專利名稱：兔抗人cide－3蛋白多克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蛋白的多克隆抗體，特別是一種兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗體。
背景技術(shù)：
誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的DFF45樣效應(yīng)因子(cell death-inducing DFF45-likeeffector，CIDE)-3于2003年發(fā)現(xiàn)，位于人類3p25染色體上，全長(zhǎng)約169 kb。其過(guò)表達(dá)時(shí)可誘導(dǎo)人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的凋亡。CIDE家族蛋白可裂解為N端(CIDE-N)和C端(CIDE-C)。CIDE-N是相互作用的結(jié)構(gòu)域，CIDE家族蛋白可與其他含有CIDE-N結(jié)構(gòu)的蛋白形成同二聚體或異二聚體，CIDE-C為功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的功能。在人類其家族成員有3種CIDE-A、CIDE-B及CIDE-3，其中CIDE-A和CIDE-B可誘導(dǎo)非Caspase依賴的細(xì)胞凋亡，但可被DFF45阻斷。而作為同一家族成員的CIDE-3是否也可通過(guò)相同的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡？根據(jù)申請(qǐng)人所進(jìn)行的資料檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于，提供一種兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗體。申請(qǐng)人構(gòu)建了人CIDE-3基因的原核表達(dá)載體，并在E.coli BL21(DE3)中成功地了表達(dá)蛋白，經(jīng)過(guò)純化后免疫兔，獲得了效價(jià)高、特異性較強(qiáng)的兔抗人CIDE-3蛋白血清，為進(jìn)一步研究人CIDE-3奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗體，該抗體為重組的人CIDE-3N端172個(gè)氨基酸重組蛋白，其基因及氨基酸序列如下1 atggaatacgccatgaagtcccttagccttctgtaccccaagtccctctccaggcatgtgM E Y A M K S L S L L Y P K S L S R H V60 tcagtgcgtacctctgtggtgacccagcagctgctgtcggagcccagccccaaggcccccS V R T S V V T Q Q L L S E P S P K A P120 agggcccggccctgccgcgtaagcacggcggatcgaagcgtgaggaagggcatcatggctR A R P C R V S T A D R S V R K G I M A180 tacagtcttgaggacctcctcctcaaggtccgggacactctgatgctggcagacaagcccY S L E D L L L K V R D T L M L A D K P240 ttcttcctggtgctggaggaagatggcacaactgtagagacagaagagtacttccaagccF F L V L E E D G T T V E T E E Y F Q A300 ctggcaggggatacagtgttcatggtcctccagaaggggcagaaatggcagcccccatcaL A G D T V F M V L Q K G Q K W Q P P S360 gaacaggggacaaggcacccactgtccctctcccataagcctgccaagaagattgatgtgE Q G T R H P L S L S H K P A K K I D V420 gcccgtgtaacgtttgatctgtacaagctgaacccacaggacttcattggctgcctgaacA R V T F D L Y K L N P Q D F I G C L N480 gtgaaggcgactttttatgatacatactccctttcctagV K A T F Y D T Y S L S * 。
上述兔抗人CIDE-3多克隆抗體的制備方法是用多克隆抗體技術(shù)先把人CIDE-3重組蛋白和同等體積的弗氏佐劑乳化后，背部皮下多點(diǎn)，多次注射于新西蘭白兔，使其產(chǎn)生特異性抗體。然后用ELISA方法檢測(cè)其效價(jià)，用Western blot檢測(cè)抗體的特異性。通過(guò)多克隆抗體技術(shù)用人CIDE-3重組蛋白作為抗原，免疫新西蘭白兔獲得了高效價(jià)的免疫兔血清即兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗體，經(jīng)ELISA檢驗(yàn)效價(jià)高于1∶500000，Western blot顯示特異性比較強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式
CIDE-3基因的誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)/CIDE-3(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，質(zhì)粒pET28a(+)購(gòu)自Novagen公司)轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)(購(gòu)自上海生工公司)，挑單克隆菌落，于含30μg/ml卡那霉素(購(gòu)自上海生工公司)的LB中37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日1∶100接種于含50μg/ml卡那霉素的SOB中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6，加終濃度為0.4 mM的IPTG(購(gòu)自TaKaRa公司)誘導(dǎo)表達(dá)3h，12000 rpm離心收集菌體。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，CIDE-3蛋白主要以包涵體的形式存在，表達(dá)的蛋白約占菌體總蛋白的32％。
CIDE-3蛋白的純化1000ml誘導(dǎo)菌體重懸于含1％TritonX-100的PBS中超聲裂解，分離收集包涵體，經(jīng)Buffer A(8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01MTris-cl，pH 8.0)變性，同Ni-NTA Agarose(購(gòu)自Invitrogen公司)孵育后填柱，經(jīng)Buffer B(8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-cl，pH 6.3)、Buffer C(8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-cl，pH 5.9)洗脫未結(jié)合成分，Buffer D(8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-cl，pH 4.5)洗脫結(jié)合蛋白。洗脫液于4L透析液(0.01M Tris-cl，0.1％TritonX-100)中透析24h，8000rpm離心收集蛋白，重懸于PBS。
CIDE-3蛋白的鑒定將純化前后的蛋白分別進(jìn)行SDS-PAGE、Westernblot鑒定分析。將純化后的人CIDE-3蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5％脫脂奶粉封閉，加入滴度為1∶1000的鼠抗組氨酸標(biāo)簽抗體(購(gòu)自北京中杉金橋公司)，4℃過(guò)夜；TTBS洗滌；次日加入1∶2500 HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(購(gòu)自北京中杉金橋公司)，37℃孵育1h；分別用TTBS、TBS洗滌，DAB(購(gòu)自北京中杉金橋公司)顯色。SDS-PAGE顯示與誘導(dǎo)前對(duì)照相比，誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)23×103處有明顯的蛋白帶，并且經(jīng)Ni-NTA Agarose純化后，得到同樣大小的一條蛋白帶，符合CIDE-3理論值的大小。由于重組質(zhì)粒pET28a(+)/CIDE-3在多克隆位點(diǎn)的上游同一閱讀框架內(nèi)存在組氨酸標(biāo)簽基因，能編碼6個(gè)組氨酸(His)6與目的蛋白融合表達(dá)，所以應(yīng)用鼠抗組氨酸標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot，結(jié)果證實(shí)該條帶為目的表達(dá)蛋白。
兔抗人CIDE-3蛋白血清的制備選體重2.0kg的雄性新西蘭白兔(購(gòu)自本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，于背部皮下多點(diǎn)注射純化后的人CIDE-3蛋白，共免疫注射4次第一次為1mg的人CIDE-3蛋白加等體積完全弗氏佐劑(購(gòu)自Sigma公司)；后三次均采用500μg人CIDE-3蛋白加等體積不完全弗氏佐劑，每次間隔為10d；末次免疫1w后，股主動(dòng)脈放血、收集血清。
兔抗人CIDE-3蛋白血清的鑒定采用Western blot及免疫酶聯(lián)吸咐實(shí)驗(yàn)(ELISA)法抗原人CIDE-3蛋白經(jīng)包被液(pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩沖液)稀釋至終濃度為8μg/ml，4℃包被酶標(biāo)板過(guò)夜；洗滌緩沖液(pH 7.4、0.15M PBS)洗滌，分別加滴度1∶1000-1∶1024000的兔抗人CIDE-3蛋白血清0.1ml，同時(shí)用正常兔血清做對(duì)照，37℃孵育1h；洗滌后加1∶2500的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(購(gòu)自北京中杉金橋公司)0.1ml，37℃孵育0.5h，洗滌后TMB顯色，2M硫酸終止反應(yīng)；ELISA讀數(shù)儀測(cè)波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度。結(jié)果顯示抗體效價(jià)約為1∶512000。Western blot結(jié)果顯示兔抗人CIDE-3蛋白血清與CIDE-3蛋白特異性結(jié)合，不與菌體其他成分結(jié)合。
CIDE-3蛋白在組織中的定位根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人CIDE-3蛋白在人的胃組織中陽(yáng)性表達(dá)。因此申請(qǐng)人選取了3例正常胃組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)法。組織切片脫蠟至水，3％雙氧水室溫封閉0.5h；PBS洗滌，羊血清室溫封閉0.5h；加不同稀釋的兔抗人CIDE-3蛋白血清，4℃過(guò)夜，同時(shí)設(shè)立用PBS替代一抗的空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)及用鼠抗人甲狀腺球蛋白單克隆抗體(購(gòu)自Dako公司)替代一抗的無(wú)關(guān)對(duì)照實(shí)驗(yàn)；37℃復(fù)溫1h后，PBS洗滌，加即用型HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫0.5h；DAB顯色后，常規(guī)脫水、透明及中性樹脂封片。結(jié)果顯示部分胃黏膜上皮細(xì)胞CIDE-3蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性，陽(yáng)性物質(zhì)為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，空白及無(wú)關(guān)對(duì)照實(shí)驗(yàn)為陰性?？贵w最佳稀釋度為1∶3000。
本發(fā)明的兔抗人CIDE-3多克隆抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)敏感性高，ELISA結(jié)果顯示抗體效價(jià)約為1∶512000，石蠟切片最佳效價(jià)為1∶3000；(2)特異性強(qiáng)，Western blot結(jié)果顯示兔抗人CIDE-3蛋白血清與CIDE-3蛋白特異性結(jié)合，不與菌體其他成分結(jié)合。石蠟切片染色顯示CIDE-3特異性定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，而間質(zhì)組織染色陰性。
兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗體的基因序列及氨基酸序列1atggaatacgccatgaagtcccttagccttctgtaccccaagtccctctccaggcatgtgM E Y A M K S L S L L Y P K S L S R H V60 tcagtgcgtacctctgtggtgacccagcagctgctgtcggagcccagccccaaggcccccS V R T S V V T Q Q L L S E P S P K A P120 agggcccggccctgccgcgtaagcacggcggatcgaagcgtgaggaagggcatcatggctR A R P C R V S T A D R S V R K G I M A180 tacagtcttgaggacctcctcctcaaggtccgggacactctgatgctggcagacaagcccY S L E D L L L K V R D T L M L A D K P240 ttcttcctggtgctggaggaagatggcacaactgtagagacagaagagtacttccaagccF F L V L E E D G T T V E T E E Y F Q A300 ctggcaggggatacagtgttcatggtcctccagaaggggcagaaatggcagcccccatcaL A G D T V F M V L Q K G Q K W Q P P S360 gaacaggggacaaggcacccactgtccctctcccataagcctgccaagaagattgatgtgE Q G T R H P L S L S H K P A K K I D V420 gcccgtgtaacgtttgatctgtacaagctgaacccacaggacttcattggctgcctgaacA R V T F D L Y K L N P Q D F I G C L N480 gtgaaggcgactttttatgatacatactccctttcctagV K A T F Y D T Y S L S * 。
權(quán)利要求
1.一種兔抗人CIDE-3多克隆抗體，其特征在于，該抗體的基因及氨基酸序列如下1 atggaatacgccatgaagtcccttagccttctgtaccccaagtccctctccaggcatgtgM E Y A M K S L S L L Y P K S L S R H V60 tcagtgcgtacctctgtggtgacccagcagctgctgtcggagcccagccccaaggcccccS V R T S V V T Q Q L L S E P S P K A P120 agggcccggccctgccgcgtaagcacggcggatcgaagcgtgaggaagggcatcatggctR A R P C R V S T A D R S V R K G I M A180 tacagtcttgaggacctcctcctcaaggtccgggacactctgatgctggcagacaagcccY S L E D L L L K V R D T L M L A D K P240 ttcttcctggtgctggaggaagatggcacaactgtagagacagaagagtacttccaagccF F L V L E E D G T T V E T E E Y F Q A300 ctggcaggggatacagtgttcatggtcctccagaaggggcagaaatggcagcccccatcaL A G D T V F M V L Q K G Q K W Q P P S360 gaacaggggacaaggcacccactgtccctctcccataagcctgccaagaagattgatgtgE Q G T R H P L S L S H K P A K K I D V420 gcccgtgtaacgtttgatctgtacaagctgaacccacaggacttcattggctgcctgaacA R V T F D L Y K L N P Q D F I G C L N480 gtgaaggcgactttttatgatacatactccctttcctagV K A T F Y D T Y S L S *。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人CIDE－3蛋白兔抗多克隆抗體，本發(fā)明通過(guò)分子克隆技術(shù)，得到重組的人CIDE－3蛋白N端172個(gè)氨基酸，以此為抗原免疫新西蘭白兔，獲得了高效價(jià)的免疫兔血清。經(jīng)針對(duì)CIDE－3蛋白的綜合性能指標(biāo)測(cè)試，該抗體在免疫組織化學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附和免疫印記實(shí)驗(yàn)中性能穩(wěn)定，敏感性高，特異性強(qiáng)，故可用于CIDE－3功能的分子生物學(xué)及組織學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1821404SQ200610041899
公開(kāi)日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者李青, 姚麗 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)