專利名稱：一種用于研究魚(yú)類遺傳關(guān)系的dna分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用分子遺傳標(biāo)記來(lái)分析魚(yú)類之間的分子遺傳關(guān)系，具體涉及用DNA分子標(biāo)記來(lái)判斷和分析不同魚(yú)類的遺傳特性和遺傳關(guān)系。
背景技術(shù)：
對(duì)生物遺傳變異的分析，一是直接測(cè)序，一是借助分子遺傳標(biāo)記。目前大規(guī)模全基因組測(cè)序發(fā)展迅猛，但對(duì)生物界所有物種測(cè)序是不現(xiàn)實(shí)的。分子遺傳標(biāo)記仍然是個(gè)體水平和群體水平上分析生物遺傳多樣性及其變化規(guī)律的主要手段，廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、遺傳作圖等理論研究及保護(hù)生物學(xué)、動(dòng)植物遺傳育種、疾病診斷等實(shí)踐領(lǐng)域。
目前，DNA分子標(biāo)記主要有以下五種(1)線粒體DNA(mtDNA)分子標(biāo)記；(2)基于Southern雜交分子標(biāo)記，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)，熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)；(3)基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplification Polymorphic DNA，RAPD)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)和單鏈構(gòu)象多態(tài)-DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Single-Strand ConformationPolymorphism-Polymerase Chain Reaction，SSCP-PCR)；(4)基于重復(fù)序列的分子標(biāo)記，如微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA；(5)基于mRNA的分子標(biāo)記，如逆轉(zhuǎn)錄PCR(Polymerase ChainReaction)和差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR。
1990年，Sinclair等人在人類和小鼠中克隆了睪丸決定因子SRY/Sry(Sexdetermining region on Y chromosome)基因，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Sry基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中含有一段具有高度保守性且具有結(jié)合DNA功能的區(qū)域(稱為high mobility group，HMG)。Sox基因族編碼的蛋白質(zhì)中都含有HMG區(qū)域，每個(gè)Sox基因的HMG序列與Sry基因的HMG序列至少具有60％的同源性。目前，已在進(jìn)化位置明顯不同的各類物種如哺乳類、鳥(niǎo)類、爬行類、兩棲類、魚(yú)類以及昆蟲(chóng)中克隆出了40多個(gè)Sox基因，對(duì)其序列和功能進(jìn)行了研究，迄今發(fā)現(xiàn)的所有Sox基因，按其HMG-box盒的同源性程度，可劃分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10個(gè)不同的亞族。如C組的Sox4基因參與心臟管腔發(fā)育，E組的Sox9基因參與睪丸的發(fā)育，F(xiàn)組中的Sox18基因參與血管的發(fā)育。但是目前還沒(méi)有利用Sox基因族的DNA片段作為分子遺傳標(biāo)記來(lái)判斷不同魚(yú)類的遺傳特性和分析它們的遺傳關(guān)系的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在應(yīng)用擴(kuò)增獲得的DNA片段作為分子遺傳標(biāo)記分析不同魚(yú)類之間的遺傳關(guān)系。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的用Sox基因族的HMG-box的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)PCR、瓊脂糖凝膠電泳獲得Sox基因的DNA片段，根據(jù)擴(kuò)增片段在數(shù)目和種類上的共同性和差異性分析不同魚(yú)類之間的遺傳關(guān)系，簡(jiǎn)并引物序列為上游引物5’TGAAGCGACCCATGAAC/TG 3’；下游引物5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT 3’。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明。


圖1部分魚(yú)種Sox基因HMG-box DNA片段的擴(kuò)增圖。
其中M200bp分子梯度標(biāo)記；1.紅鯽；2.鯉魚(yú)；3.鯽鯉F1；4.鯽鯉F2；5.異源四倍體鯽鯉；6.雄核發(fā)育二倍體鯽鯉；7.雌核發(fā)育二倍體鯽鯉第一代(G1)；8.雌核發(fā)育二倍體鯽鯉第一代(G2)；9.日本白鯽；10.雌核發(fā)育日本白鯽；11.三倍體湘云鯽(日本白鯽(♀)×四倍體鯽鯉(♂))；12.三倍體鯽魚(yú)(紅色雙尾金魚(yú)(♀)×四倍體鯽鯉(♂))；13.異源四倍體鯽鯉；14.紅色雙尾金魚(yú)；15珍珠雙尾金魚(yú)；16.黑色雙尾墨龍金魚(yú)；17.本地鯽魚(yú)；18.彭澤鯽。
圖2部分魚(yú)種Sox基因HMG-box DNA片段的擴(kuò)增圖。
其中M200bp分子梯度標(biāo)記1.雌核發(fā)育二倍體鯽鯉；2.異源四倍體鯽鯉；3.雌核發(fā)育二倍體鯽鯉(G1)(♀)×四倍體鯽鯉(4n)(♂)；4.單尾紅鯽；5.雙尾紅鯽；6.灰色鯉魚(yú)；7.白色鯽魚(yú)。
引物設(shè)計(jì)參照不同物種中Sox基因HMG保守區(qū)序列，用Primer Premier 5.0軟件和Jellyfish1.4軟件設(shè)計(jì)獨(dú)特的簡(jiǎn)并引物，由上海Sangon公司合成。其序列如下上游引物5’TGAAGCGACCCATGAAC/TG3’；下游引物5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT3’。
實(shí)驗(yàn)材料紅鯽(Carassius carassius red var.，2n＝100)和鯉魚(yú)(Cyprinus carpio L.，2n＝100)及其二倍體雜交后代鯽鯉F1-F2，異源四倍體鯽鯉(人工鯽鯉雜交產(chǎn)生的四倍體魚(yú))，雄核發(fā)育二倍體鯽鯉，雌核發(fā)育二倍體鯽鯉第一代(G1)、第二代(G2)，日本白鯽(Carassius auratus cuvieri)，雌核發(fā)育日本白鯽，三倍體湘云鯽(日本白鯽(♀)×四倍體鯽鯉(♂))，三倍體金魚(yú)(紅色雙尾金魚(yú)(♀)×四倍體鯽鯉(♂))，黑色雙尾墨龍金魚(yú)，珍珠雙尾金魚(yú)，紅色雙尾金魚(yú)，雌核發(fā)育二倍體鯽鯉第一代G1(♀)×異源四倍體鯽鯉4n(♂)自交后代分離出的單尾紅鯽，雙尾紅鯽，灰色鯉魚(yú)，白色鯽魚(yú)，本地鯽魚(yú)，彭澤鯽(Carassius auratus varpengze)。
基因組DNA的提取血液DNA的提取按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。提取的DNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，-20℃保存。
PCR擴(kuò)增和克隆PCR反應(yīng)在美國(guó)Applied Biosystems公司生產(chǎn)的GeneAmpPCR System 2700熱循環(huán)儀上進(jìn)行，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25μl，其中模板基因組DNA 80ng，每種dNTP200μmol.l-1，每種引物各0.25μmol.l-1，TaqDNA聚合酶1.25U，反應(yīng)液在94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸80s，共35個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠電泳中分離，用上海Sangon公司膠回收試劑盒純化切取的擴(kuò)增片段，純化方法參照產(chǎn)品手冊(cè)進(jìn)行。將回收的DNA片段克隆于載體pMD18-T(TakaRa公司)，連接反應(yīng)及細(xì)菌轉(zhuǎn)化按pMD18-T載體試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
測(cè)序和序列分析選取陽(yáng)性克隆菌落，提取重組質(zhì)粒pMD18-T，經(jīng)過(guò)菌落PCR和酶切鑒定后，由上海Sangon公司對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，采用Blast軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性比較，根據(jù)其與查詢序列的最高相似性而命名所得克隆。
本研究根據(jù)Sox基因家族HMG保守區(qū)設(shè)計(jì)獨(dú)特簡(jiǎn)并引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增不同魚(yú)類基因組DNA片段并對(duì)一些DNA片段的序列進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果表明，不同魚(yú)類中Sox基因的DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物在數(shù)目、大小和種類方面存在共同性和差異性，通過(guò)這些差異性和共同性可以確定它們各自的遺傳特性和分析它們的遺傳關(guān)系。本發(fā)明基于Sox基因組DNA片段的數(shù)目、大小和種類的分子標(biāo)記技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、特異、敏感地確定不同魚(yú)類的分子遺傳特性并分析它們的分子遺傳關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)以紅鯽(Carassius carassius red var.)為例具體介紹本發(fā)明。按活體解剖確定紅鯽性別，選擇性成熟紅鯽個(gè)體。用一次性注射器從紅鯽背動(dòng)脈取血，血液DNA的提取按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。提取的DNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，-20℃保存。
參照不同物種中Sox基因HMG保守區(qū)序列，用Primer Premier 5.0軟件和Jellyfish1.4軟件設(shè)計(jì)獨(dú)特的簡(jiǎn)并引物，由上海Sangon公司合成。其序列如下上游引物5’TGAAGCGACCCATGAAC/TG3’；下游引物5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT3’。以紅鯽基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)PCR體系擴(kuò)增其Sox基因。具體步驟如下PCR反應(yīng)在美國(guó)Applied Biosystems公司生產(chǎn)的GeneAmpPCR System 2700熱循環(huán)儀上進(jìn)行，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25μl，其中紅鯽基因組DNA 80ng，每種dNTP 200μmol.l-1，每種獨(dú)特的簡(jiǎn)并引物各0.25μmol.l-1，TaqDNA聚合酶1.25U，反應(yīng)液在94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸80s，共35個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠電泳中分離，用凝膠成像掃描儀拍照，結(jié)果見(jiàn)圖1中1號(hào)樣品所示，可見(jiàn)清晰的三條擴(kuò)增帶，大小分別約為200、600和1900bp。
其它實(shí)驗(yàn)魚(yú)Sox基因的擴(kuò)增和克隆方法與紅鯽基本一致，結(jié)果見(jiàn)圖1圖2。從圖1可知，二倍體鯽鯉F1-F2(3、4號(hào)樣品)以及異源四倍體鯽鯉(在鯽鯉F3中形成四倍體鯽鯉，目前繁殖到F15，證明鯽鯉F3-F15都是四倍體魚(yú))(5號(hào)樣品)中有四條大小分別約為200、600、900和1900bp的DNA擴(kuò)增帶，而在其原始母本-紅鯽(1號(hào)樣品)只有3條帶和原始父本-鯉魚(yú)中(2號(hào)樣品)只有2條擴(kuò)增帶，大小分別約為200、600、1900bp和200、900bp。這些結(jié)果表明二倍體鯽鯉F1-F2和四倍體鯽鯉都既兼有其原始親本共有的200bp擴(kuò)增帶，又有區(qū)別于鯉魚(yú)，紅鯽特有的600，1900bp擴(kuò)增帶和區(qū)別于紅鯽，鯉魚(yú)特有的900bp擴(kuò)增帶。通過(guò)這些擴(kuò)增帶特征，我們能很容易的區(qū)分紅鯽和鯉魚(yú)及它們的二倍體和四倍體雜交后代。四倍體鯽鯉產(chǎn)生的二倍體精子通過(guò)無(wú)需染色體加倍的雄核發(fā)育過(guò)程發(fā)育成為二倍體雄核發(fā)育雜交后代(6號(hào)樣品)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它們具有同鯽鯉F1-F2、四倍體鯽鯉同樣大小的四條帶，從分子水平證明了它們的異源性，同樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明四倍體鯽鯉產(chǎn)生的二倍體卵子通過(guò)雌核發(fā)育過(guò)程形成的雌核發(fā)育后代(G1和G2)(7、8號(hào)樣品)也具有類似的四條帶，顯示出異源性，證明它們是一個(gè)雜交克隆體系。
日本白鯽(9號(hào)樣品)和雌核發(fā)育白鯽(10號(hào)樣品)具有相同的大小分別約為200和640bp的2條帶，說(shuō)明雌核發(fā)育白鯽的遺傳組成中與其母本的遺傳組成是一致的，沒(méi)有檢測(cè)到父本(團(tuán)頭魴，Megalobrama amblycephala)的遺傳物質(zhì)。這兩條帶特別是640bp這條帶的特征可作為區(qū)分白鯽與紅鯽、鯉魚(yú)、金魚(yú)、本地鯽魚(yú)以及彭澤鯽的分子遺傳標(biāo)記。三倍體湘云鯽(11號(hào)樣品)具有5條帶(大小分別約為200、600、620、900和1900bp)，兼有父母本的帶，這五條帶可作為區(qū)分紅鯽、鯉魚(yú)、白鯽、四倍體鯽鯉等魚(yú)的分子遺傳標(biāo)記。而由紅色雙尾金魚(yú)作為母本制備的三倍體鯽魚(yú)(12號(hào)樣品)只具有四條帶，以此可以把此三倍體鯽魚(yú)與三倍體湘云鯽區(qū)分出來(lái)。紅色雙尾金魚(yú)(14號(hào)樣品)，珍珠雙尾金魚(yú)(15號(hào)樣品)，黑色雙尾墨龍金魚(yú)(16號(hào)樣品)，都只具有2條大小分別為200和600bp的帶，說(shuō)明這三種金魚(yú)雖然在體色和形態(tài)方面都存在差異，但是在遺傳組成方面它們是非常相似的并與白鯽的遺傳組成很接近。本地鯽魚(yú)(17號(hào)樣品)與金魚(yú)、日本白鯽很接近都只具有2條帶，但是與彭澤鯽(18號(hào)樣品)有顯著的差異(彭澤鯽具有4條帶)，這說(shuō)明彭澤鯽比本地鯽魚(yú)、日本白鯽和金魚(yú)具有更復(fù)雜的遺傳組成。
從圖2可知，雌核發(fā)育二倍體鯽鯉(G1)(♀)×四倍體鯽鯉(4n)(♂)(3號(hào)樣品)具有與親本(1和2號(hào)樣品)完全相同的擴(kuò)增帶，說(shuō)明G1(♀)×4n(♂)具有紅鯽和鯉魚(yú)兩種遺傳成分，單尾紅鯽(4號(hào)樣品)，雙尾紅鯽(5號(hào)樣品)，灰色鯉魚(yú)(6號(hào)樣品)和白色鯽魚(yú)(7號(hào)樣品)是一些特殊的G1(♀)×4n(♂)后代通過(guò)自交的方式產(chǎn)生的具有分離性狀的不同類型的魚(yú)，其中紅色單尾紅鯽，雙尾紅鯽，白色鯽魚(yú)都是類似紅鯽的鯽魚(yú)，其外形特征偏向于它們的原始母本紅鯽，其共同的基本特征就是它們都沒(méi)有須。本研究結(jié)果顯示它們具有3條同樣大小的DNA帶，說(shuō)明它們的遺傳組成與紅鯽是一致的；分離后代中的灰色鯉魚(yú)與普通鯉魚(yú)的外形是完全一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它們都具有相同大小的4條DNA帶，說(shuō)明它們的遺傳組成是一致的。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為證明雌核發(fā)育效應(yīng)可以導(dǎo)致異源四倍體鯽鯉的自交后代出現(xiàn)分離提供了重要的分子遺傳標(biāo)記證據(jù)。
為了進(jìn)一步確定紅鯽這三條擴(kuò)增帶的性質(zhì)，用一次性刀片分別切取這三條擴(kuò)增帶，經(jīng)Sangon公司膠回收試劑盒純化切取的擴(kuò)增片段，純化方法參照產(chǎn)品手冊(cè)進(jìn)行。將回收的三個(gè)不同大小的DNA片段分別克隆于載體pMD18-T(TakaRa公司)，連接反應(yīng)及細(xì)菌轉(zhuǎn)化按pMD18-T載體試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
從三個(gè)不同平板上選取陽(yáng)性克隆菌落，分別提取重組質(zhì)粒pMD18-T，經(jīng)過(guò)菌落PCR和酶切鑒定后，由上海Sangon公司對(duì)三種不同陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，采用Blast軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性比較，并根據(jù)其與查詢序列的最高相似性而命名所得克隆。
對(duì)四倍體鯽、鯉的4條擴(kuò)增帶(5號(hào))進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明四倍體鯽鯉中的200bpDNA片段屬于Sox18基因，600bpDNA片段屬于Sox9a基因，900bpDNA片段屬于Sox9b基因，1900bpDNA片段屬于Sox4基因。該結(jié)果表明四倍體鯽鯉兼有其原始父母本的遺傳基因，它們是異源四倍體而不是同源四倍體，研究表明異源四倍體比同源四倍體具有更多的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)。
權(quán)利要求
1.一種用以分析魚(yú)類遺傳特性和遺傳關(guān)系的DNA分子標(biāo)記方法，其特征在于用Sox基因族的HMG-box的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)PCR、瓊脂糖凝膠電泳獲得Sox基因的DNA片段，根據(jù)擴(kuò)增片段在數(shù)目和種類上的共同性和差異性分析不同魚(yú)類之間的遺傳關(guān)系，簡(jiǎn)并引物序列為上游引物5’TGAAGCGACCCATGAAC/TG 3’；下游引物5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT 3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及魚(yú)類的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。本發(fā)明選擇Sox基因族的HMG(High mobilitygroup)保守區(qū)域?yàn)榉肿涌寺〉哪繕?biāo)，設(shè)計(jì)獨(dú)特簡(jiǎn)并引物，應(yīng)用PCR、瓊脂糖凝膠電泳等方法獲得在數(shù)目和種類上有差異的Sox基因的DNA片段，用這些特殊的DNA分子來(lái)判斷和分析不同魚(yú)類的遺傳特性和遺傳關(guān)系。該方法可以快速準(zhǔn)確分析魚(yú)類的遺傳關(guān)系，也能應(yīng)用于其他動(dòng)物的遺傳關(guān)系分析。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1884529SQ20061003179
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者劉少軍, 劉筠, 劉季芳, 李偉, 陶敏 申請(qǐng)人:湖南師范大學(xué)