專利名稱：同位素標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種同位素標記15N-L-谷氨酰胺的合成方法，具體涉及利用有機合成的方法，制備γ-15N和α-、γ-雙15N標記L-谷氨酰胺。
背景技術：
氮-15(簡稱15N，下同)是氮元素的穩(wěn)定同位素，可以用作示蹤劑，廣泛應用于生物化學、醫(yī)學、藥物學、農業(yè)科學等領域，尤其對生命科學研究有極為重大的意義。特別是在蛋白質的人工合成方面，氮-15氨基酸起著獨特的示蹤作用，其應用越來越廣泛，市場前景良好。
由于此類產品產量小，對純度和豐度要求高。目前主要是通過化學合成法或生物發(fā)酵法生產。化學合成法設備要求簡單，生產的氨基酸是DL型氨基酸，豐度高，但不具有光學活性，需要再經化學或酶法拆分得到L型氨基酸。D型氨基酸大多被廢棄，導致氮-15原料利用率降低，增加了生產成本。生物發(fā)酵法具有反應步驟少，產品光學純度高的優(yōu)點。但需要較大的設備投入，對菌種的要求高，后提取步驟較多。
L-谷氨酰胺是構成蛋白質的主要成分之一，其酶法生產較為困難。目前國內外報導的方法以化學合成法為主。主要以L-谷氨酸同甲醇用鹽酸或干燥的HCl氣體為催化劑，生成中間體L-谷氨酸-γ-甲酯鹽酸鹽，再加入過量二硫化碳和氨水后氨解得到L-谷氨酰胺；或由L-谷氨酸-γ-甲酯與水合肼等反應得酰肼，再加氫還原后得到L-谷氨酰胺。以上方法消耗大量氨水或其它有機胺類物質，是常用的L-谷氨酰胺生成方法，不適用同位素標記15N-L-谷氨酰胺的合成。目前尚未看到由化學合成法生成同位素15N標記L-谷氨酰胺的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是為了提供一種工藝簡單、15N原料利用率高同位素標記15N-L-谷氨酰胺的合成方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)一種同位素標記15N-L-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應將L-谷氨酸溶解于氫氧化鈉溶液，于冰浴和攪拌下緩慢滴加氯代甲酸芐甲酯Z-Cl，經萃取、干燥后得到N-芐氧羰基L-谷氨酸；產物在苯甲醇中與二環(huán)己胺和溴芐作用，經脫鹽后得到N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸；(2)酰氯化將N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸、氯化亞砜于回流和攪拌下反應2～10小時，除去溶劑并蒸餾后得到產物N-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯固體；(3)酰胺化將N-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的乙醚溶液、氫氧化鈉水溶液混合后，加入非標記或15N標記無機氮源，在-10℃～20℃低溫下條件下氨解1～10小時，冷卻、提取和干燥后，蒸去溶劑得到N-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰胺產品；(4)解保護將15N標記N-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰胺通過皂化或加氫的方法脫除α-酯和N-芐氧羰基，得到同位素標記15N-L-谷氨酰胺。
所述的原料L-谷氨酸包括非標記或15N標記的L-谷氨酸。
所述的解保護工藝得到的產品為γ-15N標記或α-、γ-雙15N標記的L-谷氨酰胺。
本發(fā)明提供了一套15N標記L-谷氨酰胺的合成方法，該方法在現(xiàn)有的有機合成L-谷氨酰胺技術的基礎上，結合15N原料昂貴的特點，對了工藝條件進行改變，使之具有良好的經濟性和使用價值。該方法適用于合成γ-和α、γ雙15N標記L-谷氨酰胺。本方法過程簡單，15N原料利用率高，得到的L-谷氨酰胺產品純度在99％以上，豐度在98％以上。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1
一種同位素標記15N-L-谷氨酰胺的合成方法，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應將29.2g(0.2mol)L-谷氨酸懸浮分散在含50克K2CO3的450毫升水中，溫水浴溶解后，攪拌下滴加40毫升氯代甲酸芐甲酯，中和后經萃取、酸化、洗滌后得到43.9g N-芐氧羰基L-谷氨酸(收率78％)。將28.1g(0.1mol)N-芐氧羰基L-谷氨酸溶解于40ml DMF溶劑中，于劇烈攪拌下加入0.1mol的二環(huán)己胺和0.11mol溴芐，經萃取洗滌后得到得到38.7gN-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸的二環(huán)己胺鹽(收率70％)，脫鹽后得到N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸。
(2)酰氯化反應將3.71g(0.01mol)N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸和0.012mol的氯化亞砜于回流和攪拌下反應4小時，除去溶劑并蒸餾后得到3.3gN-芐氧羰基α-芐酯-L-谷氨酰氯固體(收率85％)。
(3)氨解反應取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氫氧化鈉1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及7.8gN-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的70ml苯溶液處理5小時。混合物經冷卻、過濾、提取后，最后得到6.7gα-芐酯-L-谷氨酰胺(15N收率91％)。
(4)解保護將6.7gN-芐氧羰基α-芐酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入6.7g5％Pt/C催化劑，于常壓下加氫反應5小時，母液經濃縮、提取后得到2.28gγ-15N標記L-谷氨酰胺(收率85％)，熔點183～185℃，[α]20D＝+32.4°(c＝102N HCl)。
實施例2一種同位素標記15N-L-谷氨酰胺的合成方法，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應將29.2g(0.2mol)L-谷氨酸懸浮分散在含50克Na2CO3的450毫升水中，溫水浴溶解后，攪拌下滴加40毫升氯代甲酸芐甲酯，中和后經萃取、酸化、洗滌后得到42.7g N-芐氧羰基L-谷氨酸(收率75.9％)。將28.1g(0.1mol)N-芐氧羰基L-谷氨酸溶解于40ml DMF溶劑中，于劇烈攪拌下加入0.1mol的二環(huán)己胺和0.11mol溴芐，經萃取洗滌后得到得到38.7gN-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸的二環(huán)己胺鹽(收率70％)，脫鹽后得到N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸。
(2)酰氯化反應將3.71g(0.01mol)N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸和0.012mol的氯化亞砜于回流和攪拌下反應2小時，除去溶劑并蒸餾后得到2.5gN-芐氧羰基α-芐酯-L-谷氨酰氯固體(收率64.4％)。
(3)氨解反應取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氫氧化鈉1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及7.8gN-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的70ml苯溶液處理10小時?；旌衔锝浝鋮s、過濾、提取后，最后得到6.8gα-芐酯-L-谷氨酰胺(15N收率92.3％)。
(4)解保護將6.8gN-芐氧羰基α-芐酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入7g 5％Pt/C催化劑，于常壓下加氫反應6小時，母液經濃縮、提取后得到2.35gγ-15N標記L-谷氨酰胺(收率86.5％)，熔點183～185℃，[α]20D＝+32.4°(c＝10 2NHCl)。
實施例3一種同位素標記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應將29.2g(0.2mol)L-谷氨酸懸浮分散在含50克K2CO3的450毫升水中，溫水浴溶解后，攪拌下滴加40毫升氯代甲酸芐甲酯，中和后經萃取、酸化、洗滌后得到43.9g N-芐氧羰基L-谷氨酸(收率78％)。將28.1g(0.1mol)N-芐氧羰基L-谷氨酸溶解于40ml DMF溶劑中，于劇烈攪拌下加入0.1mol的二環(huán)己胺和0.11mol溴芐，經萃取洗滌后得到得到38.7gN-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸的二環(huán)己胺鹽(收率70％)，脫鹽后得到N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸。
(2)酰氯化反應將3.71g(0.01mol)N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸和0.012mol的氯化亞砜于回流和攪拌下反應10小時，除去溶劑并蒸餾后得到3.1gN-芐氧羰基α-芐酯-L-谷氨酰氯固體(收率79.8％)。
(3)氨解反應取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氫氧化鈉1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及7.8gN-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的70ml苯溶液處理2小時?；旌衔锝浝鋮s、過濾、提取后，最后得到6.3g α-芐酯-L-谷氨酰胺(15N收率85.6％)。
(4)解保護將6.3gN-芐氧羰基α-芐酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入6.3g 5％Pt/C催化劑，于常壓下加氫反應10小時，母液經濃縮、提取后得到2.27gγ-15N標記L-谷氨酰胺(收率90.1％)，熔點182～184℃，[α]20D＝+32.3°(c＝10 2NHCl)。
權利要求
1.一種同位素標記15N-L-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應將L-谷氨酸溶解于氫氧化鈉溶液，于冰浴和攪拌下緩慢滴加氯代甲酸芐甲酯Z-Cl，經萃取、干燥后得到N-芐氧羰基L-谷氨酸；產物在苯甲醇中與二環(huán)己胺和溴芐作用，經脫鹽后得到N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸；(2)酰氯化將N-芐氧羰基α-芐酯L-谷氨酸、氯化亞砜于回流和攪拌下反應2～10小時，除去溶劑并蒸餾后得到產物N-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯固體；(3)酰胺化將N-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的乙醚溶液、氫氧化鈉水溶液混合后，加入非標記或15N標記無機氮源，在-10℃～20℃低溫下條件下氨解1～10小時，冷卻、提取和干燥后，蒸去溶劑得到N-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰胺產品；(4)解保護將15N標記N-芐氧羰基α-酯-L-谷氨酰胺通過皂化或加氫的方法脫除α-酯和N-芐氧羰基，得到同位素標記15N-L-谷氨酰胺。
2.根據(jù)權利要求1所述的同位素標記15N-L-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，所述的原料L-谷氨酸包括非標記或15N標記的L-谷氨酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的同位素標記15N-L-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，所述的解保護工藝得到的產品為γ-15N標記或α-、γ-雙15N標記的L-谷氨酰胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同位素標記
文檔編號C07C237/06GK101041627SQ20061002494
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月22日 優(yōu)先權日2006年3月22日
發(fā)明者羅勇, 王博, 強歌, 陸平曄, 李美華 申請人:上海化工研究院