專利名稱：制備酪－絲－纈三肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽的制備方法。更具體地講，本發(fā)明涉及酪-絲-纈三肽的制備方法。
背景技術(shù)：
在多肽合成方法中，常用的液相合成方法是采用最大保護(hù)策略，即對(duì)氨基酸的相關(guān)官能基團(tuán)，尤其是氨基、羧基和羥基均作出保護(hù)，再進(jìn)行氨基酸間的縮合反應(yīng)最后脫去所有的保護(hù)基從而合成多肽。關(guān)于多肽合成的詳細(xì)描述可參見(jiàn)《多肽合成》，1985年，黃惟德、陳常慶著；《多肽藥物化學(xué)》，1990年，彭師奇。
例如，在合成酪-絲-纈三肽時(shí)，采用最大保護(hù)策略方法，可以Boc-Val-OH為原料制備銫鹽，接著將羧端芐酯化，隨后用HCl脫去Boc，暴露出氨端，然后按照DCC法(HOBT為輔助縮合劑)和側(cè)鏈用芐基(Bzl)保護(hù)的絲氨酸和2，6-二氯芐基(Dcb)保護(hù)的酪氨酸進(jìn)行逐步接肽，接著采用HCl脫去Boc，最后用HF脫去各種保護(hù)基，得到酪-絲-纈三肽。
最大保護(hù)策略采用側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸價(jià)格昂貴，在合成的最后需要經(jīng)過(guò)劇烈的HF脫保護(hù)。由于HF的劇毒性，反應(yīng)的危險(xiǎn)性較大，必須具備專門的HF脫保護(hù)裝置。而且由于這類脫保護(hù)裝置的反應(yīng)容器體積有限，每一次脫保護(hù)所得產(chǎn)品數(shù)量有限，因此限制了在產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用。
因此，需要一種避免采用強(qiáng)毒性和刺激性的HF進(jìn)行脫保護(hù)、成本便宜且能夠在工業(yè)上實(shí)施的合成酪-絲-纈三肽的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種采用最小保護(hù)策略合成所述酪-絲-纈三肽的方法，所述方法包括以下步驟(1)使L-Val-OH的酯與氨端保護(hù)但側(cè)鏈的羥基無(wú)需保護(hù)的L-Ser-OH在縮合劑存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制得氨端保護(hù)的絲氨酸和纈氨酸的二肽縮合物的酯；(2)對(duì)(1)中制得的產(chǎn)物的氨端進(jìn)行脫保護(hù)，脫除保護(hù)基團(tuán)；(3)使(2)中制得的產(chǎn)物與氨端保護(hù)但側(cè)鏈的羥基無(wú)需保護(hù)的L-Tyr-0H在縮合劑存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制得氨端保護(hù)的酪氨酸、絲氨酸和纈氨酸的三肽縮合物的酯；(4)使(3)中制得的產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中、在堿存在下進(jìn)行水解皂化，得到氨端保護(hù)的H-Tyr-Ser-Val-OH；(5)對(duì)(4)中制得的產(chǎn)物的氨端進(jìn)行脫保護(hù)，脫除保護(hù)基團(tuán)，得到H-Tyr-Ser-Val-OH。
進(jìn)一步的，所述的方法還包括在步驟(5)后將制得的產(chǎn)物經(jīng)C18反相柱純化脫鹽。
其中所述經(jīng)C18反相柱純化脫鹽所用的洗脫液為含有反離子酸及有機(jī)溶劑的水溶液，洗脫方式可以采用等度或梯度洗脫。
其中所述反離子酸為0.5～1.5％的HOAC或0.08％～0.12％的TFA，所述有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇或乙醇。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述梯度洗脫為三步梯度洗脫，洗脫液分別為含1％HOAC和5％乙晴的水溶液、含1％HOAC和10％乙晴的水溶液、含1％HOAC和15％乙晴的水溶液。
其中，將制得的產(chǎn)物經(jīng)C18反相柱純化脫鹽后進(jìn)一步包括將收集的洗脫液進(jìn)行冷凍干燥。
進(jìn)一步的，步驟(2)包括在得到目標(biāo)化合物之前用甲醇/無(wú)水乙醚重結(jié)晶。
所述用于氨端保護(hù)的保護(hù)基團(tuán)為Boc。
在步驟(1)和步驟(3)中所用的縮合劑均為DCC/HOBt。
在步驟(1)和步驟(3)的反應(yīng)中pH值均為8～9。
在步驟(2)和步驟(5)中的脫保護(hù)采用HCl/乙酸乙酯進(jìn)行，并且，在步驟(2)中所用的HCl/乙酸乙酯含有體積百分含量為2.5％的三異丙基硅烷。
本發(fā)明的有益效果在于相對(duì)于HF的脫保護(hù)條件，本發(fā)明方法的安全性增大，同時(shí)對(duì)工業(yè)化沒(méi)有障礙。另外，由于側(cè)鏈不保護(hù)氨基酸的價(jià)格較為便宜，因此采用本發(fā)明的保護(hù)路線的合成成本也較小，而且不需要最大保護(hù)路線的昂貴的HF脫保護(hù)的裝置。
進(jìn)一步的用C18反相柱純化能夠?qū)⒌玫降漠a(chǎn)物進(jìn)行脫鹽精制，從而提高產(chǎn)物的純度。
利用分別含1％HOAC和5％乙晴的水溶液、含1％HOAC和10％乙晴的水溶液、含1％HOAC和15％乙晴的水溶液作為C18反相柱純化的洗脫液依次分三步進(jìn)行梯度洗脫使分離效果更佳。
步驟(2)中在得到目標(biāo)化合物之前用甲醇/無(wú)水乙醚重結(jié)晶能夠消除反應(yīng)過(guò)程中帶來(lái)的雜質(zhì)，或者采用在HCl/乙酸乙酯中加入2.5％(V/V)三異丙基硅烷(TIS)能夠避免副反應(yīng)發(fā)生，提高中間產(chǎn)物HCl·Ser-Val-OMe的純度，并使下一步反應(yīng)更順利進(jìn)行。
本發(fā)明方法在制備過(guò)程中通過(guò)選擇合適的反應(yīng)條件，有效地防止副反應(yīng)的發(fā)生，制得的產(chǎn)物經(jīng)薄層層析測(cè)定為單點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明的HCl·Ser-Val-OMe制備工藝流程圖；圖2為本發(fā)明的Boc-Tyr-Ser-Val-OMe制備工藝流程圖；圖3為本發(fā)明的HCl·Tyr-Ser-Val-OH制備工藝流程圖；圖4為本發(fā)明的產(chǎn)品脫鹽流程圖。
具體實(shí)施例方式
盡管不希望受任何理論的限制，但是認(rèn)為本發(fā)明是以下面的事實(shí)為基礎(chǔ)由于1)酪-絲-纈三肽為僅含有三個(gè)氨基酸殘基的小肽；2)酪氨酸和絲氨酸的側(cè)鏈的羥基的親核反應(yīng)活性相對(duì)氨基較??；因此在合成過(guò)程中可以不對(duì)兩個(gè)側(cè)鏈的羥基進(jìn)行保護(hù)。
申請(qǐng)人將L-纈氨酸的酯與側(cè)鏈不保護(hù)的絲氨酸和酪氨酸進(jìn)行逐步接肽，皂化脫去酯基，最后脫去保護(hù)得到酪絲纈肽的鹽，采用C18反相脫鹽純化，凍干得到酪絲纈肽純品。該合成策略為最小保護(hù)策略。簡(jiǎn)明路線如下所示 1.Boc保護(hù)的纈氨酸和絲氨酸的二肽縮合物的酯的制備將H-Val-OH的酯用有機(jī)溶劑溶解，采用有機(jī)堿調(diào)節(jié)pH值至一定值(中性)。另一方面，將僅對(duì)氨基進(jìn)行保護(hù)(醇羥基呈游離狀態(tài))的Boc-L-Ser-OH用溶劑溶解，加入縮合劑，隨后在一定溫度下與H-Val-OH的酯溶液混合反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中采用有機(jī)堿維持pH值在一定范圍內(nèi)。得到Boc保護(hù)的纈氨酸和絲氨酸的二肽縮合物的酯。
在該步反應(yīng)中采用Boc-作為氨基保護(hù)劑，此外所述氨基保護(hù)劑還可選自常用于多肽合成中的任意保護(hù)劑，如芐氧羰基(Z)。
所用的溶劑可選自四氫呋喃、重蒸的DMF、NMP等，優(yōu)選使用四氫呋喃。
所用的有機(jī)堿可選自N-甲基嗎啉(NMM)、三乙胺和DIEA(二異丙基乙基胺)等，優(yōu)選使用NMM。
在該步反應(yīng)中選用DCC/HOBt作為縮合劑，此外所述縮合劑還可選自DIC、HBTU、BOP等常用于多肽合成中的任意縮合劑。
在反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)pH較低時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的純度將降低，而pH太高時(shí)，將使產(chǎn)率降低。因此，優(yōu)選將pH控制在8～9范圍內(nèi)。
反應(yīng)溫度可為-10℃至室溫。
2.脫保護(hù)Boc保護(hù)的二肽縮合物的脫保護(hù)可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脫保護(hù)試劑來(lái)實(shí)施。其中優(yōu)選使用HCl/乙酸乙酯作為脫保護(hù)試劑。
Boc-Ser-Val-OMe二肽用HCl/EtOAc脫保護(hù)時(shí)，薄層層析顯示在產(chǎn)物的上方會(huì)出現(xiàn)一個(gè)較大的雜點(diǎn)(＞15％)。該副產(chǎn)物在HPLC-MS得到證實(shí)，在主峰保留時(shí)間后面出現(xiàn)了一個(gè)較大的質(zhì)量數(shù)比主峰多56的雜峰，并且脫保護(hù)反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)沉淀，可能因?yàn)樵摳狈磻?yīng)的發(fā)生使沉淀難以形成。
為了提高純度，在該步中得到目標(biāo)化合物之前需要用甲醇/無(wú)水乙醚重結(jié)晶，具體步驟是先將樣品用一定體積(盡量少)的甲醇溶解，然后分次逐步加入乙醚，使溶液出現(xiàn)乳濁狀，放置靜置。
或采用脫保護(hù)過(guò)程中在HCl/乙酸乙酯中加入2.5％(V/V)三異丙基硅烷(TIS)能夠抑制副反應(yīng)的發(fā)生。
3.Boc保護(hù)的纈氨酸、絲氨酸和酪氨酸的三肽縮合物的酯的制備Boc保護(hù)的纈氨酸、絲氨酸和酪氨酸的三肽縮合物的酯的制備條件的選擇與Boc保護(hù)的纈氨酸和絲氨酸的二肽縮合物的酯的制備條件的選擇類似。
在該步反應(yīng)中采用Boc作為氨基保護(hù)劑，此外所述氨基保護(hù)劑還可選自常用于多肽合成中的任意保護(hù)劑，如芐氧羰基(Z)。
所用的溶劑可選自四氫呋喃、重蒸的DMF、NMP等，優(yōu)選使用四氫呋喃。所用的有機(jī)堿可選自N-甲基嗎啉、三乙胺和DIEA等，優(yōu)選使用NMM。縮合劑可選自DCC/HOBt、DIC、HBTU、BOP等，優(yōu)選使用DCC/HOBt。反應(yīng)過(guò)程的pH控制在8～9。反應(yīng)溫度控制為先在0℃下反應(yīng)2小時(shí)，再于室溫下反應(yīng)。
4.Boc-Tyr-Ser-Val-OH的制備將上一步反應(yīng)產(chǎn)物用醇溶劑溶解，在一定溫度下緩慢滴加入堿進(jìn)行皂化反應(yīng)，脫去羧酸端的酯基。
反應(yīng)中使用的溶劑可選自甲醇、乙醇等常用反應(yīng)溶劑。
反應(yīng)可在0℃至室溫下進(jìn)行。在室溫下進(jìn)行可縮短反應(yīng)時(shí)間(由0℃下的約5小時(shí)縮至2小時(shí))，但發(fā)生嚴(yán)重的消旋化，產(chǎn)生較多的包括消旋物在內(nèi)的副產(chǎn)物。而當(dāng)在0℃下進(jìn)行時(shí)則得到經(jīng)薄層層析檢測(cè)為純的化合物。因此優(yōu)選在0℃下實(shí)施皂化反應(yīng)。
5.Boc-Tyr-Ser-Val-OH的脫保護(hù)與3中的脫保護(hù)條件類似，可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脫保護(hù)試劑來(lái)實(shí)施。但較優(yōu)選使用HCl/乙酸乙酯作為脫保護(hù)試劑。
6.精制將制得的HCl·Tyr-Ser-Val-OH粗產(chǎn)品先預(yù)處理，即用水溶解并過(guò)濾后調(diào)節(jié)pH至5～6，采用C18反相柱進(jìn)行脫鹽純化，凍干得終產(chǎn)品為酪絲纈肽H-Tyr-Ser-Val-OH。
利用C18反相柱進(jìn)行脫鹽純化可采用等度或梯度洗脫，洗脫液為含有0.5～1.5％的HOAC或0.08％～0.12％的TFA等反離子酸，并且含有5～30％的有機(jī)溶劑如乙腈、甲醇或乙醇的水溶液。由于產(chǎn)品中一般不能殘留三氟乙酸，并且乙腈的分離效果要好于醇類溶劑，因此優(yōu)選的，本發(fā)明的洗脫液選用含有0.5～1.5％的HOAC、并且含有濃度范圍在大于0、小于等于30％的乙腈的水溶液。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中采用三步梯度洗脫，洗脫液分別為含1％HOAC和5％乙腈的水溶液、含1％HOAC和10％乙腈的水溶液、含1％HOAC和15％乙腈的水溶液。洗脫時(shí)pH值的確定為根據(jù)該肽的等電點(diǎn)以除去鹽酸鹽來(lái)選擇的。
將收集的洗脫液進(jìn)行冷凍干燥24小時(shí)，之后再次加入蒸餾水溶解，并再冷凍干燥48小時(shí)得最終產(chǎn)品。
在本文中，所用試劑的縮寫為DCC二環(huán)己基碳二亞胺HOBt1-羥基苯并三氮唑NMMN-甲基嗎啉THF四氫呋喃實(shí)施例1.Boc-Ser-Val-OMe的制備50g(0.298mol)HCl·Val-OMe用200ml無(wú)水四氫呋喃溶解，得到的溶液用N-甲基嗎啉調(diào)節(jié)pH至7～8，冷卻至0℃?zhèn)溆谩?br> 61g(0.298mol)Boc-Ser-OH，32g(0.238mol)HOBt用200ml無(wú)水四氫呋喃溶解，冷卻至0℃，緩慢加入64g(0.313mol)DCC，0℃攪拌5分鐘。然后與上面的溶液混合，用N-甲基嗎啉維持pH8～9，室溫?cái)嚢?0小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇/乙酸，20/1/0.4)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物過(guò)濾，濾液減壓濃縮，殘留物用石油醚反復(fù)研磨，得到的粘稠狀物質(zhì)用1500ml乙酸乙酯溶解，分別用飽和NaHCO3水溶液(75ml×5)，飽和NaCl水溶液(75ml×1)，5％KHSO4水溶液(75ml×5)，飽和NaCl水溶液(15ml×3)洗滌，有機(jī)層無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓旋干得到99.2g粘稠狀目標(biāo)化合物。在乙酸乙酯/石油醚(1/1)與氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)兩種展開(kāi)系統(tǒng)中均為單點(diǎn)，Rf值分別為0.28和0.36，該產(chǎn)物可直接用于下一步反應(yīng)。 (C＝2 MeOH)ESI-MS[M+1]+＝319.2。
2.HCl·Ser-Val-OMe的制備99.2g Boc-Ser-Val-OMe與300ml 4M HCL/乙酸乙酯溶液混合之后在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，反應(yīng)液出現(xiàn)粘稠狀物質(zhì)附著瓶壁，TLC(氯仿/甲醇，20/1)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)液中加入200ml石油醚使產(chǎn)物全部析出，傾出上清液，殘留物用乙酸乙酯(100ml×3)和乙醚(100ml×3)洗滌以除去HCl，再用甲醇/無(wú)水乙醚重結(jié)晶，得目標(biāo)化合物46g(產(chǎn)率60％)。
另外，也可采用在HCl/乙酸乙酯中加入2.5％(V/V)三異丙基硅烷(TIS)，從而避免副反應(yīng)發(fā)生，提高純度。
經(jīng)重結(jié)晶得到的目標(biāo)化合物，或者在HCl/乙酸乙酯中加入了2.5％(V/V)TIS進(jìn)行脫保護(hù)且未經(jīng)重結(jié)晶得到的目標(biāo)化合物在氯仿/甲醇(5/1)展開(kāi)系統(tǒng)中均為單點(diǎn)，Rf＝0.46，熔點(diǎn)90～92℃， (C＝2 MeOH)ESI-MS[M+1]+＝219.2。
3.Boc-Tyr-Ser-Val-OMe的制備50g(0.179mol)Boc-Tyr-OH，19g(0.143mol)HOBt用250ml無(wú)水四氫呋喃溶解，冷至0℃，緩慢加入39g(0.188mol)DCC，0℃攪拌5分鐘，然后加入46g(0.179mol)HCl·Ser-Val-OMe及40ml N-甲基嗎啉。0℃攪拌2小時(shí)，用N-甲基嗎啉維持pH8～9，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇/乙酸，20/1/0.4)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物過(guò)濾，濾液減壓濃縮，殘留物用石油醚反復(fù)研磨，得到的固體加1500ml乙酸乙酯溶解，分別用飽和NaHCO3水溶液(75ml×3)，飽和NaCl水溶液(75ml×1)，5％KHSO4水溶液(75ml×3)，飽和NaCl水溶液(15ml×3)洗滌，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓旋干得到84g粗品(產(chǎn)率98％)。在乙酸乙酯/石油醚(2/1)與氯仿/甲醇/乙酸(15/1/0.4)兩種展開(kāi)系統(tǒng)中均為單點(diǎn)，Rf值分別為0.22和0.22，可直接用于下一步反應(yīng)。取少量粗品采用乙酸乙酯/石油醚進(jìn)行重結(jié)晶，得到結(jié)晶性粉末用于測(cè)定熔點(diǎn)和比旋度，測(cè)得熔點(diǎn)97～101℃， (C＝2 MeOH)ESI-MS[M+1]+＝482.1。
4.Boc-Tyr-Ser-Val-OH的制備84g(0.175mol)Boc-Tyr-Ser-Val-OMe，用300ml CH3OH溶解，0℃下緩慢滴入80ml 2M NaOH/H2O，0℃攪拌5小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇，10/1)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)液用KHSO4/H2O調(diào)至中性，減壓蒸干甲醇，KHSO4/H2O繼續(xù)酸化至pH值1～2，乙酸乙酯(300ml×3)萃取，合并有機(jī)層，并用(50ml×3)H2O反洗至中性，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓旋干，得粗品81g(產(chǎn)率99％)。在氯仿/甲醇(5/1)展開(kāi)系統(tǒng)中為單點(diǎn)，Rf＝0.4，可直接用于下一步反應(yīng)。取少量粗品采用乙酸乙酯/石油醚進(jìn)行重結(jié)晶，得到結(jié)晶性粉末用于測(cè)定熔點(diǎn)和比旋度，測(cè)得熔點(diǎn)117～119℃。 (C＝2MeOH)ESI-MS[M+1]+＝468.1。
5.HCl·Tyr-Ser-Val-OH的制備81g(0.173mol)Boc-Tyr-Ser-Val-OH，0℃下緩慢加入250ml 4M HCl/乙酸乙酯，于0℃攪拌1.5小時(shí)，反應(yīng)液出現(xiàn)大量沉淀，TLC(氯仿/甲醇，10/1)顯示原料點(diǎn)消失，過(guò)濾，沉淀用乙酸乙酯(50ml×3)和無(wú)水乙醚(50ml×3)反復(fù)洗滌至無(wú)HCl，得目標(biāo)化合物59g粗品(85％)。氯仿/甲醇/水(1∶1∶0.1)展開(kāi)系統(tǒng)為一單點(diǎn)，Rf＝0.27。

6.脫鹽(精制)采用C18反相柱純化脫鹽。
粗品預(yù)處理60g HCl·Tyr-Ser-Val-OH分成5份，分別用5ml水溶解，過(guò)濾，濾液用10％稀氨水小心調(diào)節(jié)pH至5～6。
填料C18，柱長(zhǎng)800mm，內(nèi)徑50mm，洗脫條件梯度洗脫，流速2ml/min，先用5％乙腈1％HOAC水溶液洗脫，硝酸銀溶液檢測(cè)氯離子，接收液無(wú)氯后換為10％乙腈1％HOAC水溶液，1小時(shí)后再轉(zhuǎn)換為15％乙腈1％HOAC水溶液。
收集樣品采用TLC茚三酮顯色方法檢測(cè)樣品的流出情況，并根據(jù)HPLC檢測(cè)數(shù)據(jù)收集主成分，合并洗脫液，冷凍干燥24小時(shí)后，再次加入蒸餾水溶解續(xù)凍干48小時(shí)得37g終產(chǎn)品白色凍干粉末酪絲纈肽(產(chǎn)率68％)。 (C＝2冰醋酸)。FAB-MS[M]+＝368.2已經(jīng)通過(guò)非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出了舉例說(shuō)明。但本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，在沒(méi)有偏離本發(fā)明的宗旨和范圍下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種修改、替換和變更。
權(quán)利要求
1.一種制備具有以下結(jié)構(gòu)的三肽化合物的方法 所述方法包括以下步驟(1)使L-Val-OH的酯與氨端保護(hù)但側(cè)鏈的羥基無(wú)需保護(hù)的L-Ser-OH在縮合劑存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制得氨端保護(hù)的絲氨酸和纈氨酸的二肽縮合物的酯；(2)對(duì)(1)中制得的產(chǎn)物的氨端進(jìn)行脫保護(hù)，脫除保護(hù)基團(tuán)；(3)使(2)中制得的產(chǎn)物與氨端保護(hù)但側(cè)鏈的羥基無(wú)需保護(hù)的L-Tyr-OH在縮合劑存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制得氨端保護(hù)的酪氨酸、絲氨酸和纈氨酸的三肽縮合物的酯；(4)使(3)中制得的產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中、在堿存在下進(jìn)行水解皂化，得到氨端保護(hù)的H-Tyr-Ser-Val-OH；(5)對(duì)(4)中制得的產(chǎn)物的氨端進(jìn)行脫保護(hù)，脫除保護(hù)基團(tuán)，得到H-Tyr-Ser-Val-OH。
2.權(quán)利要求1的方法，其中還包括在步驟(5)后將制得的產(chǎn)物經(jīng)C18反相柱純化脫鹽。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述經(jīng)C18反相柱純化脫鹽所用的洗脫液為含有反離子酸及有機(jī)溶劑的水溶液，洗脫方式采用等度或梯度洗脫。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中所述反離子酸為0.5～1.5％的HOAC或0.08％～0.12％的TFA，所述有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇或乙醇。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述梯度洗脫步驟為用含1％HOAC和5％乙腈的水溶液、含1％HOAC和10％乙腈的水溶液以及含1％HOAC和15％乙腈的水溶液依次洗脫。
6.權(quán)利要求2的方法，其中，將制得的產(chǎn)物經(jīng)C18反相柱純化脫鹽后進(jìn)一步包括將收集的洗脫液進(jìn)行冷凍干燥。
7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(2)包括在得到目標(biāo)化合物之前用甲醇/無(wú)水乙醚重結(jié)晶。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述用于氨端保護(hù)的保護(hù)基團(tuán)為Boc。
9.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(1)和步驟(3)中所用的縮合劑均為DCC/HOBt。
10.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(2)和步驟(5)中的脫保護(hù)采用HCl/乙酸乙酯進(jìn)行，并且，在步驟(2)中所用的HCl/乙酸乙酯含有體積百分含量為2.5％的三異丙基硅烷。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種采用最小保護(hù)策略合成所述酪－絲－纈三肽的方法，所述方法包括步驟(1)使L－Val－OH的酯與氨端保護(hù)但側(cè)鏈羥基無(wú)保護(hù)的L－Ser－OH進(jìn)行縮合反應(yīng)；(2)對(duì)(1)的產(chǎn)物的氨端脫除保護(hù)基團(tuán)；(3)使(2)的產(chǎn)物與氨端保護(hù)但側(cè)鏈羥基無(wú)保護(hù)的L－Tyr－OH進(jìn)行縮合反應(yīng)；(4)使(3)的產(chǎn)物進(jìn)行水解皂化，得到氨端保護(hù)的H－Tyr－Ser－Val－OH；(5)對(duì)(4)的產(chǎn)物的氨端進(jìn)行脫除保護(hù)基團(tuán)，得到酪－絲－纈三肽。相對(duì)于HF的脫保護(hù)條件，本發(fā)明方法的安全性增大，同時(shí)對(duì)工業(yè)化沒(méi)有障礙。另外，由于側(cè)鏈不保護(hù)氨基酸的價(jià)格較為便宜，因此本發(fā)明的方法成本小。
文檔編號(hào)C07K5/08GK1935834SQ20061006178
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月20日
發(fā)明者丁文鋒, 彭師奇, 趙明, 王超, 林剛 申請(qǐng)人:一泰醫(yī)藥研究(深圳)有限公司