專利名稱：一種生產(chǎn)殼寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)殼寡糖的方法，特別是涉及一種通過發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)殼聚糖酶的微生物，生產(chǎn)殼聚糖酶，利用該酶降解殼聚糖生產(chǎn)殼寡糖的方法。
背景技術(shù)：
甲殼素和殼聚糖是多糖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，殼聚糖是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。但由于殼聚糖不溶于水，在體內(nèi)不易降解吸收，從而影響了它的應(yīng)用范圍。殼寡糖是殼聚糖經(jīng)降解后形成的聚合度2～20的氨基葡萄糖低聚糖，具有很好的水溶性，并具有許多獨(dú)特的生理活性和功能，如增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，降低血清膽固醇、血脂，降低糖尿病患者的血糖含量，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等。在農(nóng)業(yè)方面對(duì)農(nóng)作物具有抗菌抗病、增產(chǎn)、改善品質(zhì)等功能。因此，在保健食品、生態(tài)農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、生物工程等領(lǐng)域有著廣泛的用途，具有很大的市場(chǎng)需求潛力。
目前國(guó)內(nèi)外殼寡糖的制備方法有酸降解法、酶降解法、氧化降解法等。酸降解法生產(chǎn)的殼寡糖由于反應(yīng)時(shí)所用的水體積大，耗能大，難以控制分子量范圍，得到的水溶性寡糖產(chǎn)率相當(dāng)?shù)?，且含有大量無(wú)機(jī)鹽不容易去除。氧化降解法生產(chǎn)殼寡糖，由于反應(yīng)劇烈，得到的寡糖分子量大小均一性差，難以控制，且該寡糖的結(jié)構(gòu)易被破壞，有害物質(zhì)殘留多，產(chǎn)品質(zhì)量差。酶降解法是用水解酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行生物降解，能得到平均分子量較低的殼寡糖，又由于酶法降解反應(yīng)條件溫和，能耗低，無(wú)污染，屬綠色清潔生產(chǎn)，因此是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的最好的殼寡糖生產(chǎn)方法。但目前的酶降解法生產(chǎn)殼寡糖工藝中，所用的酶活性不高，專一性不強(qiáng)，由此造成產(chǎn)品收率低，生產(chǎn)成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)殼寡糖的方法，以克服現(xiàn)有酶法生產(chǎn)殼寡糖的上述缺點(diǎn)。
一種生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征是將殼聚糖溶解于醋酸水溶液中，加入殼聚糖酶，使殼聚糖水解；將所得水解液減壓濃縮，然后用乙醇沉淀、干燥或?qū)⑺庖簢婌F干燥；所述的殼聚糖酶為殼聚糖酶液或殼聚糖酶粉；所述的殼聚糖酶液的體積與殼聚糖的重量比為0.1～2L∶1Kg，所述的殼聚糖酶粉與殼聚糖的重量比為0.5g～10g∶1Kg。
按本發(fā)明的方法生產(chǎn)的殼寡糖水溶性好，收率高，成本低。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)產(chǎn)殼聚糖酶菌株的獲得先制備選擇性平板培養(yǎng)基分別稱取殼聚糖1.0g、(NH4)2SO40.5g、酵母浸粉0.1g、K2HPO40.05g、KH2PO40.3g、NaCl 1.0g、MgSO4·7H2O 0.05g、瓊脂2.0g，置于500ml三角燒瓶中，量取蒸餾水95g，倒入上述三角燒瓶中，用1mol/L的NaOH水溶液調(diào)pH至8.1，加上棉塞，于121℃高壓下滅菌20min。滅菌后將制得的培養(yǎng)基分裝到直徑為9cm的玻璃平皿中，每皿15ml，冷卻至室溫，得選擇性平板培養(yǎng)基。取養(yǎng)蝦池海水0.2ml，于無(wú)菌條件下均勻涂布在上述選擇性平板培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)5天，得產(chǎn)殼聚糖酶的細(xì)菌。以劃線法將上述產(chǎn)殼聚糖酶細(xì)菌進(jìn)一步純化，得產(chǎn)殼聚糖酶菌株。
制備選擇性平板培養(yǎng)基所用的各物質(zhì)及其重量百分?jǐn)?shù)范圍可以是殼聚糖0.1～5％、(NH4)2SO40.1～5％、酵母浸粉0.05～1％、K2HPO40.05～0.1％、KH2PO40.01～0.5％、NaCl 0.1～3％、MgSO4·7H2O 0.02～0.08％、瓊脂1.5～2.5％、水90-98％，調(diào)pH7.5～8.5。(NH4)2SO4可以改為NH4NO3也能達(dá)到同樣的效果。
(2)殼聚糖酶發(fā)酵液的制備先配制發(fā)酵培養(yǎng)基分別稱取殼聚糖25g、(NH4)2SO420g、酵母提取物5g、NaCl 20g、MgSO4·7H2O 0.5g，置于5000ml的三角燒瓶中，加入蒸餾水至1000ml，倒入三角燒瓶中，攪拌均勻，調(diào)pH至8.1，得混合液體。從該混合液體中量取100ml，倒入500ml三角燒瓶中，分別塞上兩個(gè)三角燒瓶的棉塞，121高壓下滅菌20min，得無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基。無(wú)菌條件下接種上述產(chǎn)殼聚糖酶菌株于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角燒瓶中，置搖床30℃下培養(yǎng)24h，得產(chǎn)殼聚糖酶液體種子。無(wú)菌條件下將上述液體種子倒入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5000ml的三角燒瓶中，30℃下?lián)u床培養(yǎng)60小時(shí)，得殼聚糖酶發(fā)酵液。
配制發(fā)酵培養(yǎng)基的各組分及其重量百分?jǐn)?shù)范圍可以是殼聚糖0.1～5％、(NH4)2SO40.1～5％、酵母浸粉0.05～1％、NaCl 0.1～3％、MgSO4·7H2O 0.02～0.08％，其余為水，調(diào)pH7.5～8.5。(NH4)2SO4可以改為NH4NO3也能達(dá)到同樣的效果。
(3)殼聚糖酶液的制備將上述殼聚糖酶發(fā)酵養(yǎng)液于4℃下5000rpm離心30min除菌體，得到的離心上清液再經(jīng)截留分子量為10000Da的超濾膜超濾除去小分子物質(zhì)，其含大分子量的濃縮液酶活力達(dá)120Iu，即為殼聚糖酶液。
(4)殼聚糖水解液的制備稱取殼聚糖15Kg置于500L的不銹鋼反應(yīng)釜中，加入294L水，6L醋酸，攪拌溶解，加入上述殼聚糖酶液1.5L，40℃下攪拌降解12小時(shí)，得殼聚糖水解液。
在所述的殼聚糖水解液中，醋酸的重量百分?jǐn)?shù)濃度范圍為2％～5％，殼聚糖的濃度范圍為2％～10％，殼聚糖酶液的體積與殼聚糖的重量比為0.1～2L∶1Kg，降解溫度范圍為30～50℃，降解時(shí)間為2小時(shí)～24小時(shí)。
(5)殼寡糖制備將上述殼聚糖水解液減壓濃縮至原體積的1/3，即約100L，向該濃縮液中加入5倍體積比(V/V)的食品級(jí)乙醇，沉淀，甩干，得固形物。再向固形物中加入2倍體積的食品級(jí)乙醇，攪拌脫水，甩干，得固形物，再經(jīng)真空干燥得殼寡糖產(chǎn)品，該殼寡糖收率80％，水溶性好。
實(shí)施例2(1)產(chǎn)殼聚糖酶菌株的獲得同實(shí)施例1中的(1)之步驟。
(2)殼聚糖酶發(fā)酵液的制備同實(shí)施例1中的(2)之步驟。
(3)殼聚糖酶粉的制備將殼聚糖酶發(fā)酵養(yǎng)液于4℃下5000rpm離心30min除菌體，得到得離心上清酶液，再經(jīng)截留分子量為10000Da的超濾膜超濾除去小分子物質(zhì)，得含大分子量的酶濃縮液，經(jīng)冷凍干燥，制得殼聚糖酶粉。
(4)殼聚糖水解液的制備稱取殼聚糖15Kg置于500L的搪瓷罐中，加入294L水，10L醋酸，攪拌溶解，加入殼聚糖酶粉25g，40℃下攪拌降解15小時(shí)，得殼聚糖酶解液。
在本實(shí)施例中，殼聚糖水解液中醋酸的重量百分?jǐn)?shù)濃度范圍為2％～5％，殼聚糖的濃度范圍為2％～10％，殼聚糖酶粉與殼聚糖的重量比范圍為0.5g～10g∶1Kg，降解溫度范為圍30～50℃，降解時(shí)間為2小時(shí)～24小時(shí)。
(5)殼寡糖制備將殼聚糖水解液，采用噴霧干燥機(jī)，調(diào)節(jié)進(jìn)料口溫度為175℃，出料口溫度75～80℃，進(jìn)行噴霧干燥，制得殼寡糖干燥粉產(chǎn)品，該殼寡糖收率90％，水溶性好。
本發(fā)明人從海洋微生物中通過選擇性培養(yǎng)基分離出產(chǎn)殼聚糖酶的微生物菌株，并進(jìn)行了產(chǎn)酶發(fā)酵條件的試驗(yàn)，掌握了酶的分離純化技術(shù)，研究了酶催化底物的最適反應(yīng)條件等，建立了殼寡糖質(zhì)量分析方法，分析了酶解產(chǎn)物。本研究的產(chǎn)殼聚糖酶菌株經(jīng)逐級(jí)放大培養(yǎng)到100L發(fā)酵試驗(yàn)，產(chǎn)酶活性穩(wěn)定，酶活力高，發(fā)酵液殼聚糖酶活力達(dá)120Iu，滿足酶法生產(chǎn)殼寡糖的要求。利用發(fā)酵生產(chǎn)的殼聚糖酶水解殼聚糖，制成殼寡糖，收率高，水溶性好。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征是將殼聚糖溶解于醋酸水溶液中，加入殼聚糖酶，使殼聚糖水解；將所得水解液減壓濃縮，然后用乙醇沉淀、干燥或?qū)⑺庖簢婌F干燥；所述的殼聚糖酶為殼聚糖酶液或殼聚糖酶粉；所述的殼聚糖酶液的體積與殼聚糖的重量比為0.1～2L∶1Kg，所述的殼聚糖酶粉與殼聚糖的重量比為0.5g～10g∶1Kg。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的殼聚糖酶是按下述方法得到的以含殼聚糖的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，制出含殼聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)液，經(jīng)低溫離心除菌體，再經(jīng)超濾除去小分子物質(zhì)，得到殼聚糖酶液；或再將該殼聚糖酶液冷凍干燥，制得殼聚糖酶粉。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)基各組分及其重量百分?jǐn)?shù)范圍是殼聚糖0.1～5％、NH4NO3或(NH4)5SO40.1～5％、酵母浸粉0.05～1％、NaCl 0.1～3％、MgSO4·7H2O 0.02～0.08％，其余為水。
全文摘要
一種生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征是將殼聚糖溶解于醋酸水溶液中，加入殼聚糖酶，使殼聚糖水解；將所得水解液減壓濃縮，然后用乙醇沉淀、干燥或?qū)⑺庖簢婌F干燥；所述的殼聚糖酶為殼聚糖酶液或殼聚糖酶粉；所述的殼聚糖酶液的體積與殼聚糖的重量比為0.1～2L∶1Kg，所述的殼聚糖酶粉與殼聚糖的重量比為0.5g～10g∶1Kg。按本發(fā)明的方法生產(chǎn)的殼寡糖水溶性好，收率高，成本低。
文檔編號(hào)C07H3/06GK1884308SQ20061004541
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月8日
發(fā)明者劉萬(wàn)順, 韓寶芹, 彭睿 申請(qǐng)人:青島弘海生物技術(shù)有限公司