專(zhuān)利名稱(chēng)：：胃癌靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及表達(dá)甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)基因的胃癌的基因治療藥物，具體涉及靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：早在1970年BourreilleJ等在《PresseMed.》上發(fā)表了“胃起源的二級(jí)肝癌中甲胎蛋白的存在”一文(BourreilleJ，MetayerP，SaugerF，etal.Existenceofalpha-fetoproteinduringgastric-originsecondarycanceroftheliver.PresseMed.1970Jun6；78(28)1277-8.)，首次報(bào)道了一例AFP表達(dá)陽(yáng)性胃癌(alpha-fetoprotein-producinggastriccarcinoma，APGC)。有關(guān)APGC的文獻(xiàn)報(bào)道主要來(lái)自日本，APGC發(fā)病率國(guó)外文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)占胃癌的5.1％～15％。國(guó)內(nèi)報(bào)道發(fā)病率比國(guó)外低，其原因主要是對(duì)該種類(lèi)型的胃癌缺乏認(rèn)識(shí)，未能常規(guī)做病理標(biāo)本AFP的免疫組化染色所致。這類(lèi)胃癌雖占少數(shù)，但具有明顯的侵襲性和惡性生物學(xué)行為，其臨床病理學(xué)特征也與普通型胃癌有較大不同。2002年，KonoK等在《消化外科》上發(fā)表了“甲胎蛋白表達(dá)陽(yáng)性胃癌的臨床病理學(xué)特征”的研究(KonoK，AmemiyaH，SekikawaT.Clinicopathologicfeaturesofgastriccancersproducingalphafetoprotein.DigSurg.2002；19(5)359-65.)，對(duì)大量APGC胃癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)深度、臨床分期、肝轉(zhuǎn)移率都高于AFP陰性組，胃癌根治切除術(shù)后生存率明顯低于AFP陰性組，AFP被認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。了解APGC高侵襲性的分子作用機(jī)制對(duì)于今后制定出新的診斷治療方案有著重要的意義。然而，AFP的升高與APGC的高侵襲性之間的關(guān)系尚不明確。AFP在胎兒循環(huán)中濃度很高，但在出生后不久就急劇下降，到產(chǎn)后第2個(gè)月末僅能測(cè)出微量AFP，幾乎完全被血清白蛋白取代。AFP在胎兒期是必不可少的，它在胎兒的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著很重要的生理作用，如作為結(jié)合、運(yùn)輸配體的工具，AFP能與雌激素相互作用，與脂肪酸、膽紅素有很高的親和力，能有效地結(jié)合銅，鎳離子等；另外AFP的免疫抑制作用可保護(hù)胎兒免受母體免疫攻擊。而成人血中AFP含量升高則是發(fā)生多種疾病的標(biāo)志，包括肝細(xì)胞癌、某些胃腸道腫瘤及某些生殖系胚胎腫瘤等，然而AFP基因表達(dá)的調(diào)控及其生物學(xué)活性十分復(fù)雜，其與這些AFP相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系尚未完全闡明。近年來(lái)人們已意識(shí)到甲胎蛋白在腫瘤生長(zhǎng)中的調(diào)節(jié)作用并開(kāi)始了大量實(shí)驗(yàn)研究，尤其是AFP與腫瘤的增殖，凋亡和免疫監(jiān)視等方面的關(guān)系，而AFP基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。1998年發(fā)現(xiàn)的RNA干涉技術(shù)(RNAi，RNAinterfering)是雙鏈RNA通過(guò)降解其同源mRNA來(lái)特異沉默相應(yīng)同源基因表達(dá)的一個(gè)過(guò)程，是一種在動(dòng)植物中序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS，post-transcriptionalgenesilencing)過(guò)程。RNA干擾技術(shù)可以在基因轉(zhuǎn)錄水平抑制基因的表達(dá)，其作用分子-小干擾RNA(siRNA，smallinterferingRNA)因其眾多優(yōu)點(diǎn)已作為一種潛在的治療腫瘤的方法引起人們的廣泛關(guān)注。首先是它的高效性，少量的siRNA就可以有效的抑制同源性基因的表達(dá)；其次是siRNA有嚴(yán)格的序列特異性，可以特異性的沉默致病基因，而正常基因表達(dá)卻不受影響。由于體外得到的siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解且產(chǎn)生的RNA干擾效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短，因此現(xiàn)在研究人員多利用質(zhì)粒、病毒類(lèi)載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達(dá)。2002年，BrummelkampTR等在《科學(xué)》上發(fā)表了“一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)小干擾RNA的系統(tǒng)”的研究(BrummelkampTR，BernardsR，AgamiR.ASystemforStableExpressionofShortInterferingRNAsinMammalianCells[J].Science，2002Apr19，296550-553.)，他們通過(guò)構(gòu)建一種新的載體系統(tǒng)(命名為pSUPER)以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)siRNA合成。在RNA聚合酶III啟動(dòng)子H1與作為終止信號(hào)的五個(gè)胸腺嘧啶(T5)之間插入反向重復(fù)序列(對(duì)應(yīng)雙鏈RNA的正義鏈和反義鏈)，兩個(gè)反向重復(fù)序列之間夾一長(zhǎng)度不定的間隔區(qū)，將具有如上結(jié)構(gòu)的pSUPER導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄從G或A開(kāi)始，在轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的第二個(gè)堿基處終止，這樣就合成了一條RNA鏈，這條RNA鏈可以通過(guò)兩端的各19個(gè)核苷酸反向互補(bǔ)特性而折疊成具有3’-UU或TT突出末端的發(fā)夾樣雙鏈結(jié)構(gòu)，形成小發(fā)夾RNA(smallhairpinRNAs，shRNAs)，shRNA的作用與siRNA分子類(lèi)似，可進(jìn)一步起到基因抑制作用。利用這種自然現(xiàn)象發(fā)展起來(lái)的RNAi技術(shù)能夠迅速而簡(jiǎn)單地制備某個(gè)基因功能缺失表型，其快速發(fā)展為基因功能研究、基因治療、藥物篩選等領(lǐng)域提供了新技術(shù)平臺(tái)。本發(fā)明采用SiRNA相關(guān)技術(shù)構(gòu)建了針對(duì)AFP基因的3種SiRNAs表達(dá)質(zhì)粒，成功的抑制了AFP基因的表達(dá)，并篩選出抑制率最高的一個(gè)SiRNA表達(dá)質(zhì)粒，為制備治療分泌AFP蛋白胃癌的最佳基因藥物提供了理論依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種胃癌靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體構(gòu)建、篩選及其用途的方法。本發(fā)明以利用RNA干涉技術(shù)為主，針對(duì)AFP基因的不同靶序列，構(gòu)建了三個(gè)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)shRNA的表達(dá)質(zhì)粒pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP-siRNA1和pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP-siRNA3，其示意圖譜見(jiàn)圖1，能高效的特異性的抑制AFP基因表達(dá)，可用于制備治療分泌AFP的胃癌的基因藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案如下靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector為載體，針對(duì)AFP基因編碼區(qū)上、中、下游的三段序列，在可特異表達(dá)AFP的人胃腺癌細(xì)胞株FU97中發(fā)揮RNA干擾作用，這三段AFP特異性RNA干涉靶序列分別為①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于508位；②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’，起始于968位；③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，起始于1474位，是用于與AFP相關(guān)的胃癌的治療性物質(zhì)，由以下方法制得(1)RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設(shè)計(jì)與合成選擇AFP基因編碼區(qū)的三段序列①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’、②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’、③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，設(shè)計(jì)并分別體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下①AFP寡核苷酸序列1正義鏈5’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’反義鏈5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’②AFP寡核苷酸序列2正義鏈5’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’反義鏈5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’③AFP寡核苷酸序列3正義鏈5’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’反義鏈5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’(2)將上述合成的寡核苷酸分別與線(xiàn)性載體pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取首先用TE緩沖液重懸AFP寡核苷酸1/2/3干粉，上下游序列以1∶1混合，95℃30秒，72℃2分鐘，37℃2分鐘，25℃2分鐘完成退火；然后將退火后的雙鏈寡核苷酸與pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選，將單克隆陽(yáng)性重組子小量擴(kuò)增，再用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA；(3)質(zhì)粒的鑒定質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，并進(jìn)行插入片斷測(cè)序，以確定合成的寡核苷酸是否已正確轉(zhuǎn)入pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector質(zhì)粒中。本發(fā)明的胃癌靶向AFP基因的有效siRNAs表達(dá)載體在制備治療分泌AFP蛋白的胃癌的基因藥物中的應(yīng)用。為了對(duì)AFP基因siRNAs表達(dá)質(zhì)粒對(duì)AFP基因的抑制效果及對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行鑒定，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取總RNA，收集培養(yǎng)上清，化學(xué)發(fā)光法和免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定AFP蛋白水平的表達(dá)，RT-PCR法測(cè)定對(duì)AFP基因表達(dá)的抑制作用，MTT法和AnnexinV/PI雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑制AFP基因后對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響。本發(fā)明的針對(duì)AFP基因構(gòu)建的3種siRNAs表達(dá)質(zhì)粒是可用于AFP相關(guān)胃癌的治療物質(zhì)，其中AFP-siRNA1和AFP-siRNA3抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效率較高，可用于進(jìn)一步研究AFP基因的功能及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因治療研究。本發(fā)明的胃癌靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體的制備方法和生物學(xué)活性的鑒定主要包括如下內(nèi)容一、質(zhì)粒的制備，包括RNA干涉靶序列的選擇及插入模板的設(shè)計(jì)與合成，將上述合成的寡核苷酸分別與線(xiàn)性載體pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒DNA的提取，質(zhì)粒的鑒定。二、質(zhì)粒生物學(xué)活性的鑒定，包括質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的計(jì)算、RT-PCR檢測(cè)AFP基因的表達(dá)、化學(xué)發(fā)光法和免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定AFP蛋白水平的表達(dá)、MTT法檢測(cè)抑制AFP基因后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況及AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)抑制AFP基因后腫瘤細(xì)胞凋亡情況。下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明制備方法中各步驟的具體操作方法1.RNA干涉靶序列的選擇及插入模板的設(shè)計(jì)與合成將AFP基因編碼序列中的AA二聚體及其下游的19個(gè)核苷酸作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)，從上、中、下游隨機(jī)選取三段符合件的靶序列，即不選擇5’和3’非編碼區(qū)及靠近起始密碼子區(qū)域，也不選擇有連續(xù)三個(gè)或更多T的序列，GC含量在50％左右時(shí)最理想等；應(yīng)用PrimerPremier5.0分析軟件檢查這21個(gè)堿基的寡核苷酸有無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)以防錯(cuò)誤的退火；將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，排除那些和其它編碼序列同源的序列。為找到具有最佳沉默效果的靶位點(diǎn)，選取三段靶序列，分別為①CAGGGAGACATTCATGAAC，起始于508位，GC含量為47％；②CTGGAACGTGGTCAATGTA，起始于968位，GC含量為47％；③GGCTGACATTATTATCGGA，起始于1474位，GC含量為42％。另外陽(yáng)性對(duì)照(Luciferaseoligonucleotide，熒光素酶寡核苷酸)，陰性對(duì)照(Negativeoligonucleotide)由載體試劑盒同時(shí)提供。每一正向單鏈寡核苷酸內(nèi)，19nt的寡核苷酸以正反向組合，中間以TTCAAGAGA的發(fā)夾環(huán)序列間隔，使寡核苷酸內(nèi)部可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，每對(duì)寡核苷酸的核心序列反向互補(bǔ)，每對(duì)寡核苷酸兩端分別帶有BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，如圖2所示。按照以上所述，三個(gè)靶序列設(shè)計(jì)后的寡核苷酸序列如前所述。2.合成的寡核苷酸分別與線(xiàn)性載體pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取用TE緩沖液重懸AFP寡核苷酸序列1/2/3干粉，上、下游序列以1∶1混合，95℃30秒，72℃2分鐘，37℃2分鐘，25℃2分鐘完成退火。將退火后的雙鏈寡核苷酸與pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector用T4DNA連接酶連接，同時(shí)連接試劑盒中提供的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，用超純水代替寡核苷酸做空白對(duì)照。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入EcoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選，將單克隆陽(yáng)性重組子小量擴(kuò)增，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。3.質(zhì)粒的鑒定質(zhì)粒DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，送上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行插入片斷測(cè)序。上述方法所構(gòu)建的質(zhì)粒生物學(xué)活性鑒定方法如下1.胃癌細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染FU97培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將腫瘤細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板上，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞，使每孔細(xì)胞飽和度在轉(zhuǎn)染前達(dá)到90％以上，鋪板時(shí)不使用含抗生素的培養(yǎng)液。種板后24小時(shí)，按Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)方法，對(duì)于6孔板中的每一孔，將質(zhì)粒DNA(包括實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒)和Lipofectamine2000以1(μg)∶2.5(μl)的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染后8-12h于熒光顯微鏡下直接觀(guān)察DsRed熒光蛋白的表達(dá)，估算轉(zhuǎn)染效率。改變質(zhì)粒載體和轉(zhuǎn)染劑的比例(質(zhì)粒DNA∶脂質(zhì)體分別為2μg∶5μl、4μg∶10μl、8μg∶20μl)以?xún)?yōu)化轉(zhuǎn)染。2.總RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效應(yīng)的半定量RT-PCR檢測(cè)(1)提取總RNA取轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞FU97，用PBS漂洗2次，按106-107個(gè)細(xì)胞加1mlTrizol(Invitrogen)裂解細(xì)胞，裂解液轉(zhuǎn)至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200μl氯仿，劇烈振蕩30秒，12000轉(zhuǎn)/分4℃離心5分鐘，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入與上清等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘后12000轉(zhuǎn)/分4℃離心5分鐘，小心棄上清，70％乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀2次，室溫下自然晾干，用ddH2O(含1％DEPC)溶解，下續(xù)反應(yīng)。(2)cDNA的合成和PCR反應(yīng)使用Takara公司的RT-PCR試劑盒，先按50℃30min，99℃5min，5℃5min的步驟分別合成cDNA，反應(yīng)總體系為10μl，包括MgCI22μl，10XRTBuffer1μl，dNTPs混合物1μl，RNaseInhibitor0.25μl，AMVReverseTranscriptase0.5μl，OligodT-AdaptorPrimer0.5μl，RNA4.8μl；然后取cDNA1μl在PCR儀(PE5700)中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃2min一個(gè)循環(huán)，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min共30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)總體系為20μl，包括5XPCRbuffer5μl，滅菌蒸餾水9.875μl，TaKaRaExTaqHS酶0.125μl，AFP上、下游引物各1μl，內(nèi)參GAPDH上、下游引物各1μl，cDNA1μl。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR引物序列見(jiàn)表1。表1目的基因PCR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度3.蛋白水平驗(yàn)正AFP基因表達(dá)的變化(1)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)上清，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，應(yīng)用美國(guó)雅培公司的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套的AFP定量檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中細(xì)胞分泌的AFP蛋白含量的變化，計(jì)算抑制率，并利用方差分析比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的AFP表達(dá)水平有無(wú)顯著性差異。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)法的主要原理是利用熒光素、生物素或地高辛等標(biāo)記的抗體(或抗原)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，經(jīng)過(guò)化學(xué)呈色反應(yīng)之后，用顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分或化學(xué)性質(zhì)。我們應(yīng)用高度靈敏的SP(StreptavidinPeroxidase，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素)免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后的FU97中AFP表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。先將FU97以約5×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種在已鋪有無(wú)菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，37℃，5％CO2下生長(zhǎng)24小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)取出蓋玻片，在室溫下用免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(中杉金橋)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.陽(yáng)性對(duì)照抑制效率的檢測(cè)購(gòu)買(mǎi)載體RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector時(shí)其試劑盒中同時(shí)提供陽(yáng)性對(duì)照(針對(duì)熒光素酶基因的寡核苷酸)，即此段寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的shRNA絕對(duì)可發(fā)揮RNA干擾作用而抑制熒光素酶基因的表達(dá)，從而說(shuō)明所購(gòu)載體完全適用于RNA干擾技術(shù)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega)檢測(cè)。5.細(xì)胞的增殖活性變化我們采用的是MTT比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞活力，此法原理是MTT易被水溶解，透過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體脫氫酶能將MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苡谒乃{(lán)紫色甲替(Formazam)結(jié)晶顆粒，此結(jié)晶可被酸性異丙醇，SDS，DMSO等有機(jī)溶劑溶解，依顏色深淺可通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定出各吸光度值，由于結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)量及代謝活性成比例，因此吸光度(A)值的大小可反映活細(xì)胞的數(shù)量及活性，而死亡細(xì)胞沒(méi)有線(xiàn)粒體脫氫酶活性，與MTT不起反應(yīng)。將FU97細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞終密度約為2×104/ml，體積100μl，接種后24小時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別培養(yǎng)0h，24h，48h，72h后每孔加入100μlMTT液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心棄去上清液，加入100μlDMSO液，震蕩，待藍(lán)紫色溶解后，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A492。抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組A值平均值/對(duì)照組A值平均值)×100％。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3孔求平均值，以時(shí)間為橫軸，以抑制率為縱軸繪制曲線(xiàn)。6.細(xì)胞凋亡水平的變化我們采用的是AnnexinV/PI雙染色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面，而膜聯(lián)蛋自V(AnnexinV)是一種Ca2+依賴(lài)，對(duì)PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可通過(guò)識(shí)別細(xì)胞膜表面的PS從而識(shí)別凋亡細(xì)胞，但PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中，兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了，所以需同時(shí)用碘化丙啶(PI)來(lái)染細(xì)胞膜破損的細(xì)胞，這樣AnnexinV-FITC陽(yáng)性而PI陰性的就是早期凋亡細(xì)胞。PI是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，只能結(jié)合細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA，在細(xì)胞凋亡晚期，細(xì)胞膜裂解損毀，同壞死細(xì)胞一樣，AnnexinV-FITC和PI染色同時(shí)陽(yáng)性。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的PI，可確定是否有凋亡晚期的細(xì)胞。具體方法如下，在轉(zhuǎn)染48h后，按以下步驟應(yīng)用AnnexinV-FITC和PI雙染色法檢測(cè)該腫瘤細(xì)胞被抑制后的凋亡情況先用胰酶消化下待測(cè)細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，用250μl1X結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml；取100μl的細(xì)胞懸液加入一個(gè)5ml流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和10μl20μg/ml的PI溶液；混勻后于室溫避光孵育15分鐘；在反應(yīng)管中加400μlPBS，上流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)分析。所構(gòu)建質(zhì)粒及生物活性的鑒定結(jié)果如下1.質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3示，與Marker的條帶比較可見(jiàn)質(zhì)粒DNA位于9416bp和6557bp之間，已知構(gòu)建好的質(zhì)粒大小約為6740bp左右；另外比較②至⑦的條帶亮度和面積可看出質(zhì)粒之間的濃度大小和紫外分光光度計(jì)的結(jié)果相符。2.紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果如表2所示各質(zhì)粒濃度如下，結(jié)果與電泳圖相符。另外各質(zhì)粒的A260/A280之比中，個(gè)別比值稍低于1.75，說(shuō)明有少量蛋白質(zhì)污染。表2紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提質(zhì)粒DNA的濃度和純度3.測(cè)序結(jié)果通過(guò)測(cè)序(圖4)驗(yàn)證了插入序列與我們合成的寡核苷酸序列完全符合，說(shuō)明我們成功構(gòu)建了pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP1/2/34.轉(zhuǎn)染率計(jì)算結(jié)果轉(zhuǎn)染后11-12h左右，在熒光顯微鏡下觀(guān)察DsRed紅色熒光蛋白的表達(dá)，取三個(gè)視野分別在光鏡下計(jì)細(xì)胞總數(shù)，在熒光鏡下計(jì)表達(dá)特異紅色熒光的細(xì)胞數(shù)以計(jì)算質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率(轉(zhuǎn)染率＝同一視野下發(fā)熒光的細(xì)胞/同一視野下所有細(xì)胞％)。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率，用不同比例的質(zhì)粒載體和脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染(見(jiàn)表3)，以4μg∶10μl下轉(zhuǎn)染效率較高，且脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的毒性較小，為質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染劑的合適比例(如圖5)。當(dāng)脂質(zhì)體體積更大時(shí)(8μg∶20μl)，對(duì)細(xì)胞的毒性較大，細(xì)胞形態(tài)不佳(如圖7)。5.RT-PCR結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖9所示，各組均可見(jiàn)AFP基因的特異性條帶(275bp)和內(nèi)參GAPDH主帶(500bp)，與空白對(duì)照的條帶比較可發(fā)現(xiàn)pDonorVector-AFP2的亮度變化不明顯，說(shuō)明此質(zhì)粒對(duì)AFP基因的抑制不明顯；而pDonorVector-AFP1和pDonorVector-AFP3的AFP條帶亮度較弱，說(shuō)明此二質(zhì)粒抑制AFP的效率較高。6.化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)上清中AFP的結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，取FU97培養(yǎng)上清檢測(cè)細(xì)胞分泌的AFP蛋白含量的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)五次，取平均值。計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的抑制率，抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組平均值/空白對(duì)照平均值)×100％，得出pDonorVector-AFP1作用后抑制率為36.46％，pDonorVector-AFP3為32.84％；而pDonorVector-AFP2抑制率最低，為11.77％。另外利用方差分析，將實(shí)驗(yàn)組三組和空白對(duì)照組的AFP表達(dá)水平進(jìn)行兩兩比較，認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組三組與空白對(duì)照組之間的AFP水平均不同(P＜0.01)，pDonorVector-AFP1組和pDonorVector-AFP3組作用后的AFP水平與pDonorVector-AFP2組之間均不同(P＜0.01)，但pDonorVector-AFP1組和pDonorVector-AFP3組之間的AFP水平?jīng)]有顯著性差異(P＞0.05)。7.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，AFP的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖10、11。棕黃色顆粒沉著代表甲胎蛋白表達(dá)陽(yáng)性，如圖10所示轉(zhuǎn)染后48h，空白對(duì)照組FU97細(xì)胞中的AFP表達(dá)較多，多數(shù)細(xì)胞均有棕黃色顆粒沉著，而如圖11所示實(shí)驗(yàn)組FU97細(xì)胞中僅個(gè)別細(xì)胞有棕黃色顆粒沉著。8.陽(yáng)、陰性對(duì)照抑制效率的檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒中熒光素酶基因表達(dá)結(jié)果如圖12、13所示，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒作用后熒光素酶的Intensity(a.u.)為182.066，陰性對(duì)照質(zhì)粒作用后熒光素酶的Intensity(a.u.)為932.074，抑制率＝(1-182.066/932.074)×100％＝80.47％。此結(jié)果說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒很好的發(fā)揮了RNA干擾作用，有效抑制了熒光素酶基因的表達(dá)，即所購(gòu)載體完全適用于RNA干擾技術(shù)。9.MTT結(jié)果抑制曲線(xiàn)如圖14，可見(jiàn)pDonorVector-AFP1的抑制作用最明顯，而pDonorVector-AFP2的抑制率最低。10.流式凋亡結(jié)果轉(zhuǎn)染后48h，AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)FU97凋亡結(jié)果如圖15。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較可見(jiàn)，AnnexinV-FITC表達(dá)率很低，即未在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)發(fā)現(xiàn)明顯早期凋亡細(xì)胞；但PI的表達(dá)率有升高，pDonorVector-AFP1/2/3的％Gated分別為46.69％、42.79％、38.48％，而空白對(duì)照為23.31％，說(shuō)明排除壞死細(xì)胞外，有相當(dāng)一部分為晚期凋亡細(xì)胞，且pDonorVector-AFP1作用后誘導(dǎo)的晚期凋亡細(xì)胞最多。本發(fā)明的優(yōu)良效果如下本發(fā)明在近幾年國(guó)內(nèi)外RNA干涉研究的工作基礎(chǔ)上，針對(duì)AFP基因，利用RNA干擾技術(shù)結(jié)合基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的3種siRNAs表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)在AFP陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞株FU97中表達(dá)AFP特異性發(fā)夾狀siRNAs分子，特異性的抑制了AFP基因的表達(dá)，并篩選出抑制率最高的一種SiRNA表達(dá)質(zhì)粒，以達(dá)到特異性、有效阻斷AFP表達(dá)及治療胃癌的目的。(1)本發(fā)明構(gòu)建的3種AFP特異性siRNAs表達(dá)質(zhì)?？捎行б种艫FP基因的表達(dá)。主要有如下優(yōu)點(diǎn)①本質(zhì)?？稍诖竽c桿菌DH5α中大量擴(kuò)增，即可不斷獲得表達(dá)siRNAs的載體；②針對(duì)AFP編碼區(qū)上、中、下游分別設(shè)計(jì)了RNA干擾的靶位點(diǎn)，從而找到了對(duì)AFP基因抑制效率較高的位點(diǎn)；③安全性高，無(wú)插入突變危險(xiǎn)，亦無(wú)免疫毒性反應(yīng)。(2)本發(fā)明構(gòu)建、篩選的AFP特異性siRNAs表達(dá)質(zhì)粒針對(duì)AFP基因，抑制效果明顯。本發(fā)明的針對(duì)AFP基因的siRNAs表達(dá)質(zhì)粒是可用于AFP相關(guān)胃癌的治療物質(zhì)，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并能誘導(dǎo)其凋亡，可進(jìn)一步研究AFP基因的功能及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因治療研究。圖1質(zhì)粒pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector示意圖。圖2shRNA寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)。圖3質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，①λ-HindIIIdigestDNAMarker，②空白對(duì)照質(zhì)粒，③陰性對(duì)照質(zhì)粒，④陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒(pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-Luciferase)，⑤pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP3，⑥pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP2，⑦pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP1。圖4插入的AFPoligonucleotide1/2/3測(cè)序圖。圖5質(zhì)粒載體∶脂質(zhì)體＝2μg∶5μl時(shí)腫瘤細(xì)胞中DsRed紅色熒光蛋白的表達(dá)。圖6質(zhì)粒載體∶脂質(zhì)體＝4μg∶10μl時(shí)腫瘤細(xì)胞中DsRed紅色熒光蛋白的表達(dá)。圖7質(zhì)粒載體∶脂質(zhì)體＝8μg∶20μl時(shí)腫瘤細(xì)胞中DsRed紅色熒光蛋白的表達(dá)。圖8正常對(duì)照細(xì)胞，無(wú)紅色熒光表達(dá)。圖9RT-PCR產(chǎn)物圖，①DNAMarkerDL2000，②空白對(duì)照，③pDonorVector-AFP3，④pDonorVector-AFP2，⑤pDonorVector-AFP1。圖10轉(zhuǎn)染后48h，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)空白對(duì)照組FU97的AFP表達(dá)。圖11轉(zhuǎn)染后48h，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組FU97的AFP表達(dá)。圖12轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒作用后FU97中熒光素酶的表達(dá)Wavelength(nm)＝527.76，Int.(a.u.)＝182.066。圖13轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，陰性對(duì)照質(zhì)粒作用后FU97中熒光素酶的表達(dá)Wavelength(nm)＝562.56，Int.(a.u.)＝932.074。圖14MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后對(duì)FU97生長(zhǎng)的抑制。圖15-18為轉(zhuǎn)染后48h，AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)FU97凋亡情況。圖15，Z為空白對(duì)照，圖16、17、18中1/2/3分別對(duì)應(yīng)pDonorVector-AFP1/2/3。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不僅限于此。一.主要試劑1.載體RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector購(gòu)自Clontech公司2.T4DNA連接酶和RT-PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司3.質(zhì)粒小量提取試劑盒QIAprepSpinMiniprepKit購(gòu)自QIAGEN公司4.AFP特異性PCR引物合成、AFP特異性siRNA寡核苷酸鏈合成和DNA序列測(cè)定由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成5.轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000Reagent和TRzolReagent購(gòu)自Invitrogen公司6.熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Promega公司7.鼠抗人α甲胎蛋白單克隆抗體、免疫組化染色試劑盒和濃縮型DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司8.凋亡試劑AnnexinVFITCKit購(gòu)自晶美生物工程有限公司二.主要儀器1.紫外分光光度計(jì)(GeneQuantPro)AmershamBiosciences2.凝膠成像系統(tǒng)(ChemilmagerTM4400)AlphaInnotech3.生物安全柜(Hfsafel200)上海力申科學(xué)儀器公司4.二氧化碳培養(yǎng)箱(HF90)上海力申科學(xué)儀器公司5.熒光顯微鏡(ECLIPSETE2000-S)Nikon6.CCD(penguinl50CL)美國(guó)pixera公司7.臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL-16G)上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)8.PCR儀(PE5700)ABI9.全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(AbbottAXSYMSYSTEM)美國(guó)雅培公司10.流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)BECTONDICKINSON11.熒光光譜儀(VARIANCARYEclipse)美國(guó)VARIAN公司12.全自動(dòng)酶標(biāo)儀(MultiskanMk3)ThermoLabsystems三.質(zhì)粒的制備方法及其生物學(xué)活性鑒定1.RNA干涉靶序列的選擇及插入模板的設(shè)計(jì)與合成1.1選擇靶序列選取AFP基因的三段靶序列，分別為①CAGGGAGACATTCATGAAC，起始于508位，GC含量為47％；②CTGGAACGTGGTCAATGTA，起始于968位，GC含量為47％；③GGCTGACATTATTATCGGA，起始于1474位，GC含量為42％。另外陽(yáng)性對(duì)照(Luciferaseoligonucleotide，熒光素酶寡核苷酸)，陰性對(duì)照(Negativeoligonucleotide)由載體試劑盒同時(shí)提供。1.2設(shè)計(jì)寡核苷酸每一正向單鏈寡核苷酸內(nèi)，19nt的寡核苷酸以正反向組合，中間以TTCAAGAGA的發(fā)夾環(huán)序列間隔，使寡核苷酸內(nèi)部可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，每對(duì)寡核苷酸的核心序列反向互補(bǔ)，每對(duì)寡核苷酸兩端分別帶有BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，如圖2所示。按照以上所述，三個(gè)靶序列設(shè)計(jì)后的寡核苷酸序列如下AFP寡核苷酸序列15’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’，5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’；AFP寡核苷酸序列25’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’，5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’；AFP寡核苷酸序列35’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’，5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’。2.構(gòu)建pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP-siRNA載體2.1退火用TE緩沖液(10mMTris-HCI，1mMEDTA，Ph8.0)重懸AFP的寡核苷酸干粉至濃度為100μM，上下游序列以1∶1混合，95℃30sec，72℃2min，37℃2min，25℃2min完成退火。取其中1μl退火后的雙鏈寡核苷酸用TE緩沖液稀釋成100μl，即濃度為0.5μM，下續(xù)反應(yīng)。其余的放-20℃保存。2.2連接AFP的雙鏈寡核苷酸1/2/3分別與pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector(載體圖譜見(jiàn)圖1)，用T4DNA連接酶連接，同時(shí)連接試劑盒中提供的陽(yáng)性對(duì)照(針對(duì)熒光素酶基因的寡核苷酸)和陰性對(duì)照，空白對(duì)照(超純水代替寡核苷酸)。室溫放置3小時(shí)以進(jìn)行連接。反應(yīng)結(jié)束后取2μl進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)，其余的保存在-20℃。2.3轉(zhuǎn)化取制備好的E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞6管(50μl/每Ep管)，冰上融化10min，分別加入各連接產(chǎn)物2μl混勻，冰上放置30min，每隔5min輕輕搖動(dòng)Ep管，42℃水浴中放置60-70sec，勿晃動(dòng)；迅速取出置于冰中，靜置1-2min，每管加500μl的LB液，37℃振搖(約170轉(zhuǎn))1小時(shí)左右，取不同體積菌液(80-150μl)涂布于含氨芐青霉素(終濃度為100g/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。2.4陽(yáng)性重組子小量擴(kuò)增與分離純化挑選上述含氨芐的LB平板中的單個(gè)克隆，種在5ml含氨芐青霉素(終濃度為100g/ml)的LB液中，37℃振搖(約170轉(zhuǎn))14-16小時(shí)左右。每組都分別挑選5個(gè)克隆。實(shí)驗(yàn)組各取1ml菌液送上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行插入片斷測(cè)序。另用甘油保存余下菌液，置-80℃?zhèn)溆?。取出測(cè)序結(jié)果正確的菌種，劃線(xiàn)接種在含氨芐的LB平板上，37℃孵育14-16小時(shí)。挑單個(gè)菌落接種在4ml含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖(約170轉(zhuǎn))14-16小時(shí)左右。取約3ml菌液按QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN)說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。3.質(zhì)粒DNA的檢測(cè)3.1瓊脂糖凝膠電泳分析配制0.8％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml溴化乙錠)，取1μ1質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳，檢測(cè)提取的質(zhì)粒DNA。3.2紫外分光光度計(jì)分析取1μl質(zhì)粒DNA用69μl超純水稀釋?zhuān)谧贤夥止夤舛扔?jì)(GeneQuantPro)下檢測(cè)A260nm和A280nm處的吸光值，以測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度。4.胃癌細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染FU97培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將腫瘤細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板上，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞，使每孔細(xì)胞飽和度在轉(zhuǎn)染前達(dá)到90％以上，鋪板時(shí)不使用含抗生素的培養(yǎng)液。種板后24小時(shí)，按Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)方法，對(duì)于6孔板中的每一孔，將質(zhì)粒DNA(包括實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒)和Lipofectamine2000以1(μg)∶2.5(μl)的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染后8-12h于熒光顯微鏡下直接觀(guān)察DsRed熒光蛋白的表達(dá)，估算轉(zhuǎn)染效率。改變質(zhì)粒載體和轉(zhuǎn)染劑的比例(質(zhì)粒DNA∶脂質(zhì)體分別為2μg∶5μl、4μg∶10μl、8μg∶20μl)以?xún)?yōu)化轉(zhuǎn)染。5.總RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效應(yīng)的半定量RT-PCR檢測(cè)5.1提取總RNA取轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞FU97，用PBS漂洗2次，按106-107個(gè)細(xì)胞加1mlTrizol(Invitrogen)裂解細(xì)胞，裂解液轉(zhuǎn)至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200μl氯仿，劇烈振蕩30秒，12000轉(zhuǎn)/分4℃離心5分鐘，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入與上清等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘后12000轉(zhuǎn)/分4℃離心5分鐘，小心棄上清，70％乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀2次，室溫下自然晾干，用ddH2O(含1％DEPC)溶解，下續(xù)反應(yīng)。5.2cDNA的合成和PCR反應(yīng)使用Takara公司的RT-PCR試劑盒，先按50℃30min，99℃5min，5℃5min的步驟分別合成cDNA，反應(yīng)總體系為10μl，包括MgCI22μl，10XRTBuffer1μl，dNTPs混合物1μl，RNaseInhibitor0.25μl，AMVReverseTranscriptase0.5μl，OligodT-AdaptorPrimer0.5μl，RNA4.8μl；然后取cDNA1μl在PCR儀(PE5700)中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃2min一個(gè)循環(huán)，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min共30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)總體系為20μl，包括5XPCRbuffer5μl，滅菌蒸餾水9.875μl，TaKaRaExTaqHS酶0.125μl，AFP上、下游引物各1μl，內(nèi)參GAPDH上、下游引物各1μl，cDNA1μl。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR引物序列見(jiàn)表1。6.化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，應(yīng)用美國(guó)雅培公司的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套的AFP定量檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中細(xì)胞分泌的AFP蛋白含量的變化，計(jì)算抑制率，并利用方差分析比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的AFP表達(dá)水平有無(wú)顯著性差異。7.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外蛋白應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后的FU97中AFP表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。先將FU97以約5×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種在已鋪有無(wú)菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，37℃，5％CO2下生長(zhǎng)24小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)取出蓋玻片，在室溫下用免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(中杉金橋)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。8.陽(yáng)性對(duì)照抑制效率的檢測(cè)購(gòu)買(mǎi)載體RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector時(shí)其試劑盒中同時(shí)提供陽(yáng)性對(duì)照(針對(duì)熒光素酶基因的寡核苷酸)，即此段寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的shRNA絕對(duì)可發(fā)揮RNA干擾作用而抑制熒光素酶基因的表達(dá)，從而說(shuō)明所購(gòu)載體完全適用于RNA干擾技術(shù)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega)檢測(cè)。9.細(xì)胞的增殖活性變化我們采用的是MTT比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞活力，將FU97細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞終密度約為2×104/ml，體積100μl，接種后24小時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別培養(yǎng)0h，24h，48h，72h后每孔加入100μlMTT液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心棄去上清液，加入100μlDMSO液，震蕩，待藍(lán)紫色溶解后，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A492。抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組A值平均值/對(duì)照組A值平均值)×100％。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3孔求平均值，以時(shí)間為橫軸，以抑制率為縱軸繪制曲線(xiàn)。10.細(xì)胞凋亡水平的變化在轉(zhuǎn)染48h后，按以下步驟應(yīng)用AnnexinV-FITC和PI雙染色法檢測(cè)該腫瘤細(xì)胞被抑制后的凋亡情況先用胰酶消化下待測(cè)細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，用250μl1X結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml；取100μl的細(xì)胞懸液加入一個(gè)5ml流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和10μl20μg/ml的PI溶液；混勻后于室溫避光孵育15分鐘；在反應(yīng)管中加400μlPBS，上流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)分析。四.結(jié)果1.質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3示，與Marker的條帶比較可見(jiàn)質(zhì)粒DNA位于9416bp和6557bp之間，已知構(gòu)建好的質(zhì)粒大小約為6740bp左右；另外比較②至⑦的條帶亮度和面積可看出質(zhì)粒之間的濃度大小和紫外分光光度計(jì)的結(jié)果相符。2.紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果如表2所示各質(zhì)粒濃度如下，結(jié)果與電泳圖相符。另外各質(zhì)粒的A260/A280之比中，個(gè)別比值稍低于1.75，說(shuō)明有少量蛋白質(zhì)污染。3.測(cè)序結(jié)果通過(guò)測(cè)序(圖4)驗(yàn)證了插入序列與我們合成的寡核苷酸序列完全符合，說(shuō)明我們成功構(gòu)建了pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP1/2/34.轉(zhuǎn)染率計(jì)算結(jié)果轉(zhuǎn)染后11-12h左右，在熒光顯微鏡下觀(guān)察DsRed紅色熒光蛋白的表達(dá)，取三個(gè)視野分別在光鏡下計(jì)細(xì)胞總數(shù)，在熒光鏡下計(jì)表達(dá)特異紅色熒光的細(xì)胞數(shù)以計(jì)算質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率(轉(zhuǎn)染率＝同一視野下發(fā)熒光的細(xì)胞/同一視野下所有細(xì)胞％)。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率，用不同比例的質(zhì)粒載體和脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染(見(jiàn)表3)，以4μg∶10μl下轉(zhuǎn)染效率較高，且脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的毒性較小，為質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染劑的合適比例(圖5)。當(dāng)脂質(zhì)體體積更大時(shí)(8μg∶20μl)，對(duì)細(xì)胞的毒性較大，細(xì)胞形態(tài)不佳(圖7)。表3質(zhì)粒載體和脂質(zhì)體不同比例下的轉(zhuǎn)染效率5.RT-PCR結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖9所示，各組均可見(jiàn)AFP基因的特異性條帶(275bp)和內(nèi)參GAPDH主帶(500bp)，與空白對(duì)照的條帶比較可發(fā)現(xiàn)pDonorVector-AFP2的亮度變化不明顯，說(shuō)明此質(zhì)粒對(duì)AFP基因的抑制不明顯；而pDonorVector-AFP1和pDonorVector-AFP3的AFP條帶亮度較弱，說(shuō)明此二質(zhì)粒抑制AFP的效率較高。6.化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)上清中AFP的結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，取FU97培養(yǎng)上清檢測(cè)細(xì)胞分泌的AFP蛋白含量的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)五次，取平均值。計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的抑制率，抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組平均值/空白對(duì)照平均值)×100％，得出pDonorVector-AFP1作用后抑制率為36.46％，pDonorVector-AFP3為32.84％；而pDonorVector-AFP2抑制率最低，為11.77％。另外利用方差分析，將實(shí)驗(yàn)組三組和空白對(duì)照組的AFP表達(dá)水平進(jìn)行兩兩比較，認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組三組與空白對(duì)照組之間的AFP水平均不同(P＜0.01)，pDonorVector-AFP1組和pDonorVector-AFP3組作用后的AFP水平與pDonorVector-AFP2組之間均不同(P＜0.01)，但pDonorVector-AFP1組和pDonorVector-AFP3組之間的AFP水平?jīng)]有顯著性差異(P＞0.05)。7.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，AFP的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖10、11。棕黃色顆粒沉著代表甲胎蛋白表達(dá)陽(yáng)性，如圖10所示轉(zhuǎn)染后48h，空白對(duì)照組FU97細(xì)胞中的AFP表達(dá)較多，多數(shù)細(xì)胞均有棕黃色顆粒沉著，而如圖11所示實(shí)驗(yàn)組FU97細(xì)胞中僅個(gè)別細(xì)胞有棕黃色顆粒沉著。8.陽(yáng)、陰性對(duì)照抑制效率的檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒中熒光素酶基因表達(dá)結(jié)果如圖12、13所示，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒作用后熒光素酶的Intensity(a.u.)為182.066，陰性對(duì)照質(zhì)粒作用后熒光素酶的Intensity(a.u.)為932.074，抑制率＝(1-182.066/932.074)×100％＝80.47％。此結(jié)果說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒很好的發(fā)揮了RNA干擾作用，有效抑制了熒光素酶基因的表達(dá)，即所購(gòu)載體完全適用于RNA干擾技術(shù)。9.MTT結(jié)果抑制曲線(xiàn)如圖14，可見(jiàn)pDonorVector-AFP1的抑制作用最明顯，而pDonorVector-AFP2的抑制率最低。10.流式凋亡結(jié)果轉(zhuǎn)染后48h，AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)FU97凋亡結(jié)果如圖15。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較可見(jiàn)，AnnexinV-FITC表達(dá)率很低，即未在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)發(fā)現(xiàn)明顯早期凋亡細(xì)胞；但PI的表達(dá)率有升高，pDonorVector-AFP1/2/3的％Gated分別為46.69％、42.79％、38.48％，而空白對(duì)照為23.31％，說(shuō)明排除壞死細(xì)胞外，有相當(dāng)一部分為晚期凋亡細(xì)胞，且pDonorVector-AFP1作用后誘導(dǎo)的晚期凋亡細(xì)胞最多。序列表<110>汪運(yùn)山<120>胃癌靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途<160>9<170>PatentIn3.1<210>1<211>19<212>DNA5’-cagggagacattcatgaac-3’19<210>2<211>19<212>DNA5’-ctggaacgtggtcaatgta-3’19<210>3<211>19<212>DNA5’-ggctgacattattatcgga-3’19<210>4<211>66<212>DNA5’gatccgcagggagacattcatgaacttcaagagagttcatgaatgtctccctgtttttta60cgcgtg3’66<210>5<211>66<212>DNA5’aattcacgcgtaaaaaacagggagacattcatgaactctcttgaagttcatgaatgtctc60cctgcg3’66<210>6<211>66<212>DNA5’gatccgctggaacgtggtcaatgtattcaagagatacattgaccacgttccagtttttta60cgcgtg3’66<210>7<211>66<212>DNA5’aattcacgcgtaaaaaactggaacgtggtcaatgtatctcttgaatacattgaccacgtt60ccagcg3’66<210>8<211>65<212>DNA5’gatccggctgacattattatcggattcaagagatccgataataatgtcagccttttttac60gcgtg3’65<210>9<211>65<212>DNA5’aattcacgcgtaaaaaaggctgacattattatcggatctcttgaatccgataataatgtc60agccg3’6權(quán)利要求1.靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector為載體，針對(duì)甲胎蛋白(AFP)基因編碼區(qū)上、中、下游的三段序列，在可特異表達(dá)AFP的人胃腺癌細(xì)胞株FU97中發(fā)揮RNA干擾作用，這三段AFP特異性RNA干涉靶序列分別為①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于508位；②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’，起始于968位；③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，起始于1474位，是用于與AFP相關(guān)的胃癌的治療性物質(zhì)，由以下方法制得(1)RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設(shè)計(jì)與合成選擇AFP基因編碼區(qū)的三段序列①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’、②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’、③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，設(shè)計(jì)并分別體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下①AFP寡核苷酸序列1正義鏈5’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’反義鏈5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’②AFP寡核苷酸序列2正義鏈5’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’反義鏈5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’③AFP寡核苷酸序列3正義鏈5’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’反義鏈5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’(2)將上述合成的寡核苷酸分別與線(xiàn)性載體pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取首先用TE緩沖液重懸AFP寡核苷酸1/2/3干粉，上下游序列以1∶1混合，95℃30秒，72℃2分鐘，37℃2分鐘，25℃2分鐘完成退火；然后將退火后的雙鏈寡核苷酸與pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector用T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選，將單克隆陽(yáng)性重組子小量擴(kuò)增，再用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA；(3)質(zhì)粒的鑒定質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，并進(jìn)行插入片斷測(cè)序，以確定合成的寡核苷酸是否已正確轉(zhuǎn)入pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector質(zhì)粒中。2.權(quán)利要求1的胃癌靶向AFP基因的有效siRNAs表達(dá)載體在制備治療分泌AFP蛋白的胃癌的基因藥物中的應(yīng)用。全文摘要一種胃癌靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體構(gòu)建、篩選及其用途。本發(fā)明以利用RNA干涉技術(shù)為主，針對(duì)AFP基因的不同靶序列，構(gòu)建了三個(gè)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)shRNA的表達(dá)質(zhì)粒pSIREN－DNR－DsRed－ExpressDonorVector－AFP－siRNAl、pSIREN－DNR－DsRed－ExpressDonorVector－AFP－siRNA2和pSIREN－DNR－DsRed－ExpressDonorVector－AFP－siRNA3，能高效的特異性的抑制AFP基因表達(dá)，可用于制備治療分泌AFP的胃癌的基因藥物。文檔編號(hào)C07H21/00GK1940074SQ200610069659公開(kāi)日2007年4月4日申請(qǐng)日期2006年8月7日優(yōu)先權(quán)日2006年8月7日發(fā)明者汪運(yùn)山,胡安拉,馬曉麗,朱之煒,肖東杰,孫善會(huì),郟雁飛,周芳申請(qǐng)人:汪運(yùn)山