專利名稱：一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取谷胱甘肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取谷胱甘肽的方法，涉及從谷胱甘肽發(fā)酵液中制備低蛋白質(zhì)含量、高品質(zhì)的谷胱甘肽，屬于谷胱甘肽制備技術領域。
背景技術：
谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸(glutathione，GSH)，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的一種同時具有γ-谷氨酰基和巰基的生物活性三肽化合物。谷胱甘肽有兩種形式還原型GSH和氧化型GSSG，只有GSH才具有活性，而生物體內(nèi)的GSSG需還原后才能發(fā)揮其重要的生理功能。還原型谷胱甘肽固體較為穩(wěn)定，但其水溶液在空氣中極易被氧化成氧化型谷胱甘肽GSSG。GSH在自然界中廣泛分布于動物、植物和微生物細胞內(nèi)。GSH在生物體內(nèi)有著多種重要的生理功能，特別是對于維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境起著至關重要的作用。GSH還具有獨特的生理功能，被稱為長壽因子和抗衰老因子。由于GSH在強化食品風味的同時對人體有保健作用，它的應用前景顯然要優(yōu)于其它類型的防腐劑或抗氧化劑。隨著GSH的生理生化功能和性質(zhì)被不斷研究發(fā)現(xiàn)，GSH作為一種多功能的生物活性添加劑在食品加工業(yè)中的應用將會愈來愈廣，GSH的需求量正日益增大。
發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的方法不斷得到改進，已經(jīng)成為目前國內(nèi)外生產(chǎn)谷胱甘肽最普遍的方法。但要從發(fā)酵液中獲得純度很高的GSH，一直成為國內(nèi)外研究的熱點。到目前為止報道的分離提純GSH的方法有銅鹽法、離子交換、親和層析、雙水相分離等。銅鹽法是一種比較傳統(tǒng)的方法，有一定實用價值，目前仍然被一些GSH生產(chǎn)工藝所應用，但需要大量的H2S，污染較大，工藝復雜，所以隨著各項新的分離純化技術的出現(xiàn)，必將逐漸被淘汰。由于氨基酸和多肽類物質(zhì)為具有弱堿性和弱酸性官能團的兩性化合物，因此采用陰陽離子交換樹脂吸附、解吸的方法來使得氨基酸和肽類化合物和其他物質(zhì)快速有效的分離。該方法經(jīng)濟效益較高，可望完全代替銅鹽法。親和層析方法是一種有效的分離純化GSH的方法。一般而言含汞樹脂對酸堿比較敏感，穩(wěn)定性比較差，在工業(yè)應用上有一定的限制。雙水相分離具有分相時間短、易于連續(xù)操作、目標產(chǎn)物分配系數(shù)大、投資費用少、大多形成雙水相的高聚物可回收利用等特點，被廣泛用于生物化學、細胞生物學、生物化工等領域產(chǎn)品的分離和提取。ATPE技術主要用于分離生物有機大分子(蛋白質(zhì)、核酸、菌等)，但實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)仍有困難。
近年來我國離子交換樹脂工業(yè)發(fā)展迅速，國產(chǎn)離子交換樹脂的價格相對于進口樹脂價格大大降低，使得離子交換法在生化物質(zhì)的分離方面的研究不斷深入。離子交換法能夠?qū)щ娗闆r不同的物質(zhì)進行分離，廣泛應用于天然活性成分的研究中。對于離子交換法，國內(nèi)外對陽離子交換樹脂的研究比較多，但大多GSH的回收率很低，只達到32.9％-57.6％，采用高選擇性的含汞樹脂分離效果回收率也只達到54.3％，同時獲得的產(chǎn)品純度普遍較低。
以往的GSH提取方法普遍存在著成本高、提取率不高、質(zhì)量低劣和品質(zhì)不穩(wěn)定、環(huán)境污染嚴重等缺點，難以適應工業(yè)化生產(chǎn)和實際應用的需要?？紤]到國內(nèi)外對高品質(zhì)的谷胱甘肽食品添加劑需求的不斷增長，因此，如何在工業(yè)規(guī)模上實現(xiàn)高品質(zhì)的GSH提取，具有重要的工業(yè)應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取谷胱甘肽的方法，是利用谷胱甘肽發(fā)酵液制備高品質(zhì)、高含量的谷胱甘肽的方法，制備的谷胱甘肽以富含谷胱甘肽的食品添加劑的形式作為產(chǎn)品。
本發(fā)明的技術方案將谷胱甘肽發(fā)酵液經(jīng)離心得到酵母細胞液、調(diào)節(jié)pH值、沸水破壁、陽離子交換、真空濃縮、冷凍干燥、成品包裝而制得。
具體操作步驟如下1、離心得酵母細胞液將發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速為3000rpm，時間為10-15min，得到濕酵母細胞沉淀。
2、調(diào)節(jié)pH值用2mol/1H2SO4將酵母細胞液的pH值調(diào)節(jié)為1-2。
3、沸水破壁以濕酵母細胞質(zhì)量計，按照物料比為10-12ml/g計算蒸餾水體積用量，先將大部分蒸餾水加熱至沸騰，將調(diào)好pH值的酵母細胞液倒進沸水中，迅速攪拌，用剩下少量的蒸餾水沖洗燒杯，一并倒入。當溫度再次加熱至95-100℃，開始計時，12min后，立刻放置冰浴中冷卻至4℃。
4、陽離子交換將型號為001×7陽離子交換樹脂裝柱，柱體積為φ2.6cm×30cm，將含菌體的酵母細胞液直接上柱，其上樣時pH值為2-3，流速為1ml/min，留出未吸附的酵母細胞液循環(huán)上樣直至飽和；用3-4倍柱體積的以鹽酸調(diào)pH值為3的蒸餾水洗樹脂柱，將菌體和細胞沉淀等雜質(zhì)洗去，再用3-4倍柱體積的1.5％HCl洗脫，其洗脫速度為0.5ml/min，洗脫液濃縮到5-6倍，收集富含谷胱甘肽的濃縮液。
5、真空濃縮將谷胱甘肽濃縮液再次真空濃縮，按照下列條件進行真空度0.9MPa，旋轉(zhuǎn)速度130rpm，溫度55-60℃，濃縮至8-10倍，得谷胱甘肽超濃縮液。
6、冷凍干燥將谷胱甘肽超濃縮液進行冷凍干燥于-84℃下干燥28h，得到白色粉末狀谷胱甘肽成品。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取GSH的過程分為提取和濃縮兩個階段，提取為將發(fā)酵液離心得到酵母細胞沉淀煮沸破壁提取GSH，再經(jīng)過離子交換技術等進一步濃縮得到GSH。采用離心得酵母細胞、調(diào)節(jié)pH值、沸水破壁方法，提取細胞中的谷胱甘肽，同時使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)變性沉淀，使用陽離子交換技術去除小分子和有色物質(zhì)，最終達到從發(fā)酵液中濃縮純化谷胱甘肽的操作工序，不僅可以在實驗室中方便實施，而且極易在工業(yè)生產(chǎn)中運用。采用沸水破壁前調(diào)節(jié)pH值，不僅有利于GSH的穩(wěn)定，而且可以使大分子蛋白質(zhì)變性沉淀，除去大部分蛋白質(zhì)。將帶菌體的酵母液直接上柱，生產(chǎn)成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。使用適合于工業(yè)化規(guī)模的離子交換技術可有效的去除小分子和有色物質(zhì)，尤其是離子交換技術適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。該法操作簡單、高效、費用低廉、成品純度較高、環(huán)境污染小、易于工業(yè)化。制得GSH產(chǎn)品的分子量為307.33、蛋白質(zhì)含量為23％、提取收率為80.5％的谷胱甘肽成品。
具體實施例方式
實施例1發(fā)酵得到的谷胱甘肽發(fā)酵液，成份分析結果菌體75g/L；GSH含量3.95g/L。將上述2L發(fā)酵液于3000rpm下離心15min，棄去上清液，得到420g濕菌體。在上述濕菌體中加水稀釋至5L。將稀釋后的菌體用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至1-2范圍內(nèi)。加熱煮沸12min后置于冰水浴中冷卻至4℃。將冷卻后的菌體混合液直接上001×7陽離子交換樹脂柱，柱體積為φ2.6cm×30cm，將含菌體的酵母細胞液直接上柱，柱吸附洗脫，此時GSH回收率為89.1％，蛋白質(zhì)去除率為78％，洗脫液濃縮5倍。將上述經(jīng)吸附柱濃縮后的谷胱甘肽濃縮液再次進行真空濃縮，按照下列條件進行真空度0.9MPa，旋轉(zhuǎn)速度130rpm，溫度55-60℃，濃縮至8倍。將谷胱甘肽超濃縮液進行冷凍干燥，于-84℃下干燥28h后得到白色粉末狀谷胱甘肽成品。此時谷胱甘肽的純含量為6.36g，提取收率為80.5％。谷胱甘肽呈白色粉末狀物質(zhì)，具有良好的感官品質(zhì)。
對比實施例1改變沸水破壁前用硫酸所調(diào)pH值，將pH調(diào)節(jié)為3，其它操作同實施例1。結果谷胱甘肽的純含量為2.46g，提取收率為31.1％。
對比實施例2改變煮沸時間。將煮沸時間改為2h，其他操作同實施例1。結果谷胱甘肽的純含量為2.46g，提取收率為62.5％。
對比實施例3改變所用的洗脫劑，將1.5％的HCl改為采用1.5％NaCl為洗脫劑。其他操作同實施例1。結果濃縮倍數(shù)僅為6倍，谷胱甘肽的純含量為5.7g，提取收率為72.4％，蛋白質(zhì)去除率40.6％。
權利要求
1.一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取谷胱甘肽的方法，其特征是將谷胱甘肽發(fā)酵液經(jīng)離心得到酵母細胞液、調(diào)節(jié)pH值、沸水破壁、陽離子交換、真空濃縮、冷凍干燥、成品包裝而制得成品谷胱甘肽；離心得酵母細胞液將發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速為3000rpm，時間為10-15min，得到濕酵母細胞沉淀；調(diào)節(jié)pH值用2mol/l H2SO4將酵母細胞液的pH值調(diào)節(jié)為1-2；沸水破壁以濕酵母細胞質(zhì)量計，按照物料比為10-12ml/g計算蒸餾水體積用量，先將大部分蒸餾水加熱至沸騰，將調(diào)好pH值的酵母細胞液倒進沸水中，迅速攪拌，用剩下少量的蒸餾水沖洗燒杯，一并倒入，當溫度再次加熱至95-100℃，開始計時，12min后，立刻放置冰浴中冷卻至4℃；陽離子交換將型號為001×7陽離子交換樹脂裝柱，柱體積為φ2.6cm×30cm，將含菌體的酵母細胞液直接上柱，其上樣時pH值為2-3，流速為1ml/min，留出未吸附的酵母細胞液循環(huán)上樣直至飽和；用3-4倍柱體積的以鹽酸調(diào)pH值為3的蒸餾水洗樹脂柱，將菌體和細胞沉淀等雜質(zhì)洗去，再用3-4倍柱體積的1.5％HCl洗脫，其洗脫速度為0.5ml/min，洗脫液濃縮到5-6倍，收集富含谷胱甘肽的濃縮液；真空濃縮將谷胱甘肽濃縮液再次真空濃縮，按照下列條件進行真空度0.9MPa，旋轉(zhuǎn)速度130r/min，溫度55-60℃，濃縮至8-10倍，得谷胱甘肽超濃縮液；冷凍干燥將谷胱甘肽超濃縮液進行冷凍干燥，-84℃下干燥28h，即得白色粉末狀谷胱甘肽成品。
全文摘要
一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取谷胱甘肽的方法，屬于谷胱甘肽制備技術領域，涉及從谷胱甘肽發(fā)酵液中制備低蛋白質(zhì)含量的谷胱甘肽成品。本發(fā)明采用谷胱甘肽發(fā)酵液離心得酵母細胞、調(diào)節(jié)pH值、沸水破壁方法，提取細胞中的谷胱甘肽，同時使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)變性沉淀；使用陽離子交換技術去除小分子和有色物質(zhì)，最終達到從發(fā)酵液中濃縮純化谷胱甘肽的目的，制得分子量為307.33、蛋白質(zhì)含量為23％、提取收率為80.5％的白色粉末狀谷胱甘肽成品。本發(fā)明方法具有操作簡便、工藝流程簡單、高效、費用低廉、成品純度較高、環(huán)境污染小、易于工業(yè)化等優(yōu)點，不僅可以在實驗室中方便實施，而且極易在工業(yè)生產(chǎn)中運用。
文檔編號C07K1/18GK1850854SQ20061004060
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月19日 優(yōu)先權日2006年5月19日
發(fā)明者王淼, 蘇曉晉 申請人:江南大學