專利名稱：鬼針草提取物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是關(guān)于鬼針草提取物-含有黃酮類及雙咖啡酰衍生物的混合物及其在制備防治糖尿病的藥物或食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鬼針草(Bidens bipinnata L)又名鬼骨針，婆婆針，是菊科植物鬼針草的全草。藥理實(shí)驗(yàn)證明鬼針草除具有清熱解毒，散淤消腫等作用外還具有預(yù)防高血脂造成的脂質(zhì)代謝紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化心腦血管病，治療胃潰瘍等多種作用。已報(bào)道的鬼針草含有的主要成分為金絲桃苷，異奧卡寧7-O-葡萄糖苷，奧卡寧，海生菊苷[王建平，石井永，惠秋莎等.“鬼針草化學(xué)成分的研究”，中草藥，1992，23(5)229]，6-O-(6″乙酰基-吡喃葡萄糖基)-6，7，3′，4′-四羥基噢哢，槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷[李帥，匡海學(xué)，岡田嘉仁等，“鬼針草有效成分的研究II”，中草藥，2004，35(9)972]和鬼針聚炔苷[王建平，“鬼針草抗炎新成分的藥理作用”，中草藥，1997，28(11)112]。至今未見對(duì)上述化合物進(jìn)行防治糖尿病的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種鬼針草提取物及其應(yīng)用。鬼針草用乙醇滲漉提取，減壓濃縮至無(wú)乙醇后得濃縮液，濃縮液依次用石油醚，乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取液減壓濃縮即得提取物，該提取物是主要含黃酮類和雙咖啡酰衍生物的混合物，從該提取物進(jìn)一步分離并鑒定得14個(gè)黃酮類化合物和3個(gè)雙咖啡酰類化合物，提取物中黃酮類含量為65-70％，雙咖啡酰衍生物的含量為5-10％。采用鏈尿佐菌素所致糖尿病大鼠的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鬼針草提取物對(duì)鏈尿佐菌素所致大鼠血糖升高有顯著的降血糖作用。
14個(gè)黃酮類化合物(BL-1-BL-14，其中BL-11和BL-13為新化合物)和3個(gè)雙咖啡酰類衍生物(BL-15-BL-17)為BL-13′，4′，7，8-四羥基二氫黃酮醇[Dziedzic，et al.，Journal of Agricultural andFood Chemistry，1985，33(2)，244]；BL-2異奧卡寧-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[王建平，惠秋莎，秦紅巖等，中草藥，1992，23(5)229-231]；BL-32′，3′，4′，3，4-五羥基查爾酮4′-葡萄糖苷[王建平，惠秋莎，秦紅巖等，中草藥，1992，23(5)229-231]；BL-4奧卡寧′-O-β-D-(2″，4″，6″-三乙?；?-葡萄糖苷[Hoffmann B，Hlzl J，Planta Medica，1998，54(1)52]；BL-53′，4′-二甲氧基槲皮素[姜巖青，左春旭，藥學(xué)學(xué)報(bào)，1988，23(10)749]；BL-6槲皮素[項(xiàng)光亞，楊瑜，阮金蘭，.同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2001，30(5)481-483]；BL-7槲皮素-7-O-鼠李糖苷[易金海，張國(guó)林，李伯剛，.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37(5)352-335]；BL-8木犀草素[于德泉，楊俊山主編分析化學(xué)手冊(cè)(第二版)第七分冊(cè)，P818，28]；BL-9金絲桃苷[王建平，惠秋莎，秦紅巖等，中草藥，1992，23(5)229-231]；BL-103，5-二羥基-3′，5′-二甲氧基黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[陳耀祖，張惠迪，張所明等，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，1989，10(3)260]；BL-118，3′，4′-三羥基黃酮-7-O-β-D葡萄糖苷[該化合物的波譜數(shù)據(jù)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)m/z449[M-H]+，核磁共振氫譜(1H-NMR)(DMSO-d6)δ8.9(s，2H，3′，4′-OH)，8.4(s，1H，8-OH)，7.23(d，J＝9Hz，1H，C-5)，6.86(d，J＝9Hz，1H，C-6)，6.89(d，J＝2，1H，B環(huán)C-2′)，6.78(dd，J＝2，8Hz，1H，B環(huán)C-6′)，6.75(d，J＝8Hz，1H，B環(huán)C-5′)，5.41(1H，ddd，J＝12，12，2Hz，C環(huán)，C-2)，3.10(m，1H，C環(huán)C-3)，2.70(t，J＝12，17，2Hz，1H，C環(huán)C-3)。4.81(d，J＝7Hz，糖上C-1″)；核磁共振碳譜(13C-NMR)(DMSO-d6)δ191.0(C-4)，135.1(C-8)，150.7(C-7)，145.5(C-4′)，145.1(C-3′)，150.7(C-9)，130.1(C-1′)，117.9(C-5)，108.9(C-6)，117.9(C-6′)，115.2(C-5′)，114.4(C-2′)，116.5(C-10)，79.1(C-2)，43.4(C-3)，糖上101.5(C-1″)，77.0(C-5″)，75.8(C-3″)，73.2(C-2″)，69.7(C-4″)，60.6(C-6″)]；BL-125，8，4′-三羥基黃酮-7-O-β-D葡萄糖苷[張衛(wèi)東，陳萬(wàn)生，王永紅等，中草藥，2000，(31)，8565]；BL-133，6，8-三氯-5，7，3′，4′-四羥基黃酮[高分辨電噴霧質(zhì)譜(HRESI-MS)精確分子量388.9217；分子式C15H6O6Cl3；核磁共振氫譜(1H-NMR)(DMSO-d6)δ6.95(1H，d，J＝9.0Hz，5’-H)，7.44(1H，dd，J＝9.0，3.0Hz，6’-H)，7.51(1H，d，J＝3.0Hz，2’-H)，9.98(1H，s，4’-OH)，9.55(1H，s，3’-OH)，13.04(1H，s，5-OH)；核磁共振碳譜(13C-NMR)(DMSO-d6)δ175.92(CO)，115.52(5’-C)，116.44(2’-C)，122.02(6’-C)，160.80(2-C)，156.28((5-C)，154.40(9-C)，150.00(3’-C)，149.60(4’-C)，145.15(7-C)，120.74(10-C)，104.61(6-C)，103.29(3-C)，99.15(8-C))；BL-146，7，3′，4′-四羥基橙酮[Venkateswarlu，et al.，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry；2004，68(10)2183-2185]；BL-153，5-雙咖啡酰奎寧酸[Timmermann B et al.，Journal of NaturalProducts，1983，46(3)365]；BL-163，5-雙咖啡酰奎寧酸甲酯[Timmermann B，etal.，Journal of Natural Products，1983，46(3)365]；BL-174，5-雙咖啡?？鼘幩醄B.H.Um et al.，F(xiàn)itoterapia，2002，73550]。
14個(gè)黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 BL-1 R1＝-OHBL-3 R2＝-葡萄糖基BL-2 R1＝-葡萄糖基BL-4 R2＝2″，4″，6″-三乙酰基葡萄糖苷 BL-5 R3＝R4＝-OH，R5＝R6＝-OCH3BL-10R7＝R10＝-H，R8＝R12＝-OH，R9＝R11＝-OCH3BL-6 R3＝R4＝R5＝R6＝-OHBL-11R7＝R9＝R10＝-OH，R8＝R10＝R11＝R12＝-HBL-7 R3＝鼠李糖基，R4＝R5＝R6＝-OH BL-12R7＝R8＝R10＝-OH，R9＝R11＝R12＝-HBL-8 R3＝R5＝R6＝-OH，R4＝-HBL-9 R4＝葡萄糖基，R3＝R5＝R6＝-OH
3個(gè)雙咖啡酰衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)如下具體實(shí)施方式
下面用鬼針草提取物-含有黃酮類和雙咖啡酰衍生物的混合物的藥理活性試驗(yàn)及結(jié)果來(lái)說(shuō)明其應(yīng)用。
實(shí)施例1 鬼針草提取物的制備方法鬼針草干燥藥材10Kg，用20倍量80％乙醇滲漉提取，減壓濃縮至無(wú)乙醇后得濃縮液，濃縮液依次用1000ml石油醚萃取3次，合并石油醚萃取液，減壓濃縮得到石油醚部分10g。再用1000ml乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮得到乙酸乙酯部分40g，即乙酸乙酯提取物，該提取物是主要含黃酮類和雙咖啡酰衍生物的混合物(該提取物含黃酮類成分約70％，雙咖啡酰衍生物成分約10％)。該提取物再經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚∶乙酸乙酯不同比例洗脫，部分收集流份，共分五個(gè)梯度(體積/體積)10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，乙酸乙酯洗脫。每500ml為一個(gè)收集流分，分別回收流份并檢查，從石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)洗脫梯度得到化合物BL-1，BL-5，BL-13和BL-14四個(gè)化合物；從石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)洗脫梯度得到化合物BL-4，BL-6和BL-8三個(gè)化合物；從石油醚∶乙酸乙酯(2∶1)洗脫梯度得到化合物BL-10，BL-15，BL-16和BL-17四個(gè)化合物；從石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)洗脫梯度得到化合物BL-2，BL-3，BL-7和BL-9四個(gè)化合物；乙酸乙酯洗脫得到BL-11和BL-12二個(gè)化合物。通過(guò)波譜分析測(cè)定和與文獻(xiàn)比較(對(duì)已知化合物)結(jié)果一致，分別確定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2 鬼針草提取物對(duì)鏈尿佐菌素所致大鼠血糖升高模型的降血糖作用試驗(yàn)2.1.材料受試藥物樣品鬼針草提取物。
試劑鏈尿佐菌素 Sigma公司產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，清潔級(jí)，雌雄兼用，購(gòu)自海軍醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心，并飼養(yǎng)在該中心動(dòng)物房，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK-軍-2002-044。
給藥劑量本實(shí)驗(yàn)中，大鼠低、高劑量組的給藥劑量分別為150mg/kg/次，300mg/kg/次。
檢測(cè)指標(biāo)血糖含量的變化。
檢測(cè)方法強(qiáng)生隨手測(cè)型血糖儀；隨手測(cè)試紙。
2.2大鼠糖尿病模型的制備鏈尿佐菌素溶液的配制鏈尿佐菌素在低溫和PH為4的條件下配制為2％的水溶液并保存。
取體重180～240g的SD大鼠，在適應(yīng)性飼養(yǎng)后禁食24小時(shí)，大鼠開始腹腔一次性快速注射給藥鏈尿佐菌素劑量為60mg/kg。72小時(shí)后出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖相，血糖≥16.7mmol/L，即糖尿病階段。
2.3給藥方法藥物以10％吐溫-80助溶后加生理鹽水配制或稀釋成所要的濃度，配制好后密封置棕色試劑瓶?jī)?nèi)室溫保存，稱量動(dòng)物體重后采用灌胃的方法給藥。給藥體積均為5ml/kg。糖尿病大鼠在禁食后7小時(shí)后測(cè)空腹血糖，然后給藥一次。
2.4判斷標(biāo)準(zhǔn)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理測(cè)量給藥前血糖水平為基礎(chǔ)值，測(cè)給藥后1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)血糖水平與基礎(chǔ)值比較，觀察是否有降糖作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以X±S表示，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)，全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。P＜0.05，表示有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2.5分組鬼針草提取物對(duì)大鼠糖尿病模型的抑制作用實(shí)驗(yàn)分為2組，第一組的動(dòng)物數(shù)為10只，給藥劑量150mg/kg，第二組的動(dòng)物數(shù)為8只，給藥劑量300mg/kg。分別在給藥后1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)抽取大鼠尾部的靜脈血做血糖含量測(cè)定。測(cè)量給藥前血糖水平為基礎(chǔ)值，測(cè)給藥后1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)血糖水平與基礎(chǔ)值比較，觀察是否有降低血糖作用。測(cè)定的血糖水平均為空腹血糖(空腹血糖以FSG代表)水平。
2.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果鬼針草提取物對(duì)大鼠糖尿病模型的抑制作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見下表1。
表1

**P＜0.01(差別非常顯著)，*P＜0.05(差別顯著)，與自身給藥前血糖水平對(duì)照比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鬼針草提取物對(duì)鏈尿佐菌素所致大鼠血糖升高有顯著的降低血糖作用。
結(jié)論以上實(shí)施例2的試驗(yàn)結(jié)果表明在所試驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，鬼針草提取物-含有黃酮類和雙咖啡酰衍生物的混合物已具備作為治療糖尿病(降低血糖)的藥物的基本條件。因此，本發(fā)明鬼針草提取物可用于制備防治糖尿病的藥物或食品。
權(quán)利要求
1.一種鬼針草提取物，其特征在于該提取物是含有黃酮類及雙咖啡酰衍生物的混合物。
2.如權(quán)利要求1所述的鬼針草提取物，其特征在于所述提取物中黃酮類含量為65-70％，雙咖啡酰衍生物的含量為5-10％。
3.如權(quán)利要求1或2所述的鬼針草提取物，其特征在于所述提取物中含有如下化合物3′，4′，7，8-四羥基二氫黃酮醇；異奧卡寧-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；2′，3′，4′，3，4-五羥基查爾酮4′-葡萄糖苷；奧卡寧′-O-β-D-(2″，4″，6″-三乙?；?-葡萄糖苷；3′，4′-二甲氧基槲皮素；槲皮素；槲皮素-7-O-鼠李糖苷；木犀草素；金絲桃苷；3，5-二羥基-3′，5′-二甲氧基黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；8，3′，4′-三羥基黃酮-7-O-β-D葡萄糖苷；5，8，4′-三羥基黃酮-7-O-β-D葡萄糖苷；3，6，8-三氯-5，7，3′，4′-四羥基黃酮；6，7，3′，4′-四羥基橙酮；3，5-雙咖啡?？鼘幩幔?，5-雙咖啡?？鼘幩峒柞?；4，5-雙咖啡?？鼘幩?。
4.權(quán)利要求1或2所述的鬼針草提取物在制備防治糖尿病的藥物或食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是一種鬼針草提取物及其應(yīng)用。鬼針草提取物是一種含有黃酮類及雙咖啡酰衍生物的混合物，經(jīng)分離鑒定得14個(gè)黃酮類化合物和3個(gè)雙咖啡酰衍生物。藥理試驗(yàn)研究表明，鬼針草提取物對(duì)鏈尿佐菌素所致大鼠血糖升高有顯著的降血糖作用。因此，本發(fā)明鬼針草提取物可用于制備防治糖尿病的藥物或食品。
文檔編號(hào)C07D311/30GK1899340SQ200610028870
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日
發(fā)明者陳海生, 劉建國(guó), 黃敏珠, 唐秋海 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)