專利名稱：達氟沙星的偶聯物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種喹諾酮類抗生素的偶聯物及其制備方法與應用，尤其涉及一種達氟沙星(danofloxacin)的偶聯物及其制備方法與應用。屬抗生素藥免疫檢測領域。
背景技術：
本發(fā)明涉及的下列名稱適用于整個說明書和權利要求書BSA牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，Sigma公司產品PBS磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.40)Sephadex-675葡聚糖凝膠，Sigma公司產品cBSA經乙二胺修飾的牛血清蛋白透析膜美國聯合炭化(United Carbide)公司產品達氟沙星中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所EDC乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺，簡稱EDC，Sigma公司產品達氟沙星(danofloxacin)屬于喹諾酮類抗生素。這類抗生素由于其抗菌譜廣，殺菌能力強，是繼土霉素之后在畜禽水產養(yǎng)殖中廣泛應用的藥物。這類藥物可以有效地預防和治療家禽細菌和霉形體疾病。達氟沙星是其中最常用最有效的藥物之一。但人們通過研究逐漸發(fā)現，喹諾酮類抗生素在動物源食品中的殘留對人體有毒害。作為一種人畜共用藥，喹諾酮類抗生素在食品中的殘留通過食物鏈對人體健康危害很大。新英格蘭明尼蘇達州衛(wèi)生署的KIRKE SMITH為首的研究小組發(fā)現，家禽使用喹諾酮類藥物使彎曲桿菌產生了耐藥性。根據美國疾病控制與預防中心的調查，一種由食品引起疾病的彎曲桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性由1998年的13.6％上升到1999年的17.6％。而我國尚未頒布動物源食品中殘留的喹諾酮類藥物的檢測方法和相應標準。美國由于考慮到這類藥物的交叉感染，已經開始在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中禁用喹諾酮類抗生素。我國雖尚未在畜禽水產養(yǎng)殖業(yè)中禁用喹諾酮類抗生素，但有嚴格的停藥期規(guī)定。隨著人民生活水平的提高及我國加入WTO，對動物源食品的品質要求也越來越高，食品中藥物殘留的檢測必將法制化，常規(guī)化。因此，研究喹諾酮類藥物在食品中的殘留限量和檢測方法是非常必要的。
在抗生素藥物殘留的檢測中，儀器法如液相色譜和質譜以及液相質譜聯用是應用最廣泛的方法。這些方法準確，穩(wěn)定，可靠，可以作為標準方法。但儀器法價格昂貴，費時較長，且造成有機溶劑污染，需要大型儀器設備，需要專門的技術人員，所以難于用于現場操作。酶聯免疫檢測法(ELISA)提供了一種極好的掃描手段。該法具有快速，準確，簡易，不需要專門人員操作等優(yōu)點，這使得ELISA法成為一種理想的，可用于常規(guī)掃描的檢測方法。酶聯免疫檢測法的核心是需要高質量的抗體。大多數抗生素包括喹諾酮類藥物都是小分子有機化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以，必須把這些化合物轉變成能引發(fā)動物免疫系統(tǒng)產生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。經檢索，現在世界上尚未有關于達氟沙星的免疫原的合成及抗體制備的報道，而且目前國內檢測達氟沙星藥物殘留的ELISA試劑盒大都購于國外，保存期限短，價格高，遠不能滿足檢測需要，因此研究達氟沙星的免疫原的合成及抗體制備就顯得十分必要。

發(fā)明內容
針對上述現有技術的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種能引發(fā)動物免疫系統(tǒng)產生針對達氟沙星有特異反應的抗體的免疫原，即達氟沙星(danofloxacin)的偶聯物及其制備方法。同時，本發(fā)明還提供了所述的達氟沙星的偶聯物作為免疫原在制備達氟沙星特異反應抗體中的應用。
本發(fā)明的達氟沙星的偶聯物，由達氟沙星半抗原與產生抗原性的載體物質牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯構成。
其中上述產生免疫原性的載體物質優(yōu)選是牛血清蛋白。
本發(fā)明所述的達氟沙星的偶聯物，其結構通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結合的達氟沙星的分子個數，所述n為整數1～20，BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9Kda；上述偶聯物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體；(2)紫外吸收光譜281nm，323nm，334nm。
上述的達氟沙星的偶聯物，其中n優(yōu)選為整數5～15，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
上述的達氟沙星的偶聯物的制備方法是將達氟沙星與產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產生抗體的偶聯物，并保持該偶聯物的生物活性不變。
上述的達氟沙星的偶聯物的制備方法，由如下步驟完成(1)溶液A的制備將達氟沙星，羥基琥珀酰亞胺，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(EDC)，以摩爾比1∶2～8∶5～15溶解在二甲基甲酰胺中，反應生成達氟沙星與乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺溶于pH為7.38～7.56，濃度為0.01M～0.02M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調pH為7.38～7.56；以乙二胺∶BSA∶EDC的摩爾比為15～25∶1∶15～25的量稱取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃±5℃條件下攪拌反應2～4小時；將乙二胺與BSA的反應溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.38～7.56，濃度為0.01M～0.02M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，備用；(4)按達氟沙星與cBSA的摩爾比為15～50∶1量分別取溶液A和溶液B，在20℃±5℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應4～6小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析70～80小時，再改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達氟沙星的偶聯物。
在上述的達氟沙星的偶聯物的制備方法中步驟(1)所述達氟沙星與羥基琥珀酰亞胺、EDC的摩爾比優(yōu)選為1∶5∶10。
在上述的達氟沙星的偶聯物的制備方法中步驟(2)所述乙二胺與牛血清蛋白、EDC的摩爾比優(yōu)選為20∶1∶20。
在上述的達氟沙星的偶聯物的制備方法中步驟(2)(3)所述的磷酸緩沖液pH優(yōu)選為7.40，濃度優(yōu)選為0.01M。
在上述的達氟沙星的偶聯物的制備方法中步驟(4)所述的達氟沙星與牛血清蛋白的摩爾數比優(yōu)選為30∶1。
本發(fā)明所述的達氟沙星的偶聯物作為免疫原在制備達氟沙星特異反應抗體中的應用。
利用本發(fā)明的技術方案可以成功地把半抗原達氟沙星與載體蛋白特別是牛血清蛋白BSA偶聯起來，從而合成了能夠在動物體內引發(fā)免疫反應，產生抗體的完全免疫原——達氟沙星的偶聯物。
利用本發(fā)明所述的達氟沙星的偶聯物作為免疫原免疫新西蘭大白兔，成功地獲得了對半抗原達氟沙星有特異反應的抗體。經ELISA實驗鑒定，利用本發(fā)明所述的達氟沙星的偶聯物作為免疫原制備的達氟沙星特異反應抗體，其抗血清效價達到1∶256,000，其最低檢測限為0.01ppb。
上述的達氟沙星的偶聯物以及高效價的達氟沙星特異反應抗體的制備成功，為制備達氟沙星的酶聯免疫檢測試劑盒提供了基礎。在實際應用中，把所述制備的達氟沙星特異反應抗體鍍在微孔盤內，就可以用來檢驗動物源食品中達氟沙星的殘留。由于本發(fā)明所述方法具有簡易，快速，特異，準確的特點，所以可以用于食品檢驗檢疫中的初步掃描檢測之用。這樣不但可以節(jié)省大量的檢驗時間，還可以用于現場操作，從而彌補了儀器法費時較長，需要大型儀器設備支持，需要專門的技術人員操作，難用于現場的不足。所以，半抗原達氟沙星與載體蛋白特別是牛血清蛋白BSA偶聯物的合成及抗血清的成功制備為這種快速檢驗法奠定了基礎。
具體實施例方式
實施例1(1)液A的制備稱取達氟沙星10.00mg，羥基琥珀酰亞胺10.13mg，EDC 21.09mg，溶解在3ml二甲基甲酰胺中，反應生成達氟沙星與EDC的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺18.03mg溶于20ml pH為7.40，濃度為0.01M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調pH為7.40；分別稱取1000.00mg BSA(分子量68，000)和57.51mg EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃條件下攪拌反應2小時；將乙二胺與BSA的反應溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析70小時，然后改用蒸餾水透析24小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.40，濃度為0.01M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，備用；(4)按達氟沙星與cBSA的摩爾比為20∶1量分別取溶液A和溶液B，在20℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應6小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析70小時，再改用蒸餾水透析24小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達氟沙星的偶聯物。
實施例2(1)A的制備稱取達氟沙星10.00mg，羥基琥珀酰亞胺12.66mg，EDC 42.17mg，溶解在4.6ml二甲基甲酰胺中，反應生成達氟沙星與EDC的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺18.03mg溶于20ml pH為7.40，濃度為0.01M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調pH為7.40；分別稱取1000.00mg BSA(分子量68,000)和57.51mg EDC，然后加入乙二胺溶液中，在25℃條件下攪拌反應4小時；將乙二胺與BSA的反應溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析72小時，然后改用蒸餾水透析30小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.40，濃度為0.01M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，備用；
(4)按達氟沙星與cBSA的摩爾比為30∶1量分別取溶液A和溶液B，在25℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應4小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析72小時，再改用蒸餾水透析30小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達氟沙星的偶聯物。
實施例3(1)液A的制備稱取達氟沙星10.00mg，羥基琥珀酰亞胺20.26mg，EDC 63.26mg，溶解在10ml二甲基甲酰胺中，反應生成達氟沙星與EDC的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺18.52mg溶于20ml pH為7.56，濃度為0.02M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調pH為7.56；分別稱取1000.00mg BSA(分子量67,000)和57.51mg EDC，然后加入乙二胺溶液中，在22℃條件下攪拌反應3小時；將乙二胺與BSA的反應溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析80小時，然后改用蒸餾水透析20小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.56，濃度為0.02M的磷酸緩沖溶液中，配成12.0mg/ml的溶液，備用；(4)按達氟沙星與cBSA的摩爾比為50∶1量分別取溶液A和溶液B，在22℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應5小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析80小時，再改用蒸餾水透析20小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達氟沙星的偶聯物。
(7)用Sephadex-G75(Sigma)進行純化分離，以PBS(0.01M，pH＝7.40)為洗脫液。收集達氟沙星的偶聯物純品。凍干得到達氟沙星的偶聯物即達氟沙星免疫原固體粉末。
實施例4抗體的制備純化及檢測1.抗體的制備選擇上述實施例2所制備的達氟沙星的偶聯物作為免疫原進行動物免疫實驗以制備抗體。
取1mg/ml的達氟沙星的偶聯物的溶液1ml，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后，經皮下多點注射給四只體重2kg的雄性健康新西蘭大白兔，1ml/只，15天后以同量抗原與弗氏不完全佐劑充分乳化后進行二免，二免以后，每隔15天加強免疫一次，抗原量減半，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心臟采血，室溫靜置1小時，0-4℃過夜，13000轉/分離心15分鐘，收集血清，-20℃保存，備用。
2.抗體的純化攪拌狀態(tài)下向上述制備的抗血清中加入飽和硫酸銨至硫酸銨溶液的終濃度為體積百分比是50％，0-4℃放置過夜，有沉淀物析出；以13000轉/分離心15分鐘，棄上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH7.4的PBS至沉淀溶解，然后加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨溶液的終濃度為體積百分比是33％，0-4℃放置過夜，有沉淀物析出；以13000轉/分離心15分鐘，棄上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH7.4的PBS至沉淀溶解。將上述純化物用0.01M、pH7.4的PBS，0-4℃透析，換透析液3次，然后加入質量體積百分比為0.02％的疊氮化鈉，-20℃保存，備用。
3.抗體的酶聯免疫檢測(1)效價測定方法采用常規(guī)的間接酶聯免疫吸附檢測法在96孔的酶標板上，用100μl/孔的達氟沙星與卵清蛋白的偶聯物(10μg/ml)包被，0-4℃放置過夜，然后用PBST(1000mlpH7.4、濃度0.01M的PBS+體積百分比是0.05％Tween20)洗板四次；用250μl/孔封閉液(1000mlPBST+質量體積百分比是1％卵清蛋白)封閉，室溫放置3小時，洗板；在洗去封閉液后，加100ul/孔的抗血清，室溫放置2小時，洗板；在洗去抗血清以后，每孔加入1∶1000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 100ul，室溫放置1小時，洗板；加入底物鄰苯二胺顯色，室溫放置10min，再加入2MHCl終止。酶標儀A492nm檢測。
經測定本發(fā)明所述達氟沙星的偶聯物抗體效價達1∶256,000。
效價的判定以P/N大于2∶1的血清最高稀釋倍數為該抗體的酶聯免疫檢測效價。
其中上述P為代測血清在某一稀釋倍數測定的吸光度值，上述N為陰性對照在相應稀釋倍數測定的吸光度值。
(2)特異性測定測定步驟與效價測定類似，在上述最佳的包被抗原與抗體濃度條件下，加抗體的同時加入達氟沙星溶液(從100ppm-1ppt)，與包被抗原競爭結合有限的抗體，達氟沙星藥的濃度越高，抗體與包被抗原就結合得越少，從而顯色越淺，吸光度值越低。再與空白對照(只加抗體，未加達氟沙星藥的吸光度值)相比較，以確定抗體特異性。
通過測定抗體特異性較好，其最低檢測限可達到0.01ppb，檢測靈敏度較高，并且與喹諾酮類其它藥物的交叉反應較小。
實施例5制備達氟沙星與卵清蛋白的偶聯物(1)A的制備稱取達氟沙星10.00mg，羥基琥珀酰亞胺12.75mg，EDC 42.17mg，溶解在4.6ml二甲基甲酰胺中，反應生成達氟沙星與EDC的活性中間體，備用；(2)溶液B的配制把卵清蛋白溶于pH為7.40，濃度為0.01M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，備用；(3)按達氟沙星與卵清蛋白的摩爾比為30∶1量分別取溶液A和溶液B，在25℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應4小時，得到溶液C；(4)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析72小時，再改用蒸餾水透析24小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(5)凍干上清液，得到白色達氟沙星與卵清蛋白的偶聯物。
權利要求
1.一種達氟沙星的偶聯物，由達氟沙星半抗原與產生免疫原性的載體物質牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯構成。
2.如權利要求1所述的達氟沙星的偶聯物，其中所述產生免疫原性的載體物質是牛血清蛋白。
3.如權利要求2所述的達氟沙星的偶聯物，其結構通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結合的達氟沙星的分子個數，所述n為整數1～20，BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9Kda；上述偶聯物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體；(2)紫外吸收光譜281nm，323nm，334nm。
4.如權利要求3所述的達氟沙星的偶聯物，其特征是所述n為整數5～15，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
5.權利要求1～4中任一項所述的達氟沙星的偶聯物的制備方法，其特征是將達氟沙星與產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產生抗體的偶聯物，并保持該偶聯物的生物活性不變。
6.如權利要求5所述的達氟沙星的偶聯物的制備方法，由如下步驟完成(1)溶液A的制備將達氟沙星，羥基琥珀酰亞胺，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(EDC)，以摩爾比1∶2～8∶5～15溶解在二甲基甲酰胺中，反應生成達氟沙星與乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺溶于pH為7.38～7.56，濃度為0.01M～0.02M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調pH為7.38～7.56；以乙二胺∶BSA∶EDC的摩爾比為15～25∶1∶15～25的量稱取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃±5℃條件下攪拌反應2～4小時；將乙二胺與BSA的反應溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.38～7.56，濃度為0.01M～0.02M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，備用；(4)按達氟沙星與cBSA的摩爾比為15～50∶1量分別取溶液A和溶液B，在20℃±5℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應4～6小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析70～80小時，再改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達氟沙星的偶聯物。
7.如權利要求6所述的達氟沙星的偶聯物的制備方法，其特征是步驟(1)所述達氟沙星與羥基琥珀酰亞胺、EDC摩爾比為1∶5∶10。
8.如權利要求6所述的達氟沙星的偶聯物的制備方法，其特征是步驟(2)所述乙二胺與牛血清蛋白、EDC的摩爾比為20∶1∶20。
9.如權利要求6所述的達氟沙星的偶聯物的制備方法，其特征是步驟(4)所述的達氟沙星與牛血清蛋白的摩爾數比為30∶1。
10.權利要求1～4中任一項所述的達氟沙星的偶聯物作為免疫原在制備達氟沙星特異反應抗體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通式(I)的達氟沙星的偶聯物，由達氟沙星半抗原與產生免疫原性的載體物質牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯構成。其中n為與一個牛血清蛋白分子結合的達氟沙星的分子數，所述n為整數1～20，BSA為牛血清蛋白，分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa。本發(fā)明還公開了所述的偶聯物的制備方法，即將達氟沙星與產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產生抗體的偶聯物。本發(fā)明的達氟沙星的偶聯物通過免疫新西蘭大白兔，制備了效價達1∶256,000的抗血清，其最低檢測限為0.01ppb。本發(fā)明具有方法簡便，快速，特異，準確的特點，為制備達氟沙星的酶聯免疫檢測試劑盒提供了基礎。
文檔編號C07K1/00GK1827643SQ20061004320
公開日2006年9月6日 申請日期2006年3月14日 優(yōu)先權日2006年3月14日
發(fā)明者郗日沫, 盧圣欣, 張玉蘭 申請人:山東大學