專利名稱：分離與富集蛋白質(zhì)的分子印跡樹脂和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子印跡樹脂的合成及其應(yīng)用，特別是一種分子印跡樹脂和制備方法及其分離與富集天然微量蛋白質(zhì)的應(yīng)用，以克隆蛋白質(zhì)為模板用輔助識(shí)別的限長聚合物鏈(識(shí)別分子)合成蛋白質(zhì)印跡聚合物，具體地用于天然微量蛋白質(zhì)的分離、富集。
背景技術(shù)：
分子印跡技術(shù)是聚合物通過“記憶”印跡分子的立體空間而具有的分子水平上的專一性識(shí)別能力。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特殊性及生物活性的要求，近年來印跡蛋白質(zhì)成為分子印跡領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。利用非共價(jià)作用是印跡蛋白質(zhì)最簡單方法。常用的弱分子間作用力有氫鍵、靜電力、電荷轉(zhuǎn)移、疏水作用以及范德華力等。
印跡蛋白質(zhì)的方法主要有包埋法、表面印跡法、抗原決定基的方法。早期采用最多的聚合方法是包埋法，印跡的蛋白質(zhì)通過蛋白酶的降解去除，印跡聚合物可以重新吸附印跡分子。Hjéten等(Hjéten J，Liao J L，Nakazato Ketal.，Chromatography，1997，44227-234)采用該法，以丙烯酰胺為單體合成了低交聯(lián)度的凝膠，對(duì)血紅蛋白、生長激素、紅細(xì)胞色素、肌紅蛋白和核糖核酸酶等進(jìn)行了印跡。洗脫印跡分子后得到了具有良好選擇性的分子印跡聚合物，不同的印跡分子能被相應(yīng)的凝膠所吸附。
表面印跡法制得的介質(zhì)使印跡識(shí)別位點(diǎn)處在顆粒的表面(或表層)，克服了包埋法印跡分子利用率低、印跡分子洗脫困難、介質(zhì)內(nèi)部擴(kuò)散阻力大、介質(zhì)形態(tài)不規(guī)則等缺點(diǎn)。從蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性來看，表面印跡法更適合印跡蛋白質(zhì)分子。其優(yōu)點(diǎn)是可利用粒子的機(jī)械穩(wěn)定性及調(diào)節(jié)粒子本身性能的適應(yīng)不同的印跡需要。表面印跡法印跡蛋白質(zhì)的載體有硅膠粒子、云母、聚合物微球等。硅膠作載體的優(yōu)點(diǎn)是在聚合過程中硅膠表面的修飾基團(tuán)通過價(jià)鍵距離控制，只有相應(yīng)底物有強(qiáng)烈識(shí)別作用，可大大降低非特異吸附對(duì)選擇性的影響。但用聚合方法制備的微球作載體(Ye L，Cormack PAG， Mosbach K.AnalChim Acta.2001，435187～196)可通過對(duì)初始聚合階段工藝條件的控制，得到尺寸均一，有良好機(jī)械性能的聚合物顆粒，不用粉碎和篩分，能保證得到的印跡聚合物的物理和化學(xué)性能。表面印跡法一般是在微球上進(jìn)行印跡或涂層印跡聚合物，或是將蛋白質(zhì)首先吸附到云母上(Shi H，Tsai W B，F(xiàn)errari S，Ratner B D.，Nature，1999，398593-597)，然后將一薄層的二糖分子包被在吸附的蛋白質(zhì)上，糖層與蛋白質(zhì)通過氫鍵結(jié)合。接著在糖分子表面聚合上一層光滑的熒光聚合物薄層。最后除去云母并溶解掉印跡蛋白質(zhì)，即生成了具有蛋白質(zhì)形狀空穴的聚二糖表面印跡聚合物。Sergey等(Bossi A，Piletsky S A，PiletskaE V，et al.Anal.Chem.，2001，735281～5286)提出表面接枝印跡方法是在聚苯乙烯樹脂表面涂一薄層穩(wěn)定的可鍵合的物質(zhì)，該物質(zhì)在蛋白質(zhì)分子存在下可聚合。
抗原決定基的方法根據(jù)抗原和抗體僅僅是通過一小部分即抗原決定基來相互作用的原理而建立的一種方法，所謂的抗原決定基是由三到六個(gè)氨基酸殘基組成的表面區(qū)域(Rachkov A，Minoura N.Biochi et Biophy Acta，2001，1544255～266)。如果使用代表蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)的小部分裸露片段的短肽作為模板，就會(huì)產(chǎn)生與該短肽相匹配的空間大孔，從而分子印跡聚合物就會(huì)識(shí)別含有該短肽部分的整個(gè)蛋白質(zhì)分子?？乖瓫Q定基方法的缺點(diǎn)是不僅可以識(shí)別模板分子，還可以識(shí)別其他的具有與模板分子相同序列的氨基酸和蛋白質(zhì)。
從上述情況來看，目前印跡蛋白質(zhì)方法單一，單體聚合發(fā)生在有機(jī)溶劑中，用以印跡的蛋白質(zhì)種類少且均為常見的、在生物體內(nèi)含量很大或很容易得到的蛋白質(zhì)，這限制了蛋白質(zhì)印跡聚合物的應(yīng)用的實(shí)際意義。因此開發(fā)印跡蛋白質(zhì)的新方法，尤其是用以吸附、富集天然微量蛋白質(zhì)的分子印跡聚合物是迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種分離與富集蛋白質(zhì)的分子印跡樹脂和制備方法，即它是將一段帶有隨機(jī)分布功能基團(tuán)的識(shí)別分子引入識(shí)別體系，該識(shí)別分子與作為模板的克隆蛋白質(zhì)先進(jìn)行自組裝，然后組裝體與自由單體丙烯酰胺共同以聚丙烯酸甲酯大孔樹脂為載體在水相中進(jìn)行交聯(lián)聚合。本發(fā)明成球在有機(jī)相中進(jìn)行，印跡在水相中進(jìn)行，避免了對(duì)模板蛋白質(zhì)的破壞，實(shí)用性強(qiáng)。以克隆蛋白質(zhì)為模板的方法克服了天然微量蛋白質(zhì)的印跡模板難以得到的瓶頸。使用免疫印跡的方法檢測(cè)吸附蛋白及其洗滌過程，這種檢測(cè)方法能夠在天然細(xì)胞提取物的復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合體系中特異性地檢測(cè)出目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量且靈敏度高，直觀準(zhǔn)確，目標(biāo)蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中的含量提高了300倍以上。。
本發(fā)明提供的分子印跡樹脂的孔徑為20nm，小球直徑為0.2mm，按以下步驟制備1)以丙烯酸丁酯為單體，在引發(fā)劑、催化劑和配位劑存在下，通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)合成聚合度為30的鏈聚合物，水解后與烯丙基氯進(jìn)行部分取代反應(yīng)，取代后的側(cè)基由于帶有雙鍵，可以被引發(fā)聚合從而錨定到也帶有懸掛雙鍵的大孔微球表面，故稱為錨定基團(tuán)，通過氯含量測(cè)試實(shí)驗(yàn)證實(shí)，有20％的羧基未發(fā)生取代反應(yīng)，這些未取代的羧基可以和蛋白質(zhì)表面的帶正電荷的基團(tuán)作用，所以稱為識(shí)別基團(tuán)；2)以克隆蛋白質(zhì)為模板與識(shí)別分子在水溶液中進(jìn)行組裝，用丙烯酸甲酯聚合而成的大孔微球?qū)ψR(shí)別分子/模板蛋白質(zhì)組裝體進(jìn)行吸附，接著在體系中加入丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺，在引發(fā)劑過二硫酸胺作用下，組裝體中識(shí)別分子錨定基團(tuán)側(cè)鏈的雙鍵和微球表面的雙鍵進(jìn)行交聯(lián)共聚，把輔助識(shí)別聚合物鏈固定到載體小球上；3)用高離子強(qiáng)度的緩沖溶液洗脫蛋白質(zhì)和未聚合的識(shí)別分子，徹底去除殘留蛋白質(zhì)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳/硝酸銀染色的方法檢測(cè)是否有殘留的蛋白質(zhì)，得到分子印跡樹脂。
所述的識(shí)別分子是聚合度為30的低分子量聚丙烯酸進(jìn)行部分取代反應(yīng)的產(chǎn)物，該聚合物鏈上具有隨機(jī)分布的識(shí)別基團(tuán)與錨定基團(tuán)，其中識(shí)別基團(tuán)含量20％，錨定基團(tuán)含量80％。
所述的克隆蛋白質(zhì)是克隆的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)。
一種制備分子印跡樹脂的方法包括以下步驟1)在120℃，α-氯代苯乙烷為引發(fā)劑，氯化亞銅為催化劑，聯(lián)二吡啶為配位劑，丙烯酸丁酯聚合反應(yīng)8～10h，然后70℃在5％的NaOH溶液中水解6h，制得聚丙烯酸，聚合度在30左右；α-氯代苯乙烷、氯化亞銅、聯(lián)二吡啶的摩爾比為1∶1∶3；2)在室溫，充分?jǐn)嚢柘戮徛渭酉┍?，烯丙基氯與聚丙烯酸摩爾比為24∶1，產(chǎn)物通過溴加成-紫外分光光度法測(cè)定其雙鍵含量，滴加稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH值使溶液為酸性，產(chǎn)生絮狀沉淀，離心分離后，制得功能基化后的聚丙烯酸，即為識(shí)別分子。
3)將識(shí)別分子10mg與克隆的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)400μg混合，在4℃進(jìn)行自組裝12h～15h，然后向溶液中加入1g丙烯酸酯大孔微球樹脂載體，吸附2h后加入38.8mg丙烯酰胺、1.2mg N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、1.28mg過二硫酸銨，常溫下通氮除氧1h，然后加入0.65mg N，N，N′，N′-四甲基二乙胺溶液，交聯(lián)聚合反應(yīng)2h，用2M氯化鉀溶液洗滌樹脂球至電泳檢測(cè)無條帶，得到分子印跡樹脂。
步驟1)所述的丙烯酸丁酯與α-氯代苯乙烷的質(zhì)量比為28∶1。
步驟2)所述的烯丙基氯與聚丙烯酸摩爾比為24∶1，即聚合度為30的聚丙烯酸鏈上有80％的羧基發(fā)生反應(yīng)，其余20％的羧基未發(fā)生反應(yīng)。
所述的分子印跡樹脂在分離、富集天然蛋白質(zhì)上的應(yīng)用。
所述的分子印跡樹脂制成的用于蛋白質(zhì)分離的試劑盒，包括識(shí)別分子、丙烯酰胺單體及引發(fā)體系和丙烯酸甲酯大孔樹脂。
本發(fā)明提供的所述的分子印跡樹脂應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離的方法包括下述步驟(1)4℃下，將計(jì)量的分子印跡樹脂直接放入豬白細(xì)胞提取物中，吸附15h；(2)吸附蛋白后的樹脂依次用10mM Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液洗10次，每次1mL，再用1mL含10mM Tris-HCl(pH 7.5)和300mM氯化鉀的緩沖溶液洗滌樹脂，得到洗滌液；(3)應(yīng)用Bradford法檢測(cè)氯化鉀緩沖溶液的洗滌液，得出總蛋白含量；再取200μL洗滌液，用三氯乙酸/脫氧膽酸納(TCA/DOC)方法沉淀蛋白，蛋白液制樣后恒流走十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用豬親環(huán)素18的抗體對(duì)其做免疫印跡檢測(cè)吸附蛋白中親環(huán)素18的含量，從而得出在所吸附蛋白質(zhì)中親環(huán)素18與總蛋白質(zhì)含量的比值。
本發(fā)明可做成試劑盒，即包括識(shí)別分子、丙烯酰胺單體及引發(fā)體系和丙烯酸甲酯大孔樹脂。
本發(fā)明得到的分子印跡樹脂在天然的細(xì)胞提取物中，能夠極大地富集目標(biāo)蛋白質(zhì)，目標(biāo)蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中的含量提高了300倍以上。
本發(fā)明不同于其他印跡蛋白質(zhì)的方法有兩點(diǎn)，其一是引入了用以輔助識(shí)別的識(shí)別分子，本發(fā)明中的識(shí)別分子是具有多識(shí)別位點(diǎn)的，且這些識(shí)別位點(diǎn)是隨機(jī)分布的，這種方法克服了通常由單純的單體制備的識(shí)別體系識(shí)別位點(diǎn)單一、結(jié)構(gòu)緊密蛋白質(zhì)不易洗脫的弊端。同時(shí)這種方法使得成球與印跡可以分步進(jìn)行，成球在有機(jī)相中進(jìn)行，印跡在水相中進(jìn)行，避免了對(duì)模板蛋白質(zhì)的破壞，實(shí)用性強(qiáng)。其二是本發(fā)明使用克隆的蛋白質(zhì)作為模板，克服了印跡天然微量蛋白質(zhì)時(shí)模板無法得到的瓶頸，而這一點(diǎn)正是蛋白質(zhì)印跡技術(shù)無法取得更多的應(yīng)用價(jià)值的主要困難之一。


圖1分子印跡樹脂的對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)吸附效果的測(cè)定。
圖2分子印跡樹脂再生性的測(cè)定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
α-氯代苯乙烷為引發(fā)劑0.3004g，氯化亞銅為催化劑0.2135g，聯(lián)二吡啶為配位劑1.0000g，與丙烯酸丁酯4.1051g一同加入封管中，即α-氯代苯乙烷、氯化亞銅、聯(lián)二吡啶的摩爾比為1∶1∶3。丙烯酸丁酯與α-氯代苯乙烷的質(zhì)量比為28∶1。封管經(jīng)過反復(fù)通氮?dú)?、抽真空后，?20℃反應(yīng)8h，所得產(chǎn)物加入100mL 10％的氫氧化鈉溶液在70℃水解6h，溶液完全澄清后，降至室溫，充分?jǐn)嚢柘戮徛渭酉┍龋┍扰c聚丙烯酸摩爾比為24∶1，產(chǎn)物通過溴加成-紫外分光光度法測(cè)定其雙鍵含量，結(jié)果證實(shí)，聚合度為30的聚丙烯酸鏈上有80％的羧基帶有雙鍵，其余20％的羧基未發(fā)生反應(yīng)不帶有雙鍵，滴加稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH值使溶液為酸性，產(chǎn)生絮狀沉淀，離心分離后，制得功能基化后的聚丙烯酸，聚合度在30左右，即為識(shí)別分子。
取識(shí)別分子1g，溶于100mL10mM Tris-HCl(pH7.8)緩沖液中，分裝貯存。取上述溶液1mL，加入1mL含有400μg克隆豬親環(huán)素18的蛋白質(zhì)溶液，于4℃旋轉(zhuǎn)12h，然后向溶液中加入1g丙烯酸酯樹脂載體(大孔微球)吸附2h，接著加入38.8mg丙烯酰胺、1.2mgN，N-亞甲基雙丙烯酰胺、1.28mg過二硫酸銨，常溫下通氮除氧1h，然后加入0.65mgN，N，N′，N′-四甲基二乙胺溶液，交聯(lián)聚合反應(yīng)2h，用2mol.L-1氯化鉀溶液洗滌樹脂球至電泳檢測(cè)無條帶，得到分子印跡樹脂。
4℃下，將上述分子印跡樹脂與1mL豬白細(xì)胞提取物混合，吸附15h；吸附蛋白后的樹脂依次用10mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液洗10次，每次1mL，再用1mL含10mM Tris-HCl(pH7.5)的300mM氯化鉀溶液洗滌樹脂，得到洗滌液；應(yīng)用Bradford法檢測(cè)氯化鉀溶液的洗滌液以及豬白細(xì)胞提取物溶液，得出總蛋白含量；再取200μL洗滌液，用三氯乙酸/脫氧膽酸納(TCA/DOC)方法沉淀蛋白，蛋白液制樣后恒流走十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用豬親環(huán)素18的抗體對(duì)其做免疫印跡檢測(cè)吸附蛋白中親環(huán)素18的含量，從而得出在所吸附蛋白質(zhì)中親環(huán)素18與總蛋白質(zhì)含量的比值，同樣的方法亦可測(cè)得豬白細(xì)胞提取物溶液中親環(huán)素18的含量。結(jié)果如圖1所示，在0.08μL豬白細(xì)胞提取物中總共含蛋白質(zhì)0.1μg，在其中檢測(cè)不到親環(huán)素18(第-泳道)；在20μL豬白細(xì)胞提取物中總共含蛋白質(zhì)26μg，其中有6ng親環(huán)素18(第二泳道)；而在200μL的洗滌液總共含有蛋白質(zhì)0.1μg，其中有7ng親環(huán)素18(第三泳道)，所以在1mL豬白細(xì)胞提取物中親環(huán)素18在總蛋白質(zhì)中所占比例為300ng/1.3mg(即0.023％)，而在1mL洗脫液中親環(huán)素18在總蛋白質(zhì)中所占比例為35ng/0.5μg(即7％)，目標(biāo)蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中的含量提高了300倍。
溴加成-紫外分光光度法測(cè)定雙鍵含量1.配制溶液取86mL48％的氫溴酸(密度1.49)、32mL水和882mL冰乙酸，充分混合制成“對(duì)照溶液”。取500mL對(duì)照溶液，加入3.25mL溴，配得“三溴溶液”。
2.以對(duì)照溶液為參比，在410nm處測(cè)量三溴溶液的吸光度值，穩(wěn)定后加入100μL識(shí)別分子溶液，穩(wěn)定1分鐘后測(cè)量其吸光度值。
3.根據(jù)吸光度變化，換算可知溴的減少量，從而得到識(shí)別分子溶液中雙鍵的含量。
克隆蛋白質(zhì)豬親環(huán)素18的制備方法1.目的基因的克隆本實(shí)驗(yàn)采用豬肝臟mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，并將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒載體pGEX-5X1進(jìn)行限制性內(nèi)切酶修飾，待連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中并進(jìn)行質(zhì)粒鑒定。
(1)在200mL的薄壁PCR管中，按下列順序依次加入所需各組分進(jìn)行PCR反應(yīng)；(2)稱取0.75g瓊脂糖，加入50mL 1×TAE，混勻后加熱至沸騰，取出后待稍冷時(shí)加入2μL溴化乙錠(EB)溶液(10mg/mL)，將膠液倒入電泳槽的膠臺(tái)上，并插入梳子；從100μL的反應(yīng)體系中，取出16μL樣品，加4μL 5×加樣緩沖液；將20μL樣品全部加入電泳膠的齒孔中，倒入1×TAE直至沒過膠面，在80V下進(jìn)行電泳，結(jié)束后于紫外燈下觀察結(jié)果。
(3)在PCR產(chǎn)物中加入1/10體積的NaAc溶液(3M，pH5.2)，混勻后加入2.5倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀20min；于4℃、12,000rpm離心15min；棄去上清，用1mL 70％乙醇洗滌；再次于4℃、12,000rpm離心15min；棄去上清，真空干燥沉淀30min，DNA量多時(shí)在管壁上呈無色透明的膜狀物；加14μL滅菌水，使之溶解，然后按照下列配比向管中依次加入兩種限制性內(nèi)切酶，建立酶切體系；取2μL濃度為450ng/mL的pGEX-5X1質(zhì)粒，也加入同樣的兩種限制性內(nèi)切酶，建立酶切體系。
(5)在20μL酶切產(chǎn)物中加5μL 5×加樣緩沖液，混勻、離心。灌制濃度為1.5％的瓊脂糖凝膠，上樣，80V下進(jìn)行電泳。等染料前沿走至膠的一半時(shí)，在紫外燈下觀察，迅速將目的條帶切下；將凝膠塊放入充滿1×TAE電泳緩沖液的透析袋內(nèi)一側(cè)，放入電泳槽使凝膠一側(cè)靠近負(fù)極，80V電泳，使DNA在電場(chǎng)的作用下從凝膠遷移到緩沖液中。電泳1h后，加反向電壓100V，反洗脫60sec；將透析袋中的液體吸入一滅菌的1.5mL離心管中(約500μL)，加等體積的三合一酚，劇烈振蕩10sec，室溫離心15sec，將上層含DNA的水相轉(zhuǎn)入另一新管中；加入等體積的氯仿，劇烈振蕩10sec，離心15sec，將上層含DNA的水相轉(zhuǎn)入另一新管中；加入1/10體積的NaAC(3M，pH5.2)溶液，稍振蕩后加入2.5倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀20min；于4℃、12,000rpm離心15min；棄去上清，加入1mL 70％無水乙醇，洗滌沉淀；再次于4℃、12,000rpm離心15min；棄去上清，真空干燥DNA沉淀30min；將干燥的沉淀溶于實(shí)驗(yàn)所需量的水中；pGEX-5X1質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物也做相同處理；取待插入的DNA和質(zhì)粒DNA，建立連接體系。
(6)挑取E.Coli.DH5α原菌的單克隆菌落于2mL LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)；次日將菌液1∶100稀釋到50mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌液的OD600值為0.3(約4-6小時(shí))；將50mL菌液分裝至兩個(gè)滅菌的離心管中，在冰上放置10min，于4℃、4,000rpm離心10min；棄上清用10mL冰預(yù)冷的10mM NaCl重懸細(xì)菌沉淀；于4℃、4,000rpm離心10min；棄上清，用10mL冰預(yù)冷的50mMCaCl2重懸細(xì)菌并冰上放置20min；于4℃、4,000rpm離心10min；棄上清，加1mL冰預(yù)冷的50mM CaCl2重懸細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞?？蓪⒅频玫母惺軕B(tài)細(xì)胞以200mL(含15％甘油)分裝，-80℃凍存；(7)取200μL感受態(tài)細(xì)胞，加5μL連接產(chǎn)物，輕旋混勻；同時(shí)另取200μL感受態(tài)細(xì)胞，完全不加DNA作為負(fù)對(duì)照，于冰上放置1hr；42℃水浴加熱90sec后迅速轉(zhuǎn)移至冰水中冷卻1～2min；每管補(bǔ)加800mL的LB培養(yǎng)基，37℃溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素標(biāo)記基因；取含目的DNA的菌液200μL涂于AMP(50μg/mL)固體培養(yǎng)基平皿上，剩余800μL涂于另一平皿上，而不加DNA的菌液取500μL涂于一平皿上作為對(duì)照；將平皿置于無菌潔凈工作臺(tái)中至液體完全被吸收，然后倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12～16hr。
(8)挑取平板上某一單克隆，加入液體LB培養(yǎng)基2mL，過夜培養(yǎng)。將菌液在一新的平板上畫線過夜培養(yǎng)后貯存于4℃。其余菌液取10μL Glutathione SepharoseTM4B珠子混合后電泳進(jìn)行小樣蛋白檢測(cè)。
2.目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及提純(1)挑取單菌落于20mL LB/AMP(50μg/mL)培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。
(2)次日按1∶100稀釋到2L新鮮的LB/AMP(50μg/mL)培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6(約7～8h)。
(3)達(dá)到確定的OD600值后，將培養(yǎng)溫度調(diào)至20℃，繼續(xù)培養(yǎng)30min。
(4)加IPTG至終濃度為0.1mM，20℃誘導(dǎo)1～2h。
(5)將培養(yǎng)物于4℃、5,000rpm離心15min，棄上清并倒置數(shù)分鐘使殘留液體流盡，用少量冰預(yù)冷的MTPBS洗滌細(xì)胞1～2次，離心去除洗滌液。
(6)用相當(dāng)于1/50～1/100培養(yǎng)體積的MTPBS重懸細(xì)胞，加PMSF至終濃度為0.1mM并挑加少量溶菌酶，于液氮及37℃水浴中反復(fù)凍融3次以破碎細(xì)胞。
(7)挑加DNase，反復(fù)顛倒幾次，以解離雙鏈DNA，使細(xì)菌裂解液的粘度明顯降低。
(8)按1∶100(v/v)的比例加入Triton X-100，4℃旋轉(zhuǎn)混合30min，以促進(jìn)蛋白溶解性。
(9)4℃，10,000rpm離心10min(可適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，這有利于細(xì)胞的破碎)。
(10)收集上清，沉淀和上清分別取樣待做電泳檢測(cè)。
(11)上清中加入預(yù)溶脹過的親和層析珠Glutathione SepharoseTM 4B 100～200μL(珠體積)，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合40～60min。
(12)自然沉降或稍做離心，去上清，珠子用預(yù)冷的MTPBS洗滌3～4次。
(13)珠子用預(yù)冷的50mM Tris·Cl(pH8.0)平衡1～2次。
(14)將珠子小心地轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，定容后取樣作蛋白含量測(cè)定。
(15)珠子用凝血因子Xa的緩沖液洗滌3～4次。
(16)根據(jù)電泳圖估算珠子上融合蛋白的含量，加入50μL(0.5u/μL)凝血因子Xa和450μL凝血因子Xa緩沖液，4℃酶切16h。
(17)將珠子稍離心，上清轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中；再離心，上清轉(zhuǎn)移至另一干凈管中；再一次離心，上清即為所要的蛋白溶液。這樣反復(fù)離心是為了徹底除去蛋白溶液中殘留的珠子。
(18)在珠子中加入500μL凝血因子Xa緩沖液，溫和振蕩洗滌珠子。如步驟3取上清。
(19)洗滌珠子6次，得到六個(gè)蛋白樣品。從每個(gè)樣品中各取出10μL加10μL 2×SDS樣品緩沖液，電泳檢測(cè)切下的目的蛋白含量。
三氯乙酸/脫氧膽酸納(TCA/DOC)沉淀蛋白質(zhì)方法材料5％脫氧膽酸鈉溶液30％三氯乙酸溶液
3.2M氫氧化鈉溶液4.十二烷基磺酸鈉(1×SDS)樣品緩沖液組成Tris·Cl(pH 6.8)50mMDTT(二硫蘇糖醇) 100mMSDS 2％溴酚藍(lán) 0.1％甘油10％步驟1.向1mL上述各蛋白液中加入10μL 5％脫氧膽酸鈉溶液后混勻，然后加480μL 30％三氯乙酸，混勻后于4℃放置2h或冰浴中放置30min。
2.4℃、10,000rpm離心25min，去上清。
3.10,000rpm離心25min，去盡殘留液體。
4.沉積物中加入50μL一倍樣品液重懸，如果呈黃色或有沉淀，則加1～2μL 2M氫氧化鈉溶液將顏色調(diào)至藍(lán)色并使之完全溶解。
5.99℃煮沸5min，3000rpm離心10s后即可直接上樣走電泳。
作為對(duì)照，我們還做了無模板蛋白質(zhì)的印跡(即識(shí)別分子不與克隆蛋白質(zhì)自組裝而直接交聯(lián)聚合錨定到大孔微球表面)和無識(shí)別分子的印跡(即克隆蛋白質(zhì)不與識(shí)別分子自組裝而直接被大孔微球吸附，然后引發(fā)聚合)，結(jié)果如圖一中第四、第五泳道所示，無明顯的富集效果。
圖1分子印跡樹脂的對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)吸附效果的測(cè)定。其中A圖為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳并以硝酸銀染色的電泳結(jié)果；B圖為用豬親環(huán)素18的抗體對(duì)相同樣品做免疫印跡得到的結(jié)果；第一泳道樣品為0.08μL豬白細(xì)胞提取物；第二泳道樣品為20μL豬白細(xì)胞提取物；第三泳道樣品為200μL分子印跡樹脂洗滌液。
實(shí)施例2.
上例中使用過的分子印跡樹脂用2mol.L-1氯化鉀溶液洗滌樹脂球至電泳檢測(cè)無條帶。加入1mL豬白細(xì)胞提取物，用同樣的方法吸附、洗脫和檢測(cè)，然后再重復(fù)一次。結(jié)果兩次再生重復(fù)使用的吸附效果如圖2所示，與第一次吸附效果基本無差別。
圖2分子印跡樹脂再生性的測(cè)定。第一泳道樣品為200μL分子印跡樹脂洗滌液；第二泳道樣品為200μL分子印跡樹脂再生后重復(fù)使用的洗滌液；第三泳道樣品為200μL分子印跡樹脂又一次再生后重復(fù)使用的洗滌液。
權(quán)利要求
1.一種分子印跡樹脂，其特征在于，它的孔徑為20nm，小球直徑為0.2mm，按以下步驟制備1)以丙烯酸丁酯為單體，在引發(fā)劑、催化劑和配位劑存在下，通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)合成聚合度為30的鏈聚合物，水解后與烯丙基氯進(jìn)行部分取代反應(yīng)，取代后的側(cè)基作為錨定基團(tuán)，未取代的羧基作為識(shí)別基團(tuán)從而得到識(shí)別分子；2)以克隆蛋白質(zhì)為模板與識(shí)別分子在水溶液中進(jìn)行組裝，用丙烯酸甲酯聚合而成的大孔微球?qū)ψR(shí)別分子/模板蛋白質(zhì)組裝體進(jìn)行吸附，接著在體系中加入丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺，在引發(fā)劑過二硫酸胺作用下，組裝體中識(shí)別分子錨定基團(tuán)側(cè)鏈的雙鍵和微球表面的雙鍵進(jìn)行交聯(lián)共聚，把輔助識(shí)別聚合物鏈固定到載體小球上；3)用高離子強(qiáng)度的緩沖溶液洗脫蛋白質(zhì)和未聚合的識(shí)別分子，徹底去除殘留蛋白質(zhì)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳/硝酸銀染色的方法檢測(cè)是否有殘留的蛋白質(zhì)，得到分子印跡樹脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子印跡樹脂，其特征在于，所述的識(shí)別分子是聚合度為30的低分子量聚丙烯酸進(jìn)行部分取代反應(yīng)的產(chǎn)物，該聚合物鏈上具有隨機(jī)分布的識(shí)別基團(tuán)與錨定基團(tuán)，其中識(shí)別基團(tuán)含量20％，錨定基團(tuán)含量80％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子印跡樹脂，其特征還在于，所述的克隆蛋白質(zhì)是克隆的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的分子印跡樹脂的方法，其特征在于它包括以下步驟1)在120℃，α-氯代苯乙烷為引發(fā)劑，氯化亞銅為催化劑，聯(lián)二吡啶為配位劑，丙烯酸丁酯聚合反應(yīng)8～10h，然后70℃下在含5％的NaOH溶液中水解6h，制得聚丙烯酸，聚合度30；α-氯代苯乙烷、氯化亞銅、聯(lián)二吡啶的摩爾比為1∶1∶3；2)在室溫，充分?jǐn)嚢柘戮徛渭酉┍?，烯丙基氯與聚丙烯酸摩爾比為24∶1，產(chǎn)物通過溴加成-紫外分光光度法測(cè)定其雙鍵含量，滴加稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH值使溶液為酸性，產(chǎn)生絮狀沉淀，離心分離后，制得功能基化后的聚丙烯酸，即為識(shí)別分子。3)將識(shí)別分子10mg與克隆的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)400μg混合，在4℃進(jìn)行自組裝12h～15h，然后向溶液中加入1g丙烯酸酯大孔微球樹脂載體，吸附2h后加入38.8mg丙烯酰胺、1.2mg N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、1.28mg過二硫酸銨，常溫下通氮除氧1h，然后加入0.65mg N，N，N′，N′-四甲基二乙胺溶液，交聯(lián)聚合反應(yīng)2h，用2M氯化鉀溶液洗滌樹脂球至電泳檢測(cè)無條帶，得到分子印跡樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟1)所述的丙烯酸丁酯與α-氯代苯乙烷的質(zhì)量比為28∶1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟2)所述的烯丙基氯與聚丙烯酸摩爾比為24∶1，即聚合度為30的聚丙烯酸鏈上有80％的羧基發(fā)生反應(yīng)，其余20％的羧基未發(fā)生反應(yīng)。
7.權(quán)利要求1所述的分子印跡樹脂在分離與富集天然蛋白質(zhì)上的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的分子印跡樹脂制成的用于蛋白質(zhì)分離的試劑盒，包括識(shí)別分子、丙烯酰胺單體及引發(fā)體系和丙烯酸甲酯大孔樹脂。
9.一種權(quán)利要求1所述的分子印跡樹脂應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離的方法，其特征在于包括下述步驟(1)4℃下，將計(jì)量的分子印跡樹脂直接放入豬白細(xì)胞提取物中，吸附15h；(2)吸附蛋白后的樹脂依次用10mM Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液洗10次，每次1mL，再用1mL含10mM Tris-HCl(pH 7.5)和300mM氯化鉀的緩沖溶液洗滌樹脂，得到洗滌液；(3)應(yīng)用Bradford法檢測(cè)氯化鉀緩沖溶液的洗滌液，得出總蛋白含量；再取200μL洗滌液，用三氯乙酸/脫氧膽酸納(TCA/DOC)方法沉淀蛋白，蛋白液制樣后恒流走十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用豬親環(huán)素18的抗體對(duì)其做免疫印跡檢測(cè)吸附蛋白中親環(huán)素18的含量，從而得出在所吸附蛋白質(zhì)中親環(huán)素18與總蛋白質(zhì)含量的比值。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離與富集蛋白質(zhì)的分子印跡樹脂和制備方法，以克隆蛋白質(zhì)為模板用輔助識(shí)別的限長聚合物鏈(識(shí)別分子)合成蛋白質(zhì)印跡聚合物，具體地用于天然微量蛋白質(zhì)的分離、富集。該分子印跡樹脂可用于天然細(xì)胞提取物中目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離、富集。本發(fā)明成球在有機(jī)相中進(jìn)行，印跡在水相中進(jìn)行，避免了對(duì)模板蛋白質(zhì)的破壞，實(shí)用性強(qiáng)。以克隆蛋白質(zhì)為模板的方法克服了天然微量蛋白質(zhì)的印跡模板難以得到的瓶頸。使用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳并以硝酸銀染色檢測(cè)吸附蛋白及其洗滌過程，這種檢測(cè)方法靈敏度高，定量容易，直觀準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1844174SQ200610013329
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月20日
發(fā)明者宓懷風(fēng), 趙琢, 王春紅 申請(qǐng)人:南開大學(xué)