專利名稱：治療艾滋病的藥物組合物,其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物技術領域，具體地說，涉及一種治療艾滋病的藥物組合物，該藥物組合物的制備方法，及其在制備逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物和在制備抗艾滋病藥物中的應用。
背景技術：
自從1981年首例艾滋病(Acquired ImmunodeficiencySyndrome，AIDS)報告以來，其流行迅速蔓延至世界各國，據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計結果，到2005年底艾滋病病毒感染者人數(shù)總計4030萬，2005年新感染艾滋病病毒人數(shù)總計490萬，2005年每天約有1.4萬人新感染艾滋病病毒，2005年一年艾滋病死亡人數(shù)總計310萬。AIDS在我國呈加速流行趨勢。累計報告HIV感染者超過萬例的有云南、河南、新疆、廣西和廣東等省(區(qū))。據(jù)衛(wèi)生部2006年1月25日公布了《2005年中國艾滋病疫情與防治工作進展》報告，截至2005年年底，中國現(xiàn)有HIV感染者約65萬人，其中AIDS病人約7.5萬人。中國AIDS流行態(tài)勢較為嚴重，HIV感染者的人數(shù)已居亞洲第2位，全球第14位。因此，艾滋病是21世紀人類面臨的最重大的公共健康問題，其防治研究無可爭議地成為當代科學的熱點之一。2006年2月國家院發(fā)布的“國家中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃綱要”(2006-2020年)已將“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”作為16個重大專項之一，明確為我國科技發(fā)展的重中之重。
目前有十余種HIV疫苗正在臨床試驗，但尚無有確切療效的HIV疫苗面市。因而，抗艾滋病藥物的研究就顯得特別重要，藥物治療成為目前防治艾滋病的焦點。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART，即雞尾酒療法)延長了HIV感染者壽命，取得了很好的效果，但仍然不能清除體內(nèi)病毒，治愈病人。目前臨床使用的25種抗HIV藥物都是基于病毒本身的蛋白為靶標，包括HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(如AZT，DDC，DDI，D4T，3TC)和蛋白水解酶抑制劑(如Sequanavir，Ritonavir，Indinavir，Nelfinavir)，這些藥物存在治療價格昂貴、有毒副作用、服藥繁瑣、不能清除體內(nèi)病毒和耐藥病毒株的產(chǎn)生等缺陷。從天然產(chǎn)物中尋找新的抗HIV藥物或先導化合物的研究，是國內(nèi)外新藥研制中非?；钴S的領域，也是近期創(chuàng)制新藥的一條捷徑。至今已發(fā)現(xiàn)100多種天然化合物具有很好的抗HIV活性，其中活性較強的有甘草甜素，金絲桃素，姜黃素，大豆皂甙，喜樹堿，栗精胺，香菇多糖和天花粉蛋白等。
迄今為止，尚沒有研究揭示化合物(+)-戈米辛K3作為有效成分在治療艾滋病方面的作用的報道，也沒有該化合物具有抗HIV-1活性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療艾滋病的藥物組合物，該藥物組合物的制備方法，及其在制備逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物和在制備抗艾滋病藥物中的應用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案用于治療艾滋病的藥物組合物，其中含有治療艾滋病有效量的式(I)化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]及可藥用載體和/或賦形劑。
本發(fā)明還提供了制備上述藥物組合物的方法，取紅花五味子果實，粉碎，用65％-100％的丙酮、乙醇或甲醇冷浸或熱回流，得總浸膏，總浸膏用水分散后用乙酸乙酯、氯仿、乙醚或石油醚萃取得萃取物，經(jīng)反復柱層析分離后得化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]，再加入常規(guī)藥用載體得所述藥物組合物。
更具體地，本發(fā)明的制備方法如下取干燥紅花五味子(Schisandra rubriflora(Franch.)Rehd.et Wils.)果實，粉碎后用70％丙酮、乙醇或甲醇—水室溫下冷浸三次，每次24小時，提取液合并，減壓蒸餾除去丙酮后，靜置過夜，用乙酸乙酯、氯仿、乙醚或石油醚萃取3次，回收溶劑后，得乙酸乙酯部分，經(jīng)MCI柱層析，用90％甲醇、100％甲醇及丙酮洗脫，90％甲醇洗下部分用硅膠拌樣，裝柱，經(jīng)石油醚/丙酮(100∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，1∶1，0∶100)梯度洗脫，得結晶，反復重結晶后得化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]，再加入常規(guī)藥用載體得所述藥物組合物。
同時，本發(fā)明還提供了所述藥物化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]在制備逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物中的應用，以及在制備抗艾滋病藥物中的應用。
本發(fā)明的藥物化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]或其藥物組合物可經(jīng)口或不經(jīng)過口服給藥，給藥量因藥物不同而各有不同，對成人來說，每天1～100mg比較合適。
經(jīng)口服給藥時，首先使化合物與常規(guī)的藥用輔劑如賦形劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、抗氧化劑、包衣劑、著色劑、芳香劑、表面活性劑等混合，將其制成顆粒劑、膠囊、片劑等形式給藥；非經(jīng)口給藥時可以注射液、輸液劑或栓劑等形式給藥。制備上述制劑時，可使用常規(guī)的制劑技術。


圖1為本發(fā)明化合物(+)-戈米辛K3對C8166細胞的毒性作用示意圖，圖中數(shù)據(jù)為三個復孔的平均值±標準差；圖2為本發(fā)明化合物(+)-戈米辛K3對HIV-1急性感染MT-4細胞致細胞死亡的保護作用示意圖，圖中數(shù)據(jù)為三個復孔的平均值±標準差；圖3為本發(fā)明化合物捕捉p24抗原ELISA測定(+)-戈米辛抑制實驗株HIV-1IIIB復制的作用示意圖，圖中數(shù)據(jù)為三個復孔的平均值±標準差；圖4為本發(fā)明化合物(+)-戈米辛K3對HIV-1IIIB感染C8166細胞形成合胞體的抑制作用，圖中數(shù)據(jù)為三個復孔的平均值±標準差。
具體實施例方式下面結合附圖用實施例、試驗實施例和制劑實施例進一步詳細地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
式(I)化合物(+)-gomisin K3的制備干燥紅花五味子(Schisandra rubriflora(Franch.)Rehd.et Wils.)果實4.2kg，粉碎后用70％丙酮—水室溫下冷浸三次(每次10升左右)，每次24小時，提取液合并，減壓蒸餾除去丙酮后，靜置過夜，用乙酸乙酯萃取3次，回收溶劑后，得乙酸乙酯部分(180g)。乙酸乙酯部分提交MCI柱層析，用90％甲醇、100％甲醇及丙酮洗脫，90％甲醇洗下部分(120g)用150g硅膠拌樣，用1.0Kg硅膠裝柱，石油醚/丙酮(100∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，1∶1，0∶100)梯度洗脫，得到一白色片狀結晶，再經(jīng)反復重結晶得到化合物(+)-gomisin K3，結構式如式(I)所式。

表-1 (+)-戈米辛K3的核磁數(shù)據(jù)(CD3OD中測定)a

aBruker DRX-400MHz核磁共振儀測定，化學位移值(δ)用ppm表示，偶合常數(shù)(J)用Hz表示[試驗實施例1]式(I)化合物(+)-戈米辛K3體外抗艾滋病HIV-1活性試驗體外抗HIV-1活性實驗方法1、病毒感染性滴定實驗HIV-1IIIB按常規(guī)方法改良進行滴定。簡述如下將HIV-1貯存液在96孔板上作倍比稀釋，10個梯度，每梯度6個重復孔，每孔加入C8166細胞懸液100μl，每孔終體積200μl。37℃，5％CO2培養(yǎng)。第3天補加100μl新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基(含10％FCS)。第7天在倒置顯微鏡下觀察每孔中HIV-1誘導細胞病變效應(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞體(syncytium)的形成確定。
2、化合物對C8166細胞的毒性實驗C8166細胞懸液100ul與不同的待測化合物溶液混合。設好對照孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)三天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。ELx800ELISA儀測定OD值，測定波長為595nm，參考波長為630nm。計算得到CC50值(50％ Cytotoxic Concentration)，即對50％的正常T淋巴細胞系C8166產(chǎn)生毒性時的化合物濃度。
3、對實驗株HIV-1IIIB致細胞病變(CPE)的抑制實驗將C8166細胞接種到含有倍比稀釋化合物的96孔細胞培養(yǎng)板上，然后加入HIV-1IIIB稀釋上清。設三個重復孔。同時設置不含化合物的正常細胞對照孔。AZT為陽性藥物對照。37℃，5％CO2培養(yǎng)三天，倒置顯微鏡下(100×)計數(shù)合胞體的形成。EC50(50％ EffectiveConcentration)為抑制合胞體形成50％時的化合物濃度。
4、對感染細胞的保護實驗按Pauwell等(1988)及Mahmood(1995)所述方法改良進行。在96孔細胞培養(yǎng)板上，對每種化合物進行5倍倍比稀釋，每個稀釋度設4孔，共6個稀釋度。每孔100μl。同時設置不含化合物的未感染或感染HIV-1IIIB的細胞對照組。AZT作為陽性對照藥物。每個稀釋度中的2孔分別滴加細胞懸液和HIV-1IIIB上清。另2孔滴加的MT-4細胞懸液。每孔終體積為200μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染后第三天補加新鮮培養(yǎng)基。第5天用MTT方法用ELx800酶標儀測定OD595/630nm值。計算化合物對細胞生長的抑制率和對HIV-1IIIB感染細胞的保護率。CC50為對50％的宿主細胞產(chǎn)生毒性的化合物濃度；EC50為保護50％的HIV-1IIIB感染細胞存活時的化合物濃度。
5、對試驗株HIV-1IIIB在C8166中復制的抑制實驗采用p24抗原捕獲法檢測。簡述為細胞病毒4℃孵育，PBS洗三次。96孔板，上述感染的細胞與不同濃度的藥物混勻，37℃，5％CO2培養(yǎng)三天，收集上清，0.5％Triton X-100裂解，做ELISA檢測。
ELISA檢測如下采用ELISA檢測HIV-1p24抗原[7]。簡述為鼠抗p24單抗4℃包被過夜。PBS-T洗滌3次，5％脫脂奶粉37℃封板1小時。洗滌，每孔加入100μ5％脫脂奶粉稀釋的裂解上清，37℃，2小時。洗滌，每孔加入100μl 5％脫脂奶粉稀釋的HIV陽性患者血清，37℃，1小時。洗滌，每孔加入100μl 5％脫脂奶粉稀釋的羊抗人IgG-HRP，37℃，1小時。洗滌，每孔加入100μl OPD底物反應液。10分鐘后，每孔50μl 2M硫酸終止反應，490/630nm讀取OD值。計算得到EC50。
6、對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制實驗按照試劑盒上的說明進行實驗。簡述為藥物，逆轉(zhuǎn)錄酶，反應混合物物各20μl于微孔板中孵育37℃2小時。洗板5次，每孔加入200μl稀釋的HRP標記的抗DIG的抗體，37℃1小時。洗板5次，每孔加入200μlABTS底物，37℃ 15-30分鐘。ELx800 ELISA儀測定OD值，測定波長為405nm，參考波長為490nm。計算抑制率。
7、對HIV-1蛋白酶活性的抑制實驗按試劑盒上的操作進行。簡述為酶溶液中加入待測樣品，輕輕混勻，25℃溫育15分鐘，加入50μl底物工作液，反應60分鐘，讀取熒光值，計算抑制率。
8、計算公式根據(jù)實驗結果繪制劑量反應曲線，按Reed&Muench法計算出化合物抑制病毒的50％有效濃度(EC50)，50％抑制細胞生長濃度(CC50)及抗HIV-1活性的治療指數(shù)TI值(Therapeutic index)為TI＝CC50/EC50。
1)、存活率(％)＝(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×1002)、HIV-1致細胞病變的抑制率(％)＝(1-實驗孔合胞體數(shù)/對照孔合胞體數(shù)×1003)、保護率(％)＝(實驗孔OD值-陽性對照孔OD值)/(陰性對照孔OD值-陽性對照孔OD值)×1004)、HIV-1復制的抑制率(％)＝100-(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×1005)、RT活性的抑制率(％)＝100-(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×1006)、蛋白酶活性的抑制率(％)＝100-(實驗孔60分鐘的RFU值-實驗孔0分鐘的RFU值)/(對照孔60分鐘的RFU值-對照孔0分鐘的RFU值)×1009、實驗結果化合物(+)-戈米辛K3是一種有效的抗HIV化合物，對合胞體形成、感染細胞的保護、HIV-1IIIB在C8166內(nèi)復制抑制CC50值分別為26.91，52.14，26.91μg/ml，EC50值分別為1.01，1.72，3.81μg/ml，選擇指數(shù)(CC50/EC50)分別為26.64，30.31，7.06(見表2)。對其機制研究表明化合物戈米辛K3對逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶均有一定的抑制作用，其抑制率分別為54.64％和27.14％。故化合物(+)-戈米辛K3可作為治療艾滋病藥物的輔助藥物或治療藥物。
表-2(+)-戈米辛K3對不同抗HIV作用靶點的測試結果

a對重組HIV-1RT活性的抑制作用(Reverse Transcriptase Assay Kit為Roche產(chǎn)品)b對HIV-1蛋白酶活性的抑制作用(HIV-1 Protease assay Kit為Anaspec產(chǎn)品)下面的的制劑實施例說明包含由本發(fā)明提供的藥物化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]的藥用制劑。
片劑按照本領域已知的方法制備片劑，每片含有下述成分式(I)化合物 50mg乳糖 70mg硬脂酸鎂 3mg聚乙烯吡咯烷酮7mg合計 130mg如果需要，片劑可用羥丙基甲基纖維素、滑石和著色劑進行膜包覆。
膠囊按照本領域已知的方法制備膠囊劑，每個膠囊中含有下述成分式(I)化合物 50mg乳糖 70mg玉米淀粉 25mg硬脂酸鎂 1mg聚乙烯吡咯烷酮4mg合計 150mg[制劑實施例3]注射劑按實施例1的方法先制得本發(fā)明式(I)化合物，按本領域已知的方法制備注射劑，加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
權利要求
1.用于治療艾滋病的藥物組合物，其中含有治療艾滋病有效量的式(I)化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]及可藥用載體和/或賦形劑。
2.制備權利要求1藥物組合物的方法，取紅花五味子果實，粉碎，用65％-100％的丙酮、乙醇或甲醇冷浸或熱回流，得總浸膏，總浸膏用水分散后用乙酸乙酯、氯仿、乙醚或石油醚萃取得萃取物，經(jīng)反復柱層析分離后得化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]，再加入常規(guī)藥用載體得所述藥物組合物。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于取干燥紅花五味子(Schisandra rubriflora(Franch.)Rehd.et Wils.)果實，粉碎后用70％丙酮、乙醇或甲醇—水室溫下冷浸三次，每次24小時，提取液合并，減壓蒸餾除去丙酮后，靜置過夜，用乙酸乙酯、氯仿、乙醚或石油醚萃取3次，回收溶劑后，得乙酸乙酯部分，經(jīng)MCI柱層析，用90％甲醇、100％甲醇及丙酮洗脫，90％甲醇洗下部分用硅膠拌樣，裝柱，經(jīng)石油醚/丙酮(100∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，1∶1，0∶100)梯度洗脫，得結晶，反復重結晶后得化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]，再加入常規(guī)藥用載體得所述藥物組合物。
4.聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]化合物在制備逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物中的應用。
5.聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)-戈米辛K3[(+)-gomisin K3]化合物在制備抗艾滋病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療艾滋病的藥物組合物，其中含有治療艾滋病有效量的式(I)化合物聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素(+)－戈米辛K
文檔編號C07C43/253GK1931151SQ20061004867
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月14日 優(yōu)先權日2006年9月14日
發(fā)明者肖偉烈, 鄭永唐, 孫漢董, 楊柳萌, 田仁榮, 普建新, 李蓉濤 申請人:中國科學院昆明植物研究所, 中國科學院昆明動物研究所