專利名稱：一種制備雙功能抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本技術(shù)涉及雙功能抗體的制備方法，特別涉及免疫學(xué)中可攜帶用于治療小分子的藥物，同時(shí)也具有定向功能的雙功能單克隆抗體制備方法。
背景技術(shù)：
免疫學(xué)中的抗體具有特異性，能特異性地識(shí)別目標(biāo)抗原。隨著雜交瘤技術(shù)的發(fā)展，人們很容易地就可以通過(guò)常規(guī)的免疫雜交瘤技術(shù)已經(jīng)獲得了大量的特異性的單克隆抗體，尤其是特異性的抗腫瘤的單克隆抗體的獲得使單克隆抗體對(duì)腫瘤的診斷與醫(yī)治起著非常重要的作用.然而由于單克隆抗體多數(shù)是鼠源抗體，因而必然存在異源性問(wèn)題，也必然引起免疫的排斥反應(yīng).并且鼠源性抗體對(duì)激發(fā)人細(xì)胞免疫活力方面的作用也是有限的。
后來(lái)人們又發(fā)明了免疫毒素或放射免疫治療技術(shù)，將毒蛋白或放射性同位與特異性的單克隆抗體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制備出毒素與單克隆抗體的化學(xué)偶聯(lián)物，由于單克隆抗體的導(dǎo)向作用，從而將毒蛋白或放射性同位帶到靶細(xì)胞處，再利用毒蛋白毒性或放射性同位素射線將靶細(xì)胞殺死.這種免疫毒素或放射免疫技術(shù)，雖然對(duì)靶細(xì)胞有一定殺傷作用，但是同時(shí)毒蛋白質(zhì)分子本身就是異源物質(zhì)，是很好的免疫原，在免疫毒素發(fā)揮一段時(shí)間作用之后，機(jī)體產(chǎn)生抗毒蛋白的抗體，其治療效果將大打折扣.再說(shuō)放射免疫因同位素的污染性較強(qiáng)，對(duì)機(jī)體及環(huán)境都是有很大的危害，從而也限制了放射免疫技術(shù)的應(yīng)用.
現(xiàn)實(shí)生活中許多化療所涉及的化學(xué)藥物雖然對(duì)癌癥細(xì)胞具有極大的殺傷作用，但是由于化療或放療過(guò)程中藥物的負(fù)作用很大，使得正常細(xì)胞在治療期間也同時(shí)得到極大的傷害，這主要是由于正常組織細(xì)胞所能承受的藥物濃度與腫瘤細(xì)胞治療所用的濃度很接近，雖然殺死了腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)也對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生極大的殺傷，以至于許多放療以及化療患者都出現(xiàn)脫發(fā)、病體虛弱等現(xiàn)象。
于是人們想到了雙功能抗體，希望抗體既具有特異性識(shí)別功能，同時(shí)也具有治療功能.現(xiàn)在雙功能抗體，多數(shù)集中在抗腫瘤特異性的抗體獲得后，再通過(guò)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)雜交瘤，獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型的腫瘤細(xì)胞，再與抗第二種抗原的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，并且第二種抗原通常是治療中相關(guān)蛋白，這種雙功能抗體研究與開(kāi)發(fā)周期較長(zhǎng)，并且雙功能抗體自身也存在穩(wěn)定性的問(wèn)題，在實(shí)際中治療效果存在不足.
人們急需要一種雙功能抗體，用于治療，并且研發(fā)周期長(zhǎng)相對(duì)較短，穩(wěn)定性好，治療效果強(qiáng)，并且毒性與負(fù)作用小的雙功能抗體.
雖然制備這種雙功能抗體構(gòu)思本人在數(shù)年前就已經(jīng)形成，但苦于資金等條件所限而未能實(shí)施，并且為了籌款本人在其他方面也投入了許多精力?，F(xiàn)將相關(guān)制備方法公開(kāi)以便人們能從根本上解決醫(yī)學(xué)上的難題，并且對(duì)其他疾病治療帶來(lái)啟發(fā).

發(fā)明內(nèi)容
一種制備雙功能抗體的方法，其內(nèi)容是將小分子藥物作為半抗原與以特異性抗原作為載體蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，其中治療藥物是小分子化合物，具有一定的化學(xué)結(jié)合為半抗原，而特異性抗原是大分子物質(zhì)，直接用作載體蛋白；通過(guò)常規(guī)的化學(xué)偶聯(lián)制備形成小分子藥物與特異蛋白的偶聯(lián)物，將其偶聯(lián)物作為免疫原，免疫動(dòng)物，然而取其脾細(xì)胞與相應(yīng)的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，在HAT選擇培養(yǎng)基的篩選下，只能融合細(xì)胞才能存活生長(zhǎng)，再經(jīng)過(guò)ELISA篩選出，抗藥物小分子的單克隆抗體，所用篩選抗原為小分子藥物與另一種蛋白載體的化學(xué)偶聯(lián)物，這樣可得到抗小分子藥物的單克隆抗體，同時(shí)這種單克隆抗體對(duì)載體蛋白也呈陽(yáng)性反應(yīng)，再?gòu)倪@些陽(yáng)性雜交瘤中篩選出針對(duì)特異性的載體抗原也具有良好的特異性的單克隆抗體。這樣就得到抗藥物小分子的特異性的單克隆抗體，而同時(shí)這個(gè)特異性的單克隆抗體對(duì)免疫原中的載體蛋白成分即特異性的病原抗原也具有良好的抗原抗體反應(yīng)能力，即所獲得具有雙功能特點(diǎn)的單克隆抗體！本發(fā)明建立在一些常規(guī)的免疫學(xué)理論或技術(shù)的基礎(chǔ)上，同時(shí)本人依據(jù)相關(guān)的免疫技術(shù)進(jìn)而提出“定向免疫治療論點(diǎn)”，該論點(diǎn)的基本內(nèi)容是1、小分子化學(xué)藥物與以病原的特異性抗原作載體能通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)的方法形成的半抗原-載體蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物依然具有良好的免疫原2、所得到的半抗原-病原特異性抗原的復(fù)合物可以誘發(fā)機(jī)體，產(chǎn)生抗小分子藥物、同時(shí)也抗病原特異性抗原的雙功能抗體3、所產(chǎn)生的雙功能抗體，能與自由的半抗原小分子藥物通過(guò)非共價(jià)鍵的方式進(jìn)行結(jié)合，同時(shí)也能通過(guò)非共價(jià)鍵的方式與腫瘤特異性抗原進(jìn)行抗原-抗體親和結(jié)合4、該類雙功能抗體能與半抗原藥物預(yù)先結(jié)合，并且半抗原結(jié)合后，依然能與特定病原中的特異性抗原結(jié)合，從而從藥物分子帶到病灶處，由于半抗原藥物分子與抗體結(jié)合是非共價(jià)鍵，這種結(jié)合是可逆反應(yīng)的，因而小分子藥物可以從抗體中脫落5、由于小分子藥物可以從雙功能抗體中脫落的，是一種動(dòng)態(tài)的可逆反應(yīng)，這種雙功能抗體在一定程度上具有“藥泵”作用，將有效的治療藥物，定向地帶到病原的特異性抗原周圍，使得病灶周圍藥物的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于血清中藥物的濃度，這樣就可以減輕藥物對(duì)機(jī)體的毒害作用。
6、小分子藥物與雙功能抗體結(jié)合后，再結(jié)合病灶處特定的抗原時(shí)不脫落小分子藥物也會(huì)隨著病灶細(xì)胞上的特定抗原在細(xì)胞膜上的移動(dòng)而進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)。
7、采用病原特異抗原作為載體與抑制病毒復(fù)制小分子藥物偶聯(lián)時(shí)，所得到的特定的雙功能抗體制備可以將藥物定向帶到病毒感染細(xì)胞的周圍，提高化學(xué)治療藥物對(duì)病毒復(fù)制的干擾效果。
8、采用病原特異性抗原作載體時(shí)，與具有細(xì)胞毒性小分子藥物進(jìn)行偶聯(lián)，所得到的特定的雙功能抗體，可以實(shí)現(xiàn)將細(xì)胞毒性的藥物帶到病毒感染細(xì)胞周圍，使病毒感染細(xì)胞死亡，限制了病毒的擴(kuò)散.但機(jī)體的這類細(xì)胞不能是實(shí)質(zhì)器官組織的細(xì)胞，避免給機(jī)體實(shí)質(zhì)器官帶來(lái)傷害.
9、采用病原細(xì)菌特異性抗原作為載體時(shí)，可以將殺死細(xì)菌的藥物，定向帶來(lái)病細(xì)菌的周圍從而提高了藥物的殺菌效果。
10、以其他病原微生物或寄生蟲(chóng)的特異性的抗原作為載體，并結(jié)合相關(guān)藥物也具有類同的定向藥泵作用。
11、針對(duì)不同藥物半抗原分別與同一種特異性抗原偶聯(lián)，制備不同的雙功能單克隆抗體，將不同種的雙功能分別與不同藥物預(yù)先結(jié)合，再混合輸入患者的機(jī)體內(nèi)，有助于治療效果的提高。
12、本雙功能抗體也可以結(jié)合外用，將以非共價(jià)鍵結(jié)合有治療藥物的雙功能抗體在緩沖液中，并在接近體溫的條件上，將藥物傳送到病原處，對(duì)病原微生物構(gòu)成殺傷.
本發(fā)明所涉及免疫學(xué)理論的基礎(chǔ)是1、半抗原只有免疫反應(yīng)性而沒(méi)有免疫原，2、以特異性抗原作為載體蛋白，所得到的抗體一定與特異性抗原有免疫學(xué)反應(yīng)，只要進(jìn)一步篩選人們就能從中篩選出良好的雙功能抗體雜交瘤。所涉的基本技術(shù)包括小分子藥物與特異性抗原化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)、雜交瘤技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)等免疫學(xué)技術(shù)。
使用本發(fā)明所得到的雙功能單克隆抗體，使用前預(yù)先最好與小分子藥物即半抗原進(jìn)行免疫親和結(jié)合，然而將這種復(fù)合物通過(guò)輸液的方式經(jīng)血液循環(huán)，利用雙功能抗體對(duì)特異性抗原能進(jìn)行特異性的親和反應(yīng)的特點(diǎn)，將雙功能抗體送達(dá)特定的位置，同時(shí)也將治療所用的藥物帶到病灶處，從而使得病灶處的藥物濃度很高，較低血液中藥物的濃度，因而對(duì)病人的身體健康不會(huì)構(gòu)成毒害作用。雖然小分子藥物與該雙功能單克隆抗體在體內(nèi)也可以結(jié)合，但是藥泵的效果會(huì)不如將小分子藥物與雙功能單克隆抗體預(yù)先結(jié)合。同時(shí)將小分子藥與雙功能單克隆抗體輸入體內(nèi)，藥物也能定向送到病灶處，傳送藥物的效果可能會(huì)低許多。
本發(fā)明雖然存在異源性的問(wèn)題，但是本發(fā)明中的雙功能抗體的研制方法，卻能為人類開(kāi)創(chuàng)一系列的治療性雙功能的單克隆抗體的研發(fā)提供幫助，同時(shí)也為人類構(gòu)造人源化的基因工程抗體提供基礎(chǔ)，促進(jìn)人源雜交瘤技術(shù)以及體外免疫技術(shù)成熟，從而徹底解決免疫排異。
具體施實(shí)例實(shí)施例1將治療人胃癌的化學(xué)藥物，5-氟-尿嘧啶核糖與人胃癌特異性的抗原進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，此處化學(xué)偶聯(lián)的方法可以采用過(guò)碘酸鈉氧化法，將適量的5-氟-尿嘧啶核糖與適量的過(guò)碘酸鈉進(jìn)行糖基的氧化反應(yīng)，然后再加入適量乙二醇反應(yīng)掉過(guò)量的過(guò)碘酸鈉，再加入適量的胃癌特異性的抗原在偏堿性條件進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)，過(guò)夜后加入適量的硼氫化鈉，消除化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)中產(chǎn)生的烯醇式結(jié)構(gòu)，再經(jīng)透析并反復(fù)多次換液，即可獲得半抗原-胃癌特異性抗原的復(fù)合物，以此物作為免疫原，免疫BAL b/c小鼠，免疫按常規(guī)免疫方法進(jìn)行，然后取脾細(xì)胞與鼠源骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，得到融合細(xì)胞再經(jīng)過(guò)ELISA篩選，即可以獲得雙功能雜交瘤單克隆抗體。該雙功能單克隆抗體，既有結(jié)合小分子治療藥物5-氟尿嘧啶核糖或小分子5-氟尿嘧啶能力，同時(shí)也能特異性地結(jié)合胃癌細(xì)胞中的腫瘤特異性抗原。
實(shí)施例2利用柔紅霉素與白血病特異性抗原進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)得到柔紅霉素-白血病特異性抗原的復(fù)合物進(jìn)行免疫、細(xì)胞融合、篩選出特定的雙功能單克隆抗體，制備單克隆抗體的方法同常規(guī)雜交瘤融合技術(shù)。柔紅霉素與白血病特異性蛋白的偶聯(lián)方法如下將適量的柔紅霉素與適量的水合碳化二亞胺混合，再與適量的白血病特異性的抗原混合，利用柔紅霉素中的氨基進(jìn)行活化反應(yīng)，與載體蛋白進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，獲取柔紅霉素-白血病的特異性抗原復(fù)合物。然后再按常規(guī)免疫學(xué)方法免疫、進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得雜交瘤，并從中篩選出特定的雙功能的單克隆抗體，由于這種抗體同時(shí)具有抗柔紅霉素、抗白血病特異性的功能，在化療時(shí)就可以將相關(guān)化學(xué)藥物富集到病灶周圍，這些藥物之所以能富集到病灶周圍，是由于雙功能抗體所識(shí)別的另一個(gè)抗原就是腫瘤特異性的抗原，而這種特異性的抗原只有病灶處較多。病灶處存在許多腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞中都存在特異性的腫瘤抗原，而機(jī)體的正常組織是沒(méi)有這種特異性的抗原，因而藥物就會(huì)被定向富集到腫瘤細(xì)胞周圍，而機(jī)體血液中的藥物濃度就可以降低許多而不會(huì)影響藥物的療效，這樣就可拉開(kāi)了病灶組織與機(jī)體細(xì)胞所接觸到的藥物濃度，降減藥物的負(fù)作用?；蛘咴谠械闹委煗舛认?，通過(guò)定向送藥的效應(yīng)將更高濃度的藥物定向送到病灶處，提高藥物的治療效果。
實(shí)施例3阿霉菌素與肺癌特異性抗原通過(guò)碳化二亞胺進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，制備成阿霉菌素與肺癌特異性蛋白化學(xué)偶聯(lián)的免疫復(fù)合物，該免疫復(fù)合物免疫小鼠之后，經(jīng)細(xì)胞融合即可得以雜交瘤細(xì)胞，在得到的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中通過(guò)ELISA檢測(cè)進(jìn)行篩選，將抗阿霉菌素的雜交瘤篩選出來(lái)，再進(jìn)一步對(duì)所得到的雜交瘤進(jìn)行特異性篩選與單克隆化處理，從而篩選出穩(wěn)定的、抗阿霉菌素同時(shí)也抗肺癌特異性抗原的單抗雜交瘤，該雜交瘤經(jīng)克隆處理將是雙阿霉菌素，同時(shí)也會(huì)抗肺癌的雙功能單克隆抗體。
實(shí)施例4將抗生素與細(xì)菌特異性抗原化學(xué)偶聯(lián)。利用化學(xué)偶聯(lián)的方法將特定的治療性的抗生素鏈霉素與細(xì)菌特異性的抗原進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，獲得半抗原-載體蛋白復(fù)合物免疫動(dòng)物，制備特異性的雙功能雜交瘤來(lái)分泌單克隆抗體，所得到的雙功能抗體能與抗生素反應(yīng)，同時(shí)也能與特定的病原細(xì)菌結(jié)合，具備雙功能抗體。
使用這種雙功能抗體時(shí)，抗體與抗生素結(jié)合后，再隨著血液循環(huán)將藥物帶到病原菌處，使得特定的病菌周圍的抗生素濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于環(huán)境，從而干擾了細(xì)菌的生長(zhǎng)，提升藥物的療效。
將相關(guān)藥物與載體蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)制備免疫原方法是成熟的，但人們主要考慮免疫學(xué)的檢測(cè)低分子化合物含量，進(jìn)而進(jìn)行測(cè)定分析等。而特異性抗原在市場(chǎng)上早有供應(yīng)的，但是人們也是采用它的特異性用于免疫學(xué)檢測(cè)分析、免疫學(xué)診斷與特定蛋白在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位研究，而將低分子的藥物與特異性抗原結(jié)合起來(lái)考慮問(wèn)題，制備直接雙功能單克隆抗體的并未見(jiàn)到。
現(xiàn)實(shí)中應(yīng)用的治療性的藥物很多，所涉及到特異性抗原的研究與開(kāi)發(fā)也很多，人們可采用一種小分子藥與多種特異性抗原物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，這樣就做到一種疾病采用同種小分子藥物進(jìn)行化學(xué)治療反應(yīng)，但是特異性的蛋白載體，人們可以一種特異性的載體蛋白質(zhì)與多種小分子藥物進(jìn)行偶聯(lián)，實(shí)行小分子藥物的多元化，做到以多種藥物合用抗擊一種疾病，此處不再一一列舉。
權(quán)利要求
1.一種制備雙功能抗體的方法，其特征是將小分子藥物與特異性抗原進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，其中治療藥物是小分子化合物，為半抗原，而特異性抗原是大分子物質(zhì)蛋白，直接用作載體蛋白；通過(guò)常規(guī)的化學(xué)偶聯(lián)的方法制備小分子藥物與特異蛋白的偶聯(lián)物，將該偶聯(lián)物作為免疫原，免疫動(dòng)物，然而取免疫動(dòng)物脾細(xì)胞與相應(yīng)的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，在HAT選擇培養(yǎng)基的篩選下，只能融合細(xì)胞才能存活生長(zhǎng)，再經(jīng)過(guò)ELISA篩選出，抗藥物小分子的單克隆抗體，所用篩選抗原為小分子藥物與另一種蛋白載體的化學(xué)偶聯(lián)物，這樣可得到抗小分子藥物的單克隆抗體，同時(shí)這種單克隆抗體對(duì)載體蛋白也呈陽(yáng)性反應(yīng)，再?gòu)倪@些陽(yáng)性雜交瘤中篩選出針對(duì)特異性的載體抗原也具有良好的特異性的單克隆抗體。這樣就得到抗藥物小分子的特異性的單克隆抗體，而同時(shí)這個(gè)特異性的單克隆抗體對(duì)免疫原中的載體蛋白成分即特異性的病原抗原也具有良好的抗原抗體反應(yīng)能力，即所獲得具有雙功能特點(diǎn)的單克隆抗體！
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述，用于與半抗原化學(xué)偶聯(lián)的載體蛋白是特異性抗原，它們可以是腫瘤特異性抗原、細(xì)菌真菌的特異性蛋白抗原、病毒特異性蛋白抗原、寄生蟲(chóng)的特異性蛋白抗原。
3.依據(jù)權(quán)利要求1所述，雙功能單克隆抗體所針對(duì)的藥物小分子，是小分子藥物或小分子有毒物質(zhì)，并且小分子物質(zhì)是具有一定化學(xué)結(jié)構(gòu)的半抗原化合物，能與蛋白載體通過(guò)化學(xué)手段在不破壞小分子化合物的主要結(jié)構(gòu)的前提下實(shí)現(xiàn)共價(jià)偶聯(lián)。
4.依據(jù)權(quán)利要求1所述，雙功能單克隆抗體與小分子藥物以及特異性抗原結(jié)合都是非共價(jià)鍵的形式結(jié)合，在病灶處可以發(fā)生可逆性結(jié)合與脫落現(xiàn)象，小分子藥物被這種方式運(yùn)送到病灶處。
5.依據(jù)權(quán)利要求1所述，雙功能抗體能特異性地識(shí)別病灶處特異性抗原蛋白質(zhì)，而其他部分沒(méi)有這種特異性的抗原成分，因而這種雙功能抗體保持定向作用，將藥物定向送到病灶處.
全文摘要
一種制備雙功能抗體的方法，其特征是將小分子藥物與病原或腫瘤特異性抗原進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，制成小分子藥物--特異蛋白的偶聯(lián)物，免疫動(dòng)物后，取該動(dòng)物脾細(xì)胞，與相應(yīng)的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，制備單克隆抗體，再經(jīng)過(guò)ELISA篩選出抗小分子藥物的單克隆抗體，并從陽(yáng)性雜交瘤中篩選出同時(shí)針對(duì)特異性載體蛋白的抗原也有良好反應(yīng)的單克隆抗體。這種雙功能單克隆抗體與小分子藥物、特定病原的抗原都是通過(guò)非共價(jià)鍵的形式結(jié)合，且結(jié)合是可逆的，起到定向?qū)⑿》肿铀幬飵У教囟ㄎ恢玫淖饔?，使病灶處藥物濃度高于機(jī)體的其他部位。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101070346SQ20061005061
公開(kāi)日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2006年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月8日
發(fā)明者陳正賢 申請(qǐng)人:陳正賢