專利名稱：抗腫瘤寡肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人們很早就知道尿的藥用價值。1943年，Magnelin等首次將尿的提取物用來治療癌癥。1967年Burzynski等從人尿中分離得到了抗瘤酮。目前國外已對抗瘤酮A2、A3、A5和A10進(jìn)行了I期和II期臨床試驗，試驗結(jié)果表明大部分可以完全緩解，少部分緩解，部分穩(wěn)定，極少惡化。
我們采用適合我國國情的分離純化方法，從健康男性尿液中得到了抗瘤肽，由Glu、Gly、Leu、Pro、Tyr等氨基酸組成，其分子量小于1000，有明顯的抗腫瘤作用。
在人尿抗瘤肽的基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)并合成了一定結(jié)構(gòu)的化合物，具有很強(qiáng)的抑瘤作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是用人工合成的方法合成了具有很強(qiáng)抑瘤作用的寡肽(antitumoroligopeptide，簡稱AOP)，為八肽，其序列為Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala(X為Leu或Ile，Y為Thr或Ser)?？鼓[瘤寡肽-1(AOP-1)序列為Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；抗腫瘤寡肽-2(AOP-2)序列為Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；抗腫瘤寡肽-3(AOP-3)序列為Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala；抗腫瘤寡肽-4(AOP-4)序列為Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。體外及體內(nèi)試驗表明AOP-1、AOP-2、AOP-3、AOP-4均具有很明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，可用來制備抗腫瘤藥物，用于治療腫瘤。
本發(fā)明可以通過以下措施來達(dá)到1.抗腫瘤寡肽的制備
(1)采用液相合成法和活化酯逐個增長法，將寡肽C端的第二個氨基酸的α-氨基用Boc基(叔丁氧羰?；?保護(hù)，α-羧基用HOSu(N-羥基琥珀酰亞胺)活化，然后在KHCO3溶液中與C端第一個氨基酸30℃反應(yīng)2天。抽去溶劑，在冰浴中調(diào)pH至3～4，抽提，飽和NaCl洗，無水Na2SO4干燥，抽干，研磨，得帶保護(hù)基的二肽。用50％TFA(三氟醋酸)處理，脫去Boc基，再與N端帶Boc保護(hù)基，C端用HOSu活化的C端第三個氨基酸縮合，用同樣的方法逐個接上氨基酸，最后用催化氫化法脫去Glu側(cè)鏈上的保護(hù)基OBzl(芐酯)，用50％TFA脫去八肽N端的Boc基，得粗肽，粗肽用HPLC進(jìn)行分離純化，純度在96％以上。
(2)采用固相合成法，從C端→N端逐個延長。
參考書①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學(xué)出版社，1985年。②N.休厄德、H.D.賈庫布克著，劉克良、何軍林等譯，肽化學(xué)與生物學(xué)，科學(xué)出版社，2005年。
2.抗腫瘤寡肽的鑒定抗腫瘤寡肽經(jīng)5.7mol/LHCl水解16小時，用氨基酸自動分析儀進(jìn)行氨基酸分析。經(jīng)氨基酸序列儀分析其序列。經(jīng)電噴霧質(zhì)譜測定其分子量。
3.抗腫瘤寡肽的抗腫瘤活性(1)體外活性測定采用細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞計數(shù)的方法，人肝癌細(xì)胞7721以RPMI1640為培養(yǎng)基，人胃癌細(xì)胞MKN以DME/F12(1∶1)為培養(yǎng)基，視不同情況加入10％左右的小牛血清，用T-25培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中單層培養(yǎng)。
當(dāng)細(xì)胞生長成單層后消化，用含1％小牛血清的培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按每孔1ml接種到24孔培養(yǎng)板上，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，加入不同劑量的抗腫瘤寡肽，對照組和實驗組均設(shè)三個重復(fù)孔，對照組加入20μl的PBS，試驗組加入不同劑量的抗腫瘤寡肽，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗，然后每孔加入200μl消化液消化，待細(xì)胞變圓后，加入800μl的PBS，在倒置顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)。
(2)體內(nèi)活性測定50只健康昆明種小白鼠，體重20±2克，平均分五組，每組10只，雌雄各半或全部為雄鼠。將已接種S180肉瘤或H22肝癌的荷瘤小鼠處死，無菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀釋，配制成細(xì)胞懸液，于每只實驗用小鼠的右前肢腋窩皮下注射0.2ml瘤細(xì)胞懸液，瘤細(xì)胞不少于105，植瘤24hr后，給藥組分別以不同劑量進(jìn)行靜脈注射，以生理鹽水作為陰性對照組，CTX為陽性對照組，連續(xù)注射7天后，于停藥3天時處死小鼠，剖取皮下瘤塊，稱瘤重，計算抑瘤率。對于Lewis肺癌，植瘤24hr后，給藥組、生理鹽水和CTX組樣品連續(xù)注射10天后，于停藥4天時處死小鼠，剖取皮下瘤塊，稱癌重，計算抑瘤率。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的效果本發(fā)明合成了一個具有很強(qiáng)抑瘤作用的寡肽AOP-1。目前雖有文獻(xiàn)報道抗腫瘤肽類，但大多數(shù)從海洋生物、植物及生物體中分離得到。我們合成的寡肽由天然氨基酸組成，分子量較小，便于人工合成，易于產(chǎn)業(yè)化，且抑瘤作用強(qiáng)，對正常白細(xì)胞、紅細(xì)胞無影響，是一種安全、高效、理想的抗癌藥物。
我們還合成了AOP-1的三個類似物AOP-2、AOP-3和AOP-4，也具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，可作為抗腫瘤藥物。
具體實施例方式
實施例1抗腫瘤寡肽AOP-1的液相合成采用液相合成法和活化酯逐個增長法氨基酸的氨基用Boc基(叔丁氧羰?；?保護(hù)，羧基用HOSu(N-羥基琥珀酰亞胺)活化，谷氨酸的側(cè)鏈羧基用OBzl(芐酯)保護(hù)。
Boc氨基酸羧基活化的方法Boc氨基酸100mmol于70ml四氫呋喃(A.R)中，微熱溶解，加105mmol HOSu，冰浴攪拌下滴加含105mmol DCCI(二環(huán)己基碳二亞胺)的65ml四氫呋喃溶液，冰浴攪拌反應(yīng)6小時，以后讓其自然升溫，室溫過夜。次日過濾除去DCU(二環(huán)已基脲)，濾液濃縮，無水乙醚研磨或用異丙醇重結(jié)晶。
逐個增長法將Thr的α-氨基用Boc基(叔丁氧羰?；?保護(hù)，α-羧基用HOSu(N-羥基琥珀酰亞胺)活化，BocThrOsu 50mmol溶于40ml四氫呋喃，微熱溶解，加入Ala50mmol，加入100mmolKHCO3，加水20ml，30℃水浴反應(yīng)2天。抽去四氫呋喃，用2mol/L HCl在冰浴中酸化至pH3～4，乙酸乙酯抽提，飽和NaCl洗3次，無水Na2SO4干燥，抽干，無水乙醚研磨，P2O5真空干燥?？傻肂ocThr-Ala OH 38.1mmol，產(chǎn)率76.2％。
BocThr-Ala OH 30mmol溶于24ml二氯甲烷，24ml TFA(三氟醋酸)，28℃攪拌反應(yīng)1小時，減壓抽去溶劑，得油狀物，用無水乙醚研磨得白色粉末，P2O5真空干燥，得TFA·Thr-Ala OH 26mmol，產(chǎn)率86.7％。
BocProOSu 22mmol加20ml四氫呋喃，加入TFA·Thr-AlaOH 22mmol，再加20ml四氫呋喃，以及20ml含44mmol KHCO3的水溶液，30℃反應(yīng)2天。抽去四氫呋喃，用2mol/L HCl在冰浴酸化至pH3～4，乙酸乙酯抽提，飽和NaCl洗3次，無水Na2SO4干燥，抽干，無水乙醚研磨，得白色粉未，即為Boc-Pro-Thr-Ala OH，產(chǎn)量為14.7mmol，產(chǎn)率66.8％。
Boc-Pro-Thr-Ala OH 10mmol溶于8ml二氯甲烷，8mlTFA，28℃攪拌反應(yīng)1小時，減后抽去溶劑，得油狀物，用無水乙醚研磨得白色粉末，P2O5真空干燥得TFA·Pro-Thr-Ala OH 8.3mmol，得率83.0％。
用以上同樣的方法依次從C端→N端接上Gly、Pro、Glu、Leu、Tyr，得帶保護(hù)基的八肽。
用催化氫化法脫去Glu側(cè)鏈的保護(hù)基(OBzl)，具體方法為8mmol帶保護(hù)基的八肽，加300ml甲醇，加少量催化劑鈀黑，通氫氣，40℃攪拌約5小時，用薄層層析檢查反應(yīng)是否完全，待反應(yīng)完全后，過濾去除鈀黑，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽去甲醇，抽干后用乙醚洗，抽濾，P2O5真空干燥，得6.89mmol BOC八肽，得率86.1％。
Boc八肽6mmol溶于5ml二氯甲烷，5mlTFA，28℃攪拌反應(yīng)1小時，減壓抽去溶劑，得油狀物，用無水乙醚研磨得白色粉末，P2O5真空干燥得5.6mmolTFA八肽，即粗肽，得率93.3％。
HPLC分離純化用C18制備性HPLC柱分離純化，柱高25cm，直徑2cm。粗肽0.3mmol溶于3ml含0.1％TFA的25％ACN(乙腈)，用25％ACN進(jìn)行等梯度洗脫，流速8ml/min，收集主峰，抽去TFA，冷凍干燥得0.19mmol八肽，得率63.3％，純度96％以上。
實施例2抗腫瘤寡肽AOP-1的固相合成用固相合成法合成采用C端→N端逐步延長的方法。用芴甲氧羰?；?Fmoc)保護(hù)氨基酸的α-氨基，各種Fmoc保護(hù)氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基分別為Thr(tBu)、Glu(OtBu)、Tyr(tBu)(tBu和OtBu分別代表叔丁基和叔丁酯)。先將α-氨基保護(hù)的C端的第一個氨基酸，即Fmoc Ala OH掛接到樹脂上，用50％的哌啶除去Fmoc保護(hù)基，依次以二氯甲烷、無水乙醇、二氯甲烷洗滌。再與C端第二個氨基酸即FmocThr(tBu)用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作縮合劑，并加N-羥基苯駢三氮唑(HOBt)，將FmocThr(tBu)接到Ala的氨基上。用50％哌啶脫去Fmoc保護(hù)基，依次以二氯甲烷、無水乙醇、二氯甲烷洗滌，得Thr(tBu)-Ala-樹脂。再與FmocPro連接，重復(fù)上述步驟，依次接上Gly、Pro、Glu、Leu、Tyr，使肽鏈按序列從C端→N端逐步延長，用50％哌啶脫去Fmoc保護(hù)基，用50％三氟醋酸(TFA)將AOP-1寡肽從樹脂上切下，并脫去tBu和OtBu保護(hù)基，得到抗腫瘤寡肽AOP-1(粗品)，每步縮合率均在90％以上。再經(jīng)HPLC分離純化(同實施例1)，純度在96％以上。
實施例3抗腫瘤寡肽AOP-1的鑒定抗腫瘤寡肽AOP-1經(jīng)5.7mol/LHCl水解16小時，進(jìn)行氨基酸分析，知AOP-1含Ala、Glu、Gly、Leu、Pro、Thr、Tyr 7種氨基酸，其摩爾比為Ala∶Glu∶Gly∶Leu∶Pro∶Thr∶Tyr＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。經(jīng)氨基酸序列分析，序列為Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala。經(jīng)電噴霧質(zhì)譜測定得到一個峰，其分子量為846.9。
實施例4抗腫瘤寡肽AOP-1對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞的抑制作用(體外試驗)應(yīng)用本專利說明書所述方法，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤寡肽AOP-1對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞的生長和增殖有明顯的抑制作用，且劑效關(guān)系顯著，其結(jié)果如下抗腫瘤寡肽AOP-1對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

實施例5抗腫瘤寡肽AOP-1對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑制作用(體內(nèi)試驗)
應(yīng)用本專利說明書所述方法，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤寡肽AOP-1對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的生長和增殖有明顯的抑制作用，其結(jié)果如下抗腫瘤寡肽AOP-1對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑瘤作用

抗腫瘤寡肽AOP-1在劑量15、7.5和2.5mg/kg，靜脈注射時，對小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Lewis肺癌的生長有明顯的抑制作用，且劑效關(guān)系明顯。
實施例6抗腫瘤寡肽AOP-2的人工合成采用與實施例1或?qū)嵤├?同樣的合成方法，不同之處僅在于Ile替代Leu。
實施例7抗腫瘤寡肽AOP-2的鑒定抗腫瘤寡肽AOP-2經(jīng)5.7mol/LHCl水解16小時，進(jìn)行氨基酸分析，知AOP-2含Ala、Glu、Gly、Ile、Pro、Thr、Tyr 7種氨基酸，其摩爾比為Ala∶Glu∶Gly∶Ile∶Pro∶Thr∶Tyr＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。經(jīng)氨基酸序列分析，序列為Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala。經(jīng)電噴霧質(zhì)譜測定得到一個峰，其分子量為846.9。
實施例8抗腫瘤寡肽AOP-2對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞的抑制作用(體外試驗)應(yīng)用本專利說明書所述的方法，實驗結(jié)果如下
抗腫瘤寡肽AOP-2對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

抗腫瘤寡肽AOP-2對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞的生長和增殖有明顯的抑制作用，且劑效關(guān)系顯著。
實施例9抗腫瘤寡肽AOP-2對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑制作用(體內(nèi)試驗)應(yīng)用本專利說明書所述的方法，實驗結(jié)果如下抗腫瘤寡肽AOP-2對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑瘤作用

抗腫瘤寡肽AOP-2在劑量15、7.5和2.5mg/kg，靜脈注射時，對小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Lewis肺癌的生長有明顯的抑制作用，且劑效關(guān)系明顯。
實施例10抗腫瘤寡肽AOP-3的人工合成采用實施例1或?qū)嵤├?同樣的合成方法，不同之處僅在于Ser替代Thr。
實施例11抗腫瘤寡肽AOP-3的鑒定抗腫瘤寡肽AOP-3經(jīng)5.7mol/LHCl水解16小時，進(jìn)行氨基酸分析，知AOP-3含Ala、Glu、Gly、Leu、Pro、Ser、Tyr 7種氨基酸，其摩爾比為Ala∶Glu∶Gly∶Leu∶Pro∶Ser∶Tyr＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。經(jīng)氨基酸序列分析，序列為Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。經(jīng)電噴霧質(zhì)譜測定得到一個峰，其分子量為832.88。
實施例12抗腫瘤寡肽AOP-3對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞的抑制作用(體外試驗)應(yīng)用本專利說明書所述的方法，實驗結(jié)果如下腫瘤寡肽AOP-3對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

抗腫瘤寡肽AOP-3對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞的生長和增殖有明顯的抑制作用，且劑效關(guān)系顯著。
實施例13抗腫瘤寡肽AOP-3對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑制作用(體內(nèi)試驗)應(yīng)用本專利說明書所述的方法，實驗結(jié)果如下抗腫瘤寡肽AOP-3對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑瘤作用

抗腫瘤寡肽AOP-3在劑量15、7.5和2.5mg/kg，靜脈注射時，對小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Lewis肺癌的生長有明顯的抑制作用，且劑效關(guān)系明顯。
實施例14抗腫瘤寡肽AOP-4的人工合成采用與實施例1或?qū)嵤├?同樣的合成方法，不同之處僅在于Ile替代Leu，Ser替代Thr。
實施例15抗腫瘤寡肽AOP-4的鑒定抗腫瘤寡肽AOP-4經(jīng)5.7mol/LHCl水解16小時，進(jìn)行氨基酸分析，知AOP-4含Ala、Glu、Gly、Ile、Pro、Ser、Tyr 7種氨基酸，其摩爾比為Ala∶Glu∶Gly∶Ile∶Pro∶Ser∶Tyr＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。經(jīng)氨基酸序列分析，序列為Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。經(jīng)電噴霧質(zhì)譜測定得到一個峰，其分子量為832.88。
實施例16抗腫瘤寡肽AOP-4對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞的抑制作用(體外試驗)應(yīng)用本專利說明書所述的方法，實驗結(jié)果如下抗腫瘤寡肽AOP-4對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

抗腫瘤寡肽AOP-4對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN45胃癌細(xì)胞的生長和增殖有明顯的抑制作用，且劑效關(guān)系顯著。
實施例17抗腫瘤寡肽AOP-4對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑制作用(體內(nèi)試驗)應(yīng)用本專利說明書所述的方法，實驗結(jié)果如下
抗腫瘤寡肽AOP-4對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑瘤作用

抗腫瘤寡肽AOP-4在劑量15、7.5和2.5mg/kg，靜脈注射時，對小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Lewis肺癌的生長有明顯的抑制作用，且劑效關(guān)系明顯。
權(quán)利要求
1.抗腫瘤寡肽，其特征在于抗腫瘤寡肽是個八肽，其序列為Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala，其中X為Leu或Ile，Y為Thr或Ser。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤寡肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤寡肽中X為Leu，Y為Thr時，序列為Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala，分子量為846.9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤寡肽中X為Ile，Y為Thr時，序列為Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala，分子量為846.9。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤寡肽中X為Leu，Y為Ser時，序列為Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala，分子量為832.88。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤寡肽中X為Ile，Y為Ser時，序列為Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala，分子量為832.88。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤寡肽的制備方法，其特征在于采用液相合成法或固相合成法合成。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。我們?nèi)斯ず铣闪司哂泻軓?qiáng)抑瘤作用的寡肽(antitumor oligopeptide，簡稱AOP)，為八肽，其序列為Tyr－X－Glu－Pro－Gly－Pro－Y－Ala(X為Leu或Ile，Y為Thr或Ser)?？鼓[瘤寡肽－1(AOP－1)序列為Tyr－Leu－Glu－Pro－Gly－Pro－Thr－Ala；抗腫瘤寡肽－2(AOP－2)序列為Tyr－Ile－Glu－Pro－Gly－Pro－Thr－Ala；抗腫瘤寡肽－3(AOP－3)序列為Tyr－Leu－Glu－Pro－Gly－Pro－Ser－Ala；抗腫瘤寡肽－4(AOP－4)序列為Tyr－Ile－Glu－Pro－Gly－Pro－Ser－Ala。體外及體內(nèi)試驗表明AOP－1、AOP－2、AOP－3、AOP－4均具有很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。對人7721肝癌細(xì)胞和人MKN胃癌細(xì)胞的生長和增殖有很強(qiáng)的抑制作用，且有劑效關(guān)系。還對小鼠移植性腫瘤S180肉瘤、小鼠H22肝癌和小鼠Lewis肺癌的生長有很強(qiáng)的的抑制作用，并有劑效關(guān)系。可在制備抗腫瘤藥中應(yīng)用。
文檔編號C07K1/16GK1876676SQ20061007685
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者陳鈞輝, 張冬梅, 王新昌, 李俊, 譚嬋娟 申請人:南京大學(xué)