專利名稱：抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的siRNA靶基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一段抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular EndothelialGrowth Factor，VEGF)基因表達(dá)的siRNA靶基因序列，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(以下略寫為VEGF)是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，具有促進(jìn)新生血管形成的作用。一般認(rèn)為它是腫瘤血管生成的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。VEGF在多種實(shí)體瘤細(xì)胞中表達(dá)，在腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到了關(guān)鍵的作用。抑制VEGF在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制腫瘤新生血管的生成是目前抗腫瘤新生血管生成的一個(gè)重要策略。目前抑制VEGF在腫瘤內(nèi)部表達(dá)的手段有多種，其中包括應(yīng)用反義核酸技術(shù)，近來(lái)應(yīng)用反義核酸技術(shù)在體外多種腫瘤細(xì)胞中成功抑制了VEGF的表達(dá)，包括乳腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞等；另外JamesW.B.Bainbridge等發(fā)現(xiàn)VEGF基因第6外顯子編碼的肽段能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的新生血管的作用。
RNA干擾技術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的研究基因功能強(qiáng)有力的手段，到目前為止已經(jīng)成功抑制了多種基因表達(dá)。例如在2003年，Lin Zhang等、Samuel J.Reich等運(yùn)用RNA干擾技術(shù)成功抑制了小鼠VEGF基因的表達(dá)。DagR.Sorensen等在2003年詳細(xì)研究了RNA干擾技術(shù)對(duì)外源基因(GFP)以及內(nèi)源基因如TNF-α、IL-1等基因的有效抑制作用。文獻(xiàn)Daniela Castanotto，Haitang Li and John J.Rossi.Functional siRNA expression from transfected PCR products[J].RNA，2002，8，1454-1460中公開(kāi)了一種運(yùn)用PCR技術(shù)將人的Pol III啟動(dòng)子序列與GFP的siRNA序列連接在一起，并將該P(yáng)CR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，有效抑制了GFP的表達(dá)。這種方法簡(jiǎn)便快捷，而且還能迅速篩選出有效的siRNA靶基因序列，而有效的siRNA靶基因序列的選擇是RNA干擾能否取得成功的關(guān)鍵。本發(fā)明提供一段抑制VEGF基因表達(dá)的siRNA靶基因序列，用該序列構(gòu)造的siRNA表達(dá)框在已有文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在提供一種全新的抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的siRNA靶基因序列。
本發(fā)明通過(guò)PCR的方法將我們自己設(shè)計(jì)的siRNA序列與U6啟動(dòng)子以及報(bào)告基因GFP連接在一起，形成一個(gè)siRNA表達(dá)框，將該siRNA表達(dá)框體外轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞株A549(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，以及定點(diǎn)注射入實(shí)體瘤內(nèi)部，來(lái)檢測(cè)VEGF被抑制的情況，取得了良好的效果，從而得到了一段新的能夠抑制人VEGF基因表達(dá)的siRNA靶基因序列，該能夠抑制人VEGF基因表達(dá)的siRNA靶基因序列為5’ggagtaccctgatgagatc3’或者其互補(bǔ)序列5’gatctcatcagggtactcc3’本發(fā)明選擇siRNA靶基因序列的方法是根據(jù)文獻(xiàn)DanielaCastanotto，Haitang Li and John J.Rossi.Functional siRNA expressionfrom transfected PCR products[J].RNA，2002，8，1454-1460中運(yùn)用PCR技術(shù)，以人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF為靶點(diǎn)，選擇siRNA靶序列，構(gòu)建siRNA表達(dá)框，體外轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞并體內(nèi)轉(zhuǎn)染荷瘤裸鼠，檢測(cè)VEGF在腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織內(nèi)部的表達(dá)變化。具體說(shuō)來(lái)分以下幾步第一步，以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF為靶點(diǎn)，選擇siRNA靶基因序列，構(gòu)建siRNA表達(dá)框。
第二步，體外轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其體外轉(zhuǎn)染效率。
第三步，運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定人VEGF mRNA表達(dá)水平的變化。
第四步，構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌荷瘤裸鼠模型，并定點(diǎn)注射siRNA表達(dá)框，運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)部VEGF基因mRNA表達(dá)水平的變化。
siRNA干擾技術(shù)是正在快速發(fā)展的一項(xiàng)新興技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)一直是研究和開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物的重要策略。因此將siRNA技術(shù)應(yīng)用于抗腫瘤治療具有極其重要的意義，為腫瘤治療開(kāi)辟了一個(gè)新的途徑。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的siRNA表達(dá)框能夠有效的抑制人VEGF基因的表達(dá)，其靶基因序列5’ggagtaccctgatgagatc3’以及其互補(bǔ)序列5’gatctcatcagggtactcc3’將有可能成為抗非小細(xì)胞肺癌的一種很有潛力的siRNA藥物。


圖1通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增siRNA表達(dá)框架的示意2VEGF siRNA表達(dá)框架的兩次PCR產(chǎn)物的電泳圖其中圖a為第一次PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為2300bp左右；圖b為第二次PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，長(zhǎng)度為2300bp左右圖3轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM與VEGF siRNA表達(dá)框轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞熒光顯微鏡觀察照片圖a為陰性對(duì)照；圖b為轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性結(jié)果圖4流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM與pEGFP-CI按不同比例混合的體外轉(zhuǎn)染效率圖a為陰性對(duì)照；圖b為陽(yáng)性結(jié)果圖5VEGF mRNA水平RT-PCR檢測(cè)結(jié)果1為對(duì)照組；2為0.75μg組；3為1.0μg組；4為1.25μg組圖6VEGF siRNA表達(dá)框在體外對(duì)VEGF的抑制作用圖7pEGFP以及VEGF siRNA表達(dá)框在腫瘤內(nèi)部的表達(dá)。圖a為pEGFP在腫瘤內(nèi)部表達(dá)；圖b為VEGF siRNA表達(dá)框在腫瘤內(nèi)部的表達(dá)；圖c為陰性對(duì)照?qǐng)D8體內(nèi)VEGF mRNA水平RTPCR檢測(cè)結(jié)果1為對(duì)照組，2為VEGF siRNA表達(dá)框處理組圖9VEGF siRNA表達(dá)框在體內(nèi)對(duì)VEGF的抑制作用圖具體實(shí)施方式
(一)材料與方法1.試劑Taq酶購(gòu)自大連寶生物(Takara)公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自上海博大泰克生物技術(shù)公司。人非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，新生小牛血清、培養(yǎng)基RPMI-1640干粉劑購(gòu)自GIBCO，胰蛋白酶由Difco進(jìn)口分裝。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購(gòu)自Promega公司，異硫氰酸胍(Trizol)購(gòu)自Invitrogen公司。轉(zhuǎn)染試劑CytoPureTM-huv由日本NDT公司提供。
2.細(xì)胞培養(yǎng)將人非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549培養(yǎng)于含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中，0.25％胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。
3.PCR擴(kuò)增VEGF siRNA表達(dá)框根據(jù)NDT siRNA Cassette Kit操作說(shuō)明，以含有人U6啟動(dòng)子序列的cassette template DNA為模板，整個(gè)過(guò)程包括一個(gè)二次PCR的過(guò)程，上游引物5’primer序列為GAAGGTACCTCGAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAG在第一次PCR中，下游引物3’primerl含有一個(gè)8nt的loop序列、一段19nt的antisense序列以及一段與模板U6啟動(dòng)子互補(bǔ)的序列，其具體序列為CAAGCTTCGGAGTACCCTGATGAGATCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA第一次PCR反應(yīng)條件50μl反應(yīng)體系，94℃5分鐘；94℃30秒，65℃20秒，72℃2.5分鐘，37個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。將第一次PCR的產(chǎn)物稀釋10倍作為第二次PCR的模板。
在第二次PCR反應(yīng)2中，正向引物5’primer與第一次PCR反應(yīng)相同，另有一段反向引物3’primer2其中有一段poly(A)5、一段19nt的siRNA sense序列以及一段與8nt的loop互補(bǔ)的序列，其具體序列為GGACTCGAGAAAGGAAAAAGATCTCATCAGGGTACTCCCAAGCTTCGGAG第二次PCR的反應(yīng)條件與第一次PCR反應(yīng)一致。
4.轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM在體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及效率檢測(cè)將8×104A549肺癌細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿孔底60％～80％時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按照NDT公司提供的轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM操作說(shuō)明進(jìn)行。PCR siRNA表達(dá)框轉(zhuǎn)染A549 24～48小時(shí)后用PBS清洗細(xì)胞3次，滴加多聚甲醛固定15分鐘，再用PBS洗去固定液，置于熒光顯微鏡觀察PCR siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中的表達(dá)。
轉(zhuǎn)染后的A549 24～48小時(shí)后胰酶消化收集細(xì)胞，加1ml無(wú)水乙醇固定30分鐘后，3000rpm×5min離心收集細(xì)胞，用1mlPBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCR siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中的表達(dá)情況。
5.siRNA表達(dá)框體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染及RT-PCR鑒定VEGF的表達(dá)(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染將1×105A549細(xì)胞接種于六孔板，培養(yǎng)18-24小時(shí)，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿孔底60％～80％時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM與2μg/孔VEGF siRNA表達(dá)框PCR產(chǎn)物以15∶1的比例混勻并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
(2)細(xì)胞總RNA的提取單層融合細(xì)胞用PBS洗2次，用TRIZOL法提取細(xì)胞總RNATRIZOL溶液裂解細(xì)胞→氯仿抽提→異丙醇沉淀→75％乙醇洗滌→超凈臺(tái)上通風(fēng)干燥→無(wú)RNA酶的滅菌雙蒸水重溶RNA；用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度，其中RNA濃度(μg/ml)＝OD260×稀釋倍數(shù)×40(μg/ml)；用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的質(zhì)量。
(3)細(xì)胞cDNA的合成及RT-PCR鑒定VEGF的表達(dá)細(xì)胞cDNA的合成按照Promega公司提供的反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV操作說(shuō)明書進(jìn)行總RNAl-3μl、OligodT 1μl混合均勻，70℃保溫5分鐘，然后立即冰浴5分鐘，依次加入5×M-MLV buffer4μl、RNA酶抑制劑0.5μl、dNTP1μl、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV1μl，加DEPC處理無(wú)菌水至20μl，37℃保溫1小時(shí)，最后95℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶活性。根據(jù)Genebank中人VEGF cDNA序列設(shè)計(jì)兩條引物上游引物5’TCGGGCCTCCGAAACCATGA3下游引物5’CCTGGTGAGAGATCTGGTTC3’PCR循環(huán)條件94℃5分鐘；94℃1分鐘，59℃30秒，72℃30秒；28個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。最后取10μl PCR產(chǎn)物用瓊脂糖電泳鑒定。由于人VEGF存在多種轉(zhuǎn)錄剪接體，此對(duì)引物的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為516、648、720和771bp。內(nèi)對(duì)照β-actin的引物上游引物AACGGCTCCGGCATGTGCAA下游引物CTTCTGACCCATGCCCACCAPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為318bp。
6.荷瘤鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)(1)荷瘤裸鼠模型的建立大量培養(yǎng)人非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰蛋白酶消化，待細(xì)胞變圓脫落時(shí)，加入完全培養(yǎng)基吹打均勻，并調(diào)整活細(xì)胞數(shù)為5×106/ml。選取3～5周齡的裸小鼠，每只裸鼠于前肢腋下的皮下接種腫瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞數(shù)約5×106個(gè)，無(wú)菌飼養(yǎng)約3～4周，即可長(zhǎng)出瘤狀腫塊至直徑約1cm時(shí)備用。
(2)VEGF siRNA表達(dá)框的荷瘤裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將VEGF siRNA表達(dá)框架PCR產(chǎn)物2μg與20μg轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM混勻，室溫放置15分鐘后定點(diǎn)注射入荷瘤鼠動(dòng)物模型腫瘤內(nèi)部在3-4d后，脫頸椎處死裸鼠并取出腫瘤，冰凍切片根據(jù)VEGF siRNA表達(dá)框架內(nèi)部的報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況來(lái)檢測(cè)VEGF siRNA表達(dá)框架在腫瘤內(nèi)部的表達(dá)情況。分別采用pEGFP質(zhì)粒載體作為陽(yáng)性對(duì)照。注射生理鹽水作為陰性對(duì)照。同時(shí)抽取腫瘤組織總RNA，通過(guò)半定量RT-PCR鑒定VEGF基因的表達(dá)。
(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.PCR擴(kuò)增VEGF siRNA表達(dá)框PCR擴(kuò)增VEGF siRNA表達(dá)框的建立包括一個(gè)二次PCR的過(guò)程，最后所得的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA分子并發(fā)揮其功能。
VEGF siRNA表達(dá)框架的兩次PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果第一次PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為2300bp左右；第二次PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果長(zhǎng)度為2300bp左右2.轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM在體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及效率檢測(cè)將轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM與VEGF siRNA表達(dá)框1μg混合，室溫放置15分鐘后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM與VEGFsiRNA表達(dá)框按混合，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察結(jié)果為轉(zhuǎn)染后呈陽(yáng)性結(jié)果流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)VEGF siRNA表達(dá)框在A549肺癌細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果為轉(zhuǎn)染試劑CytoPure-cmnTM體外轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞株A549的效率達(dá)40％。
3.VEGF siRNA表達(dá)框體外轉(zhuǎn)染非小性肺癌細(xì)胞株A549后RT-PCR鑒定VEGF的表達(dá)根據(jù)RT-PCR的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染VEGFsiRNA表達(dá)框的細(xì)胞的VEGF基因的表達(dá)得到一定程度的抑制，并且呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴性。通過(guò)軟件Band Scan對(duì)瓊脂糖凝膠電泳條帶進(jìn)行灰度計(jì)算，求得VEGF/β-actin的值，結(jié)果如下對(duì)照組0.300±0.023；0.75μg組0.262±0.017(P＞0.05)；1.0μg組0.232±0.028(P＜0.05)；1.25μg組0.234±0.014(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，1.0μg組以及1.25μg組對(duì)VEGF基因的表達(dá)具有顯著抑制作用。
4.VEGFsiRNA表達(dá)框架體內(nèi)轉(zhuǎn)染荷瘤鼠動(dòng)物模型及冰凍切片觀察其在腫瘤內(nèi)部的表達(dá)根據(jù)熒光顯微鏡的觀察結(jié)果表明與GFP對(duì)照以及陰性對(duì)照相比VEGF siRNA表達(dá)框在體內(nèi)能夠得到有效的表達(dá)。
5.VEGF siRNA表達(dá)框體內(nèi)轉(zhuǎn)染荷瘤鼠動(dòng)物模型RT-PCR檢測(cè)結(jié)果根據(jù)RT-PCR的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染VEGF siRNA表達(dá)框的細(xì)胞的VEGF基因的表達(dá)得到一定程度的抑制。通過(guò)軟件Band Scan對(duì)瓊脂糖凝膠電泳條帶進(jìn)行灰度計(jì)算，求得VEGF/β-actin的值，結(jié)果如下對(duì)照組0.78±0.39，實(shí)驗(yàn)組0.43±0.22，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)得到一定程度的抑制，但是抑制程度不顯著(P＞0.05)。
血管新生與腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，實(shí)體瘤長(zhǎng)到一定程度就有賴于新生血管為其運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為以后的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，抑制新生血管的生成目前是抗腫瘤生物治療中的一個(gè)熱點(diǎn)。目前抗腫瘤血管生成的主要策略包括干擾血管生成過(guò)程，抑制正常內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和反應(yīng)；阻斷生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的刺激血管生長(zhǎng)的信號(hào)途徑。大量研究表明VEGF和bFGF是誘導(dǎo)血管生成的主要調(diào)節(jié)因素。因此阻斷VEGF和bFGF刺激血管生成的信號(hào)途徑對(duì)于腫瘤的治療有著廣闊的前景。
RNA干擾技術(shù)是近幾年來(lái)產(chǎn)生的一種新的抑制基因表達(dá)的強(qiáng)有力的工具。目前制備siRNA的方法主要有化學(xué)合成siRNA；體外轉(zhuǎn)錄制備siRNA；體外轉(zhuǎn)錄合成長(zhǎng)雙鏈RNA后用Dicer或者RNase III降解為siRNA庫(kù)；siRNA表達(dá)載體在細(xì)胞體內(nèi)生成siRNAs；PCR擴(kuò)增siRNA表達(dá)框并直接用于轉(zhuǎn)染。本發(fā)明通過(guò)最后一種方法-PCR擴(kuò)增siRNA表達(dá)框，不但避免了復(fù)雜的RNA操作，而且不需要經(jīng)過(guò)載體克隆、篩選和測(cè)序的步驟，只要將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中就可以進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)和對(duì)不同的siRNA進(jìn)行快速篩選。本發(fā)明提供了一種快捷、方便以及經(jīng)濟(jì)的PCR的方法，將設(shè)計(jì)好的針對(duì)VEGF編碼區(qū)的siRNA序列的有義鏈和反義鏈插入到人的U6啟動(dòng)子下方，制備出帶有人源U6啟動(dòng)子的siRNA表達(dá)框。將得到的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者注射到腫瘤內(nèi)部，有效的抑制了VEGF基因的表達(dá)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生siRNA表達(dá)框，能夠在體內(nèi)外有效的抑制VEGF基因的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種抑制血管內(nèi)生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的siRNA靶基因序列，其特征在于基因序列為5’ggagtaccctgatgagatc3’或者其互補(bǔ)序列5’gatctcatcagggtactcc3’
2.一種抑制血管內(nèi)生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的siRNA表達(dá)框，其特征在于siRNA表達(dá)框是由權(quán)利要求1中的siRNA靶基因與U6啟動(dòng)子以及報(bào)告基因GFP連接在一起構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一段抑制血管內(nèi)生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的siRNA靶基因序列，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。通過(guò)PCR的方法將siRNA序列與U6啟動(dòng)子以及報(bào)告基因GFP連接在一起，形成一個(gè)siRNA表達(dá)框，來(lái)檢測(cè)VEGF被抑制的情況，取得了良好的效果，從而得到了一段新的能夠抑制人VEGF基因表達(dá)的siRNA靶基因序列5’ggagtaccctgatgagatc3’或者其互補(bǔ)序列5’gatctcatcagggtactcc3’，該能夠抑制人VEGF基因表達(dá)，將有可能成為抗非小細(xì)胞肺癌的一種很有潛力的siRNA藥物。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1844386SQ20061002561
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月11日
發(fā)明者錢旻, 俞磊, 羅淑芳, 章平, 高云波, 杜冰, 汪磊 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)