專利名稱：一種提取膠原的方法及用膠原制備膠原蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于膠原及膠原蛋白制備領(lǐng)域，尤其涉及一種以羅非魚(yú)加工過(guò)程中產(chǎn)生的下腳料魚(yú)皮為原料提取膠原的方法以及用提取的膠原為原料制備小分子量膠原蛋白的方法。
背景技術(shù)：
膠原及膠原蛋白在醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域得到重要的應(yīng)用。膠原具有很強(qiáng)的生物活性、較弱的抗原性和良好的生物相容性，在燒傷、創(chuàng)傷、眼角膜疾病、美容、矯形、硬組織修復(fù)、創(chuàng)面止血等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。膠原蛋白具有保濕、修復(fù)、延緩衰老，營(yíng)養(yǎng)等作用。膠原蛋白能促進(jìn)皮膚膠原的合成，促進(jìn)膠原代謝，能明顯改善與老化相關(guān)的膠原合成低下的作用。
目前，國(guó)內(nèi)已報(bào)導(dǎo)了一些膠原蛋白提取及制備方法。
李彥春、祝德義、侯立杰等以牛皮邊角廢料為原料，用兩步酶解法提取膠原蛋白多肽，對(duì)影響酶水解過(guò)程的各個(gè)因素進(jìn)行了分析；通過(guò)對(duì)水解產(chǎn)物分子量分布和等電點(diǎn)等指標(biāo)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)分子量呈不連續(xù)分布，主要集中在某些分子量處，分子量的分布主要與水解方式和所用酶的種類有關(guān)。
2000410024145.1專利介紹了一種用魚(yú)皮生產(chǎn)膠原蛋白肽的工藝，以魚(yú)皮為原料，將魚(yú)皮用水洗凈撈出；放入1‰NaOH水溶液中，浸泡24小時(shí)，至少重復(fù)三次，除去雜蛋白；用濃度為0.5％～1‰的NaOH或NaHCO3除去雜蛋白，用0.5％～1‰的醋酸溶液于40℃～50℃提取后，于反應(yīng)釜中加熱滅菌后，加中性食品酶水解，條件為pH7.5，1～1.5小時(shí)，加酶量為1∶50(酶∶皮)；水解液加活性炭處理后采用工業(yè)板框過(guò)濾器過(guò)濾、脫色；過(guò)濾液濃縮，噴霧干干燥成產(chǎn)品。還有其它專利介紹不同的方法提取制備膠原或膠原蛋白。但這些方法多只涉及單一的膠原或膠原蛋白的提取或制備；不含提取前的預(yù)處理工序，得到的產(chǎn)物中含有較多的雜質(zhì)，而且提取溫度較高，提取時(shí)間較長(zhǎng)，特定結(jié)構(gòu)的膠原結(jié)構(gòu)被破壞，得到的是變性的膠原蛋白；在酶解過(guò)程中得到的產(chǎn)物的分子量分布不集中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提取膠原的方法。
本發(fā)明的另一目的在于用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法。
本發(fā)明用羅非魚(yú)皮提取膠原以及用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白，與已有的報(bào)道的不同，其中包括羅非魚(yú)皮的預(yù)處理，膠原的低溫提取，以獲得未變性的高純度的膠原，同時(shí)以高純度的膠原為原料進(jìn)行水解膠原蛋白的酶解制備，獲得高純度小分子量的膠原蛋白。
為此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下。
一種提取膠原的方法，步驟如下(1)以羅非魚(yú)皮為原料，將魚(yú)皮剪碎后按魚(yú)皮與正己烷的質(zhì)量體積比1∶10～1∶20g/ml加入正己烷，在溫度3℃～25℃下脫脂48～72h；(2)脫脂后用0.05～0.2mol/L的NaOH溶液，在25℃下除雜蛋白2～5h，重復(fù)兩次；(3)用醋酸溶液提取膠原蛋白，醋酸溶液的濃度為0.6mol/L，除雜蛋白后的魚(yú)皮與醋酸溶液的質(zhì)量體積比為1∶10～1∶15g/ml，提取時(shí)間為24～48h，提取溫度為15～30℃，重復(fù)提取二次；(4)按提取物與水的質(zhì)量體積比1∶2.5g/ml加入水，進(jìn)行水洗，經(jīng)純化、濃縮后，冷凍干燥得到膠原。
所述步驟(3)中可在用醋酸溶液提取的基礎(chǔ)上再加超聲波輔助提取，功率條件為20～80w/5g預(yù)處理的魚(yú)皮，可提高提取效率。
用提取的膠原制備膠原蛋白的方法，步驟如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用蛋白酶進(jìn)行酶解；(2)酶解結(jié)束后，升溫至90～100℃，保溫5～10min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白。
所述步驟(1)中蛋白酶不同其酶解作用條件也不同，胰蛋白酶酶解作用條件為E/[S]為500～900u/g、酶解時(shí)間為90min、酶解溫度為35～45℃、pH為7.5～8.5；Alcalase2.4L酶解作用條件為E/[S]為1000～2000u/g、酶解時(shí)間為60min、酶解溫度為50～60℃、pH為7.0～8.5；木瓜蛋白酶酶解作用條件為E/[S]為5000～6400u/g、酶解時(shí)間為3h、酶解溫度為55～65℃、pH為5.0～7.0。
上述方法制備的膠原蛋白中，分子量為500～20000的含量高，其中分子量分布范圍為2000～7000的膠原蛋白占較高比例。
本發(fā)明制備的膠原及膠原蛋白可用于醫(yī)藥及化妝品中。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明以羅非魚(yú)加工的下腳料羅非魚(yú)魚(yú)皮為原料，提取膠原蛋白，并制備水解膠原蛋白，能使羅非魚(yú)魚(yú)皮得到充分的利用，實(shí)現(xiàn)羅非魚(yú)魚(yú)皮的高值利用；(2)本發(fā)明采用正己烷脫脂，用NaOH除雜蛋白，除去魚(yú)皮中所含的脂肪和雜蛋白，提高提取膠原的純度；采用醋酸溶液為提取液及溫和的提取工藝，保持膠原的不變性；(3)本發(fā)明可選用不同的蛋白酶對(duì)膠原進(jìn)行酶解，并采用不同的酶解工藝，酶解產(chǎn)物分子量范圍為500～20000的含量高，且產(chǎn)物中分子量分布范圍為2000～7000的膠原蛋白占較高比例。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。
實(shí)施例1提取膠原的方法如下(1)以羅非魚(yú)皮為原料，將魚(yú)皮剪碎后按魚(yú)皮與正己烷的質(zhì)量體積比1∶10g/ml加入正己烷，在溫度25℃下脫脂72h；(2)脫脂后用0.05mol/L的NaOH溶液，在25℃下除雜蛋白5h，重復(fù)兩次；(3)用醋酸溶液提取膠原蛋白，醋酸溶液的濃度為0.6mol/L，除雜蛋白后的魚(yú)皮與醋酸溶液的質(zhì)量體積比為1∶10g/ml，提取時(shí)間為48h，提取溫度為30℃，重復(fù)提取二次；(4)按提取物與水的質(zhì)量體積比1∶2.5g/ml加入水，進(jìn)行水洗，經(jīng)純化、濃縮后，冷凍干燥得到膠原，膠原的得率為44％。
用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解作用條件為E/[S]為700u/g、酶解時(shí)間為90min、酶解溫度為35℃、pH為8.5；(2)酶解結(jié)束后，升溫至90℃，保溫10min；
(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白，得到的分子量為500～20000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的90％，其中分子量為2000～7000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的44％。
實(shí)施例2提取膠原的方法同實(shí)施例1。
用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解作用條件為E/[S]為500u/g、酶解時(shí)間為90min、酶解溫度為40℃、pH為8.0；(2)酶解結(jié)束后，升溫至95℃，保溫8min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白，得到的分子量為500～20000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的91％，其中分子量為2000～7000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的43％。
實(shí)施例3提取膠原的方法同實(shí)施例1。
用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解作用條件為E/[S]為900u/g、酶解時(shí)間為90min、酶解溫度為45℃、pH為7.5；(2)酶解結(jié)束后，升溫至100℃，保溫5min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白，得到的分子量為500～20000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的90％，其中分子量為2000～7000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的44％。
實(shí)施例4提取膠原的方法如下(1)以羅非魚(yú)皮為原料，將魚(yú)皮剪碎后按魚(yú)皮與正己烷的質(zhì)量體積比1∶20g/ml加入正己烷，在溫度3℃下脫脂48h；(2)脫脂后用0.2mol/L的NaOH溶液，在25℃下除雜蛋白2h，重復(fù)兩次；(3)用醋酸溶液提取膠原蛋白，醋酸溶液的濃度為0.6mol/L，除雜蛋白后的魚(yú)皮與醋酸溶液的質(zhì)量體積比為1∶15g/ml，提取時(shí)間為24h，提取溫度為15℃，重復(fù)提取二次；(4)按提取物與水的質(zhì)量體積比1∶2.5g/ml加入水，進(jìn)行水洗，經(jīng)濃縮后，冷凍干燥得到膠原，膠原的得率為43％。
用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用Alcalase2.4L進(jìn)行酶解，酶解作用條件為E/[S]為2000u/g、酶解時(shí)間為60min、酶解溫度為50℃、pH為8.5；(2)酶解結(jié)束后，升溫至90℃，保溫10min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白，得到的分子量為500～20000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的90％，其中分子量為2000～7000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的44％。
實(shí)施例5提取膠原的方法同實(shí)施例4。
用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法如下
(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用Alcalase2.4L進(jìn)行酶解，酶解作用條件為E/[S]為1000u/g、酶解時(shí)間為60min、酶解溫度為55℃、pH為8.0；(2)酶解結(jié)束后，升溫至95℃，保溫8min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白，得到的分子量為500～20000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的91％，其中分子量為2000～7000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的43％。
實(shí)施例6提取膠原的方法同實(shí)施例4。
用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用Alcalase2.4L進(jìn)行酶解，酶解作用條件為E/[S]為1500u/g、酶解時(shí)間為60min、酶解溫度為60℃、pH為7.0；(2)酶解結(jié)束后，升溫至100℃，保溫5min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白，得到的分子量為500～20000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的90％，其中分子量為2000～7000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的44％。
實(shí)施例7提取膠原的方法如下(1)以羅非魚(yú)皮為原料，將魚(yú)皮剪碎后按魚(yú)皮與正己烷的質(zhì)量體積比1∶15g/ml加入正己烷，在溫度15℃下脫脂60h；(2)脫脂后用0.1mol/L的NaOH溶液，在25℃下除雜蛋白3h，重復(fù)兩次；
(3)用醋酸溶液提取膠原蛋白，醋酸溶液的濃度為0.6mol/L，除雜蛋白后的魚(yú)皮與醋酸溶液的質(zhì)量體積比為1∶12g/ml，提取時(shí)間為36h，提取溫度為25℃，重復(fù)提取二次；(4)按提取物與水的質(zhì)量體積比1∶2.5g/ml加入水，進(jìn)行水洗，經(jīng)濃縮后，冷凍干燥得到膠原，膠原的得率為44％。
用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解作用條件為E/[S]為6400u/g、酶解時(shí)間為3h、酶解溫度為55℃、pH為5.0；(2)酶解結(jié)束后，升溫至90℃，保溫10min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白，得到的分子量為500～20000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的90％，其中分子量為2000～7000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的44％。
實(shí)施例8提取膠原的方法同實(shí)施例7。
用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解作用條件為E/[S]為5000u/g、酶解時(shí)間為3h、酶解溫度為65℃、pH為7.0；(2)酶解結(jié)束后，升溫至95℃，保溫8min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白，得到的分子量為500～20000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的91％，其中分子量為2000～7000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的43％。
實(shí)施例9提取膠原的方法同實(shí)施例7。
用提取的膠原制備小分子量膠原蛋白的方法如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解作用條件為E/[S]為5800u/g、酶解時(shí)間為3h、酶解溫度為60℃、pH為6.0；(2)酶解結(jié)束后，升溫至100℃，保溫5min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白，得到的分子量為500～20000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的90％，其中分子量為2000～7000的膠原蛋白占膠原蛋白總質(zhì)量的44％。
實(shí)施例1～9中，提取膠原方法中的步驟(3)可在用醋酸溶液提取的基礎(chǔ)上再加超聲波輔助提取，功率條件為20～80w/5g預(yù)處理的魚(yú)皮，如20w/5g、40w/5g、80w/5g等預(yù)處理的魚(yú)皮，這樣可提高提取效率。
權(quán)利要求
1.一種提取膠原的方法，其特征在于步驟如下(1)以羅非魚(yú)皮為原料，將魚(yú)皮剪碎后按魚(yú)皮與正己烷的質(zhì)量體積比1∶10～1∶20g/ml加入正己烷，在溫度3℃～25℃下脫脂48～72h；(2)脫脂后用0.05～0.2mol/L的NaOH溶液，在25℃下除雜蛋白2～5h，重復(fù)兩次；(3)用醋酸溶液提取膠原蛋白，醋酸溶液的濃度為0.6mol/L，除雜蛋白后的魚(yú)皮與醋酸溶液的質(zhì)量體積比為1∶10～1∶15g/ml，提取時(shí)間為24～48h，提取溫度為15～30℃，重復(fù)提取二次；(4)按提取物與水的質(zhì)量體積比1∶2.5g/ml加入水，進(jìn)行水洗，經(jīng)純化、濃縮后，冷凍干燥得到膠原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取膠原的方法，其特征在于所述步驟(3)中在用醋酸溶液提取的基礎(chǔ)上再加超聲波輔助提取，功率條件為20～80w/5g預(yù)處理的魚(yú)皮。
3.一種用權(quán)利要求1的方法提取的膠原制備膠原蛋白的方法，其特征在于步驟如下(1)將提取得到的膠原加入6倍的水溶解，然后利用蛋白酶進(jìn)行酶解；(2)酶解結(jié)束后，升溫至90～100℃，保溫5～10min；(3)經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備膠原蛋白的方法，其特征在于所述步驟(1)中蛋白酶是胰蛋白酶，酶解作用條件為E/[S]為500～900u/g、酶解時(shí)間為90min、酶解溫度為35～45℃、pH為7.5～8.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備膠原蛋白的方法，其特征在于所述步驟(1)中蛋白酶是Alcalase2.4L，酶解作用條件為E/[S]為1000～2000u/g、酶解時(shí)間為60min、酶解溫度為50～60℃、pH為7.0～8.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備膠原蛋白的方法，其特征在于所述步驟(1)中蛋白酶是木瓜蛋白酶，酶解作用條件為E/[S]為5000～6400u/g、酶解時(shí)間為3h、酶解溫度為55～65℃、pH為5.0～7.0。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提取膠原的方法及用膠原制備膠原蛋白的方法。本發(fā)明以羅非魚(yú)皮為原料，將魚(yú)皮剪碎后加入正己烷，脫脂后用NaOH溶液除雜蛋白，然后用醋酸溶液提取膠原蛋白，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到膠原。用提取的膠原制備膠原蛋白的方法將提取得到的膠原加入水，溶解，然后利用蛋白酶進(jìn)行酶解，經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到水解膠原蛋白。本發(fā)明用正己烷脫脂，用NaOH除雜蛋白，除去魚(yú)皮中所含的脂肪和雜蛋白，提高了提取膠原的純度；采用醋酸溶液為提取液及溫和的提取工藝，保持了膠原的不變性，采用超聲波提高提取效率；采用特定的酶解工藝，控制酶解產(chǎn)物的分子量范圍。本發(fā)明制備的膠原及膠原蛋白可用于醫(yī)藥及化妝品中。
文檔編號(hào)C07K14/78GK1903918SQ200610036860
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2006年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月31日
發(fā)明者曾慶孝, 寧初光, 朱志偉, 阮征, 張立彥, 李汴生 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)