專利名稱：一種人血清白蛋白融合長效干擾素制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人血清白蛋白融合長效干擾素的制備，用這種制備方法生產(chǎn)的干擾素能明顯延長干擾素在體內(nèi)的作用時間，可用于人類相關(guān)疾病的治療。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(HSA)是一種可溶性單體蛋白質(zhì)，構(gòu)成血液中的蛋白質(zhì)總量的一半。白蛋白作為一種基本載體，攜帶傳遞脂肪酸、類固醇和激素分子等，其穩(wěn)定的惰性性質(zhì)是維持血壓的一個重要因素。人血清白蛋白是一種球狀非糖基化的，分子量為65Kd的蛋白質(zhì)。人血清白蛋白的基因位于4號染色體上，有16961個堿基對，分為15個間隔區(qū)，經(jīng)RNA加工拼接后形成的mRNA可編碼一個具有585個氨基酸的蛋白質(zhì)。這一蛋白在經(jīng)過高爾基體的轉(zhuǎn)化加工，去除分泌信號而分泌到細胞外。人血清白蛋白有35個半胱氨酸，構(gòu)成17個二硫鍵的單體(Brown JR，The structure，functional and application of human albumin，Pergamon，NY 1977)。人血清白蛋白具有多種多態(tài)形及30種不同的遺傳分子(Weikamp，CR，humangenomic Annual，37219-226，1973)。人血清白蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)由X光衍射法測定(Carter，Science，244，1195-1198，1989)。人血清白蛋白是血液種的主要成分，在人體內(nèi)含量為每升血液含40克，半衰期壽命為14-20天。綜上所述，人血清白蛋白具有極大的優(yōu)勢使之可抵御生物體內(nèi)酶的作用，并可使治療性蛋白質(zhì)以較高的劑量使用。
目前用于臨床的人血清白蛋白均是從人血漿中提取的。利用微生物重組表達白蛋白(rHSA)的生產(chǎn)專利已經(jīng)公開，EP330451和EP361991。
干擾素(IFN)是一種多功能細胞因子，其首先被發(fā)現(xiàn)的生物活性是抵制抗性病毒感染。多年以來，干擾素的抗病毒活性是其唯一的生物功能。如今，發(fā)現(xiàn)干擾素有許多其它生物功能，如作用于細胞的生長、分化和免疫調(diào)節(jié)等活性可能具有更大的生物學意義。
干擾素有兩個完全不同的家族，分為I型和II型。I型干擾素主要包括IFNα和IFNβ，II型干擾素為IFNγ。I型干擾素的主要作用是抗病毒，IFNα和IFNβ兩者共同用一種受體，但具有完全不同的免疫原性。IFNα主要由人白細胞產(chǎn)生，稱為白細胞干擾素，IFNβ主要由成纖維細胞產(chǎn)生，稱為成纖維細胞干擾素。IFNα有很多亞型，如IFNα-1、IFNα-2、IFNα-3等約有20種亞型，此外還有亞亞型，如IFNα-1a、IFNα-1b、IFNα-2a、IFNα-2b等，IFN-α有幾十種之多。IFNβ尚未發(fā)現(xiàn)有亞型。II型干擾素主要由T細胞產(chǎn)生；主要活性是參與免疫調(diào)節(jié)，是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，又稱免疫干擾素。IFNγ只有一種活性形式的蛋白質(zhì)，沒有其它的亞型。
干擾素是具有廣泛生物學活性的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)的作用，對多種腫瘤細胞具有輔助性殺滅或抑制增殖作用，還能抑制癌基因表達從而阻止或減慢正常細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)化的過程。自80年代開始研制出重組人干擾素以來，目前有60多個國家批準上市。廣泛用于乙肝、丙肝；白血?。话捳?、濕疣；腎癌、膀胱癌；淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤等多種病毒性疾病和腫瘤的治療。但普通干擾素也存在某些不夠理想之處，由于干擾素分子量小，易被腎小球濾過，所以皮下注射后吸收很快，半衰期短，容易被酶水解等，一般要每天注射，至少每周注射三次，應用不夠方便。而干擾素治療肝炎、腫瘤、類風濕及多發(fā)性硬化癥等疾病時，治療周期常常長達數(shù)月甚至數(shù)年，這種長期大劑量頻繁用藥增加了病人的痛苦和治療費用而且易產(chǎn)生發(fā)燒、疲乏、食欲減退及流感樣癥狀等毒副作用。
聚乙二醇(PEG)修飾的干擾素是FDA批準的臨床上使用的半衰期最長的長效干擾素，PEG與干擾素連結(jié)可延長血中干擾素半哀期，使干擾素活性可延續(xù)至一周，每周只肌注一次，相當于普通干擾素每日肌注效果，并可提高療效。但是PEG價格貴，PEG與干擾素的修飾工藝復雜，從而使聚乙二醇修飾的干擾素成本太高，增大了病人的治療費用。
軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所的血清白蛋白與干擾素的融合蛋白專利(公開號CN140518A)中，在血清白蛋白與干擾素蛋白連接中設有連接肽(GlyGlyGlyGlySer)n，n為1-10的整數(shù)。在融合蛋白中包含有外源蛋白的序列，外源蛋白序列的存在對其免疫原性和治療效果的影響尚缺乏文獻資料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人血清白蛋白與人干擾素蛋白融合蛋白的制備方法。
本發(fā)明的融合蛋白中，人血清白蛋白C末端與人干擾素蛋白的N末端直接相聯(lián)，人血清白蛋白和人干擾素蛋白之間沒有連接肽，融合蛋白仍具有比較高的干擾素生物學活性。
本發(fā)明的另一個目的是提供了適合于酵母表達系統(tǒng)的編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。包括經(jīng)密碼子優(yōu)化的人血清白蛋白DNA序列和人干擾素DNA序列，利用本發(fā)明融合蛋白DNA序列，在酵母系統(tǒng)中可獲得高表達。
本發(fā)明的另一個目的是提供攜帶編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列的重組表達載體。本發(fā)明中的pAO815、pUC18等表達載體從Invitrogen Corp(San Diego California USA)公司購得，將編碼本發(fā)明中的融合蛋白的核酸克隆至酵母的表達載體pAO815中，這些質(zhì)粒為酵母整合型質(zhì)粒，帶有醇氧化酶操縱子(AOX1)5’和3’序列，用于方便編碼基因整合至酵母染色體和控制編碼基因的表達。
本發(fā)明的又一個目的是提供含有本發(fā)明融合蛋白編碼基因的宿主。本發(fā)明的宿主為可以被重組表達載體轉(zhuǎn)化，含有本發(fā)明蛋白編碼基因的細菌、酵母或動物細胞；其中優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選的是畢氏酵母，最優(yōu)選的是GS115。
本發(fā)明的再一個目的是提供了高效表達融合蛋白的發(fā)酵工藝和純化工藝條件。發(fā)酵包括菌體生長階段和融合蛋白表達兩個階段，通過對發(fā)酵條件的控制，特別是融合蛋白表達階段的補料組成、pH、培養(yǎng)溫度、溶解氧等條件的控制使融合蛋白得到高效表達。融合蛋白的純化用硫酸銨分級沉淀、透析、液相層析等方法，優(yōu)選的是使用組合的蛋白質(zhì)液相層析方法，使目標蛋白的純度達到95％以上。
編碼人血清白蛋白的初始DNA序列是通過PCR方法從人胎肝cDNA文庫(從ClontechLaboratories Inc.USA購買)中獲得。根據(jù)初始的DNA序列信息，使用單個核苷酸定點突變技術(shù)，一方面使密碼子轉(zhuǎn)換為酵母偏愛的密碼子；另一方面改變序列中的氨基酸，使其氨基酸序列與中國人群中最廣泛分布的白蛋白的氨基酸序列相一致，此外，通過對RNA二級結(jié)構(gòu)的改變，提高mRNA穩(wěn)定性并促進蛋白質(zhì)翻譯的效率。編碼人干擾素的初始DNA序列可以通過RT-PCR的方法從用新城雞瘟病毒誘導的人外周血白細胞的中獲得，通過定點突變技術(shù)，使密碼子轉(zhuǎn)換為酵母偏愛的密碼子。通過重疊PCR技術(shù)獲得編碼融合蛋白的基因。
在酵母中表達融合蛋白時，可以分泌到酵母細胞外的培養(yǎng)液中或存在于酵母細胞內(nèi)，優(yōu)選的是從酵母細胞中分泌出來。要從酵母中分泌出來必需要有分泌所用的信號肽，可以使用酵母本身的信號肽或天然的人血清白蛋白的信號肽。優(yōu)選的是使用酵母本身的信號肽，如α-交配因子前導肽、酸性磷酸酶信號肽、蔗糖酶信號肽，最優(yōu)選的是α-交配因子前導肽。
轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上包含的融合蛋白編碼基因到酵母細胞中可以使用電穿孔等方法，轉(zhuǎn)化成功的酵母經(jīng)裂解并提取DNA，然后用PCR方法鑒定。轉(zhuǎn)化成功的酵母工程菌經(jīng)過表達篩選，選取蛋白表達量較高、傳代穩(wěn)定的菌種。
通過搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)工程菌，經(jīng)過對發(fā)酵培養(yǎng)的條件的優(yōu)化，使融合蛋白得到了高效的表達。一般pH控制在2.0-7.0，優(yōu)選的是4.0-6.0。溶解氧控制在10％-100％，優(yōu)選的是30-50％。補料組成是甘油和甲醇，甲醇含量的比例是50％-100％，優(yōu)選的是70％-80％。經(jīng)過72小時的發(fā)酵后，培養(yǎng)上清液中融合蛋白的濃度大于200mg/L，占發(fā)酵上清液中總蛋白的80％以上。
在培養(yǎng)過程中，融合蛋白分泌到胞外的培養(yǎng)液中，通過離心除去菌體。上清液調(diào)整pH到6.0-10.0，優(yōu)選的是7.0-8.0，然后通過親和層析柱干擾素抗體偶聯(lián)柱收集上清液中的融合蛋白，在用甘氨酸—鹽酸洗脫液洗脫融合蛋白，優(yōu)選的是pH為3.0，濃度為100mM-500mM。經(jīng)親和柱純化的融合蛋白溶液中加入3M硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)硫酸銨的終濃度為0.5-2.0M，優(yōu)選的是0.8-1.5M，然后用Phenyl High Performance(AmershamBiosciences Sweezland)精純化融合蛋白，用含0.1-0.5M的硫酸銨洗脫目標蛋白，更優(yōu)選的是0.2M-0.3M的硫酸銨溶液洗脫。


圖1為人血清白蛋白干擾素alpha2b融合基因序列。
圖2為攜帶編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列的重組表達載體的示意圖。
圖3為本發(fā)明的純化圖譜。以及，圖4為融合蛋白電泳圖。
具體實施例方式
本發(fā)明有關(guān)于一種人血清白蛋白與人干擾素蛋白融合蛋白的制備方法，該方法至少包括以下步驟
(a)人血清白蛋白基因的克隆和密碼子優(yōu)化；(b)人干擾素alpha2b基因克隆和密碼子優(yōu)化；(c)人血清白蛋白基因和人干擾素alpha2b基因連接和表達質(zhì)粒的構(gòu)建；(d)電轉(zhuǎn)化畢赤酵母和表達菌種篩選；(e)發(fā)酵培養(yǎng)；以及，(f)融合蛋白純化。
其中，在步驟(a)中，用PCR法從人胎肝cDNA文庫中獲得HSA cDNA。ALBF除包括HSA基因的5’端序列外，還在其5’端前加入了Kex2酶切信號識別序列(下劃線部分)ALBF5’AAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGC3’ALBB5’TAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3’PCR反應條件為50μl體系中加入5μl 10X PCR反應緩沖液，5μl 25mM MgCl2，0.2μl 25mM dNTPs，25mM引物ALBF和ALBB各1μl，pfuDNA聚合酶(Cytokina Inc)5U，1μl人胎肝cDNA文庫，其余用雙蒸水補足。PCR反應在PCR儀中進行，程序為94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸6分鐘，30個循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物在1.7kb左右，與預期HSA大小一致。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化目標條帶。取純化的HSA cDNA 4ul，加入1ul pGEM-T載體，2ul 5X緩沖液1ul T4DNA連接酶，2ul雙蒸水(pGEM-T載體緩沖液和酶為Promega CorpUSA產(chǎn)品)，16度反應過夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞.轉(zhuǎn)化菌鋪于含x-gal和IPTG和氨芐青霉素(50ug/ml)的LB瓊脂平皿上，37度培養(yǎng)過夜.挑取白色菌落，接種至3ml含氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基，37度培養(yǎng)過夜，PCR鑒定陽性克隆。挑選一陽性克隆測序，測序結(jié)果正確。定點突變進行密碼子優(yōu)化。
在步驟(b)中，100μl反應體系中加入1μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，20μmol/L的IFNα2b-1，IFNα2b-2(或IFNα1b-1，IFNα1b-2)引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10X反應緩沖液10μl，Taq 5U(Cytokina Inc)。用Perk-Elmer公司的9600PCR儀，PCR條件為94℃變性1分鐘，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，循環(huán)30次。通過凝膠電泳分析反應物顯出一預期大小(約0.5kb)的條帶，PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收。用BamH I和EcoRI酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化后，克隆到用BamH I/EcoR I酶解的pUC19質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，每種PCR產(chǎn)物挑選若干克隆，純化質(zhì)粒，BamH I-EcoR I區(qū)DNA測序，挑選其編碼的氨基酸序列分別含有IFNα1b，IFNα2b，IFNα2a序列的克隆，分別命名為pUC-IFNα1b，pUC-IFNα2b，pUC-IFNα2a等。其他亞型的IFNα的cDNA可以用相似的方法克隆，共有干擾素的基因可用人工合成的方法獲得。定點突變進行密碼子優(yōu)化。
在步驟(c)中，通過重疊PCR技術(shù)，獲得編碼人血清白蛋白與干擾素融合蛋白的基因，并在兩端引入BamH I和EcoR I酶切位點。融合基因用BamH I和EcoR I酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化后，克隆到用BamH I/EcoR I酶解的pUC19質(zhì)粒上，構(gòu)建融合基因質(zhì)粒pUC19-HAS-IFN并轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細胞中。
以酵母基因組DNA為模版擴增信號肽α因子序列，融合基因以pUC19-HSA-IFN為模版擴增融合基因。將兩個PCR產(chǎn)物α因子和HSA-INF經(jīng)重疊PCR獲得編碼α-factor-HSA-IFN的融合基因片斷，EcoR I酶切后插入pUC19載體的相同位點，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，提取陽性克隆序列測序，以EcoR I酶切，回收目標片段，插入pAO815的相同位點，提取質(zhì)粒，酶切鑒定片斷插入的正反方向，以方向正確的單基因拷貝表達載體為出發(fā)點，進行多拷貝表達載體的構(gòu)建；Bgl II和Bam H I雙酶切下含有5’-AOX-α-factor-HSA-IFN-AOX(TT)-3’的表達單元，回收后進行連接反應和該雙酶酶切，將此多聚體和Bam H I酶切，CIP去磷酸化的單拷貝PAO815表達載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α菌，經(jīng)酶切鑒定篩選出了2拷貝和3拷貝的質(zhì)粒pAO815-2α-factor-HSA-IFN和pAO815-3α-factor-HSA-IFN。攜帶編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列的重組表達載體示意圖如圖2所示。
在步驟(d)中，挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培養(yǎng)過夜取100-500μl的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28～30℃、250-300r/min培養(yǎng)過夜，至OD600達到1.3～1.5將細胞培養(yǎng)物于4℃，1500g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；同上離心，用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；同上離心，用20ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；按步驟3離心，用1ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5ml；將5～20μg的線性化DNA溶解在5～10μl TE溶液中，與80μl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預冷的電轉(zhuǎn)化杯中；將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min；電壓1.5kV；電容25μF；電阻200Ω。電擊時間為4～10msec。電擊完畢后，加入1ml冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中；將菌體懸液涂布于MD或RDB平板上，每200～600μl涂布一塊平板；將平板置于30℃培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)。
在步驟(e)中，搖瓶菌種培養(yǎng)5個容量為1L的三角瓶，裝YPD培養(yǎng)基各200ml，培養(yǎng)基配方為酵母提取物(1％)10g、蛋白胨(2％)20g，葡萄糖(2％)20g，用去離子水溶解并定容到1L，115℃蒸汽滅菌20分鐘。每瓶接甘油菌種100ul，30℃搖床300rpm培養(yǎng)24小時，此時菌濃度OD600在6-20之間。
30L罐發(fā)酵培養(yǎng)30L全自動發(fā)酵罐(Biostat c-dcu，Sartourius)，具體操作可參照其使用說明書。30L罐中裝入基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基15L，配方為CaSO4·2H2O 0.93g/l，K2SO418.2g/l，MgSO4·7H2O，KOH 4.13g/l，H3PO426.7ml/l，甘油40g/l用去離子水溶解并定容到15L。連接好pH電極、溶氧電極，溫度電極等，開動攪拌500rpm，121℃在位滅菌30分鐘。滅菌結(jié)束后，待其溫度降到95℃時開始通氣，繼續(xù)待其冷卻道30℃時，加大通氣量到30L每分鐘，攪拌速度調(diào)到900rpm。調(diào)整溶氧電極讀數(shù)到100，接上氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基pH到6.0，加入66ml經(jīng)無菌過濾的微量元素添加劑70ml(GuSO4·5H2O 6g/l，NaI 0.08g/l，MnSO4·H2O3g/l，CoCl20.5g/l，ZnCl 20g/l，H3BO30.02g/l NaMoO3·2H2O 0.2g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O 65g/l，Biotin 0.2g/l，6M H2SO430ml/l)，加入已培養(yǎng)好的菌種開始培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度30℃、溶氧大于30％、pH用氨水控制在6.0、攪拌速度900rpm、空氣流量為30L每分鐘。如此培養(yǎng)20小時后，培養(yǎng)基中的甘油逐漸被耗盡，此時溶氧開始上升。當溶氧上升后，開始以280ml/小時的速度向發(fā)酵罐中補加50％的甘油(含12ml/L的PTM1)溶液，如此再培養(yǎng)6小時，停止甘油補料。此時菌體濃度OD600在150左右，開始以50ml/小時向發(fā)酵罐中補加甲醇(含12ml/L PTM1)。穩(wěn)定2小時后提高甲醇補料速度為100ml/小時，此流速再穩(wěn)定2小時后提高甲醇補料速度到150ml/小時，以此速度補加甲醇70小時后結(jié)束發(fā)酵。取出發(fā)酵液，6000rpm離心10分鐘，收集上清液。
在步驟(f)中，粗純化發(fā)酵上清液用6M NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0，上樣到經(jīng)20mM pH為7.0的磷酸鹽、500mMNaCl緩沖液平衡的干擾素抗體偶聯(lián)的親和層析柱，柱床直徑50mm，柱床高度15cm，柱床體積為300ml。上樣完畢后先用20mM pH為7.0的磷酸鹽、500mM NaCl緩沖液沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用100mM、pH為3.0的甘氨酸—鹽酸的溶液洗脫結(jié)合在柱上的融合蛋白。以紫外280nM吸收檢測，收集蛋白峰。
精純化收集的蛋白溶液用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0，再加入3M的硫酸銨溶液直到硫酸銨的終濃度到0.7M，調(diào)節(jié)pH到7.0。此溶液上樣到經(jīng)20mM的磷酸鹽加0.7M硫酸銨pH為7.0緩沖液平衡的Phenyl High Performance層析柱，柱床直徑50mm，柱床高度15cm，柱床體積為300ml。上樣完畢后先用20mM的磷酸鹽加0.7M硫酸銨pH為7.0緩沖液沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，使紫外280nm吸收的降回到基線。再用20mM磷酸鹽加上0.3M硫酸銨pH7.0的溶液洗脫結(jié)合在柱上的融合蛋白。圖3為本發(fā)明的純化圖譜。
如本技術(shù)領(lǐng)域的人所知，本發(fā)明的附圖和實施例僅為說明本發(fā)明的功能、結(jié)構(gòu)和原理而不應當成為對本發(fā)明理解上的限制；同時，本發(fā)明的目的均已經(jīng)實現(xiàn)。上述實施例可能在不脫離本發(fā)明原理的情況下有所變更，故此，本發(fā)明的保護應以權(quán)利要求書中所描述的范圍為準。
權(quán)利要求
1.一種人血清白蛋白與人干擾素蛋白融合蛋白的制備方法，其特征是該方法至少包括以下步驟(a)人血清白蛋白基因的克隆和密碼子優(yōu)化；(b)人干擾素alpha2b基因克隆和密碼子優(yōu)化；(c)人血清白蛋白基因和人干擾素alpha2b基因連接和表達質(zhì)粒的構(gòu)建；(d)電轉(zhuǎn)化畢赤酵母和表達菌種篩選；(e)發(fā)酵培養(yǎng)；以及，(f)融合蛋白純化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)中編碼人血清白蛋白的初始DNA序列是通過PCR方法從人胎肝cDNA文庫中獲得。通過定點突變技術(shù)，使密碼子轉(zhuǎn)換為酵母偏愛的密碼子。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)中編碼人干擾素的初始DNA序列是通過RT-PCR的方法從用新城雞瘟病毒誘導的人外周血白細胞的中獲得，通過定點突變技術(shù)，使密碼子轉(zhuǎn)換為酵母偏愛的密碼子。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)中通過重疊PCR技術(shù)獲得編碼融合蛋白的基因。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(b)中在酵母中表達融合蛋白時，通過分泌到酵母細胞外的培養(yǎng)液中完成。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(b)中使用酵母本身的信號肽作為分泌所用的信號肽。
7.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于步驟(b)中使用天然的人血清白蛋白的信號肽作為分泌所用的信號肽。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(f)中一般pH控制在2.0-7.0，溶解氧控制在10％-100％，補料組成是甘油和甲醇，甲醇含量的比例是50％-100％，經(jīng)過72小時的發(fā)酵后，培養(yǎng)上清液中融合蛋白的濃度大于200mg/L，占發(fā)酵上清液中總蛋白的80％以上。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(f)中上清液調(diào)整pH到6.0-10.0，然后通過干擾素抗體親和層析柱收集上清液中的融合蛋白，在用甘氨酸—鹽酸洗脫融合蛋白，濃度為100mM-500mM。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(f)中經(jīng)親和柱純化的融合蛋白溶液中加入3M硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)硫酸銨的終濃度為0.5-2.0M，然后用Phenyl High Performance(AmershamBiosciences Sweezland)精純化融合蛋白，用含0.1-0.5M的硫酸銨洗脫目標蛋白的硫酸銨溶液洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人血清白蛋白融合的長效干擾素蛋白，編碼融合蛋白的DNA序列，以及本融合蛋白工業(yè)化生產(chǎn)制備的工藝方法和條件。本發(fā)明的融合蛋白有比較高的干擾素生物學活性，并且能明顯的延長干擾素的半衰期。
文檔編號C07K14/555GK1896106SQ20061002378
公開日2007年1月17日 申請日期2006年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月7日
發(fā)明者蔡麗君, 朱化星, 王英明, 毛佳 申請人:上海健元生物科技有限公司