專利名稱：從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法。
背景技術：
乳鐵蛋白質(zhì)(LF)是母乳中的最主要活性物質(zhì)之一。它是一種具有多種生物學功能的蛋白質(zhì)(B.Lo¨nnerdal，S.Iyer，Lactoferrin(1995)Molecular structure andbiological function，Annu.Rev.Nutr.1593-110)。它不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運，而且具有抗微生物、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能，被認為是一種新型的抗菌抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。
LF可以促進中性白細胞或巨噬細胞的殺菌作用和吞噬作用，對NK細胞的活性和淋巴細胞、中性白細胞的繁殖具有調(diào)節(jié)作用。在一般情況下，血清中含有LF 0.30～0.5μg/mL；但一旦發(fā)生感染，LF將從活化的嗜中性粒細胞中釋放到血液中，而且放出量可增加到平時的20倍，因此LF可被視為抗炎因子。
人和牛的LF都已被發(fā)現(xiàn)有抑制脂質(zhì)過氧化的作用(Shinmoto，等)，因此用作食品和飼料添加劑可以起到抗氧化劑的作用。
LF還具有直接的殺菌能力，但具體的殺菌機理目前還不十分清楚。Ellison等報道，LF可粘附于細菌胞膜通過改變膜的通透性而使細菌死亡。Ellison等報道LF可以導致革蘭氏陰性菌外膜中脂多糖的釋放，從而改變胞膜的通透性。
LF還具有殺真菌的能力，對于假絲酵母屬作用研究報導的較多。這些抗細菌和真菌活性不僅僅靠奪取病原體微環(huán)境中的鐵離子，而且還通過以其N一端結合細菌和真菌的細胞壁破壞細胞膜，導致細胞內(nèi)容物的泄露來殺死它們。
新西蘭科學家在牛奶中新發(fā)現(xiàn)一種能增強人體骨質(zhì)的乳鐵蛋白，這一發(fā)現(xiàn)使牛奶成為一種具備對抗骨質(zhì)疏松的武器。直接注射乳鐵蛋白能導致的骨生長明顯加快的現(xiàn)象說明，這種方法可適用于治療骨折，使骨折患者早日康復。
乳鐵蛋白以前主要從動物乳中提取，但成本高，產(chǎn)量低。人的乳鐵蛋白由于缺乏原料，大量生產(chǎn)不可能。但是植物轉(zhuǎn)基因技術使利用植物生產(chǎn)乳鐵蛋白成為可能。利用水稻生產(chǎn)乳鐵蛋白有已有報道(Suzuki等2003 J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.36190-199)。但是植物中乳鐵蛋白含量較低，通常只有總重量1％以下。盡管含有乳鐵蛋白的植物可以直接食用，但提取高濃度乳鐵蛋白可以更廣泛地利用乳鐵蛋白。
Nandi等(2002)報道用含0.35M的NaCl的PBS緩沖液從轉(zhuǎn)基因水稻種子中提取乳鐵蛋白(Nabdi et al.，Plant Science 163713-722)。但是如此濃度的NaCl會影響乳鐵蛋白的實際應用。例如，將含高濃度NaCl的乳鐵蛋白直接作為食品添加劑或作為原料配制成的各種飲料，會造成產(chǎn)品的高NaCl含量，不符合實際需要。而采用脫鹽步驟，即增加成本又可能造成部分產(chǎn)量(乳鐵蛋白)的損失。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種成本低、產(chǎn)量高的從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法。
本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現(xiàn)的提供一種從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法，依次包括以下步驟1)、在轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子中加入水或緩沖液，混合后進行粉碎，形成濕粉末；或者直接將轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子進行粉碎，粉碎后加入水或緩沖液混合形成濕粉末；上述緩沖液均為NaCl的濃度＜0.1mol/L、且pH值為6～9的緩沖液，上述粉碎過程溫度均保持在70℃以下，水或緩沖液與轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子的投料比為1～10毫升/克。
2)、將上述濕粉末混合震蕩；再5000g離心10分鐘后，分離沉淀和上清溶液。
作為本發(fā)明的從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法的一種改進先在所得的沉淀中加入水或緩沖液，混合后形成濕粉末，所述緩沖液為NaCl的濃度＜0.1mol/L、且pH值為6～9的緩沖液，所述水或緩沖液與沉淀的投料比為1～10毫升/克；再重復步驟2)1～3次。
作為本發(fā)明的從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法的進一步改進步驟2)中混合震蕩2～3小時。
在發(fā)明過程中，發(fā)明人作了如下的對比試驗試驗1、不同NaCl濃度提取液對乳鐵蛋白提取量的影響(僅緩沖液中NaCl的濃度不同，其余均參照本發(fā)明的步驟)取二份各2克的乳鐵蛋白水稻種子，分別在5mL的含0.3M NaCl和不含NaCl的PBS(pH7.5)緩沖液中粉碎，以250轉(zhuǎn)/分鐘的頻率震蕩2小時，再5000g離心10分鐘后，分離沉淀和上清溶液。對上清溶液中的乳鐵蛋白進行了SDS-PAGE分析，并以牛BSA蛋白質(zhì)為標準蛋白質(zhì)，通過光密度掃描技術對SDS-PAGE分析的樣品中的乳鐵蛋白總量進行了測算。利用PBS含0.3M NaCl提取液，乳鐵蛋白的提取量為3.1mg/mL；而利用PBS不含NaCl則為3.4mg/mL。
試驗2、提取液不同的pH對乳鐵蛋白提取量的影響(僅緩沖液pH不同，其余均參照本發(fā)明的步驟)乳鐵蛋白水稻種子粉碎后，每克粉末中加入10mL不同pH的緩沖液。以250轉(zhuǎn)/分鐘的頻率震蕩2小時，再5000g離心10分鐘后，分離沉淀和上清溶液。將上清溶液中的乳鐵蛋白進行了SDS-PAGE分析，并以牛BSA蛋白質(zhì)為標準蛋白質(zhì)，通過光密度掃描技術對SDS-PAGE分析的樣品中的乳鐵蛋白總量進行了測算，具體結果見表1。
表1、不同pH的緩沖液所得的乳鐵蛋白量

從上述數(shù)據(jù)得知，提取液的適宜pH值為6～9。
用本發(fā)明的從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法，能使乳鐵蛋白濃度占總蛋白質(zhì)(即上清溶液)的40％以上；且能保證最終提取的乳鐵蛋白中沒有鹽或僅含有低濃度鹽。因此用本發(fā)明方法提取的乳鐵蛋白，適用于配制飲料，使飲料中含有活性的植物性來源的乳鐵蛋白；還適用于當作食品添加劑、或飼料添加劑，能起到加強功能食品性能和飼料質(zhì)量的作用。利用本發(fā)明的方法，能更簡單快速地從轉(zhuǎn)基因水稻種子中提取乳鐵蛋白，從而降低生產(chǎn)成本；還由于不用或大量減少了鹽的使用量，因此能節(jié)省脫鹽造成的成本的增加和產(chǎn)量的損失。


圖1是本發(fā)明所提取得到的乳鐵蛋白的蛋白質(zhì)凝膠電泳圖。
具體實施例方式
以下實施例中所使用分子生物學和生物化學的方法均為已知的技術，在Ausubel編寫的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology等文獻均有詳細的說明。
實施例1、表達乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻種子的獲得人乳鐵蛋白質(zhì)基因(hLF)由上海生工合成，啟動子是水稻Gt啟動子。Gt和hLF被克隆在質(zhì)粒pCAM1300中獲得pCAM1300-GT-hLF。pCAM1300-GT-hLF通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入水稻品種秀水11和臺北309。hLF由啟動子Gt1控制，能在水稻種子中表達。在獲得的40個轉(zhuǎn)基因株系(為2801～2840)中，其中二個轉(zhuǎn)基因株系，乳鐵蛋白2824和乳鐵蛋白2831，可以表達比較高水平的乳鐵蛋白，被用作為本發(fā)明的材料。
當然，所有的轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子均可作為本發(fā)明所使用的材料。
實施例2、水稻種子中人乳鐵蛋白質(zhì)的提取，依次進行以下步驟(本實施例中所指的水是指不含NaCl的水)方法A步驟1、在實施例1所得的水稻種子中加入水或緩沖液，混合后進行粉碎，形成濕粉末；或者直接將實施例1所得的水稻種子進行粉碎，粉碎后加入水或緩沖液混合形成濕粉末；所用的緩沖液均為NaCl的濃度＜0.1mol/L、且pH值為6～7.5的緩沖液，上述粉碎過程溫度均保持在70℃以下。水或緩沖液與該水稻種子的投料比為1毫升/克。
步驟2、將上述濕粉末以250轉(zhuǎn)/分鐘的頻率混合震蕩2～3小時，再5000g離心10分鐘后，分離沉淀和上清溶液。
步驟3、收集上述步驟所得的沉淀，先在所得的沉淀中加入水或緩沖液，混合后形成濕粉末，所述緩沖液為NaCl的濃度＜0.1mol/L、且pH值為6～7.5的緩沖液，水或緩沖液與沉淀的投料比為5毫升/克；再重復步驟2)1～3次。
收集所有的上清溶液即為總蛋白質(zhì)。
方法B步驟1中水或緩沖液與該水稻種子的投料比改為5毫升/克；步驟3中水或緩沖液與該沉淀的投料比改為1毫升/克；其余均同方法A。收集所有的上清溶液即為總蛋白質(zhì)。
方法C步驟1中水或緩沖液與該水稻種子的投料比改為10毫升/克；步驟3中水或緩沖液與該沉淀的投料比改為10毫升/克；其余均同方法A。收集所有的上清溶液即為總蛋白質(zhì)。
采用上述方法，所得的總蛋白質(zhì)重量的40％以上為乳鐵蛋白。
實施例3、乳鐵蛋白含量和純度分析提取的乳鐵蛋白可以用SDS-PAG分析含量和純度。根據(jù)SDS-PAGE的通用方法(奧斯伯，F(xiàn)布倫特，R金斯頓，等.精裝分子生物學實驗指南[M].北京科學出版社，1998，334-338)。對實施例2提取的乳鐵蛋白樣品進行了分析。Western分析表明SDS-PAGE膠上的主要蛋白帶為乳鐵蛋白。光密度掃描分析發(fā)現(xiàn)其占總蛋白質(zhì)含量的40～60％，具體如圖1所示當選用乳鐵蛋白2824進行實施例2時，1代表從乳鐵蛋白水稻2824中所提取的乳鐵蛋白；當選用乳鐵蛋白2831進行實施例2時，2代表從乳鐵蛋白水稻2831所提取的乳鐵蛋白；3、4、5代表的是陰性對照；當選用乳鐵蛋白2803進行實施例2時，6代表從乳鐵蛋白水稻2803所提取的乳鐵蛋白；7代表的是標準蛋白質(zhì)。
實施例4、乳鐵蛋白提取品的應用上述提取的乳鐵蛋白可用作食品添加劑、或飼料添加劑，能加強功能食品的性能和飼料的質(zhì)量；還可以作為原料配制成各種飲料。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法，其特征是包括以下步驟1)、在轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子中加入水或緩沖液，混合后進行粉碎，形成濕粉末；或者直接將轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子進行粉碎，粉碎后加入水或緩沖液混合形成濕粉末；所述緩沖液均為NaCl的濃度＜0.1mol/L、且pH值為6～9的緩沖液，上述粉碎過程溫度均保持在70℃以下，所述水或緩沖液與轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子的投料比為1～10毫升/克；2)、將上述濕粉末混合震蕩，再5000g離心10分鐘后，分離沉淀和上清溶液。
2.根據(jù)權利要求1所述的從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法，其特征是先在所得的沉淀中加入水或緩沖液，混合后形成濕粉末，所述緩沖液為NaCl的濃度＜0.1mol/L、且pH值為6～9的緩沖液，所述水或緩沖液與沉淀的投料比為1～10毫升/克；再重復步驟2)1～3次。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法，其特征是所述步驟2)中混合震蕩2～3小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻中提取乳鐵蛋白的方法，包括以下步驟1)在轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子中加入水或緩沖液，混合后進行粉碎，形成濕粉末；或者直接將轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子進行粉碎，粉碎后加入水或緩沖液混合形成濕粉末；緩沖液均為NaCl的濃度＜0.1mol/L、且pH值為6～9的緩沖液，上述粉碎過程溫度均保持在70℃以下，水或緩沖液與轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白水稻種子的投料比為1～10毫升/克。2)將上述濕粉末混合震蕩，再5000g離心10分鐘后，分離沉淀和上清溶液。用本發(fā)明的方法提取乳鐵蛋白，具有成本低、產(chǎn)量高的特點。
文檔編號C07K14/415GK1824674SQ20061005007
公開日2006年8月30日 申請日期2006年3月29日 優(yōu)先權日2006年3月29日
發(fā)明者沈志成 申請人:浙江大學