTCAAAT365G G G E E P P F L N L D D D L N H D S N1201 GGCATGCAAGCAAGGAAGGGTGGC AGAAGGCTACGTGTATCTGCTTCATTTTCAACT385G M Q A R K G G *1261 GGTTCTAGCGTCTGCTGGTAATCTGTCTCTTGGGCTGTTGTCCCCTTTTTAGCTATATAA1321 TAGGCGCATAAGAGGAATACCCCTATACAACTAATACAAG
3.一種東北野生大豆編碼DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆方法根據(jù)擬南芥DREB2A、DREB2B(AB007790、AB007791)、番茄DREB2(AF500012)、玉米DREB2(AF450481)的多序列比對(duì)結(jié)果，在DREBP/AP2的β-折疊區(qū)和α-螺旋區(qū)設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)并引物，引物序列為GsAP2 UP gg(A/T/C)AAA Tgg gT(T/A/g)(g/T)(C/g)(A/T/C)gAGsAP2 DOWNgg(g/A)AA(g/A)TT(g/A)Ag(A/T/g)(A/C)(g/T)A gC以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用降落PCR的方法，獲得到191bp的片段，命名為GsAP2；以獲得的GsAP2序列為靶序列，采用3’RACE和5’RACE方法分別對(duì)其3’和5’末端未知的序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如下PrimersSequences(5‘→3’) PCRAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT ACA A(17)3’RACEAUAP ggC CAC gCg TCg ACT AgT AC 3’/5’RACEAAPggC CAC gCg TCg ACT AgT ACg ggI Igg gII ggg IIg 5’RACEGsDREB 3GSP1 gAg gAg TTA ggC AgA ggA CAC g3’RACEGsDREB 3GSP2 gCA ggC TTT ggT Tgg gTA C3’RACEGsDREB 3GSP3 gCT gCT CTT gCC TAT gAT gAA G3’RACEGsDREB 5GSP1 AAg gAT AgC ACA Agg ACC ATA C5’RACEGsDREB 5GSP2 TgC TTC CTC TAT Tgg gCT CC 5’RACEGsDREB 5GSP3 CgT gTC CTC TgC CTA ACT CCT C5’RACE經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得1162bp 3’端序列和482bp 5’端序列；它們與191bp的保守區(qū)分別具有106bp和45bp的重疊區(qū)域；將5’RACE序列、3’RACE序列和GsAP2序列拼接，獲得1622bp的拼接序列；在拼接的兩端序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法進(jìn)行全長(zhǎng)基因擴(kuò)增，結(jié)果獲得了1360bp全長(zhǎng)cDNA序列，該基因被命名為GsDREB，全長(zhǎng)基因PCR擴(kuò)增的引物序列如下GsDREB UP CACggA TCCAgT TTg ATT gAg TAC TgT gTgGsDREB DOWNggCgAg CTCCTT gTA TTA gTT gTA TAg ggg利用DNA、氨基酸序列分析軟件分析基因序列，在序列水平上推測(cè)基因的功能；該基因包括1179bp的開(kāi)放讀碼框，編碼392個(gè)氨基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子，說(shuō)明基因的完整性；分析其氨基酸序列，在GsDREB內(nèi)部具有轉(zhuǎn)錄因子特有的與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域DREBP/AP2，其保守的氨基酸殘基為RGxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個(gè)平行的β-折疊和一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，可以與DNA的GCC-BOX結(jié)合，N端具有6個(gè)氨基酸的核定位序列(SRKRKS)；這些分析結(jié)果暗示著該基因編碼一類轉(zhuǎn)錄因子，并且具有轉(zhuǎn)錄因子所具有的結(jié)構(gòu)特征，必將行使轉(zhuǎn)錄因子的功能，在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中對(duì)功能基因的表達(dá)起調(diào)控作用。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種東北野生大豆編碼DREB轉(zhuǎn)錄因子基因及其克隆方法。該基因包括1179bp完整的開(kāi)放讀碼框，編碼392個(gè)氨基酸，有ATG起始密碼子和TAG終止密碼子；通過(guò)Protein Conserve Domain程序分析，在GsDREB內(nèi)部具有轉(zhuǎn)錄因子特有的與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域DREBP/AP2，其保守的氨基酸殘基為RgxRxRxWxKxVxExRx...xWxxT，具有三個(gè)平行的β－折疊和一個(gè)α－螺旋結(jié)構(gòu)，可以與DNA的GCC－BOX結(jié)合，N端具有6個(gè)氨基酸的核定位序列。這些分析結(jié)果暗示著該基因編碼一類轉(zhuǎn)錄因子，并且具有轉(zhuǎn)錄因子所具有的結(jié)構(gòu)特征，必將行使轉(zhuǎn)錄因子的功能，在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中對(duì)功能基因的表達(dá)起調(diào)控作用。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1850975SQ20061001002
公開(kāi)日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者朱延明, 才華, 柏錫, 李 杰 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)